KR102065343B1 - 3차원 세포 공동 배양 방법 및 세포 공동 배양 기구 - Google Patents

3차원 세포 공동 배양 방법 및 세포 공동 배양 기구 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포의 공동 배양을 위한 세포 배양 기구로서, 하이드로겔 3차원 스캐폴드를 이용한 세포 배양에 특화된 세포 배양 기구이고, 복수의 세포를 동일한 환경에서 배양할 수 있고 세포의 직접적인 접촉에 의한 문제의 해결 및 세포 간 상호작용에 의한 세포의 반응을 연구할 수 있다.

Description

3차원 세포 공동 배양 방법 및 세포 공동 배양 기구{Method and Device for three-dimensional cell co-culture}
본 발명은 각기 서로 다른 세포를 공동 배양하는데 특화된 세포 공동 배양 장치 및 방법에 관한 것이다.
동일한 환경에서 배양된 서로 다른 세포에서 발생하는 세포의 성장 등과 같은 현상의 비교는 세포의 연구에서 매우 중요하다.
웰 플레이트(well-plate)나 페트리디시(petri dish)와 같은 세포 배양 접시를 사용하는 2차원 세포 배양 방법은 복수의 서로 다른 세포 배양시 여러 문제점이 존재한다. 2차원 세포 배양 방법에서 서로 다른 세포를 배양하는 경우 세포마다 성장 및 증식 속도가 서로 달라 어느 한 종류의 세포에서 분비되는 다양한 생체 분자가 다른 종류의 세포에 주는 영향을 예측하고 조정하는 것은 불가능하다. 그리고 세포 배양시 서로 다른 세포들의 접촉이 발생하는 경우 상이한 세포들간에 종간 우열을 선점하기 위한 증식과 성장의 변화가 발생하기 때문에 배양에 사용한 세포들이 가진 공지의 특성이 정상적으로 나타나지 않을 수도 있다. 또한 서로 다른 세포를 하나의 배지에서 배양하게 되면 배양과정에서 각각의 세포들이 서로 접촉하거나, 어느 하나의 세포에서 분비된 단백질과 같은 생체 분자가 다른 세포에 영향을 주기 때문에 동일한 환경이 서로 다른 세포에 미치는 영향을 정확히 예측하기도 어렵다.
이러한 문제를 극복하기 위한 하나의 방법으로 한국 공개특허 제10-2017-0011522호에서 지방세포와 마크로파지를 하이드로겔에 혼합하여 이들 세포를 3차원으로 공동배양하는 방법을 개시하고 있다. 둘 이상의 세포를 하이드로겔과 같은 하나의 공간에 혼합하여 배양하는 경우 세포들의 상호작용에 의해 나타나는 현상의 관찰이 용이할 수 있다. 그러나 공동배양 후 혼합된 세포들을 각각 세포별로 분리하기가 매우 어려운 문제가 있어 공동배양 후 각각의 세포에서 발생한 유전적 변화나 대사변화 등의 변화를 명확히 확인하는데 한계가 존재한다.
본 발명은 이러한 하이드로겔 스캐폴드를 이용한 삼차원 세포 공동배양에서 발생할 수 있는 문제를 인지하고 이를 해결하기 위한 것으로 세포의 공동배양에 의해 나타나는 세포간 상호작용을 확인할 수 있으면서도 공동배양에 이용된 세포 각각에서 나타나는 변화도 명확히 확인할 수 있는 방법과 기구를 제공하고자 한다.
한국 공개특허 제10-2017-0011522호
본 발명은 세포를 포함하는 하이드로겔(hydrogel)을 이용하여 둘 이상의 세포를 공동 배양 하는 방법 및 세포들의 공동 배양을 위한 기구에 관한 것이다.
본 발명은 복수의 배양액 유통로가 형성된 세포 배양 플레이트를 포함하는 세포 공동 배양 기구를 준비하고, 복수의 배양액 유통로에 세포를 포함한 하이드로겔을 적하한 후 세포 배양 플레이트를 세포 배양 배지에 침지시키는 단계를 포함하는 세포 공동 배양 방법을 제공한다.
본 발명은 복수의 배양액 유통로가 형성된 세포 배양 플레이트를 포함하는 세포 공동 배양(co-culture) 기구를 제공한다.
본 발명의 세포 공동 배양 방법은 둘 이상의 서로 다른 세포를 공동 배양하여 세포 간 상호작용에 의해 나타나는 생물학적 현상을 연구할 수 있다.
그리고 서로 다른 세포를 동일한 환경에서 독립적으로 배양할 수 있고 세포 간에 직접적인 접촉에 의해 발생하는 문제를 최소화 할 수 있으며 세포를 공동 배양 한 후 각각의 서로 다른 세포를 손쉽게 채취할 수 있어 공동 배양에 의해 일어난 세포 내 현상을 정확하게 확인할 수 있다.
또한 본 발명의 세포 공동 배양에 사용하는 세포 배양 플레이트 및 이를 포함하는 세포 공동 배양 기구는 세포의 종류, 수 및 공동 배양의 목적에 따라 원하는 형태로 쉽게 제작할 수 있다.
도 1은 배양액 유통로 및 체결홈이 형성된 세포 배양 플레이트이다.
도 2는 배양액 유통로 및 결합돌기가 형성된 세포 배양 플레이트이다.
도 3은 배양액 유통로, 일 면에 형성된 체결홈 및 다른 일 면에 형성된 결합돌기를 포함하는 세포 배양 플레이트이다.
도 4는 도 1, 도 2 및 도 3의 세포 배양 플레이트 중 둘 이상의 세포 배양 플레이트를 적층한 적층체이다.
도 5는 배양액 유통로만 형성된 세포 배양 플레이트이다.
도 6은 세포 배양 플레이트를 삽입할 수 있는 세포 배양 플레이트 삽입부를 가진 용기이다.
도 7은 도 5의 세포 배양 플레이트가 도 6의 용기에 삽입되어 적층된 세포 공동 배양 용기이다.
도 8은 배양액 유통로, 결합돌기 및 돌출부가 형성된 세포 배양 플레이트이다.
도 9는 배양액 유통로, 체결홈 및 돌출부가 형성된 세포 배양 플레이트이다.
도 10은 배양액 유통로, 돌출부 및 양면에 형성된 결합돌기를 포함하는 세포 배양 플레이트이다.
도 11은 배양액 유통로, 돌출부, 일 면에 형성된 체결홈 및 다른 일 면에 형성된 결합돌기를 포함하는 세포 배양 플레이트이다.
도 12는 도 8, 도 9, 도 10 및 도 11의 세포 배양 플레이트 중 둘 이상의 세포 배양 플레이트를 적층한 적층체이다.
도 13은 각각 서로 다른 세포가 담지된 하이드로겔 스캐폴드가 도 1 및 도 2의 세포 배양 플레이트의 배양액 유통로에 형성되고, 도 1 및 도 2의 세포 배양 플레이트가 적층된 적층체이다.
도 14는 도 13의 세포 배양 플레이트 적층체의 실물 사진 및 이를 세포 배양액에 침지한 상태를 보여준다.
도 15는 도 13의 세포 배양 플레이트 적층체를 이용하여 세포를 공동 배양한 후 배양액 유통로에 형성된 하이드로겔 스캐폴드를 분리 및 채취하는 과정을 보여준다.
도 16은 도 13의 세포 배양 플레이트의 일 부분을 확대한 사진((A)), 지방세포의 분화와 증식을 현미경으로 관찰한 사진((B))을 보여준다.
도 17은 마크로파지와 지방세포 모두를 혼합하여 제조한 격자 형태의 하이드로겔 스캐폴드를 이용한 세포 공동 배양(type of scaffold = G)과 본 발명의 세포 공동 배양 기구를 이용한 마크로파지와 지방세포를 공동 배양(type of scaffold = P)에서 나타난 단백질의 발현 정도를 보여준다(adipogenesis: 지방축적, 지질생성 및 지방조직 형성 여부).
도 18은 본 발명의 세포 공동 배양 방법에 따라 지방전구세포와 마크로파지의 비율을 달리하여 배양하였을 때 나타난 단백질 발현 정도를 보여준다(adipogenesis: 지방축적, 지질생성 및 지방조직 형성 여부, Co-culture with MΦ: 지방전구세포와 마크로파지의 공동 배양 여부, preadipocytes/MΦ: 지방전구세포와 마크로파지의 혼합 비율)
이하에서 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 따로 정의하지 않는 경우 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 내용으로 해석되어야 할 것이다. 본 명세서의 도면 및 실시예는 통상의 기술자가 본 발명을 쉽게 이해하고 실시하기 위한 것으로 도면 및 실시예에서 발명의 요지를 흐릴 수 있는 내용은 생략될 수 있으며, 본 발명이 도면 및 실시예로 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 둘 이상의 세포를 공동 배양(co-culture)하는 방법 및 세포의 공동 배양을 위한 기구에 관한 발명이다.
본 발명의 세포 공동 배양 방법은 복수의 배양액 유통로가 형성된 세포 배양 플레이트를 포함하는 세포 공동 배양 기구를 준비하는 단계, 복수의 배양액 유통로에 세포를 포함한 하이드로겔(hydrogel)을 적하하는 단계 및 세포 배양 플레이트를 세포 배양 배지에 침지시키는 단계를 포함하는 세포 공동 배양 방법을 포함할 수 있다.
본 발명의 세포 공동 배양 방법에서 복수의 배양액 유통로 각각에 적하되는 하이드로겔은 서로 다른 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 세포 공동 배양 방법에서 사용하는 세포 배양 플레이트에는 복수의 구멍이 형성되어 있다. 복수의 구멍은 배양액 유통로이자, 하이드로겔이 적하되고 하이드로겔 스캐폴드가 형성되는 공간으로써 웰(well)과 같은 기능을 할 수 있다. 세포 공동 배양을 위한 세포 배양 플레이트를 세포 배양액 또는 세포 배지에 침지시키게 되면, 배양액 유통로를 통해 세포 배양액이 통과할 수 있게 된다.
세포 배양 플레이트를 세포 배양액에 침지시키기에 앞서 세포 배양 플레이트의 배양액 유통로에 세포를 포함하는 하이드로겔을 적하하고, 염화칼슘과 같은 다원자가 양이온 염을 처리하여 가교결합이 형성된 하이드로겔 스캐폴드를 형성시킬 수 있다. 하이드로겔이 배양액 유통로를 채우며 고정되어 배양액 유통로 내부에 세포를 포함한 하이드로겔 스캐폴드(hydrogle scaffold)가 형성된다.
배양액 유통로에 세포를 포함한 하이드로겔을 채운 후 세포 배양 플레이트를 세포 배양액에 침지시키면 세포 배양액은 배양액 유통로에 형성된 하이드로겔 스캐폴드를 통과할 수 있다. 세포 배양액이 배양액 유통로를 따라 배양액 유통로에 형성된 하이드로겔 스캐폴드를 통과하면서 하이드로겔 스캐폴드에 담지되거나, 하이드로겔 스캐폴드 내부의 세포에 공급되어 세포가 성장할 수 있게 된다.
배양액 유통로에 세포를 포함하는 하이드로겔을 적하하면 점도를 가진 하이드로겔이 배양액 유통로에 채워지고 가교결합이 일어나 하이드로겔 스캐폴드가 형성될 수 있다. 하이드로겔 적하시 하이드로겔은 배양액 유통로 전체를 채울 수 있도록 충분한 양을 적하하는 것이 바람직하고, 하이드로겔 스캐폴드는 배양액 유통로의 크기와 정확히 일치하지 않을 수도 있다.
본 발명의 세포 공동 배양 방법에서 사용하는 세포 배양 플레이트는 둘 이상 적층되어 세포 공동 배양 기구를 형성할 수 있다. 둘 이상의 세포 배양 플레이트가 적층되는 경우 세포 배양 플레이트가 적층 가능 하도록 플레이트에 체결홈과 결합 돌기가 형성될 수 있다.
이하 도면을 통해 본 발명에 대하여 보다 구체적으로 설명한다.
도 1, 도 2 및 도 3은 서로 적층 가능한 세포 배양 플레이트의 일 예를 보여준다.
도 1은 세포 배양 플레이트(110)에 복수의 배양액 유통로(111)와 체결홈(112)이 형성되어 있고, 도 2는 세포 배양 플레이트(120)에 복수의 배양액 유통로(121)과 결합 돌기(122)가 형성되어 있다. 도 1과 도 2의 세포 배양 플레이트(110, 120)는 각각 체결홈(112)과 결합 돌기(122)가 있어, 결합 돌기(122)가 체결홈(112)에 결합(체결)되어 둘 이상의 세포 배양 플레이트가 적층된 세포 배양 기구를 형성할 수 있다.
도 3은 하나의 세포 배양 플레이트에 체결홈과 결합 돌기가 모두 형성되어 있는 플레이트로서, 세포 배양 플레이트(130)의 한쪽 면에는 체결홈(132), 다른 한쪽 면에는 결합 돌기(133)가 형성되고 복수의 배양액 유통로(131)가 형성되어 있다. 하나의 세포 배양 플레이트에 체결홈과 결합 돌기가 모두 형성되어 있는 경우 세포 배양 플레이트 본체를 기준으로 서로 대칭되는 위치에 형성되는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 체결홈과 결합 돌기가 모두 형성되어 있는 세포 배양 플레이트(130)에서 편의상 결합 돌기(133)가 형성된 부분을 윗면으로 체결홈(132)이 형성된 부분을 아랫면으로 표시할 수 있다. 도 3의 세포 배양 플레이트(130)에서 결합 돌기(133)가 아래로 향하게 적층하는 경우, 복수의 세포 배양 플레이트가 적층된 적층체에서 가장 아래의 세포 배양 플레이트에서 결합 돌기(133)는 받침대 기능도 할 수 있다.
도 4는 도 1, 도 2 또는 도 3의 세포 배양 플레이트를 적층한 세포 배양 공동 기구의 일 예를 보여준다. 체결홈이 있는 세포 배양 플레이트(110)의 체결홈(112)에 결합 돌기가 있는 세포 배양 플레이트(120)의 결합 돌기(122)를 끼워 둘 이상의 세포 배양 플레이트가 적층된 적층체를 포함한 세포 공동 배양 기구를 형성할 수 있다. 도 3의 세포 배양 플레이트의 경우 두 개의 세포 배양 플레이트(130)를 준비하고, 어느 하나의 세포 배양 플레이트(130)의 체결홈(132)에 다른 하나의 세포 배양 플레이트의 결합 돌기(133)를 끼워 둘 이 상의 세포 배양 플레이트(130)가 적층된 세포 공동 배양 기구를 형성할 수 있다. 도 1 및 도 2의 세포 배양 플레이트(110, 120) 끼리 적층하거나 도 3의 세포 배양 플레이트(130)를 두 개 이상 적층하여 세포 공동 배양 기구를 형성할 수도 있으나 이에 제한되는 것은 아니고, 도 1 및 도 3의 세포 배양 플레이트(110, 130)를 적층하거나 도 2 및 도 3의 세포 배양 플레이트(120, 130)를 적층하여 세포 공동 배양 기구를 형성할 수 있다.
도 5는 체결홈과 결합 돌기가 없고 배양액 유통로(141)만이 형성된 세포 배양 플레이트의 일 예를 보여준다. 체결홈과 결합 돌기가 없는 세포 배양 플레이트(140)는 세포 배양 플레이트(140)를 삽입할 수 있는 용기에 삽입되어 적층될 수 있다.
도 6은 체결홈과 결합 돌기가 없는 세포 배양 플레이트를 삽입하기 위한 세포 배양 플레이트 삽입 용기(200)의 일 예를 보여준다. 용기(200)의 본체(210)에는 세포 배양 플레이트(140)를 삽입할 수 있는 복수의 삽입부(220)부가 형성되어 있어 둘 이상의 세포 배양 플레이트(140)를 삽입부(220)에 삽입하여 적층하여 세포 공동 배양 기구를 형성할 수 있다. 세포 배양 플레이트 삽입 용기(200)에는 바람직하게는 용기 바닥(230)이 형성되어 있고 뚜껑 혹은 지붕은 형성되지 않을 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
도 7은 복수개의 도 5의 세포 배양 플레이트(140)가 도 6의 용기(200)에 삽입되어 형성된 세포 공동 배양 기구를 보여준다.
도 8, 도 9, 도 10 및 도 11은 하나의 세포 배양 플레이트에 서로 다른 두 개 이상의 구역을 나누어 구획화한 세포 배양 플레이트의 일 예를 보여준다.
도 8의 결합 돌기(152)를 가진 구획화된 세포 배양 플레이트(150)로서, 각각 정사각형, 원 및 직사각형의 서로 다른 모양의 배양액 유통로(151)가 형성된 세 개의 구역이 세포 배양 플레이트의 어느 한 면에 형성된 복수의 돌출부(153)에 의해 구획화 되어 있다.
도 9는 체결홈(162)을 가진 구획화된 세포 배양 플레이트(160)로서 각각 정사각형, 원 및 직사각형의 서로 다른 모양의 배양액 유통로(161)가 형성된 세 개의 구역이 세포 배양 플레이트의 어느 한 면에 형성된 복수의 돌출부(163)에 의해 구획화 되어 있다.
도 10은 세포 배양 플레이트의 양 면(윗면, 아랫면)에 결합 돌기(172)를 가진 구획화된 세포 배양 플레이트(170)로서 각각 정사각형, 타원형 및 원형의 서로 다른 모양의 배양액 유통로(171)가 형성된 세 개의 구역이 세포 배양 플레이트의 어느 한 면에 형성된 복수의 돌출부(173)에 의해 구획화 되어 있다.
도 11은 세포 배양 플레이트의 양 면(윗면, 아랫면) 각각에 체결홈(182)과 결합 돌기(183)가 모두 형성된 구획화된 세포 배양 플레이트(180)로서 각각 정사각형, 원 및 직사각형의 서로 다른 모양의 배양액 유통로(181)가 형성된 세 개의 구역이 세포 배양 플레이트의 어느 한 면에 형성된 복수의 돌출부(184)에 의해 구획화 되어 있다.
도 12는 도 8, 도 9, 도 10 및 도 11의 세포 배양 플레이트(150, 160, 170, 180)에서 선택되는 둘 이상의 세포 배양 플레이트가 적층된 적층체의 일 예로서, 이를 포함한 세포 공동 배양 기구를 제작할 수 있다.
도 1, 2, 3, 8, 9, 10 및 11은 본 발명의 세포 공동 배양 방법에 사용할 수 있는 세포 배양 플레이트의 예시로서 해당 도면의 세포 배양 플레이트에서 일부 변형된 형태까지 본 발명에 속할 수 있다.
세포 배양 플레이트에서 배양액 유통로의 형태는 특별히 제한되지 않으며 세포를 포함한 하이드로겔이 적하되고 하이드로겔 스캐폴드로서 그 형태가 배양액 유통로에서 유지될 수 있는 다양한 형태로 변경이 가능하다. 배양액 유통로는 정사각형, 직사각형, 원, 타원 또는 별 등 다양한 형태로 제작될 수 있다. 배양액 유통로는 세포 배양 플레이트를 완전히 관통하도록 형성하거나, 하이드로겔 적하시 하이드로겔이 배양액 유통로를 통과하여 흘러버리지 않도록 배양액 유통로 내부에 복수의 구멍을 가진 망사형 또는 그물형 구조를 형성할 수도 있다.
세포 배양 플레이트에서 체결홈과 결합 돌기는 바람직하게는 둘 이상이고, 그 개수나 형태는 세포 배양 플레이트의 크기나 무게에 따라 자유롭게 변경이 가능할 수 있다. 그리고 결합 돌기가 양 면(윗면, 아랫면)에 모두 형성된 세포 배양 플레이트에서 어느 한 면에 형성된 결합 돌기는 세포 배양 플레이트 적층체에서 받침대로서 기능할 수 있다. 또한 체결홈은 세포 배양 플레이트를 완전히 관통하도록 형성할 수도 있고 세포 배양 플레이트를 관통하지 않고 파여진 홈 형태로 형성할 수 있다.
이상의 다양한 세포 배양 플레이트와 이를 적층하여 형성한 적층체를 포함한 세포 배양 용기를 이용하여 서로 다른 세포들을 공동 배양 할 수 있다.
대표적으로 도 1 및 도 2의 세포 배양 플레이트를 이용한 세포 공동 배양 방법에 대하여 보다 구체적으로 설명한다.
도 1의 세포 배양 플레이트(110)를 준비하고 배양액 유통로(111)에 세포를 포함한 하이드로겔을 적하한다. 세포를 포함한 하이드로겔을 적하한 후 세포 배양 플레이트(110)를 세포 배양 배지에 침지시켜 세포를 배양한다. 세포 배양 후 세포 배양 배지에서 세포 배양 플레이트(110)를 꺼낸 후 세척하고 배양액 유통로(111)에 형성된 하이드로겔 스캐폴드를 채취하고 용해하여 하이드로겔 스캐폴드 내에서 성장한 세포를 분석할 수 있다.
세포 배양 플레이트(110)에는 복수의 배양액 유통로(111)가 형성되어 있어 서로 다른 배양액 유통로(110) 각각에 서로 다른 세포를 포함한 하이드로겔을 적하하여 복수의 세포를 배양할 수 있다.
세포 배양 플레이트는 하나의 세포 배양액에 침지되기 때문에 동일한 조건에서 서로 다른 세포를 성장시킬 수 있다. 그리고 배양액 유통로를 통해 배양액이 흐를 수 있고, 배양액은 배양액 유통로에 형성된 하이드로겔 스캐폴드에 유입되고 통과될 수 있어 어느 하나의 하이드로겔 스캐폴드 내에서 세포 성장(증식, 분화 등)에 따라 생성되는 다양한 대사물질들이 다른 하이드로겔 스캐폴드로 이동될 수 있다.
보다 구체적인 일 예로, 세포 배양 플레이트(110)에서 세포 A를 포함한 하이드로겔를 배양액 유통로 중 어느 하나에 적하하고, 세포 B를 포함한 하이드로겔을 세포 A를 포함한 하이드로겔을 적하한 배양액 유통로와 인접한 배양액 유통로에 적하한 후 세포 배양 플레이트를 세포 배양액에 침지하여 세포 A 및 B를 공동 배양할 수 있다. 세포 A와 세포 B가 배양되면서 세포 A 및 B가 분화하거나 증식하게 되고 이 과정에서 세포 A 및 세포 B에서 세포 성장과 관계된 다양한 대사물질이 합성되게 된다. 세포 A에서 합성된 다양한 대사물질은 하이드로겔 스캐폴드에서 분비되어 배양액을 따라 인접한 세포 B를 포함한 하이드로겔 스캐폴드로 흡수될 수 있고, 세포 B에서 합성된 다양한 대사물질 역시 배양액을 따라 세포 A를 포함한 하이드로겔 스캐폴드로 흡수될 수 있다. 이와 같이 세포 A와 세포 B는 서로 다른 배양엑 유통로에 형성된 하이드로겔 스캐폴드에서 성장하나 세포 A와 세포 B에서 합성된 다양한 대사물질은 배양액을 매개로 하여 서로 다른 세포에 영향을 줄 수 있고, 세포 A와 세포 B에서 합성되는 대사물질들이 각각의 서로 다른 세포에 미치는 영향을 손쉽게 분석할 수 있다.
이러한 세포 공동 배양의 가장 큰 장점은 세포 A 및 B를 동일한 하이드로겔 스캐폴드 내부에서 서로 공동 배양하지 않고서도 세포 A 및 세포 B의 성장에 의해 상호간 미치는 영향을 분석할 수 있고, 세포 A 및 B가 각각 서로 다른 하이드로겔 스캐폴드에서 성장하기 때문에 각각의 세포를 분리하는 과정을 거칠 필요도 없다.
세포 배양 플레이트(110, 120)를 복수개 적층한 적층체를 포함한 세포 공동 배양 기구를 이용하여 세포를 공동 배양 하는 경우 결합 돌기와 체결홈을 통해 두 개 이상의 세포 배양 플레이트(110, 120)를 적층할 수 있다. 복수개의 세포 배양 플레이트를 적층하는 경우 하나의 세포 배양 플레이트의 배양액 유통로 전체에 동일한 세포를 포함한 하이드로겔을 적하하고, 다른 하나의 세포 배양 플레이트의 배양액 유통로 전체에 다른 세포를 포함한 하이드로겔을 적하하여 서로 다른 세포들을 공동 배양할 수 있다. 또는 세포 공동 배양의 목적이나 세포의 종류에 따라 동일한 세포 배양 플레이트 상에서 복수의 서로 다른 세포를 포함한 하이드로겔을 적하하여 세포를 공동 배양할 수 있음을 물론이며 세포의 종류나 세포의 수는 특별히 제한되는 것은 아니다.
복수의 세포 배양 플레이트를 적층한 적층체를 포함하는 세포 공동 배양 기구를 이용하는 세포 공동 배양 방법은 적층체를 안정하게 유지할 수만 있다면 그 높이에 제한을 받지 않기 때문에 매우 많은 양의 서로 다른 세포를 공동 배양 할 수 있다. 기존의 하이드로겔 스캐폴드를 이용한 세포 공동 배양 방법의 경우, 하이드로겔 스캐폴드 자체의 구조가 커질수록(높아질수록) 그 형태를 유지하기가 매우 어려워 한 번에 많은 양의 세포를 배양하는데 어려움이 있다. 또한 하이드로겔 스캐폴드 내부에서 세포의 성장에 따라 세포가 차지하는 영역(부피)가 증가하기 때문에 하이드로겔 스캐폴드의 크기와 높이가 제한되었고, 이에 따라 배양 가능한 세포의 종류와 세포 수도 제한되었다. 그러나, 본 발명의 세포 공동 배양 방법은 적층체의 구조를 안정화 시킬 수 있다면 하이드로겔 스캐폴드 자체의 크기와 높이가 제한되지 않기 때문에 다양한 세포와 많은 양의 세포를 동시에 동일한 환경에서 공동 배양할 수 있다.
예를 들어 3차원 세포-프린팅 시스템을 통해 지방전구세포와 마크로파지를 혼합한 하이드로겔만을 프린팅한 하이드로겔 스캐폴드에서 공동 배양 하는 경우, 배양 과정에서 각각의 세포의 분화와 증식이 일어나기 때문에 최초 하이드로겔 스캐폴드에서 1%(v/v)를 차지하던 마크로파지와 지방전구세포는 배양 종료(지방전구세포 배양을 위한 일반적인 배지 조건에서 약 8일 배양 후)일에 약 15%(v/v) 이상을 차지하게 되어 세포의 성장에 의한 하이드로 스캐폴드 구조체의 붕괴가 쉽게 발생할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 세포 배양 플레이트의 배양액 유통로에 지방전구세포(preadipocytes)를 포함하는 하이드로겔과 마크로파지(macrophage)를 포함하는 하이드로겔을 각각 적하하고, 지방전구세포와 마크로파지를 공동 배양하여 인슐린 저항성이 증가한 지방세포, 지방축적 및 지방조직이 형성된 하이드로겔 스캐폴드를 얻을 수 있다. 지방세포의 인슐린 저항성 증가는 마크로파지에 의한 영향으로 지방세포와 마크로파지를 각각 서로 다른 하이드로겔 스캐폴드에서 성장시켰으나, 마크로파지의 배양 과정에서 합성된 대사물질이 배양액을 따라 지방세포를 포함하는 스캐폴드로 유입되어 지방세포가 인슐린 저항성이 증가되도록 영향을 미친 결과로 볼 수 있다. 이러한 결과는 지방전구세포와 마크로파지를 하나의 하이드로겔에 혼합하여 배양한 결과와 동일한 결과이다.
즉, 본 발명의 세포 공동 배양 방법은 성장 과정에 있어서 서로 영향을 미치는 서로 다른 세포를 상이한 구역(상이한 배양액 유통로)에서 배양하여도 하나의 영역에서 서로 다른 세포를 공동 배양한 결과와 동일한 현상을 유도할 수 있다.
본 발명에서 하이드로겔(hydrogel)은 세포 배양 배지, 배양액 또는 물을 용매로 하여 폴리머 사슬이 네트워크를 이룰 수 있는 것으로 수용성 고분자 등이 화학적으로 가교결합을 이루거나, 물리적으로 결합할 수 있어 3차원 하이드로겔 스캐폴드를 형성할 수 있다. 하이드로겔은 점도를 가지고 있어 세포 배양 플레이트를 관통하여 형성된 배양액 유통로에 적하시 배양액 유통로를 빠져나가지 않고 배양액 유통로에 접착 및 유지되어 하이드로겔 스캐폴드를 형성할 수 있다. 하이드로겔을 배양액 유통로에 적하시 배양액 유통로를 가득 채울 수 있도록 충분한 양을 적하는 것이 바람직하다. 하이드로겔 스캐폴드의 특성에 의해 하이드로겔 스캐폴드는 배양액 유통로에서 세포 배양 기간 동안 일정한 형태를 유지할 수 있고, 배양액이 하이드로겔 스캐폴드에 유입되거나 하이드로겔 스캐폴드를 통과하여 흐를 수 있다.
본 발명에서 사용하는 하이드로겔은 크게 제한되지 않으며 콜라겐, 키토산, 히알루론산, 젤라틴을 사용할 수 있고 바람직하게는 조류(algae)로부터 유래된 알지네이트(alginate)를 포함하는 것이 바람직하다. 조류 베이스(base)의 하이드로겔을 사용하는 경우 알지네이트의 함량을 적합하게 조절하여 다양한 세포의 공동 배양과정에서 하이드로겔 스캐폴드가 용해되지 않고 유지되게 하는 것이 바람직하다.
알지네이트 하이드로겔은 조류로부터 유래된 알지네이트를 포함하여 제조한 하이드로겔을 의미한다. 알지네이트 하이드로겔에서 알지네이트는 수용성 고분자 전해질로 염화칼슘과 같은 다원자가 양이온 염을 사용하여 가교결합을 이룰 수 있다. 조류 베이스의 하이드로겔의 경우 알지네이트의 함량이 하이드로겔 스캐폴드 생성을 위한 세포 및 알지네이트 하이드로겔 혼합물 대비 1.5% 초과, 1 내지 4%, 1.5 내지 4%, 1.8 내지 3.0%, 2 내지 4%, 바람직하게는 1.5% 초과 3.0%(w/v)이하이다. 알지네이트의 함량이 충분하지 못한 경우 구조체의 용해도가 증가하고, 알지네이트의 함량이 높은 경우 세포들의 증식 및 생존율이 감소할 수 있다.
갈조류로부터 유래된 알지네이트의 함량이 1.5%(w/v)인 경우 지방세포의 생존 및 증식이 매우 활발하나, 하이드로겔 스캐폴드에서 지방세포 및 마크로파지 공동 배양시 상대적으로 형태가 오래 유지되지 않아 배양 및 연구의 적용에 어려움이 있을 수 있다. 본 발명의 일 싱시예에 따르면, 지방전구세포와 마크로파지의 공동 배양의 경우 알지네이트의 함량이 2.0%(w/v) 및 2.5%(w/v)일 때 하이드로겔 스캐폴드의 형태가 유사 지방조직 형성될 때까지 충분히 유지될 수 있었으며 지방세포의 생존 및 증식도 일정하게 유지된다. 또한, 알지네이트 함량이 3.0%(w/v) 이상인 경우 하이드로겔 스캐폴드의 형태의 지속력은 우수하나, 지방세포의 생존 및 증식이 감소할 수 있다.
본 발명에서 하이드로겔에는 젤라틴 및 콜라겐이 더 포함될 수 있으며, 젤라틴과 콜라겐의 함량은 세포 및 하이드로겔 혼합물 대비 각각 5.0 내지 10.0%(w/v)인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 하이드로겔 스캐폴드 형성을 세포를 포함한 하이드로겔 혼합물을 세포 배양 플레이트의 배양액 유통로에 채워 넣기 위해 하이드로겔 혼합물을 적하하거나 로딩하는 것은 주사기, 파이펫(pipette) 또는3차원 세포-프린팅 시스템을 이용하여 하이드로겔 스캐폴드를 제조하기 위한 기계의 디스펜서를 통해 수행될 수 있다. 또는 하이드로겔 혼합물을 적당량 손으로 덜어 세포 배양 플레이트의 배양액 유통로에 로딩할 수도 있다.
본 발명에서 하이드로겔 혼합물을 적하하거나 로딩하는데 사용하는 3차원 세포-프린팅 시스템(3D cell-printing system)은 입체구조의 하이드로겔 스캐폴드를 생성하기 위해 사용되는 시스템이다. 3차원 세포-프린팅을 위해 x-y-z 스테이지(stage), 디스펜서, 실린지 노즐(syringe nozzle), 압축 컨트롤러 및 컴퓨터 시스템을 구비하여 포함한 기계를 통해 수행될 수 있다. 본 발명에서 3차원 세포-프린팅 시스템을 통해 제조되는 하이드로겔 스캐폴드는 입체적인 구조로서 일반적으로 수행되는 배지에서의 세포 배양과 같은 이차원적 배양과 구분되는 3차원적 세포 배양이 가능하다. 하이드로겔 스캐폴드의 구조는 혼합물에 포함된 성분 및 농도, 프로그램을 통한 디자인, 세포-플로팅 시 압력 및 속도에 의해 적절하게 형성될 수 있다.
본 발명에서는 세포 배양 플레이트의 배양액 유통로에 세포를 포함하는 하이드로겔을 적하하여 하이드로겔 스캐폴드를 형성하므로 세포 공동 배양을 위한 하이드로겔 스캐폴드의 스캐폴드 패턴 및 구조가 특별히 제한되는 것은 아니다.
이하에서 본 발명을 실시하기 위한 실시예에 대하여 설명한다. 실시예는 본 발명을 실시하기 위한 하나의 예시에 해당하는 것으로서 본 발명이 실시예에 의해 한정 해석되어서는 안된다.
지방세포와 마크로파지의 공동 배양
실시예 1-1. 세포 배양
지방 전구 세포주인 3T3-L1 (ATCC #CL-173) 및 RAW264.7 마크로파지(macrophage) (ATCC #TIB-71)는 ATCC (American Type Culture Collection, VA, USA)로부터 구매하였다. 3T3-L1 및 RAW264.7은 10%의 FBS(Fetal Bovine Serum, Invitrogen, CA, USA) 및 100㎍/ml의 페니실린과 100㎍/ml의 스트렙토마이신 (Invitrogen)의 혼합물 1%를 함유하는 DMEM(Dubecco Modified Eagle Medium, Invitrogen) 내에서 유지되었다. 이어서, 세포들은 37℃의 5% CO2 인큐베이터 내의 T75 세포 배양 플라스크 내에서 성장 및 유지되었다.
DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline, Invitrogen)로 세척된 후에, 플레이트에 부착된 3T3-L1은 37℃의 5% CO2인큐베이터 내에서, 1㎖의 0.5% 트립신-EDTA(Invitreogen)에서 2분간 인큐베이션 하였고, 이어서, 3㎖의 배지로 중화 후 1,500 rpm에서 2 분간 세포 현탁액(suspension)을 원심분리하여 세포 펠렛(pellet)을 수득 한 후 실험에 이용하였다.
RAW264.7은 배양 후 10㎖의 DPBS를 이용하여 세포들을 스크랩하여 1,500rpm에서 2분간 원심분리하여 세포 펠렛(pellet)을 수득하여 사용하였다.
실시예 1-2. 3차원 세포 공동 배양기에서의 배양을 위한 세포 담지 알지네이트 하이드로겔 혼합물 준비
젤라틴(Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)), 콜라겐(Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)), 지방전구세포(3T3-L1) 및 마크로파지(RAW264.7)를 균일하게 혼합하고 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)로 최종 부피를 조절하여 세포를 포함한 알지네이트 하이드로겔 혼합물을 준비하였다. 알지네이트 하이드로겔 혼합물에 포함된 3T3-L1 및 RAW264.7는 혈구계산기-기반 세포계수기(SKC Co. Ltd., Seoul, Korea) 및 도립현미경(inverted microscope, Eclipse TE2000-U, Nikon, Tokyo, Japan)을 이용하여 같은 수의 세포를 갖을 수 있게 (3T3-L1(5×106세포/ml), RAW264.7 (5×106세포/ml))가 되게 밀도를 조절하여, 각각의 세포주에 대한 알지네이트 혼합물을 준비하였다, 각각의 세포가 담지된 혼합물에는 알지네이트는 2%(w/v), 젤라틴 0.5%(w/v), 및 콜라겐 0.5%(w/v)을 함유하도록 하였다.
실시예 1-3. 삼차원 세포 공동 배양기에 세포 담지 혼합물의 적하
세포 공동 배양 기구는 도 1의 세포 배양 플레이트 하나와 도 2의 세포 배양 플레이트 하나를 준비하여 2층으로 적층한 적층체를 사용하였다. 세포 배양 플레이트의 적층에 앞서 세포 배양 플레이트의 배양액 유통로에 지방전구세포를 포함하는 하이드로겔 혼합물과 마크로파지를 포함하는 하이드로겔 혼합물을 각각 적하하였다.
삼차원 세포 공동 배양기에 세포가 담지된 혼합물을 적하하기 위한 3차원 세포-적하(cell-drop) 시스템은 다음과 같이 준비하였다. 3 차원 디스펜싱(dispensing) 구조를 조립하기 위한 3 차원 세포-적하 시스템은 x-y-z 스테이지, 디스펜서, 시린지 노즐, 압축 컨트롤러, 및 컴퓨터 시스템으로 구성하였다. 디스펜서는 비드 스캐폴드 제작을 위한 하이드로겔을 보유하는 리저버 탱크(reservoir tank)이고 컴퓨터 시스템으로 디스펜서 내의 세포-적하 시스템의 공기압을 50~120 kPa로 조절하여 디스펜서에 적용하였다. 직경 2mm 노즐을 가지는 디스펜서로 준비한 세포 담지 알지네이트 하이드로겔 혼합물을 20~30㎕씩 적하하여, 세포 공동 배양 기구의 각각의 배양액 유통로에 삽입하였다. 각각의 세포 배양 플레이트에서 지방전구세포를 포함하는 하이드로겔 혼합물을 배양액 유통로에 적하하고, 지방전구세포를 포함하는 하이드로겔 혼합물을 적하한 배양액 유통로를 둘러싼 배양액 유통로에 마크로파지를 포함하는 하이드로겔 혼합물을 적하하였다(도 13).
이후 세포 공동 배양 기구의 배양액 유통로에 적하된 세포 담지 알지네이트 하이드로겔 혼합물에 양이온 염을 포함한 1% CaCl2 용액을 처리하였고, 하이드로겔 혼합물 내에서 가교결합이 형성되면서 하이드로겔 스캐폴드가 형성되고 배양액 유통로에 고정되었다. 세포 담지 알지네이트 하이드로겔 혼합물을 세포 공동 배양 기구 내 배양액 유통로에 적하하기 위한 장비 및 관련 소프트웨어는 Korea Research Institute of Chemical Technology (KRICT)에서 제공하였다. 각각의 세포를 담지한 세포 공동 배양 기구는 지방세포 분화 배지에 침지하였고, 최대 8일간 배양 및 분화 시켰다.
실시예 1-4. 삼차원 세포 공동 배양기 내 세포들의 분화
지방전구세포인 3T3-L1의 지방세포(adipocyte)로의 분화를 위해, 2㎍/ml 인슐린, 500μM 이소부틸메틸잔틴(IBMX) 및 0.25μM 덱사메타손(DEX)을 함유하는 분화 배지에서 4 일 동안 배양하였고, 지방 세포의 성숙 및 세포 내 지방입자 축적을 위해, 2㎍/ml 인슐린을 함유하는 분화 배지에서 3일 동안 배양하였다. 이후 DPBS로 세척 후 1일 동안 DMEM 배지에서 배양되었다.
RAW264.7 마크로파지의 경우 3T3-L1과 같이 지방세포 분화 배지와 함께 지방세포 분화 및 지방 세포 성숙기간인 8일 동안 함께 배양 되었으며, 3T3-L1 과는 서로 다른 배양액 유통로에서 에 위치되어 배양 되었다.
세포 공동 배양 기구는 20㎖의 배양액이 담긴 조직 배양 접시(tissue culture dish)에 침지하여 세포 배양 과정을 진행하였다(도 14).
실시예 1-5. 세포 공동 배양기를 이용하지 않은 지방세포와 마크로파지의 공동 배양
실시예 1-1에 따라 지방전구세포와 마크로파지를 준비하였다. 지방세포와 마크로파지를 모두 혼합한 하이드로겔 스캐폴드를 아래와 같은 방법으로 준비하였고, 세포 공동 배양 기구를 이용하여 공동 배양한 결과와 비교하였다.
젤라틴 500ul(Sigma-Aldrich), 콜라겐 500ul(Sigma-Aldrich)와 1x107 개의 지방전구세포 및 1x105 개의 마크로파지를 균일하게 혼합한 후에 둘베코 수정 이글배지로 최종 9.7ml로 맞추었다. 혼합물에 3mg 알긴산 나트륨(Sigma-Aldrich)을 넣은 후 신속하게 교반시켜 3% 알지네이트 하이드로겔 스캐폴드 제조를 위한 혼합물을 준비하고 3차원 스케폴드 제작을 위해 200~300㎛ 사이즈의 노즐로 구성된 디스펜서로 옮겼다. 원활한 세포-프린팅을 위하여 1000rpm 으로 10 초간 원심분리 하여 하이드로겔 스케폴드를 제작준비를 하였다. 디스펜서를 통해 격자형태로 하이드로겔을 세포 배양 접시에 적하하였고, 준비한 5% 염화칼슘 수용액을 신속하게 처리하여 가교결합이 일어나도록 하였다.
이외에는 실시예 1-2 내지 1-4와 동일한 방법으로 세포를 공동 배양 하였다.
지방세포와 마크로파지의 공동 배양 결과 확인
아래의 방법에 따라 웨스턴 블랏(western blot)을 이용한 세포의 발현 단백질을 측정하였다. 측정 대상 단백질은 지방세포분화과정과 관련된 전사 인자 및 지방세포 관련 마커인 FAS(fatty acid syntheses), ACC(acetyl-CoA carboxylase), FABP4(fatty acid binding protein 4) 및 GLUT4(Glucose transporter type 4)를 측정하였다.
삼차원 세포 공동 배양 기구에서 배양한 세포 담지 하이드로겔 스캐폴드를 각각의 세포주가 담지된 하이드로겔 스캐폴드 별로 분리하고 용해하여 세포 용출물을 수득하였다(도 15). 세포 용출물에 프로테아제 저해제 혼합물(protease inhibitor cocktail, Roche life science, Seoul, Korea)을 함유하는 프로-프렙(PRO-PREP) 단백질 추출 용액 (iNtRON Biotechnology Inc., Seoul, Korea)을 처리하였다. 이어서, 세포 용출물을 13,000 rpm에서 원심분리한 후, 각각의 샘플들로부터 얻은 20㎍의 단백질을 NuPage Bis-Tris Mini Gels(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 상에 로딩하고 PVDF 멤브레인 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)으로 트랜스퍼(transfer)하였다. 카제인(casein, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로 블로킹된 멤브레인에 이어서 FABP4 (fatty acid binding protein 4), 지방산 합성 효소(fatty acid synthases, FAS), ACC(acetyl-Coa carboxylase), GLUT4 (Glucose transporter type 4), β-액틴(Cell Signaling, MA, USA)의 항체와 함께 인큐베이션 하였다. 면역반응성 밴드들을 Supersignal West Dura Extended Duration Substrate Kit(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)의 화학발광 (chemiluminescent)시약으로 발색시켰고, 단백질 밴드들을 화학발광장치(BIORAD, Inc. Korea)로 시각화 하였다. 세포 공동 배양 결과와 세포에서 발현된 단백질을 확인한 결과 지방세포의 축적, 분화 및 조직형성이 원활이 이루어 졌음을 확인하였고 이러한 결과는 지방세포의 분화 과정에서 마크로파지가 지방세포에 영향을 미친 결과를 보여주는 것이었다(도 16, 도 17). 해당 결과는 지방전구세포와 마크로파지를 같이 혼합한 3차원 비드 형태의 하이드로겔 스캐폴드를 이용하여 지방세포와 마크로파지를 공동 배양한 결과와 동일한 결과(실시예 1-5에 따른 세포 공동 배양 결과)였고, 서로 다른 구역(배양액 유통로)에서 지방세포와 마크로파지를 공동 배양한 본 발명의 공동 배양 방법이 서로 다른 세포의 공동 배양에 적합함을 보여주는 것이었다.
지방세포와 마크로파지의 비율 변화를 통한 공동 배양 결과 변화 확인
실시예 1-1 내지 1-4와 동일한 방법에 따라 지방세포와 마크로파지의 비율을 99:1, 98:2, 95:5로 각각 변화시켜 세포를 공동 배양하였고, 실시예 2의 방법에 따라 GLUT, FABP4 및 β-액틴(β-actin) 단백질 발현을 측정하였다(도 18).
그 결과 배양액 유통로에 형성된 하이드로겔 스캐폴드에 포함된 세포의 비율 변화에 따라 단백질의 발현 정도가 변화하는 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는 본 발명의 세포 공동 배양 방법을 통해 세포 각각의 함량 차이에 의해 나타나는 다양한 세포 상호 결과를 확인할 수 있는 결과였다.
110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 : 세포 배양 플레이트
111, 121, 131, 141, 151, 161, 171, 181 : 배양액 유통로
112, 132, 162, 182 : 체결홈
122, 133, 152, 172, 183 : 결합 돌기
153, 163, 173 : 돌출부
200 : 세포 배양 플레이트 삽입 용기
210 : 용기 본체
220 : 세포 배양 플레이트 삽입부
230 : 용기 바닥

Claims (12)

  1. 복수의 배양액 유통로가 형성된 세포 배양 플레이트를 포함하는 세포 공동 배양 기구를 준비하는 단계;
    상기 복수의 배양액 유통로 각각에 세포를 포함한 하이드로겔을 적하하는 단계; 및
    상기 세포 공동 배양 기구를 세포 배양 배지에 침지시키는 단계를 포함하고,
    상기 세포 공동 배양 기구는 세포 배양 플레이트가 둘 이상 적층되되, 하나의 세포 배양 플레이트의 배양액 유통로 전체에 동일한 세포를 포함한 하이드로겔을 적하하고, 다른 세포 배양 플레이트의 배양액 유통로 전체에 다른 세포를 포함한 하이드로겔을 적하하거나,
    동일한 세포 배양 플레이트 상에서 복수의 서로 다른 세포를 포함한 하이드로겔을 적하하여 서로 다른 세포들을 공동 배양하는 세포 공동 배양 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 세포 공동 배양 기구는 배양액 유통로와 체결홈이 형성된 세포 배양 플레이트 및, 배양액 유통로와 결합 돌기가 형성된 세포 배양 플레이트가 적층된 세포 공동 배양 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 세포 공동 배양 기구는 윗면에는 결합 돌기가 형성되고 결합돌기와 대칭되는 위치의 아랫면에는 체결홈이 형성된 세포 배양 플레이트가 적층된 세포 공동 배양 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 세포 공동 배양 기구는 세포 배양 플레이트를 삽입할 수 있는 복수의 삽입부를 구비한 용기 본체에 복수의 배양액 유통로가 형성된 세포 배양 플레이트가 삽입되어 적층된 세포 공동 배양 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로겔은 알지네이트, 콜라겐 및 젤라틴이 포함된 알지네이트 하이드로겔 혼합물인 세포 공동 배양 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 알지네이트의 함량은 상기 알지네이트 하이드로겔 혼합물 대비 2.0 내지 4.0%(w/v)인 세포 공동 배양 방법.
  9. 복수의 배양액 유통로가 형성된 세포 배양 플레이트를 포함하는 세포 공동 배양 기구로서,
    상기 세포 공동 배양 기구는 세포 배양 플레이트가 둘 이상 적층되되, 하나의 세포 배양 플레이트의 배양액 유통로 전체에 동일한 세포를 포함한 하이드로겔을 적하하고, 다른 세포 배양 플레이트의 배양액 유통로 전체에 다른 세포를 포함한 하이드로겔을 적하하거나,
    동일한 세포 배양 플레이트 상에서 복수의 서로 다른 세포를 포함한 하이드로겔을 적하하여 서로 다른 세포들을 공동 배양하는 세포 공동 배양 기구.
  10. 삭제
  11. 제9항에 있어서,
    상기 세포 공동 배양 기구는 배양액 유통로와 체결홈이 형성된 세포 배양 플레이트 및, 배양액 유통로와 결합 돌기가 형성된 세포 배양 플레이트가 적층된 세포 공동 배양 기구.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 세포 공동 배양 기구는 윗면에는 결합 돌기가 형성되고 결합돌기와 대칭되는 위치의 아랫면에는 체결홈이 형성된 세포 배양 플레이트가 적층된 세포 공동 배양 기구.
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