JP2005318868A - 培養容器 - Google Patents

Abstract

【課題】 インキュベータ内のスペースを効率的に利用して、一度に培養可能な細胞数を増大させる。
【解決手段】 培地Ａを貯留可能な容器本体３内に、複数層の培養面３ａ，５ａ，６ａを上下に間隔をあけて配置してなる培養容器１を提供する。
各培養容器１の底面積を増大させることなく、上下方向のスペースを利用して培養面積を増大させることにより、インキュベータの内部空間を有効利用することが可能となる。
【選択図】 図１

Description

この発明は、細胞等の検体を培養する際に使用される培養容器に関するものである。

従来、培養容器としては、容器本体と、この容器本体に被せる蓋体とからなる平面視円形のシャーレが知られている。シャーレは、インキュベータ内に収容されて、温度および湿度等が所定の培養条件に維持されることにより、内部に収容された検体を培養することができる。
この場合において、一度に多くの検体を同一培養条件下において培養することが望まれる場合には、シャーレをインキュベータ内において積み重ねて収容数を増やすことが一般的である。

しかし、シャーレは平坦な底面と平坦な蓋体上面とを有しているために嵩張り、インキュベータ内の収容数をあまり多くすることができない。このため、インキュベータ内における積み重ね数を増大させて収容数を増やす手段として、容器本体に被せる蓋体に、容器本体を収容可能な凹部を設け、スタックハイトを低減する培養容器が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
特開２００３−１０２４６３号公報（図２等）

しかしながら、特許文献１の培養容器は、インキュベータ内において同時に培養する検体量を増加させるために、インキュベータ内への同時収容数を増加させるものであり、取り扱いが煩雑であるという問題がある。
すなわち、培養開始から培養終了時までの培養期間中に培養容器の内部の検体に対して何ら処理を行うことのない場合にはよいが、細胞を培養する場合のように、培養期間中に培地を交換したり、薬液を添加したりする処理が必要とされる場合には、培養容器の数が増えた分だけ処理手順が増大してしまい煩雑である。

また、下に配置される培養容器の凹部に、上に積み重ねられる培養容器を嵌合させる特許文献１の培養容器では、単一の培養容器だけを取り出すことができない不都合がある。すなわち、インキュベータ内のスペースを有効利用するためには、積み重ねた培養容器の上方には空間が設けられないので、インキュベータ内において積み重ね状態を解除することができない。したがって、いずれかの培養容器に対して処理が望まれる場合には、積み重ねられた状態の複数の培養容器を全てインキュベータ外に一旦取り出してから、処理される培養容器を積み重ねられた他の培養容器から切り離す必要があり、手数が増えるとともに、自動化も困難である。

すなわち、検体の種類が単一の場合には、培養容器数を増やすことによってインキュベータ内に同時に収容可能な検体数を増やすのではなく、培養容器数を抑えつつ培養面積を増大させてインキュベータ内のスペースを効率よく利用することが好ましい。
特に、細胞を培養する場合には、細胞が配置される培養容器の底面の面積が広すぎると増殖速度が低くなることがあり、単に培養容器の底面積を増大させただけでは、効率的な培養を行うことができない。

この発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、インキュベータ内のスペースを効率的に利用して、一度に培養可能な細胞数を増大させることができ、しかも、細胞の増殖速度を高く維持することができる培養容器を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、培地を貯留可能な容器本体内に、複数層の培養面を上下に間隔をあけて配置してなる培養容器を提供する。
本発明によれば、単一の容器本体内に複数層の培養面が配置されているので、培養容器数を増大させることなく、培養可能な細胞数を増加させることができる。この場合において、複数層の培養面を上下方向に間隔をあけて配置しているので、インキュベータ内の高さ方向のスペースを有効利用することができる。また、上下に配した各培養面を適正な面積に設定しても、積層数を増やすことにより培養面積を増大させることができ、細胞の増殖速度を高く維持しつつ、培養可能な検体量を増加させることができる。

上記発明においては、上方に配置された培養面に、上下方向に貫通する流通孔が設けられていることが好ましい。
このようにすることで、容器本体内に貯留した培地が流通孔を通して流通することができる。その結果、外部から供給される酸素や二酸化炭素が流通孔を介して下方の培養面において培養されている細胞にも供給され、細胞の健全な成長を図ることができる。また、流通孔を設けることにより、培養容器全体を振動させると、流通孔によって培養容器内部の培地の流れが乱されることになる。これにより、特に、トリプシン処理等の場合に容器内の薬液の濃度の均一化を図り、培養面からの細胞の剥離を促進することができる。

また、上記発明においては、容器本体の側壁に段部が設けられ、該段部に前記培養面を備えたプレートを載置してなることとしてもよい。段部にプレートを載置するだけで、上下方向に間隔をあけて複数層の培養面を構成できる。したがって、構造が極めて簡易であり、各培養面毎に観察したい場合には、各培養面を容易に分離することができる。

また、上記発明においては、前記容器本体が上方に開口する開口部を備え、前記プレートに、前記開口部から容器本体の底面まで直線的に到達可能にする切欠または貫通孔が設けられていることが好ましい。
このようにすることで、例えばピペットのような吸引手段を開口部から切欠または貫通孔を介して容器本体の底面まで挿入することが可能となり、容器本体内の底面近傍に貯留されていた培地あるいは、トリプシンのような薬液と細胞との細胞懸濁液をも開口部から吸引することが可能となる。

また、上記発明においては、前記切欠または貫通孔がプレートの縁部に設けられていることが好ましい。
このようにすると、例えば、培地交換の際に、培養容器を傾斜させて切欠または貫通孔を下側に配することにより、容器本体の底面に貯まった液体を縁部近傍に集めて、開口部側から残さず吸引することが可能となる。

本発明によれば、容器本体の内部に培養面を上下方向に複数層設けることにより、培養容器数を増加させることなく、培養面積を増大させることができる。また、培養面積を増大させるために、培養容器を上下方向に延ばすことにより、培養容器の底面積を増大させることなく、インキュベータの内部空間を有効利用することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る培養容器１について、図１から図４を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る培養容器１は、図１に示されるように、上部開口２を有する容器本体３と、該容器本体３に被せられることにより上部開口２を閉塞可能な蓋体４と、容器本体３内部に配置される２枚のプレート５，６とを備えている。

前記容器本体１は、図１および図３に示されるように、例えば、細胞の付着性の良好なポリスチレン等の材質により略直方体の箱状に形成され、その側壁に、全周にわたって２段の段部７，８を備えている。
本実施形態では、２段の段部７，８を有するものを例に挙げて説明しているが、段部は１段でも３段以上でもよい。
段部２，３は、底面３ａから上部開口２に向かって横断面積を段階的に広げるように形成されている。

前記プレート５，６は、各段部７，８に載置可能な大きさを有する略長方形状の平板であって、ポリスチレン等の材質からなる。プレート５，６には、上部開口２側の段部８の内側に形成されている開口３ｂを通過可能で、かつ、底面３ａ側の段部７に載置可能な大きさを有するプレート５と、上部開口２側の段部８に載置可能な大きさを有するプレート６とがある。各プレート５，６は、厚さ方向に貫通する複数の流通孔９を有している。これらの流通孔９は、プレート５，６のほぼ全面にわたって千鳥状に配列されている。

また、各プレート５，６の１つの角部には、切欠１０が設けられている。切欠１０は、図２に示されるように、２枚のプレート５，６の一致する位相位置に形成されている。これにより、２枚のプレート５，６をそれぞれの段部７，８に載置した状態で、切欠１０の位置が一致し、上部開口２から容器本体３の底面３ａが直視できるようになっている。上部開口２側の段部８に載置されるプレート６の切欠１０は、底面３ａ側の段部７に載置されるプレート５の切欠１０よりも若干大きく形成されている。

このように構成された本実施形態に係る培養容器１の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係る培養容器１により、細胞を培養するには、容器本体３内に、２枚のプレート５，６を挿入して、底面３ａ側の段部７と上部開口２側の段部８にそれぞれ載置する。これにより、容器本体３の内部には、底面３ａと、その上方にそれぞれ間隔をあけて配される２枚のプレート５，６の上面５ａ，６ａとにより、細胞を培養するための培養面が３層に構成されることになる。

この状態で、所定の培地Ａ内に間葉系幹細胞等の付着性の細胞（図示略）を混入した細胞懸濁液を容器本体３内に供給する。所定の培地Ａは、例えば、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified
Eagle Medium）またはＭＥＭ(Minimal
Essential Medium：最小必須培地)、ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum：ウシ胎児血清）、抗生剤を８４：１５：１の配合比率で混合したものである。なお、この配合比率は任意であり、また、ウシ胎児血清に代えてヒト血清を用いてもよい。
細胞懸濁液は、上部開口２側の段部８に載置されたプレート６が浸漬されるまで供給する。

この状態で、容器本体３の上部開口２を蓋体４で閉塞し、所定の時間にわたって静置し、インキュベータ（図示略）内において所定の培養条件下に配することにより、細胞懸濁液内の付着性の細胞が、容器本体３の底面３ａおよび２枚のプレート５，６の上面５ａ，６ａに付着して成長を開始する。
所定の培養条件は、例えば、温度３７±０．５℃、湿度１００％およびＣＯ_２濃度５％である。

この場合において、各プレート５，６には、厚さ方向に貫通する複数の流通孔９が設けられているので、図３に矢印で示されるように、培地Ａが流通孔９を通って上下に流通することができる。したがって、上部開口２から供給され、培地Ａ内に溶存している酸素や二酸化炭素、栄養分が、容器本体３の底面３ａ近傍まで流通させられる。
その結果、上部開口２側のプレート６上の細胞のみならず、底面３ａに付着している細胞にも十分な酸素、二酸化炭素、栄養分等が供給され、細胞の健全な成長が促進されることになる。

そして、細胞がある程度成長した段階で、培地Ａの交換が行われる際には、蓋体４が容器本体３から取り外されて、上部開口２が開かれ、先端にチップ１１を取り付けた電動ピペット（図示略）が上部開口２から容器本体３の培地Ａ内に挿入されて、培地Ａが吸引されることになる。容器本体３内の培地Ａは、培養工程の進行とともに栄養分や成長因子等の薬液成分の濃度が低下し、細胞から排出される老廃物が増加しているので、培地Ａ交換の際には、容器本体３内に残すことなく、全て排出する必要がある。

本実施形態に係る培養容器１によれば、２枚のプレート５，６のそれぞれに形成された切欠１０が、図２に示されるように、一致する位置に配置されているので、上部開口２側から容器本体３の底面３ａを直視できるようになっている。したがって、電動ピペットのチップ１１を切欠１０に挿入することにより、上部開口２側から容器本体３の底面３ａまでチップ１１の先端を挿入することができ、底面３ａ近傍に残る培地Ａを吸引することが可能となる。

特に、本実施形態によれば、プレート５，６の切欠１０が、容器本体３の角部３ｃに配置されるようになっている。したがって、図４に示されるように、容器本体３を傾斜させて、切欠１０が下側に配置されるようにすることにより、容器本体３の底面３ａの角部３ｃに貯まった培地Ａにチップ１１を接触させることができ、培地Ａを残らず吸引して排出することが可能となる。この場合に、上部開口２側のプレート６の切欠１０を底面３ａ側のプレート５の切欠１０より大きく形成しているので、図４に示されるように、容器本体３が傾斜させられても、プレート６の切欠１０の縁がチップ１１に干渉しないように配置され、培地Ａの排出作業を円滑に行うことができる。

そして、複数回の培地交換工程と培養工程とを繰り返すことにより、細胞が必要細胞数まで成長した後に、培養容器１の各培養面３ａ，５ａ，６ａから細胞を剥離して集める工程が行われる。この場合には、まず、上記のようにして、培養容器１内の培地Ａが全て吸引され排出される。次いで、水平に配置された容器本体３内にトリプシンのようなタンパク質分解酵素が供給される。トリプシンは、上部開口２側のプレート６が浸漬する程度まで供給される。そして、この状態で、容器本体３に水平方向に振動が加えられ、トリプシンが攪拌される。

このとき、攪拌によりトリプシンが容器本体３内において流動すると、各プレート５，６に設けられた流動孔９によりトリプシンの流れが乱される。これにより、トリプシンが効率よく攪拌され、細胞の剥離が促進されることになる。
そして、細胞が十分に剥離された後には、再度、チップ１１を取り付けた電動ピペットにより吸引される。この場合においても、上記の培地Ａ交換時と同様に、容器本体３内のトリプシン細胞懸濁液を残さず取り出すことができ、剥離された細胞を無駄なく回収することができる。

なお、本実施形態に係る培養容器１においては、容器本体３およびプレート５，６の材質として、細胞の付着性の良好なポリスチレンを採用したが、これに代えて、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、ポリエチレンのような他の任意の熱可塑性プラスチック、あるいは、ガラスを採用してもよい。また、容器本体３の底面３ａやプレート５，６の上面５ａ，６ａに温度応答性材料からなるコーティングを施してもよい。

また、プレート５，６に設けた円形の流通孔９を千鳥状に配置したが、これに限定されるものではなく、他の任意の形状や配列を採用してもよい。また、流通孔９の数や大きさに制限はない。
また、各プレート５，６の角部に切欠１０を設けたが、これに代えて、貫通孔（図示略）を設けることにしてもよい。この場合には、容器本体３を傾斜させたときに、鉛直上方からチップ１１を挿入可能とするように、鉛直上方から見て、容器本体３の底面３ａの角部が見通せる形状および位置に形成されていることが好ましい。

また、切欠１０を各プレート５，６の角部に形成したが、これに限定されるものではなく、容器本体３を傾斜させたときに、下側に配される位置であれば、各辺のような任意の縁部でよい。また、容器本体３の底面３ａの中程に凹みを設け、その凹みに培地Ａ等の液体が集められるようにする場合には、プレート５，６の中程に貫通孔を設けることにしてもよい。

また、容器本体３の側壁に全周にわたって段部７，８を設けることにしたが、これに代えて、図５に示されるように、容器本体３′の側壁近傍に部分的に突起１２を設けることにしてもよい。図５に示す例では、各突起１２は２段の段部７′，８′を備え、底面３ａ′側のプレート５′には、上側の段部８を通過させる切欠５ｃ′を設けることで、底面３ａ′側の段部に載置可能とし、上部開口２側のプレート６′にはその切欠５ｃ′を設けないことにより、上部開口２側の段部８に載置可能とすることができる。なお、容器本体３′の内部に突起１２を設けることに代えて、容器本体３′とは別体の上記突起１２と同形状のコマを容器本体３内に配置してもよい。

さらに、図６に示されるように、プレート１３として足１４付きのプレート１３を用意してもよい。このようにすることで、容器本体は単純な箱形とすることができるとともに、容器本体内に収容するプレート１３としても同一形状のものを複数用意すれば足りるので、コストを低減することができる。
この場合に、細胞の種類に応じて足の高さの異なる足１４付きのプレート１３を用意しておくことで、容器本体内における培養面の積層数を自由に設定することができると言う利点もある。

本発明の一実施形態に係る培養容器を示す分解斜視図である。 図１の培養容器の蓋体を外した状態の平面図である。 図１の培養容器の縦断面図である。 図１の培養容器における内部の液体の排出工程を説明する部分断面図である。 図１の培養容器の変形例を示す分解斜視図である。 図１の培養容器のプレートの変形例を示す斜視図である。

符号の説明

Ａ 培地
１ 培養容器
２ 上部開口（開口部）
３，３′ 容器本体
３ａ，３ａ′ 底面（培養面）
５，６；５′，６′ プレート
５ａ，６ａ 上面（培養面）
７，８；７′，８′ 段部
９ 流通孔
１０ 切欠

Claims (5)

1. 培地を貯留可能な容器本体内に、複数層の培養面を上下に間隔をあけて配置してなる培養容器。
2. 上方に配置された培養面に、上下方向に貫通する流通孔が設けられている請求項１に記載の培養容器。
3. 容器本体の側壁に段部が設けられ、該段部に前記培養面を備えたプレートを載置してなる請求項１または請求項２に記載の培養容器。
4. 前記容器本体が上方に開口する開口部を備え、
   前記プレートに、前記開口部から容器本体の底面まで直線的に到達可能にする切欠または貫通孔が設けられている請求項３に記載の培養容器。
5. 前記切欠または貫通孔が、前記プレートの縁部に形成されている請求項４に記載の培養容器。

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