KR102116741B1 - 설치류 유래의 지방 전구세포를 포함하는 3 차원 세포배양 구조체, 이를 이용한 3 차원 세포배양 방법, 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법 - Google Patents

설치류 유래의 지방 전구세포를 포함하는 3 차원 세포배양 구조체, 이를 이용한 3 차원 세포배양 방법, 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

알지네이트 하이드로겔 내의 지방 전구세포 및 마크로파지를 포함하는 3 차원 세포배양 구조체, 이를 이용한 3 차원 세포배양 방법, 및 상기 3 차원 세포배양 구조체를 이용한 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

설치류 유래의 지방 전구세포를 포함하는 3 차원 세포배양 구조체, 이를 이용한 3 차원 세포배양 방법, 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법{Scaffold for 3-dimensional cell culture containing rodent-derived preadipocyte, method for 3-dimensional cell culture using the same, and method for drug screening using the same}
본원은 알지네이트 하이드로겔 내의 설치류 유래 지방 전구세포(preadipocyte) 및 마크로파지를 포함하는 3 차원 세포배양 구조체, 이를 이용한 3 차원 세포배양 방법, 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다.
세포의 배양은 바이오 분야 연구에서 가장 기본이 되는 연구 방법으로서 생명체의 기능 연구뿐만 아니라 인체 질환을 연구하는 데에도 매우 광범위하게 이용되고 있다. 일반적인 진핵세포(eukaryotic cell)의 세포배양 방법이 개발 및 확립된지도 40 여년이 경과되었지만, 부착성 세포(adherent cell)의 성장을 지지하기 위해 현재까지 가장 흔히 사용되고 있는 방법은 폴리스티렌(polystyrene) 혹은 유리(glass)로 된 기질로 이루어진 2 차원 표면에서 세포를 배양하는 것이다. 그러나, 단층 세포배양 방법인 2 차원적 세포배양법에 의해 성장하는 세포는 세포외기질(extracellular matrix)에 부착되어 3 차원적 생체조직 환경에서 성장하는 세포와 많은 차이점을 나타낸다. 따라서, 2 차원적 및 3 차원적 세포배양은 전반적인 형태학적 차이를 나타내며, 또한 통상적인 2 차원적 세포배양을 통하여 일어나는 수용체의 발현, 유전자의 전사조절, 세포의 이동 및 세포자멸사(apoptosis) 등 많은 복잡한 생명 현상이 실제 생체 조직환경에서 일어나는 현상과 크게 다르기 때문에, 2 차원적 세포배양 방법은 3 차원 상에서 세포가 성장하는 생체의 생리적 환경을 정확히 반영할 수 없다는 문제점을 가지고 있다.
실제로, 비만, 당뇨, 동맥경화 등과 같은 대사성 질환(metabolic disease)의 치료제 개발 시에, 초기 시험관 내(in vitro) 실험에서는 우수한 약효를 보였던 약물들이 생체 내(in vivo) 동물 실험에서는 약효가 현저히 떨어지는 등 신약 개발에 많은 어려움이 따르고 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해서는, 치료제 개발의 초기 단계에서부터 약물의 정확한 효능 및 독성을 예측할 수 있는 생체 내 모델과 유사한 시험관 내 모델이 필요하다.
외부 약물에 대한 생체 내 조직에서의 반응 및 기능 연구를 위해 조직 공학 또는 생명 공학 분야에서는 3 차원 스캐폴드(scaffold)를 이용한 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 이러한 3 차원 인공 조직 스캐폴드에 의해 세포 분화 기전, 질병 치료제 개발, 및 조직 재생 등과 같은 연구들이 수행되고 있다. 예를 들어, 대한민국 공개특허 10-2016-0021352호는 3 차원 세포배양 시스템 및 이를 이용한 약물 스크리닝 시스템을 개시하고 있다. 그러나, 현재까지 개발된 3 차원 스캐폴드는 실제 조직이나 기관과 같이 세포와 세포간의 상호작용에 의해 구성되는 다양하고 복잡한 생체 내 구조를 모사할 수 없어 기술적인 한계가 존재하였다.
한국공개특허 제10-2016-0021352호
상기한 문제를 해결하고 대사성 질환 치료제 개발을 위한 신약 후보 물질을 빠르고 효율적으로 발굴하기 위해, 본원에서는 설치류 유래 세포들이 생체 내와 같은 3 차원 환경에서 배양되면서 세포간 상호작용을 통해 생체 지방조직과 유사한 기능을 나타내게 하는 3 차원 세포배양 구조체 및 이를 이용한 3 차원 세포배양 방법을 개발하고자 하였다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 제 1 측면은, 알지네이트 하이드로겔; 및 상기 알지네이트 하이드로겔 내에 포함된, 설치류 유래의 지방 전구세포 및 설치류 유래의 마크로파지를 포함하는 3 차원 세포배양 구조체를 제공할 수 있다.
본원의 제 2 측면은, (a) 설치류 유래의 지방 전구세포, 설치류 유래의 마크로파지, 및 알지네이트 용액의 혼합물을 준비하고; (b) 상기 혼합물을 겔화하여 지방 전구세포 및 마크로파지를 포함하는 알지네이트 하이드로겔을 제조하고; 그리고 (c) 상기 하이드로겔 내에서 상기 지방 전구세포 및 마크로파지를 배양하는 것을 포함하는 3 차원 세포배양 방법을 제공할 수 있다.
본원의 제 3 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 3 차원 세포배양 구조체를 지방세포 분화 배지 내에서 인큐베이션하여 상기 지방 전구세포를 지방세포로 분화시키고; 분화된 지방세포에 약물 후보물질을 처리하고; 그리고 상기 지방세포의 유전자 발현 및 단백질 발현 중 하나 이상을 분석하는 것을 포함하는 약물 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본 발명을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 구현예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 기재된 추가적인 구현예 및 실시예가 존재할 수 있다.
본원발명에 따라 설치류 유래 지방 전구세포와 마크로파지를 3 차원 세포배양 구조체 내에서 공동 배양하여 상기 지방 전구세포를 지방세포로 분화시킴으로써, 하이드로겔 스캐폴드 내에서 세포간 상호작용에 의해 정상적인 개체 또는 대사증후군을 가지는 개체의 생체 내 지방조직과 유사한 기능을 가지는 구조체를 형성하는 것이 가능하다. 대사증후군을 가지는 개체의 생체 내 지방조직과 유사한 기능을 가지는 지방조직 유사 구조체는 비만, 인슐린 저항성, 또는 제2형 당뇨병과 같은 대사성 질환을 가지는 생체 내 지방조직과 유사한 유전자 발현 및 단백질 활성을 나타낼 수 있으므로, 지방조직과 관련된 대사성 질환 치료를 위한 연구 및 신약개발에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 비드 형태 3 차원 세포배양 구조체 (도 1a) 및 격자 형태 3 차원 세포배양 구조체 (도 1b)의 사진 이미지이다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따라 제조된 3 차원 세포배양 구조체 내에서의 지방 전구세포의 지방세포로의 분화 과정을 2 차원 세포배양과 비교하여 보여주는 이미지이다.
도 3은 2 차원상 또는 3 차원상에서 배양 및 분화된 지방세포의 단백질 발현을 보여주는 이미지 (도 3a), 단백질 발현을 정량화한 그래프 (도 3b), 및 2 차원 및 3 차원 배양 시스템에 따른 지방세포 마커 단백질 발현을 비교한 개략도 (도 3c)이다.
도 4는 마크로파지의 농도에 따른 지방세포의 분화 효율을 보여주는 이미지이다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따라 배양 및 분화된 지방세포의 지방세포 및 글루코스 수용 연관 단백질 발현 분석 결과 이미지 (도 5a) 및 그래프 (도 5b)이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B" 의 기재는, "A, B, 또는, A 및 B" 를 의미한다.
이하, 본원의 3 차원 세포배양 구조체, 이를 이용한 3 차원 세포배양 방법, 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.
본원의 제 1 측면은, 알지네이트 하이드로겔; 및 상기 알지네이트 하이드로겔 내에 포함된, 설치류 유래의 지방 전구세포 및 설치류 유래의 마크로파지를 포함하는 3 차원 세포배양 구조체를 제공할 수 있다.
예를 들어, 상기 지방 전구세포 및/또는 마크로파지는 상기 3 차원 세포배양 구조체의 알지네이트 하이드로겔 내에서 증식 및/또는 분화될 수 있다.
본원발명에서 알지네이트 하이드로겔 스캐폴드는 지방 전구세포와 마크로파지의 공동 배양시 세포들이 분화 및 증식하고 세포간 상호작용에 의해 유사 지방조직이 형성되는 장소이다. 2 차원 평면 배지와 같이 일반적인 배지에서 세포를 배양하는 경우 세포 각각이 특정 부분에서만 세포간 상호작용을 하고, 증식 방향이 일방적이며, 분화 및 증식을 통해 세포 수가 증가되는 경우에도 세포간 상호작용을 할 수 있는 세포들이 한정적이다. 또한, 세포에서 분비되는 다양한 대사물질들이 축적되어 불균형한 농도 구배를 이루게 된다. 따라서, 2 차원 상의 시험관 내에서 세포를 배양하는 경우에는 생체 내와 같은 세포간 상호작용이 유도될 수 없으며, 생체 내와 유사한 구조체를 형성하기도 어렵다.
반면, 본원발명에 따른 하이드로겔 스캐폴드의 경우 지방 전구세포와 마크로파지가 입체적인 구조의 하이드로겔 스캐폴드에 포함된 상태로 지방 전구세포가 지방세포로 분화하기 때문에, 생체 내의 세포와 같이 주위 모든 방향으로 세포간 상호작용이 가능하고, 증식 방향이 일방적이지 않으며, 분화 및 증식을 통해 세포 수가 증가되는 경우에도 지속적으로 주위 세포들과 세포간 상호작용을 할 수 있다. 또한, 세포에서 분비되는 다양한 대사물질들이 특정 지역에 축적되는 것이 아니라 생체 내에서와 같이 주위 모든 방향으로 분비될 수 있어 불균일한 농도 구배를 방지할 수 있다. 이러한 특징에 의해, 지방 전구세포와 마크로파지의 공동 배양시 생체 내와 같은 세포간 상호작용을 유도하여 정상적인 체내 지방 조직과 같이 기능하는 유사 지방조직, 또는 마크로파지와의 공동 배양 조건 (예를 들어, 마크로파지의 비율)에 따라 대사성 질환을 가지는 개체의 지방 조직과 유사하게 기능하는 유사 지방조직을 형성할 수 있다.
본원발명에 따라 3 차원 세포배양 구조체 상에서 지방 전구세포와 마크로파지를 공동 배양하면, 2 차원 상에서 일반 배지에서 지방 전구세포 및/또는 지방세포를 배양한 경우와 비교하여 생체 내 지방 조직과 더욱 유사한 유전자 발현 및 단백질 활성을 나타낼 수 있다. 특히, 본원발명에 따르면 3 차원 세포배양 구조체 상에서 지방 전구세포와 마크로파지를 공동 배양함으로써, 정상적인 지방 조직 또는, 대사증후군 또는 대사성 질환을 가지는 개체의 지방 조직과 유사하게 기능하는 유사 지방조직을 유도하는 것이 가능하다. 2 차원 공동 배양, 예를 들어 트랜스웰 상에서의 지방 전구세포와 마크로파지 공동 배양의 경우 마크로파지의 증식이 제어되지 못하여 정상적인 공동 배양 및 지방 전구세포의 분화가 불가능하였다는 종래의 연구에 비추어 볼 때, 2 차원 공동배양에 의해서는 수행되기 어려운 지방 전구세포 및 마크로파지의 공동 배양 및 이에 따른 유사 지방조직의 형성이라는 본원발명의 효과는 지방조직과 관련된 대사성 질환 치료를 위한 연구 및 신약개발에 더욱 유용할 수 있다.
본원발명의 3 차원 세포배양 구조체 내의 지방 전구세포를 증식 및/또는 분화시키기 위해서는, 증식 및/또는 분화를 위한 배지를 하이드로겔 스캐폴드에 처리하여 하이드로겔 스캐폴드에 배지를 흡수시키고, 하이드로겔 스캐폴드에 흡수된 배지가 각 세포들에 작용하여야 한다. 이어서 배지 처리에 의해 하이드로겔 스캐폴드에 포함된 지방 전구세포가 증식 및/또는 분화하게 되고, 지방세포로 분화하는 지방 전구세포 및 지방세포 등이 마크로파지와의 세포간 상호작용에 의하여 정상 지방조직 또는 대사성 질환을 가지는 개체의 지방조직과 유사한 기능을 나타낼 수 있다.
본원발명의 세포배양 구조체 내의 마크로파지의 농도는, 지방 전구세포와의 공동 배양시 지방 전구세포 및 분화된 지방세포의 생존, 분화, 증식 및/또는 유사 지방조직 구조체 형성을 위해 조절될 수 있다. 마크로파지가 너무 적거나 또는 아예 존재하지 않는 경우 지방 전구세포가 대사증후군을 가지는 개체의 지방 조직과 유사하게 기능하는 유사 지방조직 구조체로 분화되기가 어렵고, 마크로파지가 지나치게 많을 경우에도 지방세포의 분화율이 감소하고, 지방세포 특이적 유전자 발현이 감소하며, 단백질 활성이 감소함으로써 대사증후군을 가지는 개체의 지방 조직과 유사하게 기능하는 유사 지방조직 구조체의 형성이 저하된다. 예를 들어, 마크로파지의 함량은 3 차원 세포배양 구조체 내의 지방 전구세포와 대비하여 약 2% 이하의 양으로 포함될 수 있으며, 약 1%의 양으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 마크로파지의 함량은 지방 전구세포에 비하여 약 0.1 내지 10%, 약 0.1 내지 5%, 약 0.1 내지 2%, 또는 약 0.1 내지 1%일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 마크로파지가 지방 전구세포에 비하여 약 2% 이하의 양으로 포함되는 경우, 특히 지방세포의 분화가 원활하게 이루어지며 인슐린 저항성이 증가하는 등 실제 대사증후군 또는 대사성 질환을 가지는 개체의 지방조직과 유사한 기능을 나타낼 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 설치류는 마우스, 래트, 기니피그 또는 햄스터를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 알지네이트 하이드로겔은 콜라겐, 젤라틴 및 알지네이트를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
상기 콜라겐, 젤라틴 및 알지네이트의 함량은 지방 전구세포를 지방세포로 분화시키고자 하는 목적에 맞게 통상의 기술자가 조절하여 사용할 수 있다.
본원에서 사용되는 하이드로겔은 크게 제한되지 않으나 조류(algae), 특히 갈조류로부터 유래된 것을 사용할 수 있다. 조류 유래의 하이드로겔을 사용하는 경우 알지네이트의 함량이 적합하지 않으면, 하이드로겔 스캐폴드내의 지방세포의 분화기간 및 이후의 실험 진행기간 동안 하이드로겔이 안정적으로 유지되지 못하고 용해될 수 있다. 알지네이트는 수용성 고분자 전해질로 염화칼슘과 같은 다원자가 양이온 염을 사용하여 가교결합을 이룰 수 있고, 조류 유래의 하이드로겔의 경우 알지네이트의 함량이 하이드로겔 스캐폴드 생성을 위한 지방세포, 마크로파지 및 하이드로겔 혼합물 대비 약 1 내지 10 %(w/v), 1 내지 8 %(w/v), 1 내지 6 %(w/v), 1 내지 3 %(w/v), 1 내지 3 %(w/v), 또는 1.5 내지 3 %(w/v)가 사용될 수 있다. 바람직한 알지네이트 함량보다 낮을 경우 세포배양 구조체의 용해도가 증가하며, 높을 시에는 세포들의 증식 및 생존율이 감소하게 된다. 예를 들어, 갈조류로부터 유래된 알지네이트의 함량이 1 %(w/v) 미만 포함되는 경우 지방세포의 생존 및 증식은 매우 활발할 수 있으나, 하이드로겔 스캐폴드에서 지방세포 및 마크로파지 공동 배양시 구조체의 형태가 오래 유지되지 않아 배양 및 연구의 적용에 어려움이 있을 수 있다. 따라서, 알지네이트 함량이 1.5 내지 3 %(w/v)일 때 하이드로겔 스캐폴드의 형태가 유사 지방조직 형성 시까지 충분히 유지될 수 있으며 지방세포의 생존 및 증식도 일정하게 유지될 수 있다. 예를 들어, 본원의 세포 구조체에 포함되는 알지네이트 하이드로겔은 젤라틴 및 콜라겐이 더 포함될 수 있으며, 젤라틴과 콜라겐의 함량은 하이드로겔 전체 함량 대비 각각 약 0.1 내지 5 %(w/v), 약 0.2 내지 2 %(w/v), 또는 약 0.5 %(w/v) 정도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 본원의 3 차원 세포배양 구조체는 세포 배양 배지 및/또는 세포 분화 배지 내에 존재할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 3 차원 세포배양 구조체가 세포 배양 배지 및/또는 세포 분화 배지 내에 존재하는 경우, 상기 배지가 하이드로겔을 통하여 지방 전구세포, 마크로파지 또는 상기 지방 전구세포로부터 분화되는 지방세포에 작용할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 세포 분화 배지는 지방세포 분화 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 지방세포 분화 배지는 본원발명이 속하는 기술 분야에서 지방 전구세포를 지방세포로 분화시키기 위해 필요로 하는 것으로 여겨지는 배지의 구성 성분 및/또는 인자(factor)를 포함할 수 있으며, 포함되는 성분 또는 인자의 종류 및/또는 농도는 통상의 기술자가 용이하게 조절할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 지방 전구세포는 상기 알지네이트 하이드로겔 내에 1 x 105 세포/mL 내지 1 x 107 세포/mL 포함되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 지방 전구세포는 상기 알지네이트 하이드로겔 내에 약 1.2 x 106 세포/mL 포함될 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 마크로파지는 상기 알지네이트 하이드로겔 내에 1 x 103 세포/mL 내지 1 x 105 세포/mL 포함되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 마크로파지는 상기 알지네이트 하이드로겔 내에 약 6 x 104 세포/mL 포함될 수 있다.
구체적으로는, 본원발명에서 하이드로겔 스캐폴드가 제조될 때 혼합되는 지방 전구세포의 수는 혼합물 또는 하이드로겔 스캐폴드의 디자인, 및 원하는 분화 또는 증식 속도 등에 따라 조절될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 하이드로겔과 혼합되는 세포 수가 많은 경우 배양 시간이 지날수록 증식률이 상승하게 되므로, 하이드로겔과 혼합되는 지방 전구세포의 수는 1 x 105 세포/ml 이상인 것이 바람직하나 이에 제한되지 않을 수 있다. 지방 전구세포의 수가 1 x 105 세포/ml 미만일 경우에는 증식이 원활하게 이루어지지 않을 수 있다.
본원의 제 2 측면은, (a) 설치류 유래의 지방 전구세포, 설치류 유래의 마크로파지, 및 알지네이트 용액의 혼합물을 준비하고; (b) 상기 혼합물을 겔화하여 지방 전구세포 및 마크로파지를 포함하는 알지네이트 하이드로겔을 제조하고; 그리고 (c) 상기 하이드로겔 내에서 상기 지방 전구세포 및 마크로파지를 배양하는 것을 포함하는 3 차원 세포배양 방법을 제공할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 설치류는 마우스, 래트, 기니피그 또는 햄스터를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 본원의 3 차원 세포배양 방법은 상기 하이드로겔 내에서 상기 지방 전구세포를 지방세포로 분화시키는 것을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 분화된 지방세포는 CEBPα, PPARγ, 포스포-AKT(phosphor-AKT), FABP4, FAS, ACC 및 GLUT4로 구성되는 군에서 선택되는 마커를 발현하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 분화된 지방세포는 상기 마커들 외에도 설치류 유래 지방세포가 정상적으로 발현하는 것으로 알려진 다른 마커들을 발현할 수 있고, 설치류 유래 지방세포가 정상적이라면 발현하지 않는 것으로 알려진 다른 마커들을 발현하지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 분화된 지방세포가 정상적인 유사 지방조직 또는 대사증후군을 가지는 개체의 지방 조직과 유사하게 기능하는 유사 지방조직을 형성할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 유사 지방조직은 정상적인 개체 또는 대사증후군을 가지는 개체 내의 지방 조직과 유사한 형태 및/또는 기능 및/또는 유전자 발현 및/또는 단백질 발현을 보이는 것일 수 있으며, 따라서 외부 약물에 대한 반응 역시 생체 내와 유사할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 알지네이트 용액은 콜라겐, 젤라틴 및 알지네이트를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 지방 전구세포는 상기 혼합물 내에 1 x 105 세포/mL 내지 1 x 107 세포/mL 포함되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 지방 전구세포는 상기 혼합물 내에 약 1.2 x 106 세포/mL 포함될 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 마크로파지는 상기 혼합물 내에 1 x 103 세포/mL 내지 1 x 105 세포/mL 포함되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 마크로파지는 상기 혼합물 내에 약 6 x 104 세포/mL 포함될 수 있다.
예를 들어, 본원발명에서 세포 및 알지네이트 용약을 겔화하여 알지네이트 하이드로겔 스캐폴드를 형성하는 것은, 디스펜서를 구비한 3 차원 세포-프린팅 시스템을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 3 차원 세포-프린팅 시스템(3D cell-printing system)은 입체구조의 하이드로겔 스캐폴드를 생성하기 위해 사용되는 시스템이다. 상기 시스템은 3 차원 세포-프린팅을 위해 x-y-z 스테이지(stage), 디스펜서, 실린지 노즐(syringe nozzle), 압축 컨트롤러 및 컴퓨터 시스템을 구비할 수 있다. 예를 들어, 하이드로겔 스캐폴드의 구조 및 구성은 혼합물에 포함된 성분 및 농도, 프로그램을 통한 디자인, 세포-플로팅 시 압력 및/또는 속도에 의해 적절하게 형성될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 세포 공동 배양을 위한 하이드로겔 스캐폴드의 형태는, 예를 들어 비드(bead) 혹은 격자(grid) 모양일 수 있으나, 이러한 모양에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 혼합물을 겔화하는 것은 상기 혼합물을 비드 형태로 적하(dropping)하는 것에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 혼합물을 겔화하는 것은 3 차원 세포-프린팅 시스템을 이용하여 수행되거나, 또는 실린지를 이용하여 액체 상태의 혼합물을 식염수 또는 버퍼와 같은 용매 내로 적하하는 것에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 용매는 염화칼슘 수용액일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 3 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 3 차원 세포배양 구조체를 지방세포 분화 배지 내에서 인큐베이션하여 상기 지방 전구세포를 지방세포로 분화시키고; 분화된 지방세포에 약물 후보물질을 처리하고; 그리고 상기 지방세포의 유전자 발현 및 단백질 발현 중 하나 이상을 분석하는 것을 포함하는 약물 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 본원의 약물 스크리닝 방법은 상기 약물 후보물질을 처리하기 전후의 상기 지방세포의 유전자 발현 및 단백질 발현 중 하나 이상을 상호 비교하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 유전자 발현 및/또는 단백질 발현의 비교는, 본원발명이 속하는 기술 분야에서 널리 알려진 유전자 발현 분석 방법 및/또는 단백질 발현 분석 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 본원의 약물 스크리닝 방법은 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약물 탐색을 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 대사성 질환이 비만, 인슐린 저항성, 또는 제2형 당뇨병일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[실시예]
설치류 유래 지방전구세포 및 마크로파지의 배양 및 준비
설치류 유래의 지방전구세포 (C57BL/6 종 마우스 유래, #C57-6269, Cell biologics, USA) 및 마우스 유래 마크로파지인 RAW264.7 (#TIB-71, ATCC)를 준비하고, 준비된 세포들을 인간 지방세포 유래 ADMSC (adipose-derived mesenchymal stem cell) 성장 보조제 (CEFO BIO, KOR) 10% 및 100 ㎍/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Invitrogen)의 혼합물 1%를 포함하는, 인간 지방세포 유래 MSC 성장 배지 (Human ADMSC Growth Medium, CEFO BIO)를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건의 배양용 인큐베이터에서 배양하였다. 배양 후 세포를 DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, Gibco)으로 세척하고, 0.2% 트립신-EDTA (trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid, Invitrogen) 2 ㎖을 배지에 첨가하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 1 분 동안 배양하였다. 이어서, 1,500 rpm에서 2 분간 세포 현탁액(suspension)을 원심분리하고 세포 펠렛(pellet)을 수득하여 실험에 이용하였다.
하이드로겔 3 차원 배양구조체 제작을 위한 지방전구세포, 마크로파지 및 알지네이트 하이드로겔 혼합물의 제조
젤라틴 500 ㎕ (Sigma-Aldrich), 콜라겐 500 ㎕ (Sigma-Aldrich), 1.2 x 106 세포/mL의 지방전구세포 및 6 x 104 세포/mL의 마크로파지 (5%)를 균일하게 혼합한 후에, 인간 ADMSC 성장 배지를 첨가하여 최종 부피 5 ml를 맞추었다. 혼합물에 100 mg 내지 150 mg 알긴산 나트륨 (Sigma-Aldrich)을 첨가하고 신속하게 교반한 후, 3 차원 스캐폴드 제작을 위해 10 cc 사이즈의 디스펜서 (Nordson)로 옮겼다. 원활한 세포-프린팅을 위하여 1000 rpm 으로 10 초간 원심분리 하였다.
상기 하이드로겔 혼합물을 3 차원 세포-프린팅 시스템(3D cell-printing system)에 장착하여 격자 혹은 비드 형태로 제작하였다. 제작된 하이드로겔 스캐폴드는 1% 내지 5%의 염화칼슘 수용액을 사용하여 경화하였다. 도 1a는 비드 형태로 제조된 하이드로겔 스캐폴드이며, 도 1b는 격자 형태로 제조된 하이드로겔 스캐폴드이다 (가로, 세로 및 높이는 각각 2cm x 2 cm x 2 mm). 제조된 하이드로겔 스캐폴드는 100 ㎍/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Invitrogen), 그리고 인간 ADMSC 성장 보충제 (CEFO BIO) 10%를 포함한 인간 ADMSC 성장 배지에서 1 일 동안 증식 및 세포들의 안정화를 유도하였으며, 이후 실험 목적에 맞게 사용되었다.
2 차원 세포배양 실험군의 경우 2.5 x 104 세포/cm2의 지방전구세포를 폴리스티렌(polystyrene) 6-웰 세포배양 플라스크 상에 균일하게 배양하여 실험에 사용하였다. 100 ㎍/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Invitrogen), 그리고 인간 ADMSC 성장 보충제 (CEFO BIO) 10%를 포함한 인간 ADMSC 성장 배지에서 1 일 동안 증식 및 세포들의 안정화를 유도하였으며, 이후 실험 목적에 맞게 사용되었다.
하이드로겔 스캐폴드 속 지방 전구세포의 지방세포로의 분화
하이드로겔 스캐폴드 또는 2 차원 배양 세포를 10 ㎍/㎖ 인슐린, 0.5 mM 아이소부틸메틸잔틴(3-isobutyl-1-methylxanthine), 1 μM 덱사메타손(dexamethasone), 200 μM 인도메타신(indomethacin) 및 ADMSC 성장 보충제 10%가 포함된 분화 유도 배지를 이용하여 2 일에서 8 일 동안 지방세포로의 분화를 유도하였다. 배양 배지는 최대 2일에 한 번씩 교체하였다.
세포 내 지방 입자 특이적 착색법
지방 전구세포가 지방세포로 분화 유도된 하이드로겔 스캐폴드를 사용하여, 성숙된 지방세포의 지방 입자를 BODIPY (boron-dipyrromethene)(BODIPY 493/503, Invitrogen)로, 그리고 세포핵을 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)(DAPI 658/461, Life technologies)로 착색시켰다. 착색이 완료된 후 PBS로 2 회 세척하고, 이후 착색된 지방 입자를 형광현미경을 이용해 확인하였다 (도 2의 중단(B - 비드 형태 하이드로겔 스캐폴드) 및 하단(C 격자 형태 하이드로겔 스캐폴드), 및 도 4의 하단(B)). 2 차원 배양세포의 경우 동일한 배양기간 동안 오일 레드 오 (Oil Red O, Sigma)로 성숙된 지방을 착색시키고, 헤마토실린 (Hematoxylin, Sigma)으로 세포핵을 착색시켜 지방 입자의 생성을 확인하였다(도 2의 상단(A)).
지방세포 특이적 단백질 활성 및 발현 분석법
3 차원 및 2 차원 세포배양 환경에서 분화가 유도된 세포 배양과, 배양 기간에 따른 지방세포 분화 정도를 분석하기 위해, 웨스턴 블랏(Western blot)을 통하여 지방세포 특이적 단백질 발현 비교 분석을 수행하였다 (도 3a 및 5a). 실험 목적에 맞게 지방세포로 분화 유도된, 혹은 지방전구세포 단계의 세포에서 전체 단백질을 추출하여 정량 하였다. 이후 동일한 양의 단백질을 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법 (polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)을 통하여 단백질의 크기에 따라 분리하였다. 폴리아크릴아마이드 겔 내에서 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인 (membrane)으로 옮긴 후, 특정 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 사용하여 단백질의 활성 및 발현을 분석하였다. 이후, 이미지 J(Image J) 소프트웨어 프로그램을 사용하여 활성 및 발현된 단백질의 양을 측정한 후 정규화(normalization)된 양을 그래프로 나타내었다(도 3b).
글루코스 수용 평가
6 일의 분화 유도 후, 마크로파지와 공동 배양된 하이드로겔 스캐폴드와 지방세포 단독 배양된 스캐폴드를 사용하여 글루코스 수용 평가 시험 키트(abcam®, UK)를 이용한 글루코스 수용 평가(Glucose uptake assay)를 실시하였다 (도 5b). 글루코스 수용에 의하여 세포 내에 형성된 2-데옥시-D-포도당-6-인산염(2-deoxy-D-glucose-6-phosphate)의 양을 전체 단백질 양으로 정규화(normalization)하여 그래프로 나타내었다.
하이드로겔 3 차원 배양구조체의 제조 및 하이드로겔 스캐폴드 내 지방세포의 분화
2% 내지 3%의 알지네이트를 포함하는 하이드로겔 비드의 경우, 직경 6.036±0.55 mm의 크기로 제작되었으며 무게는 약 49.30±4.74 mg으로 측정되었다 (도 1a). 총 10개의 하이드로겔 비드를 무작위로 추첨하여 크기 및 무게를 측정하여 평균과 표준편차 값을 계산하였으며, 그 결과 본 실시예의 방법에 따라 하이드로겔 비드를 매우 균일한 크기 및 무게로 제작할 수 있다는 것이 확인되었다. 또한, 3 차원 세포-프린팅 시스템(3D cell-printing system)을 사용하여 제작한 격자무늬 스캐폴드의 경우 가로(cm) x 세로(cm) x 높이(mm)를 2.0 x 2.0 x 2t의 조건으로 균일하게 제작하였다 (도 1b).
이후, 2 차원 세포배양 및 하이드로겔 스캐폴드를 이용한 3 차원 세포배양법을 사용하여 설치류 지방전구세포의 지방세포로의 분화를 유도하고 지방세포 분화 효율을 비교한 결과를 도 2 (현미경 이미지), 도 3a (정성적 분석) 및 도 3b (정량적 분석)에 나타내었다 (3 반복 실험). 도 3c는 2 차원 및 3 차원 배양 세포에서의 지방세포 특이적 전사인자 및 단백질의 발현 시점을 비교하여 나타낸 개략도이다.
3 차원 세포배양의 경우 배양 2 일차부터 BODIPY에 의해 녹색 형광으로 착색된 지방 입자를 확인 할 수 있었고, 분화 유도 기간에 비례하여 세포 내 지방 입자의 크기와 분포가 넓어지는 것을 확인하였다 (도 2의 중단(B) 및 하단(C)). 2 차원 세포배양의 경우 배양 4 일차부터 오일 레드 오(Oil Red O)에 의해 착색된 붉은 지방 입자를 확인 할 수 있었으며, 이는 분화 유도 기간에 비례하여 증가하였다 (도 2의 상단(A)). 이러한 지방 입자 착색법을 통하여 2 차원 환경에 비해 3 차원 환경에서 분화 유도된 세포들의 분화 속도 및 효율이 높아지는 것을 확인하였다. 이후, 웨스턴 블랏(western blot)을 통해 지방세포 특이적 단백질 활성 및 발현을 분석한 결과, 지방전구세포에서 성숙한 지방세포로 분화를 유도하는 주요 전사인자인 CEBPα, PPARγ 및 포스포-AKT(phospho-AKT), 그리고 세포 내 지방 입자 생성 및 축적에 관여하는 단백질인 FABP4, FAS, ACC 및 GLUT4의 발현 양이, 2 차원 배양된 세포에 비하여 3 차원적으로 하이드로겔 스캐폴드 상에서 배양된 세포에서 증가한 것으로 나타났다. 즉, 3 차원 하이드로겔 스케폴드 내에서 지방 전구세포를 분화시키는 경우 지방세포 특이적 단백질의 활성 시기가 앞당겨지는 것으로 확인되었으며 발현량 또한 유의성 있게 증가한 것이 확인되었다 (도 3a 내지 3c). 도 3b의 경우, 분화 기간에 따른 지방세포 마커의 발현량을 2 차원 배양 세포와 비교하여 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 평균±표준편차(S.D) 값으로 나타내었다.
지방 전구세포 및 마크로파지의 공동 배양에 의한 유사 지방조직 구조체 형성 확인
공동 배양되는 마크로파지의 농도에 따른 지방세포로의 분화 정도를 BODIPY를 사용한 지방 입자 착색법으로 확인하였다. 하이드로겔 스캐폴드 내에서 1% 내지 10%의 마크로파지와 지방 전구세포를 공동 배양하여 분화를 유도한 결과, 공동 배양된 지방 전구세포의 지방세포로의 분화가 유도되었으나, 10%의 마크로파지와 공동 배양한 경우 지방 입자의 생성이 비교적 감소되는 것을 확인하였다. 2 차원 세포 배양법의 경우, 트랜스웰 챔버(transwell chamber)를 사용하여 마크로파지와 지방전구세포의 공동 배양을 실시하였으나, 계속하여 성장하는 마크로파지에 의해 공동 배양시 지방 전구세포에 세포독성을 유발하는 것이 확인되었다 (도 4의 상단(A)).
또한 하이드로겔 스캐폴드 세포배양 방식으로 마크로파지와 지방 전구세포를 공동 배양하여 2 일 및 6 일동안 지방세포로의 분화를 유도한 후, 공동 배양되는 마크로파지의 농도에 따른 지방세포 특이적 발현 단백질의 발현 정도를 웨스턴 블랏(western blot)을 통하여 확인하였다. 그 결과, 마크로파지의 농도가 증가함에 따라 지방세포의 주요 전사인자인 PPARγ 및 포스포-AKT의 활성, 그리고 지방세포의 성숙 및 세포 내 지방 축적에 관련된 단백질인 FABP4, ACC, FAS 및 GLUT4의 발현이 감소되는 것을 확인하였다. 특히, 마크로파지를 5% 이상의 양으로 공동 배양시 글루코스 수용에 연관된 AKT의 인산화 및 GLUT4의 발현량이 감소되는 것을 확인할 수 있었다 (도 5a).
마크로파지와의 공동 배양에 의하여 유도된 지방세포의 인슐린 저항성을 규명하기 위하여, 6 일의 분화 유도 후, 마크로파지와 공동 배양된 하이드로겔 스캐폴드와 지방세포가 단독 배양된 스캐폴드를 사용하여 글루코스 수용 평가 시험 키트(abcam®, UK)를 이용한 글루코스 수용 평가(glucose uptake assay)를 실시하였다(도 5b). 도 5b는 총 3 회의 반복실험의 결과값을 일원분산분석 및 평균±표준편차(S.D) 값을 토대로 하여 지방전구세포와 비교분석한 결과를 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001의 값으로, 인슐린이 처리되지 않은 지방세포와 비교분석한 결과를 ##P<0.01의 값으로, 그리고 인슐린이 처리된 지방세포와 비교분석한 결과를 +P<0.05, ++P<0.01의 값으로 나타내었다. 그 결과, 지방세포만 단독배양한 스캐폴드에 비해 마크로파지와 공동 배양한 스캐폴드에서 고농도의 인슐린 (100 ㎍/ml) 공급에도 불구하고 글루코스 수용이 유의적으로 감소하였으며, 이로부터 실제 생체 내 비만조직에서 대사성 증후군을 발생시키는 주요 원인인 인슐린 저항성이 3 차원 하이드로겔 스캐폴드 상에서의 지방세포와 마크로파지의 공동 배양을 통해 유도된 것을 확인하였다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (13)

  1. 콜라겐, 젤라틴, 알지네이트, 설치류 유래의 지방 전구세포 및 설치류 유래의 마크로파지를 모두 포함하는 3 차원 세포배양 구조체로서,
    상기 알지네이트는 상기 콜라겐, 젤라틴, 설치류 유래의 지방 전구세포 및 설치류 유래의 마크로파지의 혼합물 대비 1.5 내지 2%(w/v)로 포함되고,
    상기 마크로파지는 상기 지방 전구세포에 비해 1 내지 2%의 비율로 존재하며,
    상기 지방 전구세포는 1 × 105 세포/㎖ 내지 1 × 107 세포/㎖ 로 포함되는 것인,
    인슐린 저항성이 유도된 유사 지방조직 형성용 입체적인 구조의 3 차원 세포배양 구조체.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 3차원 세포배양 구조체는 세포 배양 배지를 포함하는 것인, 3 차원 세포배양 구조체.
  4. (a) 젤라틴, 콜라겐, 설치류 유래의 지방 전구세포 및 설치류 유래의 마크로파지를 균일하게 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)의 혼합물에 인간 ADMSC 성장 배지 및 알지네이트를 첨가한 후 교반하여 하이드로겔 혼합물을 제조하는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)의 하이드로겔 혼합물을 비드(bead) 또는 격자(grid) 형태의 하이드로겔 스캐폴드로 제조하는 단계;
    (d) 상기 단계 (c)의 하이드로겔 스캐폴드를 경화한 후 안정화 하는 단계; 및
    (e) 상기 단계 (d)의 안정화된 하이드로겔 스캐폴드를 배양하여 이에 포함된 설치류 유래의 지방 전구세포를 지방세포로 분화시키는 단계;
    를 포함하는 3 차원 세포배양 방법으로서,
    상기 단계 (a)의 지방 전구세포는 혼합물에 1 × 105 세포/㎖ 내지 1 × 107 세포/㎖ 로 포함되고, 상기 마크로파지는 상기 지방 전구세포에 비해 1 내지 2%의 비율로 포함되며,
    상기 단계 (b)의 알지네이트는 혼합물 대비 1.5 내지 2%(w/v)로 첨가되는 것을 특징으로 하는,
    인슐린 저항성이 유도된 유사 지방조직 형성용 입체적인 구조의 3 차원 세포배양 방법.
  5. 삭제
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 단계 (e)의 분화된 지방세포는 CEBPα, PPARγ, 포스포-AKT(phospho-AKT), FABP4, FAS, ACC 및 GLUT4로 구성되는 군에서 선택되는 마커를 발현하는 것인, 3 차원 세포배양 방법.
  7. 제 4 항에 있어서,
    상기 단계 (e)의 분화된 지방세포가 유사 지방조직을 형성하는 것인, 3 차원 세포배양 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제 1 항 또는 제 3 항 에 따른 입체적인 구조의 3 차원 세포배양 구조체를 지방세포 분화 배지 내에서 인큐베이션하여 상기 지방 전구세포를 지방세포로 분화시키고;
    분화된 지방세포에 약물 후보물질을 처리하고; 그리고
    상기 지방세포의 유전자 발현 및 단백질 발현 중 하나 이상을 분석하는 것을 포함하는,
    약물 스크리닝 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 약물 후보물질을 처리하기 전후의 상기 지방세포의 유전자 발현 및 단백질 발현 중 하나 이상을 상호 비교하는 것을 포함하는, 약물 스크리닝 방법.
  12. 제 10 항에 있어서,
    대사성 질환의 예방 또는 치료용 약물 탐색을 위한, 약물 스크리닝 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 대사성 질환이 비만, 인슐린 저항성, 또는 제2형 당뇨병인, 약물 스크리닝 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Biomaterials.,31:5976-5985(2010.8.)*
Int. J. Mol. Sci.,7:1-26(2016.6.30.)*
Integr Biol.,4(3):318-327(2012.2.2.)
Microarrays(Basel).,4(2):133-161(2015.3.24.)
Mol Endocrinol.,23(1):11-24(2008.10.22)
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