WO2012153813A1 - 血管内皮細胞を含む三次元皮膚モデル - Google Patents

血管内皮細胞を含む三次元皮膚モデル Download PDF

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    • C12N2502/28—Vascular endothelial cells

Definitions

  • the present invention relates to a three-dimensional skin model into which vascular endothelial cells are introduced and a method for producing the same.
  • Keratinocytes and fibroblasts are the main constituent cells of the epidermis and dermis, respectively.
  • actual skin has a complicated structure, and it cannot be said that the conventional three-dimensional skin model including only keratinocytes and fibroblasts reflects the actual structure of skin tissue.
  • the present invention provides a three-dimensional skin model having a configuration close to that of human skin and capable of interacting with each cell, and a method for producing the same, in order to evaluate the effects of candidate drugs such as cosmetics in vitro.
  • the task is to do.
  • the dermis is mainly composed of cell components such as fibroblasts and interstitial components such as collagen fibers such as type I collagen, and capillaries and nerves are stretched throughout the dermis. Since blood vessels play a major role in maintaining skin homeostasis, conventional skin models that contain only keratinocytes and fibroblasts as constituent cells cannot reproduce the effects of the presence of blood vessels.
  • this application includes the following inventions: [1] A three-dimensional skin model including vascular endothelial cells, fibroblasts and keratinocytes, wherein fibroblasts and keratinocytes are laminated on the first support in order from the bottom, and the first support A three-dimensional skin model in which vascular endothelial cells incorporated in a second support are disposed on the bottom surface of [2] The three-dimensional skin model according to [1], wherein cells other than vascular endothelial cells, fibroblasts, and keratinocytes are arranged on the bottom surface of the vascular endothelial cells incorporated in the second support; [3] The three-dimensional skin model according to [2], wherein the cells arranged on the bottom surface of the vascular endothelial cell are adipocytes; [4] The three-dimensional skin model according to any one of [1] to [3], wherein the first and second supports are gels containing collagen; [5] The three-dimensional skin model according to [1]
  • VEGF and thrombospondin released from epidermal cells upon external stimulation are known to promote angiogenesis (DetmaaretM, J Dermatol Sci. 2000, S78-S84).
  • angiogenesis has been reported to be associated with the onset of psoriasis, one of the skin diseases (Heidenreich et al, Int. J. Exp. Pathol, 2000, 90 (3): 232 -248).
  • blood vessels are correlated with the skin.
  • vascular endothelial cells in a conventional three-dimensional skin model containing only keratinocytes and fibroblasts, a three-dimensional skin model having a structure closer to the skin can be obtained.
  • keratinocytes and fibroblasts interact with vascular endothelial cells.
  • the differentiation / activation marker of endothelial cells changes, and the skin It became clear that interaction was seen.
  • Such activation of endothelial cells is further enhanced when the epidermis / dermis model is stimulated. Therefore, according to this experimental system, it is possible to find a drug for preventing a reaction that causes angiogenesis by skin stimulation in vitro without performing animal experiments.
  • Vascular endothelial cells are involved in angiogenesis in the skin and are known to be able to form a lumen simulating blood vessels in a matrix such as collagen alone in vitro.
  • vascular endothelial cells are involved in angiogenesis in the skin and are known to be able to form a lumen simulating blood vessels in a matrix such as collagen alone in vitro.
  • lumen formation is promoted by combining vascular endothelial cells with the epidermis / dermis model. This indicates that the three-dimensional skin model of the present invention more faithfully reflects the phenomenon that blood vessels are born in the skin.
  • a three-dimensional skin model closer to the actual human skin configuration in which the constituent cells interact with each other can be obtained. can get.
  • the three-dimensional skin model it becomes possible to evaluate the efficacy or toxicity of a drug in vitro without relying on animal experiments.
  • FIG. 1 is a diagram showing activation of vascular endothelial cells by immunostaining for ICAM-1.
  • FIG. 2 is a diagram showing the differentiation and activation of vascular endothelial cells by gene expression analysis of Toll-like receptor 2 (TLR-2).
  • TLR-2 Toll-like receptor 2
  • Epidermis / dermis model The three-dimensional skin model produced according to the present invention includes vascular endothelial cells in addition to the conventional epidermis / dermis model imitating the epidermis / dermis, that is, keratinocytes and fibroblasts.
  • the term “epidermis / dermis model” means, for convenience, a structure in which fibroblasts are laminated on a first support such as a collagen gel and keratinocytes are laminated on the fibroblasts.
  • Such epidermis / dermis models are known to those skilled in the art (for example, AmanomanS. Et al., Exp. Cell Res., Vol.271, pp.249-262, 2001 (above) , Matrix. Biol., Vol.17, pp.603-613, 1998 (see above)).
  • a mixture of fibroblasts mixed with a support on an insert mesh is seeded. After that, keratinocytes may be seeded thereon, cultured, and exposed to air.
  • the support used to create the epidermis / dermis model may be a gel containing collagen alone or a gel containing collagen and chitosan. As described in the previous report (Black AF et al., Tissue Engineering, Vol. 11, 11, 723-733, 2005), it is preferable to use a gel containing collagen and chitosan from the viewpoint of basement membrane structure and dermal fiber formation.
  • first support a gel containing collagen alone or a gel containing collagen and chitosan from the viewpoint of basement membrane structure and dermal fiber formation.
  • an epidermis / dermis model having a uniform shape in which the gel is not shrunk it is possible to prevent variation among lots when a plurality of similar three-dimensional skin models are created.
  • the epidermis / dermis model contains, for example, fibroblasts in an amount of 1 ⁇ 10 4 to 10 8 cells / cm 2 , preferably 0.1 to 10 ⁇ 10 5 cells / cm 2 , and keratinocytes 1 ⁇ 10 2 to It may be contained in an amount of 10 6 pieces / cm 2 , preferably 1.0 to 10 ⁇ 10 4 pieces / cm 2 , more preferably about 4 to 8 ⁇ 10 4 pieces / cm 2 .
  • the epidermis / dermis model is commercially available and is not particularly limited.
  • a cell culture insert such as TESTSKIN (registered trademark) (TOYOBO) can be used.
  • Cells constituting the epidermis / dermis model are cultured in a cell culture insert, and other cells, particularly vascular endothelial cells, are cultured in a state separated from the cells of the epidermis / dermis model via the insert membrane.
  • the epidermis / dermis model is cultured at about 37 ° C. using, for example, a culture solution used for normal keratinocyte culture, such as KG medium, Epilife KG2 (Kurabo), Humedia-KG2 (Kurabo), assay medium (TOYOBO), etc. Can be carried out over 0-14 days.
  • a culture solution used for normal keratinocyte culture such as KG medium, Epilife KG2 (Kurabo), Humedia-KG2 (Kurabo), assay medium (TOYOBO), etc.
  • a culture solution used for normal keratinocyte culture such as KG medium, Epilife KG2 (Kurabo), Humedia-KG2 (Kurabo), assay medium (TOYOBO), etc.
  • a DMEM medium GAA
  • a medium in which 2-0-aD-glucopyranosyl-L-ascorbic acid-containing KGM and DMEM are mixed 1 1 can be used.
  • the medium may be removed when
  • Fibroblasts and keratinocytes may be homologous or heterologous and may be derived from any mammal.
  • the cells constituting the epidermis / dermis model may be those subjected to ultraviolet rays, drugs, or genetic modification.
  • the keratinocytes are preferably derived from humans, although not limited thereto, from the viewpoint of bringing the properties of the three-dimensional skin model closer to that of human skin.
  • the ratio of fibroblasts to keratinocytes to be used is not particularly limited.
  • keratinocytes 4 to 8 ⁇ 10 4 to 6 cells, fibroblasts 1 ⁇ 10 5 to 7 cells, preferably keratinocytes 4 Fibroblasts can be 1 ⁇ 10 6 cells to ⁇ 8 ⁇ 10 5 cells.
  • Vascular Endothelial Cells are placed on the bottom of the epidermis / dermis model.
  • the vascular endothelial cells used in the present invention are derived from, for example, a human umbilical cord, and are used in an amount of 100 to 10,000 per ml, but are not limited thereto, and may be derived from the aorta. . Further, the present invention is not limited to humans, and other mammalian vascular endothelial cells may be used.
  • the vascular endothelial cells used in the present invention are progenitor cells, they may be cultured and differentiated and / or proliferated to a desired degree before being combined with the epidermis / dermis model.
  • the vascular endothelial cells used when adhering to the epidermis / dermis model may be in a steady state or stimulated by drugs or genetic modification.
  • the vascular endothelial cells are incorporated in the second support, they are arranged on the bottom surface of the epidermis / dermis model, that is, on the bottom surface of the first support.
  • the three-dimensional skin model of the present invention has a structure closer to the dermal tissue.
  • the presence of the second support is advantageous for adhesion to the first support.
  • the second support may be the same as or different from the first support, and a collagen-only gel, a gel containing collagen and chitosan, or the like can be used as the second support.
  • the gel is in solution so that it can be mixed with the cells before incorporating the vascular endothelial cells.
  • collagen When collagen is used as the second support, it is preferably type I collagen, and the final concentration of the collagen solution before gelation is preferably about 0.1% by weight.
  • the concentration of the support may be higher than the concentration at which it is solidified and within a concentration range in which the cells can survive.
  • a solvent for dissolving collagen a solvent recognized by those skilled in the art as being usable for the dissolution, for example, a general weakly acidic aqueous solution can be used, and examples thereof include dilute hydrochloric acid.
  • a medium for vascular endothelial cells is preferably included in the second support.
  • a medium concentrated according to the amount of the support solution to be used is used.
  • the amount of the support solution is not limited, but is 100 ⁇ L to 400 ⁇ L per square centimeter.
  • the epidermis / dermis model is formed on a specific permeable membrane such as a culture insert, a method for placing vascular endothelial cells on the bottom of the epidermis / dermis model will be described.
  • the epidermis / dermis model formed on the membrane of the culture insert is turned over, and the mixture of vascular endothelial cells, concentrated growth medium for the cells and collagen solution is dropped on the first support side. Solidified. After the collagen solution has solidified, the insert is returned to its original position, and the culture solution is added to the outer layer of the insert.
  • the culture medium is preferably a medium for epidermis / dermis model, but is not limited thereto.
  • the three-dimensional skin model of the present invention may comprise additional cells in addition to vascular endothelial cells, fibroblasts and keratinocytes.
  • the arrangement is appropriately determined in consideration of the actual skin configuration. For example, since fat cells are present in the subcutaneous tissue under the dermis, the fat cells can be placed on the bottom surface of the three-dimensional skin model of the present invention from the viewpoint of bringing the three-dimensional skin model closer to the actual skin. Conceivable. If the number of fat cells increases or the oil droplets in fat cells accumulate and the cells become enlarged, obesity and sagging of the skin occur, so by including fat cells in the three-dimensional skin model of the present invention, Research on the symptoms of the disease becomes possible. In the three-dimensional skin model created by Sugihara H.
  • adipocytes were used as adipocytes.
  • preadipocytes are used, and after the cells are cultured and differentiated or proliferated to a desired degree, they are combined with an epidermis / dermis model.
  • precursor adipocyte means a cell having the ability to differentiate into a mature adipocyte, and for convenience, means a cell that has matured and has not completely differentiated into an adipocyte.
  • mature adipocytes means a state in which the proliferation is remarkably lower than that of preadipocytes, and oil droplets are considerably accumulated in the cells.
  • the preadipocytes may be the same or different from the cells used in the epidermis / dermis model and vascular endothelial cells, and those derived from any mammal can be used, but approximate the properties of human skin From the viewpoint of obtaining a three-dimensional skin model, it is preferably derived from a human.
  • the preadipocytes may be those that have been subjected to ultraviolet rays, drugs, or genetic modifications.
  • Precursor cells are in a medium containing insulin, indomethacin, dexamethasone, etc., which are factors that induce differentiation into adipocytes (hereinafter referred to as “culture medium for differentiation”) after making cells 100% confluent with high cell density.
  • Culture medium for differentiation Differentiate into mature adipocytes by culturing in Differentiation media are commercially available, and human preadipocyte basic media-2 (PBM-2) (CMW) and the like can be used.
  • PBM-2 human preadipocyte basic media-2
  • the degree of differentiation into adipocytes can be confirmed using morphological characteristics of adipocytes, accumulation of oil droplets, and gene expression of differentiation markers as indices. For example, since preadipocytes accumulate oil droplets in the cells as they differentiate, oil droplet formation confirmed by oil red staining may be used as an indicator of differentiation.
  • Adiponectin and PPAR ⁇ can be used as differentiation markers.
  • the differentiation medium can be replaced with a proliferation medium or a three-dimensional skin model medium that does not contain a differentiation-inducing factor.
  • a proliferation medium or a three-dimensional skin model medium that does not contain a differentiation-inducing factor.
  • the differentiation rate was slowed but differentiation did not stop (results not shown).
  • what mixed the culture medium for differentiation and the culture medium for proliferation can also be used for the further differentiation process.
  • a 1: 1 mixture of differentiation medium: proliferation medium may be utilized to grow and maintain some cells while inducing differentiation of most cells.
  • medium for three-dimensional skin model is a serum-free medium for keratinocytes excluding EGF and Dulbecco's Modified Eagles minimal essential medium supplemented with 10% fetal bovine serum at a ratio of 1: 1. It is a mixture.
  • the preadipocytes differentiated to a desired degree may be cultured and proliferated under predetermined culture conditions. Those that have reached 100% confluence can also be combined with epidermis / dermis model and vascular endothelial cells. Note that the number of days of culture leading to confluence varies depending on the preadipocytes used and the growth conditions.
  • the extent to which the preadipocytes are differentiated and proliferated before being combined with the epidermis / dermis model and vascular endothelial cells is determined by the use of the three-dimensional skin model. For example, when investigating the effects of externally applied drugs on the skin on the differentiation state of subcutaneous fat cells, combine fat cells with the epidermis and dermis in an undifferentiated state, and factors derived from fat cells affect the skin. When examining the effects, combine them in a differentiated state.
  • the model will behave more like actual skin.
  • the production level of the inflammatory cytokine IL-6 derived from the epidermis / dermis model decreases, and the expression level of type I and III collagen genes also increases, so the presence of adipocytes makes the epidermis / dermis model It is thought to have stabilized.
  • an ultraviolet stimulus response similar to that in the living body can be observed.
  • the medium for the three-dimensional skin model outside the immunostaining culture insert using a vascular endothelial cell activation marker was replaced with a fresh one every two days and cultured for 1 week.
  • the culture insert and the gel containing endothelial cells were separated.
  • the vascular endothelial cell-containing gel was placed in a 10% goat serum solution for 1 hour and then incubated in an anti-human I-CAM1 antibody (SIGMA) for 3 hours. After washing with PBS for 30 minutes three times, the plate was incubated for 2 hours in FITC-labeled anti-rabbit antibody and washed with PBS for 30 minutes three times.
  • SIGMA anti-human I-CAM1 antibody
  • FIG. 1A Compared with a gel containing only HUVEC cells (FIG. 1A), the three-dimensional skin model of the present invention into which vascular endothelial cells were introduced significantly expressed I-CAM1 (FIG. 1B). Since I-CAM1 is a vascular endothelial cell activation marker, the results shown in FIG. 1 indicate that vascular endothelial cells are activated when combined with an epidermis / dermis model.
  • RNA is extracted using isogen (Takara Bio)
  • cDNA synthesis is performed using SuperScript II (Invitrogen)
  • sybergeen is extracted.
  • the TLR-2 RT-PCR reaction was performed.
  • the expression level of TLR2 gene was normalized with the expression level of GADPH gene. The results are shown in FIG. From the results shown in FIG. 2, it was found that the genes of the epidermis / dermis model change in the gene expressed by co-culture with vascular endothelial cells.

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Abstract

　本発明は、血管内皮細胞、線維芽細胞及びケラチノサイトを含む三次元皮膚モデルであって、第一の支持体上に、下から順に線維芽細胞、ケラチノサイトが積層されており、当該第一の支持体の底面に、第二の支持体に組み込まれた血管内皮細胞が配置されている、三次元皮膚モデル、を提供する。

Description

血管内皮細胞を含む三次元皮膚モデル
　本発明は、血管内皮細胞を導入した三次元皮膚モデル及びその製造方法に関する。
　化粧品の開発においては、ヒトの皮膚の代わりに、マウスなどの動物モデルの皮膚を人為的に対象の皮膚症状に近づけた後、直接候補薬剤を適用して評価する方法が一般的である。しかしながら、動物モデルで得られた結果は必ずしもヒトの皮膚に適用できるものでもない。また、近年、欧州では動物愛護の観点から化粧品の開発に関して動物実験を規制する動きが広がっており、動物実験の代替となるin vitro薬物評価系の確立が必要とされている。
　従来より、ヒトの皮膚を模した三次元皮膚モデルの開発が様々なグループにより進められており、中には実際に市販されているものもある。これらの公知の三次元皮膚モデルの多くは、コラーゲンゲル等の支持体上に線維芽細胞、当該線維芽細胞上にケラチノサイトが積層された構造を有している（Amano S. et al., Exp. Cell Res., Vol.271, pp.249-262, 2001やTsunenga M. et al., Matrix. Biol., Vol.17, pp.603-613, 1998）。
　ケラチノサイト及び線維芽細胞は、それぞれ表皮、真皮の主要構成細胞である。しかしながら、実際の皮膚は複雑な構成を有しており、ケラチノサイトと線維芽細胞のみを含む従来の三次元皮膚モデルは実際の皮膚組織の構成を反映しているとは言えない。
Amano S. et al., Exp. Cell Res., Vol.271, pp.249-262, 2001 Tsunenga M. et al., Matrix. Biol., Vol.17, pp.603-613, 1998
　本発明は、化粧品等の候補薬剤の効果をin vitroで評価するために、ヒトの皮膚に近い構成を有し、且つ各細胞が相互作用することのできる三次元皮膚モデル及びその製造方法を提供することを課題とする。
　真皮は、主に、線維芽細胞等の細胞成分と、間質成分、例えば、I型コラーゲン等の膠原線維とから構成され、真皮の至る所に毛細血管や神経が張り巡らされている。血管は、皮膚の恒常性維持に大きな役割を果たすため、構成細胞としてケラチノサイト・線維芽細胞のみを含む従来の皮膚モデルでは、血管の存在が及ぼす影響を再現することができない。
　本発明者が鋭意検討した結果、従来の三次元皮膚モデルと、実際に真皮中に存在する血管内皮細胞とを組み合わせることで、実際の皮膚組織により近い状態を再現可能な三次元皮膚モデルを完成させるに至った。
　即ち、本願は下記の発明を包含する：
［１］ 血管内皮細胞、線維芽細胞及びケラチノサイトを含む三次元皮膚モデルであって、第一の支持体上に、下から順に線維芽細胞、ケラチノサイトが積層されており、当該第一の支持体の底面に、第二の支持体に組み込まれた血管内皮細胞が配置されている、三次元皮膚モデル；
［２］ 前記第二の支持体に組み込まれた血管内皮細胞の底面に、血管内皮細胞、線維芽細胞及びケラチノサイト以外の細胞が配置されている、［１］に記載の三次元皮膚モデル；
［３］ 前記血管内皮細胞の底面に配置された細胞が脂肪細胞である、［２］に記載の三次元皮膚モデル；
［４］ 前記第一及び第二の支持体がコラーゲンを含むゲルである、［１］～［３］のいずれかに記載の三次元皮膚モデル；
［５］ 前記第一及び／又は第二の支持体のゲルが更にキトサンを含む、［４］に記載の三次元皮膚モデル；
［６］ 三次元皮膚モデルの製造方法であって、
１）第一の支持体上に、下から順に線維芽細胞、ケラチノサイトを積層させる工程、
２）第二の支持体に組み込まれた血管内皮細胞を、前記第二の支持体の底面に配置する工程、
を含んで成る方法；
［７］ 更に、
３）前記第二の支持体に組み込まれた血管内皮細胞の底面に、血管内皮細胞、線維芽細胞及びケラチノサイト以外の細胞を配置する工程、
を含んで成る、［６］に記載の三次元皮膚モデルの製造方法；
［８］ 工程３）で配置される細胞が脂肪細胞である、［７］に記載の方法；
［９］ 前記第一及び第二の支持体がコラーゲンを含むゲルである、［６］～［８］のいずれかに記載の三次元皮膚モデルの製造方法；
［１０］ 前記第一及び／又は第二の支持体のゲルが更にキトサンを含む、［９］に記載の三次元皮膚モデルの製造方法。
　外部刺激を受けて表皮細胞から放出されるVEGFやトロンボスポンジンは、血管新生を促進することが知られている（Detmaar M, J Dermatol Sci. 2000, S78-S84）。逆に、血管の新生は、皮膚疾患の一つである乾癬の発症に関係していることが報告されている（Heidenreich et al, Int. J. Exp. Pathol, 2000, 90(3):232-248）。このように、血管は皮膚と互いに相関している。
　従って、血管内皮細胞を、ケラチノサイトと線維芽細胞のみを含む従来の三次元皮膚モデルに含めることで、より皮膚に近い構成を有する三次元皮膚モデルが得られる。事実、本発明の方法により得られた三次元皮膚モデルにおいては、ケラチノサイト及び線維芽細胞と血管内皮細胞とが相互作用しており、例えば内皮細胞の分化・活性化マーカーが変化し、皮膚との相互作用が見られることが明らかになった。このような内皮細胞の活性化は、表皮・真皮モデルが刺激を受けた際に更に亢進する。従って、この実験系によれば、皮膚刺激が血管新生を引き起こす反応を予防する薬剤を、動物実験を行うことなくin vitroで見出すことが可能となる。
　血管内皮細胞は、皮膚中での血管新生に関与しており、in vitroにおいても、単独で、コラーゲン等のマトリックス中で血管を模した管腔を形成することができることが知られている。しかしながら、血管内皮細胞を表皮・真皮モデルと組み合わせることで管腔形成が促進されることが新たに明らかとなった。これは、本発明の三次元皮膚モデルが、皮膚中で血管が新生される現象をより忠実に反映していることを示している。
　従って、本発明によれば、表皮・真皮モデルと血管内皮細胞層とを別々に調製して組み合わせることで、構成細胞が互いに相互作用する、より実際のヒト皮膚の構成に近い三次元皮膚モデルが得られる。また、当該三次元皮膚モデルを使用することで、動物実験に依拠せずに薬剤の有効性又は毒性をin vitroで評価することが可能となる。
図１は、血管内皮細胞の活性化をICAM-1に対する免疫染色によって示した図である。 図２は、血管内皮細胞の分化・活性化をToll様受容体2(TLR-2)の遺伝子発現解析によって示した図である。
表皮・真皮モデル
　本発明により製造される三次元皮膚モデルは、表皮・真皮を模した従来の表皮・真皮モデル、すなわちケラチノサイトと線維芽細胞に加え、血管内皮細胞を含む。本明細書で使用する場合、用語「表皮・真皮モデル」とは、便宜上、コラーゲンゲル等の第一の支持体上に、線維芽細胞が、そして当該線維芽細胞上にケラチノサイトが積層された構造を有するものを意味する。
　かかる表皮・真皮モデルは当業者にとって周知の方法（例えば、Amano S. et al., Exp. Cell Res., Vol.271, pp.249-262, 2001（上掲）やTsunenga M. et al., Matrix. Biol., Vol.17, pp.603-613, 1998（上掲）参照のこと）により調製することができ、例えばインサートメッシュ上において繊維芽細胞を支持体に混ぜ込んだものを播いた後、その上にケラチノサイトを播き、培養し、空気曝露することで調製したものであってよい。
　表皮・真皮モデルの作成に使用する支持体（以下、本明細書では「第一の支持体」と称する）は、コラーゲン単独のゲル、あるいは、コラーゲンとキトサンを含むゲルであってもよい。既報（Black AF et al., Tissue Engineering, Vol. 11, 723-733, 2005）にあるように、基底膜構造、真皮繊維形成の観点から、コラーゲンとキトサンを含むゲルを用いることが好ましい。また、表皮・真皮モデルはゲルが縮んでいない均一な形状のものを選択することで、同程度の三次元皮膚モデルを複数作成する場合のロット間のばらつきを防ぐことができる。
　表皮・真皮モデルは、例えば繊維芽細胞を１×１０4～１０8個／ｃｍ2、好ましくは０．１～１０×１０5個／ｃｍ2の量で含み、またケラチノサイトを１×１０2～１０6個／ｃｍ2、好ましくは１．０～１０×１０4個／ｃｍ2、より好ましくは約４～８×１０4個／ｃｍ2の量で含むものであってよい。
　表皮・真皮モデルは市販もされており、特に限定されるわけではないが、例えばＴＥＳＴＳＫＩＮ（登録商標）（ＴＯＹＯＢＯ）などのセルカルチャーインサートが使用できる。表皮・真皮モデルを構成する細胞はセルカルチャーインサート内で培養され、そして別の細胞、特に血管内皮細胞は、表皮・真皮モデルの細胞とインサートの膜を介して分離した状態で培養される。
　表皮・真皮モデルの培養は、例えば培養液として通常のケラチノサイト培養に用いられる培養液、例えばＫＧ培地、ＥｐｉｌｉｆｅＫＧ２（クラボウ）、Ｈｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２（クラボウ）、アッセイ培地（ＴＯＹＯＢＯ）などを用い、約３７℃で０～１４日間かけて行うことができる。培地としては、その他にＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）又は２－０－ａ－Ｄ－グルコピラノシル－Ｌ－アスコルビン酸含有ＫＧＭとＤＭＥＭを１：１混合した培地などが使用できる。培地は、表皮・真皮モデルと血管内皮細胞とを組み合わせる際に除去してもよい。
　繊維芽細胞及びケラチノサイトは同種系でも異種系であってもよく、あらゆる哺乳動物に由来してよい。更に、表皮・真皮モデルを構成する細胞は、紫外線や薬剤、あるいは遺伝子改変を受けたものであってもかまわない。しかしながら、限定するわけではないが、三次元皮膚モデルの性状をヒト皮膚のものに近づける観点から、ケラチノサイトはヒト由来であることが好ましい。また、使用する繊維芽細胞とケラチノサイトの割合も特に限定されるわけではないが、例えばケラチノサイト４～８×１０4~6細胞に対して繊維芽細胞１×１０5~7細胞、好ましくはケラチノサイト４～８×１０5細胞に対し繊維芽細胞１×１０6細胞とすることができる。
血管内皮細胞
　血管内皮細胞は、表皮・真皮モデルの底面に配置される。本発明で使用する血管内皮細胞は、例えばヒトの臍帯由来のもので、１mＬあたり１００～１０，０００個を用いるが、これに限定されるものではなく、大動脈由来のものであってもかまわない。また、ヒトに限定されるものではなく、他の哺乳動物の血管内皮細胞を用いてもかまわない。本発明で使用する血管内皮細胞が前駆細胞である場合、表皮・真皮モデルと組み合わせる前に、培養して所望の程度に分化及び／又は増殖してもよい。
　表皮・真皮モデルに付着させる際に用いる血管内皮細胞は、定常状態にあるものでも、薬剤や遺伝子改変等によって刺激されたものであってもかまわない。
　血管内皮細胞は、第二の支持体中に組み込まれた後、表皮・真皮モデルの底面、すなわち第一の支持体の底面に配置される。支持体中に血管内皮細胞を組み込むことで、本発明の三次元皮膚モデルはより真皮組織に近い構成となる。また、血管内皮細胞を第一の支持体の底面に配置させる際、第二の支持体の存在は第一の支持体との接着に有利である。
　第二の支持体は、第一の支持体と同じでも異なっていてもよく、コラーゲン単独のゲル、コラーゲンとキトサンを含むゲル等が第二の支持体として使用可能である。当該ゲルは、血管内皮細胞を組み込む前に、当該細胞と混合できるよう、溶液状態となっている。コラーゲンを第二の支持体として使用する場合、Ｉ型コラーゲンであることが好ましく、また、ゲル化前のコラーゲン溶液の最終濃度は、０．１重量％程度が好ましい。しかしながら、支持体の濃度は、固化する濃度以上で、細胞が生存できる濃度範囲であればかまわない。コラーゲンを溶解する溶媒は、当該溶解のために利用可能であることを当業者が認識している溶媒、例えば一般的な弱酸性水溶液を使用することができ、その例として希塩酸が挙げられる。
　血管内皮細胞の生存のために、血管内皮細胞用の培地を第二の支持体中に含めることが好ましい。この場合、使用する支持体溶液の量に応じて濃縮した培地が使用される。支持体の溶液量は、限定しないが、１平方cmあたり、１００μL～４００μLである。
　表皮・真皮モデルをカルチャーインサートのような特定の透過性メンブレン上に形成させた場合を例に、血管内皮細胞を表皮・真皮モデルの底面に配置する方法について説明する。
　カルチャーインサートのメンブレン上に形成された表皮・真皮モデルは、メンブレンごと裏返しにされ、第一の支持体側に、血管内皮細胞と、当該細胞用の濃縮した増殖培地とコラーゲン溶液との混合物が滴下して固化される。コラーゲン溶液が固化した後、インサートを元に戻し、インサート外層に培養液を加える。培養液は、表皮・真皮モデル用の培地が好ましいが、これに限定されるものではない。
追加の細胞
　本発明の三次元皮膚モデルは、血管内皮細胞、線維芽細胞及びケラチノサイト以外に、更に別の細胞を含んで成ることもある。その配置は、実際の皮膚の構成を考慮して適宜決定される。例えば、脂肪細胞は、真皮の下の皮下組織中に存在するため、三次元皮膚モデルをより実際の肌に近づける観点からは、脂肪細胞を本発明の三次元皮膚モデルの底面に配置することが考えられる。脂肪細胞の数が増大したり、あるいは脂肪細胞内の油滴が蓄積されて細胞が肥大すると、肥満や肌のたるみが生じるため、本発明の三次元皮膚モデルに脂肪細胞を含めることで、これらの症状についての研究が可能となる。Sugihara H.ら（上掲）が作成した三次元皮膚モデルでは、脂肪細胞は成熟した脂肪細胞が使用された。本発明の方法では、前駆脂肪細胞を使用し、当該細胞を培養して所望の程度に分化又は増殖した後、表皮・真皮モデルと組み合わされる。
　本明細書で使用する場合、「前駆脂肪細胞」とは、成熟脂肪細胞への分化能を有する細胞であって、便宜上、成熟して完全に脂肪細胞に分化していない細胞を意味する。また、「成熟脂肪細胞」とは、前駆脂肪細胞に比べて著しく増殖性が低く、かつ細胞内に油滴がかなり蓄積された状態を意味する。前駆脂肪細胞は、表皮・真皮モデルで使用する細胞や血管内皮細胞と同種系でも異種系であってもよく、あらゆる哺乳動物に由来のものを使用することができるが、ヒト皮膚の性状に近似した三次元皮膚モデルを得る観点からはヒト由来であることが好ましい。また、前駆脂肪細胞は、紫外線や薬剤、あるいは遺伝子改変を受けたものであってもかまわない。
　前駆脂肪細胞は、細胞密度の高い１００％コンフルエントな状態にした後に、脂肪細胞への分化を誘導する因子であるインスリン、インドメタシン、デキサメタゾン等を含む培地（以下、「分化用培地」と称する）中で培養することで成熟脂肪細胞へと分化する。分化用培地は市販されており、ヒト前駆脂肪細胞基本培地-2（PBM-2）（CMW社）等が使用されうる。脂肪細胞への分化の程度は、脂肪細胞の形態的特徴、油滴の蓄積、分化マーカーの遺伝子発現を指標として確認することができる。例えば、前駆脂肪細胞は分化するにつれ細胞内に油滴を蓄積していくため、オイルレッド染色により確認された油滴形成を分化の指標としてもよい。分化マーカーとしてはアディポネクチンやＰＰＡＲγを使用することができる。
　脂肪細胞への分化がある程度進んだ後は、分化用培地を、分化誘導因子を含まない増殖用培地や三次元皮膚モデル用培地に置換することができる。事実、分化誘導７日目の脂肪細胞を分化誘導因子の非存在下で培養すると、分化速度は遅くなるものの分化が停止することはないことが確認された（結果は示さない）。あるいは、分化用培地と増殖用培地を混合したものを更なる分化過程に使用することもできる。例えば、大半の細胞の分化を誘導しつつ、一部の細胞を増殖させて維持するために、限定しないが、分化用培地：増殖用培地の１：１混合物を利用してもよい。本明細書で使用する場合、「三次元皮膚モデル用培地」とはEGFを除く、ケラチノサイト用無血清培地とDulbecco’s Modified Eagles minimal essential mediumに１０％牛胎児血清を添加したものとを１：１で混合したものである。
　所望の程度に分化した前駆脂肪細胞は、所定の培養条件下で培養して増殖させてもよい。１００％コンフルエントに達したものを表皮・真皮モデル及び血管内皮細胞と組み合わせることもできる。尚、コンフルエントに至る培養日数は使用する前駆脂肪細胞や増殖条件によって変動する。
　表皮・真皮モデル及び血管内皮細胞と組み合わせる前に前駆脂肪細胞をどの程度分化・増殖させるかは、三次元皮膚モデルの用途によって決定される。例えば、皮膚への外用塗布薬剤が、皮下の脂肪細胞の分化状態に与える影響を検討する場合には、脂肪細胞を未分化な状態で表皮・真皮と組み合わせ、脂肪細胞から出る因子が皮膚に及ぼす影響を検討する場合には、分化させた状態で組み合わせる。
　本発明の三次元皮膚モデルに脂肪細胞を導入することで、当該モデルは更に実際の皮膚に近い挙動を示すようになる。例えば、表皮・真皮モデルに由来する炎症性サイトカインIL-6の産生レベルは低下し、また、I型、III型コラーゲン遺伝子の発現レベルも増加することから、脂肪細胞の存在により表皮・真皮モデルが安定化していると考えられる。更に、当該三次元皮膚モデルでは、生体内と同様の紫外線刺激応答が観察され得る。
　次に、本願発明を以下の実施例により更に具体的に説明する。
１）表皮・真皮モデルの調製
　0.3%コラーゲン溶液18mＬに5mＬの0.7%キトサン溶液（0.084M酢酸）を添加し、さらに、2ｍLの2.5%のコンドロイチン硫酸溶液を添加した。混合液400μLを１２穴のカルチャーインサートに注ぎ、凍結乾燥した。続いて、70%エタノール・乾燥によって殺菌し、１ｍLの燐酸緩衝液（PBS）で膨潤させた後、PBSを取り除いて、初代培養真皮繊維芽細胞６ｘ105個を200μLのDMEM＋10%牛胎児血清（培地）に浮遊させたものをインサートに注いだ。ウエル中には、１mＬの培地を注いだ。週３回培地交換しながら、２～３週間37℃、5%CO2環境で培養した後、培地を取り除き、インサート内に５ｘ106個の初代培養表皮ケラチノサイトを播種した。２～３日間ケラチノサイト用無血清培地（KG-２；クラボウ）で培養した後、上層の培地を取り除き、インサート外には、EGFを除いたKG-2とDMEM＋10％牛胎児血清を1対１で混合したものに250μMのアスコルビン酸を添加した皮膚モデル用培地（三次元皮膚モデル用培地）を加えた。これを週３回培地交換しながら２週間培養（空気曝露）したものを表皮・真皮モデルとした。
２）血管内皮細胞の導入
　１mＬの０．３％酸性コラーゲン溶液（KOKEN社）と、０．３３３mLの４倍濃度Dulbecco Minimal Essential Mediumを混和した。そこに１７０，０００個のHUVEC細胞（Lonza社）を含む１．６７mＬの細胞浮遊液を加え、０．３mＬを表皮・真皮モデルを形成した１２穴カルチャーインサートの裏に滴下した。３７℃で３０分静置してコラーゲン溶液を固化させた後、プレートに戻し、インサートの外側に０．５mＬの皮膚モデル用培養液を加えることで本発明の三次元皮膚モデルを完成させた。
３）血管内皮細胞の導入が表皮・真皮モデルに及ぼす影響
　２）で得られた三次元皮膚モデルにおける血管内皮細胞の導入が表皮・真皮モデルに及ぼす影響について、血管内皮細胞（HUVEC細胞）のみを含むゲルと比較検討した。
血管内皮細胞活性化マーカーを用いた免疫染色
　カルチャーインサート外の三次元皮膚モデル用培地を2日ごとに新鮮なものと交換して、1週間培養した。カルチャーインサートと内皮細胞入りのゲルを分離した。血管内皮細胞入りゲルは、１０％ヤギ血清溶液中に1時間置いた後、抗ヒトI-CAM1抗体（SIGMA社）中で3時間インキュベートした。30分3回のPBS洗浄の後、FITC標識抗ウサギ抗体中で2時間インキュベートし、30分３回のPBS洗浄を行った。免疫染色の結果を図１に示す。当該図は、共焦点顕微鏡を用いて断層撮影を行ったものを合成したものである。
　HUVEC細胞のみを含むゲルと比較して（図１Ａ）、血管内皮細胞が導入された本発明の三次元皮膚モデルは有意にI-CAM1を発現していた（図１Ｂ）。I-CAM1は血管内皮細胞活性化マーカーであるため、図１の結果から、血管内皮細胞は表皮・真皮モデルと組み合わせたことで活性化されることが分かった。
RT-PCRを用いた遺伝子発現量の検討
　上記血管内皮細胞を含むゲルから、isogen(タカラバイオ）を用いてRNAを抽出し、SuperScriptII(Invitrogen)を用いてｃDNA合成を行い、sybergeen（Invitrogen)を用いて、TLR-2のRT-PCR反応を行った。TLR2遺伝子の発現量をGADPH遺伝子の発現量で標準化した。結果を図２に示す。図２の結果より、表皮・真皮モデルの細胞は血管内皮細胞と共培養することで発現される遺伝子に変化が生じることが分かった。

Claims (10)

  1. 　血管内皮細胞、線維芽細胞及びケラチノサイトを含む三次元皮膚モデルであって、第一の支持体上に、下から順に線維芽細胞、ケラチノサイトが積層されており、当該第一の支持体の底面に、第二の支持体に組み込まれた血管内皮細胞が配置されている、三次元皮膚モデル。
  2. 　前記第二の支持体に組み込まれた血管内皮細胞の底面に、血管内皮細胞、線維芽細胞及びケラチノサイト以外の細胞が配置されている、請求項１に記載の三次元皮膚モデル。
  3. 　前記血管内皮細胞の底面に配置された細胞が脂肪細胞である、請求項２に記載の三次元皮膚モデル。
  4. 　前記第一及び第二の支持体がコラーゲンを含むゲルである、請求項１～３のいずれか１項に記載の三次元皮膚モデル。
  5. 　前記第一及び／又は第二の支持体のゲルが更にキトサンを含む、請求項４に記載の三次元皮膚モデル。
  6. 　三次元皮膚モデルの製造方法であって、
    １）第一の支持体上に、下から順に線維芽細胞、ケラチノサイトを積層させる工程、
    ２）第二の支持体に組み込まれた血管内皮細胞を、前記第二の支持体の底面に配置する工程、
    を含んで成る方法。
  7. 　更に、
    ３）前記第二の支持体に組み込まれた血管内皮細胞の底面に、血管内皮細胞、線維芽細胞及びケラチノサイト以外の細胞を配置する工程、
    を含んで成る、請求項６に記載の三次元皮膚モデルの製造方法。
  8. 　工程３）で配置される細胞が脂肪細胞である、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記第一及び第二の支持体がコラーゲンを含むゲルである、請求項６～８のいずれか１項に記載の三次元皮膚モデルの製造方法。
  10. 　前記第一及び／又は第二の支持体のゲルが更にキトサンを含む、請求項９に記載の三次元皮膚モデルの製造方法。
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