JP2008511662A - 損傷組織の修復を促進するためのWntタンパク質を含む馴化培地 - Google Patents
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Abstract
Description
本特許出願は、35 U.S.C. 第119条(e)に基づき、2004年8月30日出願の、「虚血組織の修復および再生を促進する方法(Methods for Promoting Repair and Regeneration of Ischemic Tissues)」と題される特許出願番号第60/606,072号に対し、および2005年6月17出願の「虚血組織の修復および再生を促進する方法(Methods for Promoting Repair and Regeneration of Ischemic Tissues)」と題される特許出願番号第60/691,731号に対する権利を主張する。これらの開示の全内容を参照により本明細書に組み入れる。
血管系のような器官系の発達と維持には多数のシグナル伝達経路の作用と組み合わせが必要である。Wntシグナル伝達経路は、正常な発達および種々の病因(癌を含む)において重要な役割を果たすことが示されている。最近の研究は、発達段階および病理学的状態(例えば癌)における血管系の形成とリモデリングがWntシグナル伝達により調節されることを示唆する。Wnt因子はシステインリッチな、分泌型糖タンパク質であり、ヒドラからヒトに渡る生物種で高度に保存されている。Wntシグナルの受容とシグナル伝達は、Wntタンパク質と細胞表面受容体の2つの異なるファミリーのメンバー、すなわちFrizzled(Fz)遺伝子ファミリーのメンバーおよびLDL受容体関連タンパク質(LRP)ファミリーのメンバーとの結合を要する。Fzタンパク質は、細胞外システインリッチドメイン、7回膜貫通ドメインおよび短い細胞質尾部を含有する。少なくとも19種のWntホモログおよび10種のFzホモログが哺乳動物中で発現される。Wntタンパク質およびそのシグナル伝達経路に関するさらなる背景については、例えばGoodwin and D-Amore, 2002, Angiogenesis, 5:1-9 およびMiller JR, 2001, Genome Biology, 3:3001.1-3001.15を参照されたい。
本発明の開示は損傷組織の修復とリモデリングを促進するための方法および組成物を提供する。本明細書に記載の方法により治療することのできる損傷組織の例としては、限定するものではないが、腸組織、心臓組織、肝臓組織、腎臓組織、骨格筋、結合組織、および/または皮膚組織が挙げられる。方法は、当業者に既知の手法を用いて被験体に有効量の馴化培地を投与することを含む。例えば、いくつかの実施形態においては、組成物を注射により、例えば皮下注射針を用いて投与することができる。
本明細書に記載の組成物および方法には様々な用途があり、限定するものではないが、損傷組織(組織としては腸組織、心臓組織、肝臓組織、腎臓組織、骨格筋、結合組織、皮膚組織、および/または他の組織が挙げられる)の修復とリモデリングを促進することなどが挙げられる。一般に、本明細書に記載の方法は、三次元型組織から作製された馴化培地を含む有効量の組成物を被験体に投与することを含む。いかなる理論にも限定されるものではないが、馴化培地を損傷組織に与えたときに、生理活性物質、例えばWntタンパク質および/または他の増殖因子の存在ゆえに組織修復が促進されると考えられる。
種々の実施形態において、損傷組織の修復を促進することのできる馴化培地は、三次元型組織から得られる。一般に、細胞はスカフォールド(本明細書中で生物適合性、非生命材料から構成されるスカフォールドとも言う)上で培養される。スカフォールドは、(a)それに細胞が付着することができる(またはそれに細胞が付着できるように修飾することができる)、および(b)細胞が2以上の層として増殖できる(すなわち三次元型組織を形成する)ようにするものであれば、どのような材料および/または形状であってもよい。
三次元型組織を形成するためには、スカフォールドを形成する生物適合性材料に適当な細胞を接種し、組織修復促進特性を有する馴化培地の産生を促進するのに適当な条件下で増殖させる。細胞はドナーから直接、またはドナーから作製された細胞培養物から、または樹立した細胞培養系から取得することができる。場合によっては、細胞を任意の適当な死体臓器または胎児供給源から多量に得ることができる。いくつかの実施形態において、同じ種の、かつ好ましくは1以上のMHC遺伝子座のマッチする細胞を、当該被験体または近親血縁者から生検により取得し、次いでそれを標準条件を用いてコンフルエント状態まで培地で増殖させ、必要に応じて使用する。ドナー細胞の特徴付けは、投与する被験体、馴化培地および/またはその単離成分に関して行う。
種々の実施形態において、三次元型組織は、組織の産生する生理活性物質のレパートリーを特徴とする。こうした生理活性物質としては、増殖因子(溶解型およびマトリックス結合型)、サイトカイン、および/またはWntタンパク質が挙げられる。
遺伝子操作された三次元型組織は、米国特許第5,785,964号および第5,957,972号に記載のように調製することができ、これらは参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。遺伝子操作された組織は、in vivoでの生理活性物質(例えば増殖因子(溶解型およびマトリックス結合型)、サイトカイン、および/またはWntタンパク質)の徐放出用のための遺伝子送達ビヒクルとして機能し得る。例えば、特定の実施形態では、細胞(例えば間質細胞)を遺伝子操作して、該遺伝子操作細胞に外来性または内在性の遺伝子産物を発現させることができる。有用に遺伝子操作することのできる間質細胞としては、限定するものではないが、線維芽細胞(胎児、新生児または成人由来)、平滑筋細胞、心筋細胞、幹細胞または前駆細胞、および疎性結合組織に存在する他の細胞、例えば内皮細胞、マクロファージ、単球、脂肪細胞、周皮細胞、および骨髄に存在する細網細胞が挙げられる。種々の実施形態において、幹細胞または前駆細胞を、外来性または内在性遺伝子産物を発現するように遺伝子操作して、その後三次元型スカフォールド上で、単独でまたは間質細胞と併用して、培養することができる。
三次元型組織により産生される馴化培地は、直接使用するまたは様々にさらに加工することができる。培地は、組織修復を促進する生理活性物質を保存するおよび/または濃縮するために、凍結乾燥することができる。典型的凍結乾燥工程は、3つの別の相互関連する工程、すなわち凍結、一次乾燥(凝華)、および二次乾燥(脱着)を含む。必要であれば、種々の生物適合性保存料、凍結防止剤、および安定剤を使用して活性を保存することができる。生物適合性物質の非限定的な例としては、グリセロール、ジメチルスルホキシド、およびトレハロースなどが挙げられる。いくつかの実施形態において、凍結乾燥物はまた、1種以上の賦形剤、例えば緩衝剤、充填剤、および張性修正剤を含む。凍結乾燥培地は、下に詳細に記載するように、適当な溶液または製薬上の希釈剤を添加することにより再構成する。
馴化培地またはその成分、例えば三次元型組織により産生されるWnt因子のレパートリーは、損傷組織を成長および/または修復するために使用することができる。組織損傷および欠陥は、多数の症状、限定するものではないが、例えば疾患、手術、環境的曝露、負傷、および加齢などの結果生じうる。例えば、組織損傷は、虚血(典型的には筋肉への血液と酸素の供給不足により引き起こされる)の結果生じうる。一般に、本明細書において「組織修復促進活性および/または特性」とは、馴化培地もしくはその成分を適用することにより、損傷組織内の1以上の次の生理学的変化が促進されることを意味する: (1)血管新生および/または再血管形成; (2)新組織の刺激および/または成長; (3)内皮形成; および(4)タイトジャンクション数の改善; (5)細胞性突起および微絨毛の増加; ならびに(6)治療組織の1以上の機能の、対応する健康組織において観察されるレベルへの、部分的または完全な回復。例えば、治療組織が心臓組織であれば、駆出率または心拍出量により測定される、心臓のポンプ効率の改善が観察される。再血管形成は、非侵襲的手段、例えば当業者が通常使用する超音波画像診断法により測定することができる。
生理活性物質は典型的には対象の損傷組織を治療する有効量で使用する。生理活性物質は、治療的に投与して治療効果を上げるか、または予防的に投与して予防効果を上げることができる。治療効果とは、治療中の基礎症状または障害の根絶または改善を意味する。治療効果はまた、改善が認識されるか否かに無関係に、疾患の進行を停止または遅らせることも含む。
本明細書において、馴化培地または加工したその分画を本明細書に記載のような様々な形態で含むキットを提供する。キットは、馴化培地の液体、固体または粉末配合物を、投与に適当な形態で含有し得る。種々の実施形態においては、組成物を用時調製するための適当な希釈剤を、組成物を投与すべく調製するためにキットに追加することができる。キットはさらに投与用の機器、例えば注射器具(例えば手動、機械駆動または電動)を、当業者の使用のために、含み得る。他の化合物を馴化培地と併用して投与する場合には、それらもキットに含めることができる。典型的に組成物と一緒に付属するのは、組成物の調製と投与のための説明書である。これは様々な様式のもの、例えば印刷物、磁気ディスク、磁気テープ、コンパクトディスク、フラッシュメモリーまたは適当な情報を伝達するのに適当な他の媒体であり得る。
方法および材料
上皮細胞増殖および分化アッセイ
この研究では、三次元型組織馴化培地のin vitroにおける4種の異なるヒト上皮細胞系に対する影響を評価した。用いた細胞系は次の通りである: (1)継代2〜3代目(P2〜3)の一次ヒト表皮ケラチノサイト、(2)不死化腸上皮細胞系 (Caco-2)、(3)不死化呼吸器官上皮細胞系(NCI-H292)、および (4)不死化結腸上皮細胞系(HT-29)。これらの不死化細胞系はそれらの由来する組織の一般に認められたモデルであり、in vitroで詳しく特徴付けされている。表皮ケラチノサイトは一次細胞型を表す。
細胞系をATCCから入手し、24ウェルプレートに約5000 細胞/cm2塗布し、その後10%(v/v)試験物質または対照非馴化培地の存在下で2〜3日培養した。KGM-2培地(Clonetics, Inc.)中のP2の一次ヒト表皮ケラチノサイトもまたいくつかの実験において評価した。対照は、陰性対照としての、未処理細胞ならびに非馴化培地からなるものであった。PBS中で短時間洗浄した後、相対的細胞数を、Molecular Probes, Inc. CyQuant細胞増殖キットを用いてDNA蛍光から推定し、データをウェル当たりの相対DNA蛍光として、各条件につき6ウェルとして表した。実験を各細胞系について2回反復した。本明細書における研究において、馴化培地をNouricelという。
継代2代目の一次ヒト表皮ケラチノサイトを、10%(v/v) 対照非馴化培地または試験物質を添加した無血清培地を用いて、コラーゲンコーティング済みスライドガラスチャンバー上で2日間培養した。培養物を洗浄し、パラホルムアルデヒドで固定し、PBS中0.1 % Tween-20で可透過化(permeabilize)した。一次抗体はMab x ZO-1およびRb x Claudin-1 (Zymed, Inc.)であり、それぞれ2 μg/mlで30分間作用させ、その後、蛍光色素コンジュゲート型二次抗体を用いて、核対比染色試薬としてDAPIを添加し、Vectashield (Vector Labs, Inc.)に組み込んで検出した。固定化前に、生きた培養物を位相差照射下で約100x倍率で撮影した。
細胞を、コラーゲンコーティング済み微多孔膜に高細胞密度(100,000/cm2)( Caco-2細胞系の分化を支持することが知られている条件)で接種後、10%(v/v)の<10 kD三次元型間質組織馴化培地浸透物または未処理対照の存在下で、10日間培養した。Caco-2細胞系とNCI-H292細胞系の両方を評価した。培養物を洗浄し、その後改変カルノフスキー(Karnovsky)固定試薬を用いて固定し、その後標準法を用いて電子顕微鏡法のために加工した。
表皮ケラチノサイト、Caco-2細胞、およびNCI-H292細胞の10 cmディッシュ上での単層低密度培養物に、濃縮三次元型間質組織馴化培地または非馴化培地対照を3〜5日間施し、その後mRNAを単離した。cDNAへの変換と蛍光標識後、プールしたcDNAを遺伝子チップアレイとハイブリダイズさせた。約10,000種の既知遺伝子転写産物に対してハイブリダイズしたプローブの蛍光検出は、UC Irvine大学で行い、データはGenespringソフトウェアを用いて解析した。発現プロファイルにおける相対変化を比較しながら正規化蛍光をグラフにした。
三次元型間質組織馴化培地が4種の異なる上皮細胞型の細胞増殖に及ぼす影響の比較を図1に示す。全ての細胞系が応答したわけではなく、またすべての馴化培地が有効であったわけではない。三次元型間質組織馴化培地の細胞増殖に対する影響は細胞型特異的であり、すなわち三次元型間質組織馴化培地は一次表皮ケラチノサイトおよびNCI-H292細胞の両方の細胞増殖を促進したが、Caco-2細胞またはHT-29細胞の大部分については促進しなかった。こうした三次元型間質組織馴化培地処理培養物を位相差顕微鏡法で観察したところ、やはり影響は細胞型特異的であり、すなわちHT-29細胞は形態学的に変更されていなかったが、これに対してケラチノサイト(データ未掲載)、Caco-2細胞およびNCI-H292細胞は変更された。Caco-2およびNCI-H292細胞系の両方は、位相差顕微鏡法で観察したところ、ドーム様構造物の形成を示した。Caco-2細胞系はまた、三次元型間質組織馴化培地を施した後に、免疫蛍光により、アドヘレンスジャンクション(ZO-1)およびタイトジャンクションマーカーの両方の局在変化を示した。
この研究では、C57B1/6マウスにおいて、線維芽細胞からなる三次元型組織由来の馴化培地が、毛包発達に及ぼす影響を評価した。実験は、発毛を誘発する真皮乳頭細胞由来の誘導性シグナルの擬似因子を含有するか否かを調べることを目的とした。真皮線維芽細胞馴化培地により誘導される発毛活性の候補物質としては、Wnt遺伝子産物が挙げられる。なぜならば、(1) Wnt-シグナル伝達は、胎児発育中に核のβ-カテニンを介して行われる; (2)安定型β-カテニン突然変異導入遺伝子はマウスおよびヒトにおいて毛包脂腺腫瘍を形成する、および(3)移植された真皮乳頭は齧歯類において小胞を誘発させ、これにはWntシグナル伝達が必要である、ことが挙げられる。また、毛髪成長誘導には、KGF/FGF-7、ホルモン(T3、PTH、アンドロゲン)、ソニックヘッジホッグ、およびWnt遺伝子産物が関わっていると考えられている。
Claims (20)
- 損傷組織の治療方法であって、損傷組織と、三次元型組織による1種以上の生理活性物質の分泌に適当な条件下で培養した三次元型組織培養物由来の培地を含む組成物とを、接触させることを含む前記方法。
- 損傷組織の治療方法であって、損傷組織と、三次元型組織による1種以上の生理活性物質の分泌に適当な条件下での三次元型組織培養物から得られた培地から少なくも部分精製された少なくとも1種の生理活性物質を含む組成物とを接触させることを含む前記方法。
- 組成物が少なくとも1種のWntタンパク質を含む、請求項1または2記載の方法。
- 1種以上のWntタンパク質が、Wnt5a、Wnt7a、およびWnt11aからなる群より選択される、請求項3記載の方法。
- 組成物が1種以上の増殖因子をさらに含む、請求項3記載の方法。
- 増殖因子が、血管内皮増殖因子(VEGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、上皮増殖因子(EGF)、結合組織増殖因子(CTGF)、およびトランスフォーミング増殖因子(TGF) からなる群より選択される、請求項5記載の方法。
- 損傷組織が心臓組織である、請求項1または2記載の方法。
- 損傷組織が虚血組織である、請求項1または2記載の方法。
- 虚血組織が虚血心臓組織である、請求項8記載の方法。
- 損傷組織が腸組織である、請求項1または2記載の方法。
- 損傷腸組織が小腸、大腸、結腸またはその組み合わせである、請求項10記載の方法。
- 三次元型組織が線維芽細胞を含む、請求項2記載の方法。
- 三次元型組織が幹細胞を含む、請求項1または2記載の方法。
- 1種以上の生理活性物質を含む組成物の製造方法であって、
a) 三次元型組織を生理活性物質の増殖培地への分泌に適した条件下で培養するステップ、
b) 該増殖培地から1種以上の生理活性物質を少なくとも部分精製するステップ、および
c) 該1種以上の部分精製した生理活性物質を製薬上許容される担体に加えるステップ、
を含む前記方法。 - 1種以上の生理活性物質がWntタンパク質である、請求項14記載の方法。
- 1種以上のWntタンパク質が、Wnt5a、Wnt7a、およびWnt11aからなる群より選択される、請求項15記載の方法。
- 組成物が1種以上の増殖因子をさらに含む、請求項15記載の方法。
- 増殖因子が、血管内皮増殖因子(VEGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、上皮増殖因子(EGF)、結合組織増殖因子(CTGF)、およびトランスフォーミング増殖因子(TGF)からなる群より選択される、請求項17記載の方法。
- 三次元型組織が線維芽細胞を含む、請求項14記載の方法。
- 三次元型組織が幹細胞を含む、請求項14記載の方法。
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