CN111601606A - 用于活化的成纤维细胞与免疫细胞的相互作用及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及用于成纤维细胞与一种或多种类型的免疫细胞的功能性相互作用的系统、方法和组合物，使得该相互作用导致对成纤维细胞、一种或多种类型的免疫细胞或两者的修饰。在一些实施方案中，在相互作用期间还使用一种或多种某些物质或使用一种或多种某些物质代替一种类型的细胞。在具体实施方案中，修饰待用于细胞移植疗法的细胞，使其具有降低的免疫原性。

Description

用于活化的成纤维细胞与免疫细胞的相互作用及其用途
本申请要求2017年11月29日提交的美国临时专利申请系列号62/591,858的优先权，其全部内容通过引用并如本文。
技术领域
本公开内容的实施方案至少涉及细胞生物学、分子生物学、免疫学和医学领域。
背景
细胞疗法的移植特别是同种异体移植允许利用“通用供体”方法。同种异体移植细胞的可能性允许利用针对治疗活性优化的细胞。例如，在自体骨髓疗法的情况下，具有血管生成或营养活性的细胞级分随年龄而减少，并进一步与患者的共病如糖尿病或外周动脉疾病复合。利用同种异体细胞的可能性允许施用针对效率优化的细胞产物。
同种异体细胞产物具有被宿主的免疫系统排斥的缺点。已知有两种类型的排除过程。直接排斥是通过受体T细胞受体与供体MHC II分子的结合来刺激的，如经典地由CD4+T细胞所介导的。当受体抗原呈递细胞吞噬供体细胞并将其呈递到MHC I上从而刺激CD8+T细胞时，发生间接排斥。已知在同种异体细胞的排斥中，抗原呈递的直接和间接途径均涉及免疫介导的破坏。目前抑制细胞排斥的手段包括使用钙调神经磷酸酶抑制剂例如环孢霉素，或mTOR抑制剂例如雷帕霉素和依维莫司。
尽管已使用多种同种异体细胞进行了细胞疗法试验，但是各种试验需要使用持续的免疫抑制。不论胎儿来源的干细胞、胰岛或胚胎来源的组织，都已使用了持续的免疫抑制。不幸的是，持续的免疫抑制使个体预先置于增加的感染、瘤形成和器官衰竭(特别是在含有钙调神经磷酸酶抑制剂的方案中，肾衰竭)的风险中。
因此，本领域中需要降低用于治疗目的的细胞的免疫原性。另外，在本领域中需要针对各种医学病况的改进的细胞疗法。
概述
本公开内容的实施方案包括用于修饰细胞和用于细胞疗法的组合物、方法和系统。在具体实施方案中，本公开内容涉及第一类型的细胞与第二类型的细胞和/或某些物质(agent)的相互作用，并且包括由于相互作用而导致的对第一和/或第二类型的细胞的修饰。在具体实施方案中，本公开内容包括组合物、方法和系统，其中成纤维细胞在暴露于某些细胞和/或某些物质后被修饰。在具体实施方案中，本公开内容涉及组合物、方法和系统，其中某些细胞在暴露于成纤维细胞和/或由成纤维细胞产生的某些物质后被修饰。在具体实施方案中，成纤维细胞与一种或多种其他类型的细胞的相互作用(并且任选地，该相互作用还包括一种或多种某些物质)导致成纤维细胞和/或其他类型的细胞的修饰。在具体实施方案中，其他类型的细胞至少包括免疫细胞。
在某些实施方案中，成纤维细胞暴露于一种或多种类型的免疫细胞导致对成纤维细胞和/或免疫细胞的修饰。在某些方面，成纤维细胞和/或由其产生的物质的暴露导致对一种或多种类型的免疫细胞的修饰和/或一种或多种类型的免疫细胞和/或由其产生的物质的暴露导致对成纤维细胞的修饰。在具体实施方案中，一种或多种物质也包括在暴露中并且可以是或可以不是外源提供(例如在它们对环境和/或细胞和/或组织而言是内源的其他情况下)的。
在具体实施方案中，本公开内容的方法离体发生，例如在培养物中。在具体情况下，这些方法是由人手动进行的，并且不包括人体中的普通或随机事件。在具体方面，本公开内容的方法是非天然的。在具体实施方案中，在将一种类型的细胞暴露于另一种类型的细胞的方法中使用的细胞浓度在自然界中不存在，并且在自然界中不会随机发生。在具体实施方案中，在将一种或多种物质暴露于一种或多种类型的细胞的方法中使用的一种或多种物质的浓度在自然界中不存在，并且在自然界中不会随机发生。离体或体外发生的本公开内容涵盖的任何类型的细胞的修饰不会以相同方式在体内天然发生。
本公开内容涵盖细胞的治疗用途，所述细胞包括成纤维细胞、免疫细胞及其混合物。至少在某些情况下，成纤维细胞在暴露于免疫细胞之前已被修饰，例如被活化或暴露于在人体中通常不存在的条件，并且在其他情况下，免疫细胞或其衍生物在暴露于成纤维细胞之前已被修饰，例如被活化。
在一些实施方案中，本公开内容涉及用于降低待用于细胞移植疗法的细胞的免疫原性的系统、方法和组合物。在一般的实施方案中，使细胞群经受一种或多种组合物，所述组合物包含一种或多种类型的培养基和/或一种或多种物质(其能够降低细胞群的免疫原性)。在本公开内容的具体实施方案中，方法涉及细胞群，其中细胞至少包含成纤维细胞，其可以是任何类型的。
在某些实施方案中，本公开内容涉及一种或多种物质降低成纤维细胞的免疫原性的用途，例如以允许移植，包括至少成纤维细胞的同种异体移植而不发生排斥(或异种或同基因移植)。在至少一些情况下，所述物质能够下调成纤维细胞中一种或多种免疫原性分子的表达。
本公开内容的实施方案提供了通过改变培养条件以降低成纤维细胞的免疫原性从而将成纤维细胞用作同种异体(或异种或同基因)治疗细胞的手段。在本公开内容的一个实施方案中，从具有较低免疫原性的来源提取成纤维细胞(例如胎盘成纤维细胞、网膜组织来源的成纤维细胞、脐带血来源的成纤维细胞等)。在另一个实施方案中，例如在离体培养时，将任何水平的免疫原性的成纤维细胞经受干扰素γ(IFN-γ)处理，不受机理的限制，本发明人已证明其降低了免疫原性。在具体实施方案中，通过抑制成纤维细胞引起同种异体反应性T细胞应答的能力来举例说明免疫原性的降低。在本公开内容的具体实施方案中，这些修饰的成纤维细胞被称为“通用供体”成纤维细胞，意味着它们可以被施用至任何个体，包括以不引起受体个体中有害的免疫应答的方式。在某些情况下，将从免疫原性较低的来源中提取的成纤维细胞还经受足够量的IFN-γ，以进一步降低免疫原性。
在本公开内容的一个实施方案中，成纤维细胞离体培养以保持成纤维细胞的生存力和增殖能力。本公开内容提供了对已知培养技术的修改，以减少受体免疫系统对成纤维细胞的识别。在一个实施方案中，成纤维细胞在缺乏异种成分的条件下培养，例如在无异种成分的培养基中；例如，在一些情况下，培养基不含胎牛血清。在具体实施方案中，本公开内容包括用一种或多种另外的物质代替胎牛血清，例如，有助于降低成纤维细胞的免疫原性的那些物质，例如，富含人血小板的血浆、血小板裂解物、脐带血血清、自体血清，和/或一种或多种确定的细胞因子，例如成纤维细胞生长因子1-18、表皮生长因子、白血病抑制因子、胰岛素样生长因子、血管生成素和血管内皮生长因子。
在本公开内容的一个实施方案中，将有效量的如本公开内容涵盖的方法中制备的成纤维细胞施用至个体，以治疗或预防一种或多种医学病况。在具体实施方案中，施用成纤维细胞以刺激新血管形成，该过程称为血管生成。在其他情况下，施用的成纤维细胞用于修复血管缺陷。示例性缺陷包括内皮反应性的丧失、弹性的降低和/或血栓前形成性的降低。尽管成纤维细胞可以直接或间接刺激新血管的形成，但在一些实施方案中，血管生成的刺激是由成纤维细胞释放的一种或多种生长因子和/或成纤维细胞与受体个体中一种或多种类型的细胞之间的相互作用完成的。
本公开内容的具体实施方案提供了用于血管生成疗法的方法。在本领域中，血管生成疗法以前仅限于干细胞；然而，本公开内容的实施方案提供了用成纤维细胞进行的血管生成治疗的方法。在本领域中，血管生成疗法已被描述为“生物学旁路”，其基本思路是通过施用能够诱导侧支化的物质；可以实现更天然的“旁路”类型。在本领域中，已观察到缺血性肌肉响应缺氧而分泌血管生成因子，并且在一定程度上在严重肢体缺血(CLI)的动物模型和人中发生天然血管生成(Milkiewicz等人，2004；van Weel等人，2007)。在本公开内容的一个实施方案中，在缺氧区域或需要新血管形成或修复的任何区域中，例如通过注射、例如肌肉内注射，向受试者施用有效量的通用供体成纤维细胞。
本公开内容的实施方案提供了将通用供体成纤维细胞与一种或多种刺激血管生成的物质共同施用的方法。作为在本公开内容的一个具体实施方案的一个实例，提供了将通用供体成纤维细胞与VEGF共同施用的方法。在本公开内容的一个实施方案中，将来源于已在降低免疫原性的条件下处理的成纤维细胞的通用供体成纤维细胞用于刺激个体的内源性细胞产生VEGF。
在本公开内容的具体实施方案中，提供了例如将通用供体成纤维细胞与FGF-1共同施用的方法。在本领域中，已知细胞因子FGF-1是VEGF的“上游”，因此据信它刺激了许多血管生成过程，从而导致了更成熟的血管的产生(McDonnell等人，2005)。在某些实施方案中，作为FGF-1和/或VEGF的替代或补充，HIF-1α也可以与成纤维细胞共同施用至个体。
在本公开内容的具体实施方案中，一种或多种血管生成剂通过在真核细胞中可操作的一种或多种重组表达载体在通用供体成纤维细胞中表达，并且一种或多种血管生成剂的表达可以通过例如组成型启动子或诱导型启动子或组织特异性启动子调节。在具体实施方案中，例如，载体是病毒载体，例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒，或载体是非病毒载体，例如裸DNA或质粒DNA或微环DNA。
本公开内容的实施方案提供了降低具体类型的成纤维细胞的免疫原性的方法。成纤维细胞可来源于各种组织或器官，例如皮肤、心脏、血管、骨髓、骨骼肌、肝脏、胰腺、脑、包皮，其可通过活检(适当时)或尸检获得。在一些方面，细胞包含成纤维细胞，其可以来自胎儿、新生儿、成体来源或其组合。
在具体实施方案中，用于本公开内容的任何方法中的成纤维细胞可以暴露于某些培养基组分。例如，成纤维细胞可以在补充有(a)一种或多种降低免疫原性的物质，(2)血清，和/或(3)血清替换物的培养基中重悬于离体培养物中。血清可以是任何来源，包括胎牛血清、人血清或血清替代物。在一些实施方案中，血清替代物是指包含细胞因子/生长因子的培养基，在这种情况下，以与血清中发现的浓度相似的浓度提供细胞因子/生长因子，并因此能够以类似于基于血清的培养基所提供的相似的方式允许细胞生长和活性。血清替代培养基的实例在以下美国专利号中有所描述，并通过引用并入本文：9,637,721；9,580,687；6,162,643；6,103,529；6,048,728；7,709,229；4,560,655；和5,324,666。在一些实施方案中，利用人血清或血清替代物来为细胞例如包皮饲养细胞提供无异种成分的环境。在具体实施方案中，在培养之后，当本公开内容的人包皮饲养细胞附着于固相如组织培养板时能够形成单层(Dugdale and Siddall(1969)J.Med.Lab.Technol.26:31-5)。在具体实施方案中，本公开内容的人包皮饲养细胞的这种特性使这些细胞成为合适的通用供体，因为其高的复制能力和在降低免疫原性方面对用IFN-γ治疗的高响应性。在一个实施方案中，用一定浓度的干扰素γ处理成纤维细胞。本领域技术人员将理解，在不同浓度的干扰素γ下，来自不同来源的成纤维细胞可具有不同水平的免疫原性降低。在具体实施方案中，本公开内容提供了用于待进行的评估免疫原性的方法，例如，定量调节混合淋巴细胞反应的能力。在确定是否使用这样的某一成纤维细胞群时，可以考虑通过混合淋巴细胞反应对免疫原性进行的这种评估。
混合淋巴细胞反应可以通过将已用干扰素γ处理的成纤维细胞与同种异体淋巴细胞共培养来进行。通常采用同种异体淋巴细胞的增殖指数来表示刺激性成纤维细胞的免疫原性程度。在本公开内容的一些实施方案中，成纤维细胞在与淋巴细胞培养之前被有丝分裂失活。有丝分裂失活可以通过用丝裂霉素C或其他抑制增殖而不降低生存力的物质处理来进行。当使用化学剂进行有丝分裂失活时，可以将化学剂从细胞上洗掉，以防止抑制响应性淋巴细胞。
在本公开内容的一些实施方案中，可以进行通过响应性淋巴细胞产生的细胞因子的评估。可以评估的细胞因子包括白介素(IL)-1，其与炎症过程和巨噬细胞的刺激相关；IL2，其与T细胞和NK细胞活化相关；干扰素γ，其可活化巨噬细胞并有助于Th1极化；以及IL-12和IL-18，其活化NK细胞并与细胞毒性反应的发展相关。在实施本公开内容的方法的具体实施方案中，有用的是，混合淋巴细胞反应中的响应性淋巴细胞产生较少的炎性细胞因子。相反，也可以在本公开内容的范围内进行免疫抑制或抗炎细胞因子的评估。细胞因子的实例包括刺激Th2细胞的IL-4、刺激除其他以外T调节细胞等的IL10和抑制炎症的TGF-B。
在本公开内容的一些实施方案中，利用成纤维细胞的遗传修饰引起成纤维细胞的免疫原性降低。一种方法提供了遗传修饰，包括用具有降低的免疫原性的细胞如未成熟的树突状细胞进行细胞质转移。在另一个实施方案中，利用基因编辑来选择性切除引起炎症的基因，例如HLA、CD80、CD86、CD40、CD5、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-18、IL-17、IL-21、IL-23和/或IL-27。
在本公开内容的具体实施方案中，例如通过在真核细胞中可操作的重组表达载体在通用供体成纤维细胞中表达一种或多种免疫调节剂，并且所述免疫调节剂的表达可以由组成型启动子或诱导型启动子或组织特异性启动子调节。在具体实施方案中，载体是病毒载体，例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒，或载体是非病毒载体，例如裸DNA或质粒DNA或微环DNA。用于转染的免疫调节剂包括至少以下作为实例：Fas配体、TGF-β、IL-4、IL-10、HLA-G、吲哚胺2,3脱氧酶(IDO)、半乳凝素家族成员、半乳凝素3、精氨酸酶和/或以IL-20。
本公开内容的实施方案包括通过使未成熟的树突状细胞暴露于应激的成纤维细胞来诱导树突状细胞成熟的方法，并且在某些情况下，成纤维细胞受到高热和/或血清剥夺而应激。
在一些实施方案中，存在产生血管生成性巨噬细胞的方法，并且这些方法可包括以下步骤：a)获得单核细胞和/或单核细胞祖细胞；b)在赋予单核细胞和/或单核细胞祖细胞刺激血管生成的能力的条件下，使单核细胞和/或单核细胞祖细胞与成纤维细胞接触。
在某些实施方案中，提供了用于通过向个体施用有效量的已用一种或多种应激诱导刺激预处理的成纤维细胞群来治疗个体的病毒诱导的肝功能衰竭的方法。
本领域的从业者已知各种质量控制手段来执行细胞的临床施用。细胞鉴定标准的实例包括使用诸如流式细胞术、生存力、内毒素含量的手段的标志物鉴定以及微生物和支原体污染的评估。
上文已相当广泛地概述了本公开内容的特征和技术优点，以便可以更好地理解以下的本发明的详述。下文将描述构成本公开内容权利要求主题的本发明的另外的特征和优点。本领域技术人员应该理解，所公开的概念和具体实施方案可以容易地用作修改或设计用于实现本发明的相同目的的其他结构的基础。本领域技术人员还应该认识到，这样的等同构造不脱离所附权利要求书中阐述的本发明的精神和范围。当结合附图考虑时，将从以下描述中更好地理解被认为是本发明的特征的新颖特征(就其组织和操作方法而言)以及进一步的目的和优点。然而，应该明确地理解，提供每个附图仅是出于举例说明和描述的目的，并且不旨在作为对本发明的限制的定义。
附图的简要说明
现在结合附图参考以下描述来更完整地理解本发明。
图1示出了成纤维细胞和/或由其产生的一种或多种物质与一种或多种类型的免疫细胞和/或由其产生的一种或多种物质的相互作用的具体实例。
图2显示了干扰素γ预处理降低成纤维细胞的同种异体刺激活性。
图3证明了干扰素γ处理的成纤维细胞抑制同种异体淋巴细胞的干扰素γ的产生。
图4证明了干扰素γ处理的成纤维细胞刺激同种异体淋巴细胞的白介素4的产生。
图5显示了干扰素γ处理的成纤维细胞抑制同种异体淋巴细胞的TNF-α的产生。
图6表现了富含血小板的血浆的预处理降低成纤维细胞的同种异体刺激活性。
图7显示了用成纤维细胞相对于IFN-γ预处理的成纤维细胞的胶原蛋白诱发的关节炎的治疗。
图8示出了通过成纤维细胞和PRP预处理的成纤维细胞对胶原蛋白诱发的关节炎的治疗。
图9证明了包皮成纤维细胞的添加在离体培养中加速了调节性T细胞(“Treg”)的扩增。在添加脐带血细胞之前，将包皮成纤维细胞以50％汇合度预铺板。“X”符号表示与成纤维细胞和混合物共培养时Treg生长。方形符号表示与单独的成纤维细胞共培养时Treg的生长。三角形符号表示在与单独的混合物培养时Treg的生长。培养开始时，添加50,000个Treg。通过流式细胞术进行Treg的计数。
图10A和10B显示了淋巴细胞活化的成纤维细胞显著降低丙氨酸氨基转移酶(ALT；图10A)和天冬氨酸氨基转移酶(AST；图10B)的水平。
图11A和11B显示了与CCL4和活化的成纤维细胞相比，用CCL4处理的小鼠(图11A)中肝脏的病理变化，包括肝脏的组织学切片(图11B)。
图12显示了在暴露于成纤维细胞处理的单核细胞、单独的成纤维细胞或单独的单核细胞之后，来自HUVEC培养物的VEGF产量。
图13显示了在暴露于成纤维细胞处理的单核细胞、单独的成纤维细胞或单独的单核细胞之后，来自HUVEC培养物的IL-33产量。
图14显示了在暴露于成纤维细胞处理的单核细胞、单独的成纤维细胞或单独的单核细胞之后，HUVEC细胞的增殖。
图15显示了在暴露于成纤维细胞处理的PBMC、单独的PBMC或单独的成纤维细胞之后，HUVEC细胞的增殖。
图16证明了与对照成纤维细胞相比，在与应激的成纤维细胞培养时观察到CD80的表达增加。
图17显示了与对照成纤维细胞相比，在与应激的成纤维细胞培养时观察到CD86的表达增加。
图18显示了通过在高热或血清剥夺的成纤维细胞上培养而增加的CD8增殖。
图19显示了使用培养的细胞治疗心肌梗塞小鼠模型。菱形代表单核细胞，正方形是成纤维细胞，三角形是生理盐水，“x”是单核细胞和成纤维细胞的组合。
图20A-20C显示了在将患有GVHD的个体暴露于有效量的成纤维细胞后，C反应蛋白减少。
图21A-21C显示了在将患有GVHD的个体暴露于有效量的成纤维细胞之后，TNFα减少。
图22A-22C显示了在将患有GVHD的个体暴露于有效量的成纤维细胞之后，IL-6减少。
图23A-23C显示了在将患有GVHD的个体暴露于有效量的成纤维细胞之后，IFNγ产生增加。
图24A-24C显示了在将患有GVHD的个体暴露于有效量的成纤维细胞之后，天然杀伤(NK)活性增强。
详述
I.定义的示例
为了与长期的专利法惯例保持一致，在本说明书中使用的词语“一个(a)”和“一种(an)”在本说明书包括权利要求中与词语包含一起使用时表示“一个或多个/一种或多种”。本公开内容的一些实施方案可以由本公开内容的一个或多个元件、方法步骤和/或方法组成或基本上由其组成。考虑了能够相对于本文描述的任何其他方法或组合物实施本文描述的任何方法或组合物。
如本文所用，术语“大约”或“约”是指数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相对于参考数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的变化多达30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％。在具体实施方案中，当在数值之前时，术语“大约”或“约”表示该值加或减15％、10％、5％或1％的范围。就生物系统或过程而言，该术语可指在值的一个数量级内，优选在5倍内，更优选在2倍内。除非另有说明，否则术语“大约”表示在具体值的可接受的误差范围内。
如本文所用，术语“活化的成纤维细胞”是指用能够诱导细胞中的一种或多种以下改变的一种或多种刺激处理的成纤维细胞：代谢、免疫学、生长因子分泌、表面标志物表达和/或微泡的产生。
如本文所用，术语“活化的免疫细胞”是指用能够诱导细胞中的一种或多种以下改变的一种或多种刺激物处理的免疫细胞：代谢、免疫学、生长因子分泌、表面标志物表达和/或微泡的产生。
如本文所用，术语“施用(administered)”或“给予(administering)”是指向个体提供组合物以使得该组合物具有其对患者的预期效果的任何方法。例如，一种施用方法是通过间接机制使用医疗器械例如但不限于导管、涂药枪、注射器等进行的。第二种示例性施用方法是通过直接机制例如局部组织施用、口服摄入、经皮贴剂、局部、吸入、栓剂等进行的。
如本文所用，“同种异体的”是指来自另一机体的组织或细胞，尽管来自相同物种的一个或多个个体，所述组织或细胞在天然环境中是免疫学不相容的或能够是免疫学不相容的。
如本文所用，术语“同种异体移植”是指器官、组织和/或细胞从供体到受体的移植，其中供体和受体是不同的个体，但是属于相同的物种。通过这种程序移植的组织称为同种异体移植物或同种移植物。
如本文所用，术语“同种异体刺激”和“同种异体反应”是指免疫系统响应于同种抗原或“同种异体抗原”或表达不同HLA单体型的细胞而引起的刺激和反应。
如本文所用，术语“血管生成”是指涉及从先前存在的血管中生长新血管的生理过程，并且包括初始血管生成，通过从现有血管启动而形成新血管以及分裂血管生成(套叠(intussusception)：通过分裂现有血管形成新血管)。
如本文所用，术语“自身免疫”是指生物体针对其自身健康细胞和组织的免疫应答系统。
如本文所用，“自体的”是指来源于或转移自同一个体的身体的组织或细胞(即，自体供血；自体骨髓移植)。
如本文所用，术语“自体移植”是指器官、组织和/或细胞从个体的身体的一部分移植到同一个体的另一部分，即供体和受体是同一个体。通过这种“自体”程序移植的组织称为自体移植物或自身移植物。
术语“生物活性”是指具有结构、调节或生化功能的任何分子。例如，生物活性可以例如通过在缺乏蛋白质活性的细胞中恢复野生型生长来确定。缺乏蛋白质活性的细胞可以通过许多方法(即例如，点突变和移码突变)产生。通过用表达蛋白质、其衍生物或其部分的表达载体转染缺乏蛋白质活性的细胞来实现互补。在其他情况下，如果基因产物(例如蛋白质)的片段保留了全长基因产物的活性，则该片段可以被认为具有生物活性(或其可称为功能活性)，尽管其可以处于全长基因产物的活性的降低但可检测的水平。
“细胞培养物”是包含活细胞(无论其是静息的、衰老的或(主动)分裂的)的人造体外系统。在细胞培养物中，细胞在适当的温度下(通常为37℃)并在通常含有氧气和二氧化碳的气氛中生长和维持。每种细胞类型的培养条件可能会发生很大变化，并且具体细胞类型的条件的变化可导致表达不同的表型。培养系统中最常见的变化因素是生长培养基。生长培养基可以在营养成分的浓度、生长因子和其他成分的存在上有所不同。用于补充培养基的生长因子通常来源于动物血液，例如小牛血清。
“慢性伤口”是指具有与缺陷愈合相关的病况、疾病或疗法的患者中自伤口出现后十二周内尚未完全闭合的伤口。与缺陷愈合相关的病况、疾病或疗法包括例如糖尿病、动脉功能不全、静脉功能不全、长期类固醇使用、癌症化学疗法、放射疗法、放射线照射和营养不良。慢性伤口包括导致炎症过度的缺陷(例如，IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和MMP的过量产生)、恰当愈合所需的重要生长因子的缺乏、细菌过度生长和成纤维细胞的衰老。慢性伤口具有不能覆盖伤口的整个表面并且容易发生细菌定植的上皮层。
如本文所用，术语“侧支化(collateralization)”是指供应相同的末端器官或血管床的一个或多个血管生长为不能充分足够地供应该末端器官或血管床的另一血管。
在整个说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包括(comprise)”、“包含(comprises)”和“含有(comprising)”将被理解为暗示包括陈述的步骤或元件或步骤或元件组，但不排除任何其他步骤或或元件或步骤或或元件组。“由……组成”是指包括且限于短语“由……组成”之后的任何内容。因此，短语“由……组成”表示所列出的元件是必需的或强制性的，并且不存在其他元件。“基本上由……组成”是指包括在短语之后列出的任何元件，并且限于不干扰或促成本公开内容中针对所列元件所规定的活动或动作的其他元件。因此，短语“基本上由……组成”表示所列出的元件是必需的或强制性的，但是没有其他元件是可选的，并且其他元件取决于它们是否影响所列元件的活动或动作而可以存在或不存在。
如本文所用，术语“药物”、“药剂(agent)”或“化合物”是指能够被施用以实现期望效果的任何药理活性物质。药物或化合物可以是合成的或天然存在的非肽、蛋白质或肽、寡核苷酸或核苷酸(DNA和/或RNA)、多糖或糖。
“生长因子”可以是能够刺激细胞增殖和/或细胞分化和/或细胞迁移的天然存在的、内源性或外源性蛋白质或重组蛋白质。
如本文所用，术语“个体”是指可以或可以不被容纳在医疗设施中并且可以被视为医疗设施的门诊患者的人或动物。个体可能正在通过网络接收一种或多种医疗成分。个体可以包括任何年龄的人或非人动物，因此包括成人和青少年(即儿童)和婴儿。非期望的是术语“个体”意味着需要医学治疗，因此，无论是临床还是支持基础科学研究，个体可以自愿或非自愿地参与实验。术语“受试者”或“个体”可以互换使用，并且是指作为方法或材料的对象的任何生物或动物受试者，包括哺乳动物例如人、实验动物(例如灵长类、大鼠、小鼠、兔子)、牲畜(例如牛、绵羊、山羊、猪、火鸡和鸡)、家庭宠物(例如狗、猫和啮齿动物)、马和转基因非人动物。
如本文所用，术语“局部缺血”或“局部缺血病况”是指对器官或身体的一部分的血液供应不足。这样的病况可以包括心脏缺血、缺血性结肠炎、肠系膜缺血、缺血性中风、脑缺血、肾缺血和肢体缺血。
“间充质干细胞”或“MSC”是指这样的细胞，其例如(1)粘附于塑料，(2)表达CD73、CD90和CD105抗原，但为CD14、CD34、CD45和HLA-DR阴性的，和(3)具有分化为成骨、成软骨和生脂谱系的能力。在具体实施方案中，间充质干细胞不表达实质水平(例如，与基线相比大于50％)的HLA-DR、CD117、CD45或其组合。如本文所用，“间充质基质细胞”(其也可以称为“间充质干细胞”)或“MSC”可来源于任何组织，包括但不限于骨髓、脂肪组织、羊水、子宫内膜、滋养细胞来源的组织、脐带血、脐带胶质、胎盘、羊膜组织、来源于多能干细胞以及牙齿。如本文所用，“间充质基质细胞”或“MSC”包括在最初从组织中分离时为CD34阳性但类似于关于表型和功能描述的细胞的细胞。如本文所用，“MSC”包括使用选自以下的细胞表面标志物从组织分离的细胞：NGF-R，PDGF-R，EGF-R，IGF-R，CD29，CD49a，CD56，CD63，CD73，CD105，CD106，CD140b，CD146，CD271，MSCA-1，SSEA4，STRO-1和STRO-3或它们的任意组合，并且在扩增之前或之后满足ISCT标准。如本文所用，“间充质基质细胞”或“MSC”包括在文献中描述为以下的细胞：骨髓基质干细胞(BMSSC)，骨髓分离的成体多能诱导细胞(MIAMI)细胞，多能成体祖细胞(MAPC)，间充质成体干细胞(MASCS)，
Figure BDA0002581683610000141
remestemcel-L，间充质前体细胞(MPC)，牙髓干细胞(DPSC)，PLX细胞，PLX-PAD,
Figure BDA0002581683610000142
Ixmyelocel-T,MSC-NTF,NurOwnTM,StemedyneTM-MSC,
Figure BDA0002581683610000151
StempeucelCLI,StempeucelOA,HiQCell,Hearticellgram-AMI,
Figure BDA0002581683610000152
Figure BDA0002581683610000153
Homeo-GH,AC607,PDA001,SB623,CX601,AC607,子宫内膜再生细胞(ERC)，脂肪来源的干细胞和再生细胞(ADRC)。
在整个说明书中对“一个实施方案”、“一种实施方案”、“具体实施方案”、“相关实施方案”、“某个实施方案”、“另外的实施方案”或“其他实施方案”或其组合的引用意指结合实施方案描述的具体特征、结构或特性包括在本公开内容的至少一个实施方案中。因此，在整个说明书中各个地方出现的前述短语不一定都指的是同一个实施方案。此外，在一个或多个实施方案中，可以以任何合适的方式组合具体的特征、结构或特性。
如本文所用，术语“药学上”或“药学上可接受的”是指当施用至动物或人时不产生不利的、过敏的或其他不良反应的分子实体和组合物。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂，或分散介质，包括但不限于水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，其合适的混合物，以及植物油、包衣、等渗和吸收延迟剂、脂质体、可商购的清洁剂等。补充的生物活性成分也可掺入此类载体中。
当提及未经治疗的受试者中相对于经治疗的受试者的任何症状表达时，术语“减少”、“抑制”，“变少”、“压制”、“降低”、“防止”和语法上的等同物(包括“较低”、“较小”等)，是指经治疗的受试者中症状的数量和/或程度比未经治疗的受试者中任何医学训练人员认为临床相关的任何量低。在一个实施方案中，经治疗的受试者中症状的数量和/或程度比未经治疗的受试者中症状的数量和/或程度低至少10％，至少25％，至少50％，至少75％和/或至少90％。
“治疗剂”是指在调节血管生成和/或伤口愈合中具有“治疗功效”，并且如果该剂量的治疗剂在施用至需要调节血管生成的受试者(例如动物模型或人患者)时足以引起血管生成活性的显著调节(即，增加或减少)，则该治疗剂的量被称为“血管生成调节量”。
如本文所用，术语“治疗有效量”与“有效量”、“治疗有效剂量”和/或“有效剂量”同义，并且是指将在有需要的个体中引起从业者寻求的生物学、美容学或临床反应的化合物的量。作为一个实例，有效量是足以降低一组细胞的免疫原性的量。作为非限制性实例，有效量是足以促进形成足以支持移植的组织的血液供应的量。作为另一个非限制性实例，有效量是足以促进新血管和相关脉管系统(血管生成)的形成的量和/或足以促进现有血管和相关脉管系统的修复或重塑的量。本领域技术人员可以使用本文提供的指导确定用于所公开的方法的具体应用的合适的有效量。例如，可以从本说明书中描述的体外和体内测定中推断出有效量。本领域技术人员将认识到，可以在整个治疗过程中监测个体的病况，并且可以相应地调节本文公开的化合物或组合物的有效量。
如本文所用，术语“移植”是指获取活组织或细胞并将其植入到身体的另一部分或另一身体的过程。
“治疗(treatment)”、“医疗(treat)”或“疗法(treating)”是指减少疾病或病况的作用的方法。治疗还可以指减轻疾病或病况本身而不仅仅是症状的方法。治疗可以是从治疗前水平的任何降低，并且可以是但不限于疾病、病况或疾病或病况的症状的完全消融。因此，在所公开的方法中，“治疗”可以指已建立的疾病或疾病进展的严重性的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的减少，包括疾病的至少一种症状的严重程度的减少。例如，如果与相同受试者或对照受试者中的治疗前水平相比可检测到细胞免疫原性降低，则所公开的降低细胞免疫原性的方法被认为是治疗。因此，与天然水平或对照水平相比，减少可以是10、20、30、40、50、60、70、80、90、100％或其之间的任何量的减少。应理解并在本文中预期“治疗”不一定是指疾病或病况的治愈，而是还包括疾病或病况的改善。在具体实施方案中，治疗是指减轻至少一种症状的严重性或程度，并且可替代地或另外地可以指至少一种症状的发作延迟。
II.成纤维细胞与免疫细胞的功能性相互作用
在本公开内容的具体实施方案中，在第一和第二不同类型的细胞之间存在生物学的、功能上的交叉效应，并且该相互作用(直接或间接地)导致两种类型的细胞中的至少一种具有一种或多种修饰，使得可以用于具体的治疗目的。在一些情况下，在第一类型的细胞和第二类型的细胞之间存在生物学的、功能上的交叉效应，并且该相互作用导致每种类型的细胞具有一个或多个修饰，使得两种类型的细胞都可以用于各自的治疗目的。在一些实施方案中，成纤维细胞暴露于免疫细胞(包括单核细胞、单核细胞祖细胞、PBMC、MSC等)或其他细胞使各个成纤维细胞和免疫或其他细胞能够表达一种或多种物质和/或具有在没有暴露的情况下各个细胞无法执行的一种或多种活性。在具体实施方案中，成纤维细胞和免疫细胞或其他细胞相对于彼此是同种异体的，但是在其他实施方案中，它们彼此是自体的。
在具体实施方案中，本公开内容涉及产生活化的成纤维细胞或活化的免疫细胞或活化的免疫细胞衍生物的体外方法，其包括在使得来自免疫细胞的一种或多种物质活化成纤维细胞成为活化的成纤维细胞的条件下将成纤维细胞暴露于免疫细胞的步骤。在具体实施方案中，除此以外，来自成纤维细胞的一种或多种抗原触发免疫细胞产生一种或多种细胞因子以产生活化的免疫细胞。在某些实施方案中，存在通过在使得一种或多种生长因子和/或一种或多种细胞因子活化成纤维细胞成为活化的成纤维细胞的条件下使成纤维细胞暴露于一种或多种生长因子和/或一种或多种细胞因子来产生活化的成纤维细胞或活化的免疫细胞或活化的免疫细胞衍生物的体外方法。
该方案的实施方案在图1中示出。为了简洁起见，以下在图1的实例中，术语“单核细胞”将仅用作外周血单核细胞的代表，例如免疫淋巴细胞或其他细胞包括例如MSC；可以利用树突状细胞。在图1的元件1中，成纤维细胞(来自任何来源)和单核细胞彼此暴露和/或接触，例如在能够维持细胞生存力并允许分子与细胞外囊泡相互作用的液体培养基中。结果，成纤维细胞抗原触发从单核细胞产生细胞因子。在某些情况下，代替使成纤维细胞暴露于单核细胞或除了使成纤维细胞暴露于单核细胞以外，还使溶液中的细胞因子和/或生长因子暴露于成纤维细胞。在至少某些情况下，单核细胞或游离细胞因子活化成纤维细胞中的免疫反应，从而活化成纤维细胞以产生“愈合/损伤反应”并降低成纤维细胞的免疫原性(元件2)。至少在某些情况下，这种免疫原性的降低促进了成纤维细胞在不是成纤维细胞所最初来源的个体中的使用。
所得的活化的成纤维细胞现在可以表达一种或多种某些活化标志物和/或产生一种或多种生长因子和/或一种或多种细胞因子(例如，VEGF、EGF、IL-4、IL-10等)(元件3)，从而在具体实施方案中(元件4a)，这些因子可用于许多治疗性干预(例如，血管生成、炎症反应减少等)。在元件4a中，患有一系列疾病的个体可以接受活化的成纤维细胞治疗，以减轻其一种或多种症状，例如，内源性自身免疫活性、慢性炎症、T细胞过度活跃或肝再生。
另外或可替代地，暴露于成纤维细胞后的共培养的单核细胞(或由其产生的细胞)可用于治疗一种或多种其他疾病，例如，使用M1-to-M2活化的巨噬细胞用于促进伤口愈合和/或生成T调节细胞以例如抑制自身免疫(元件4b)。
在本公开内容的一个实施方案中，向个体施用通用供体成纤维细胞以刺激新血管形成，该过程称为血管生成。在一些实施方案中，通过成纤维细胞释放的一种或多种生长因子和/或成纤维细胞与受体的细胞之间的相互作用来完成血管生成的刺激。在具体实施方案中，这样的成纤维细胞已至少暴露于IFN-γ。
本公开内容的具体实施方案提供了用于血管生成治疗的方法。本公开内容的实施方案提供了用成纤维细胞进行的血管生成治疗的方法。在本公开内容的某些实施方案中，出于刺激血管生成的目的，向受试者施用治疗有效量的通用供体成纤维细胞。在某些情况下，将成纤维细胞提供给个体而没有刺激血管生成的预期目的，但是成纤维细胞仍然刺激血管生成。本公开内容的实施方案提供了将通用供体成纤维细胞与一种或多种物质(包括一种或多种刺激血管生成的物质)共同施用的方法。
在本公开内容的一个具体实施方案中，提供了用于通用供体成纤维细胞与治疗有效量的一种或多种生长因子例如VEGF包括纯化的VEGF的共同施用的方法。其他生长因子包括以下：HGF、FGF-1、FGF-2、FGF-5、EGF、BDNF、PDGF和/或血管生成素。在本公开内容的一个实施方案中，通用供体成纤维细胞用于刺激从个体的细胞产生一种或多种生长因子(例如VEGF)。在本公开内容的一个具体实施方案中，提供了用于通用供体成纤维细胞与治疗有效量的FGF-1例如纯化的FGF-1(作为一个实例)的共同施用的方法。
在本公开内容的具体实施方案中，一种或多种血管生成剂通过在真核细胞中可操作的重组表达载体在本公开内容的通用供体成纤维细胞中表达，并且所述血管生成剂的表达可以由组成型启动子或诱导型启动子或组织特异性启动子调节。在具体实施方案中，载体是病毒载体，例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒，或载体是非病毒载体，例如裸DNA或质粒DNA或微环DNA。在具体情况下，重组表达的血管生成剂可以包括VEGF、FGF-1、FGF-2、FGF-5、EGF、血管生成素、HIF-1-α、PDGF、HGF或其组合。
尽管在具体实施方案中，两种类型的细胞和/或其一种或多种物质之间存在交叉效应，但是在某些情况下，第一种类型的细胞被第二种类型的细胞修饰而此时第二种类型的细胞不伴随地被第一种类型的细胞修饰。
以下实施方案举例说明了在成纤维细胞和/或免疫细胞彼此伴随暴露(和/或暴露于某些物质)和随后各自细胞类型的修饰之后使用成纤维细胞和/或免疫细胞的某些应用。
A.降低离体培养的细胞的细胞免疫原性
在本公开内容的一些实施方案中，存在降低细胞群的免疫原性的方法，其中使所述群体经受包含IFN-γ和任选地一种或多种另外的物质和/或条件的组合物。
在一般的实施方案中，使细胞群经受包含一种或多种具体培养基和/或一种或多种物质的一种或多种组合物，使得该组合物能够降低细胞群的免疫原性。在本公开内容的具体实施方案中，方法涉及细胞群，其中所述细胞是任何类型的成纤维细胞，并且所述成纤维细胞被修饰以使得它们具有降低的免疫原性并且可以在治疗能力上加以利用。在某些实施方案中，成纤维细胞可以是任何种类，例如包括胎盘成纤维细胞或包皮成纤维细胞。在其他实施方案中，修饰成纤维细胞以外的细胞，使得其与不存在该方法时相比具有降低的免疫原性，使得该细胞可以是胰腺β细胞、胰岛、肝细胞、神经元、软骨细胞、多能干细胞或其衍生物；这样的细胞可以或可以不在与一种或多种类型的成纤维细胞的混合物中。在其中细胞是多能干细胞的实施方案中，干细胞可包括例如诱导性多能干细胞、应激诱导干细胞、孤雌生殖来源的干细胞、胚胎干细胞、体细胞核转移来源的干细胞或其衍生物。在某些情况下，本公开内容的方法涉及自体细胞。在其他情况下，本公开内容的方法涉及同种异体细胞、异种细胞或同基因细胞。
本公开内容的实施方案提供了通过改变培养条件以降低成纤维细胞的免疫原性来利用成纤维细胞(或如上所述的其他类型的细胞)作为同种异体治疗细胞的手段。在本公开内容的一个实施方案中，从具有较低免疫原性的来源(例如胎盘成纤维细胞等)提取成纤维细胞。在另一个实施方案中，将成纤维细胞离体培养并经受干扰素γ(IFN-γ)，不受机理的限制，本发明人已证明其降低免疫原性。免疫原性的降低可以通过抑制成纤维细胞引起同种异体反应性T细胞应答的能力来举例说明。
在具体实施方案中，本公开内容提供了用于待进行的评估免疫原性的方法，例如，定量调节混合淋巴细胞反应的能力。混合淋巴细胞反应是本领域众所周知的。通常，混合淋巴细胞反应是通过将成纤维细胞(在这种情况下，已用干扰素γ处理)与同种异体淋巴细胞一起共同养来进行的。在某些实施方案中，指示免疫原性的调节的混合淋巴细胞反应的参数包括T细胞增殖、细胞因子分泌和细胞毒性。用于定量T细胞增殖、细胞因子分泌和细胞毒性的方法是本领域众所周知的。在某些实施方案中，可以通过定量一种或多种细胞因子的分泌来确定免疫原性的调节，所述细胞因子包括TNF-α、干扰素γ、白介素(IL)-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-33或其组合。
在具体实施方案中，本公开内容提供了涉及向需要其的个体施用免疫原性降低的细胞的方法。免疫原性降低的细胞群可以根据需要施用。取决于所需的反应、施用方式、细胞的寿命和/或存在的细胞数量，可以采用各种方案。
B.用于免疫调节的细胞移植疗法
自身免疫疾病的特征在于免疫系统针对内源性组织的过度反应。免疫系统错误地将内源性组织识别为要战斗的异物。这导致严重的炎症反应，其导致受其影响的器官受损。T淋巴细胞或T细胞在区分内源性和外源性结构中起着重要的作用，它们在胸腺中“受训”以仅对接在内源性细胞表面分子(即所谓的MHC分子)上，因此可以耐受内源性结构。
在自身免疫疾病中，一组T细胞表现异常。除了抵抗外来分子和生物的防御功能外，它们现在还攻击内源结构。器官或组织被认为是外源的。可能会有各种后果：如果重要结构受到影响，那么自身免疫性疾病将是致命的。免疫系统指导其针对这些结构的防御，开动细胞和还有体液防御反应，并形成自身抗体，结果，随着时间的流逝，受影响的器官停止发挥功能。最常见的是，免疫系统被削弱，并且身体变得对各种类型的疾病敏感。在某些情况下，对外源物质的识别也被破坏，结果，不能再有效地防止例如变性癌细胞的扩散，并且受影响的细胞对传染病更敏感。在疾病过程中，免疫系统的细胞破坏内源性结构，而身体的修复机制则试图尽可能地再生受损的器官部分。通常，在不进行治疗的情况下，防御系统的这种错误攻击将持续一生或直至彻底破坏目标结构。
根据受影响的器官治疗自身免疫疾病。在这种情况下，因果疗法的基本原理是通过施用免疫抑制剂例如可的松来抑制免疫系统的活性。这些物质的特征在于多种全身性副作用和相互作用，正因如此，已尝试开发特别影响牵涉疾病事件的机制的新药。
在本公开内容的一个实施方案中，将修饰的成纤维细胞施用至个体以治疗自身免疫或炎性病况。在本公开内容的一些实施方案中，成纤维细胞离体培养并经受降低其免疫原性的条件，然后将成纤维细胞用于刺激抗炎和/或免疫调节特性。其他实施方案涉及为了治疗自身免疫和/或炎性病况而向需要其的个体施用细胞的方法。
本公开内容涉及用于降低在细胞移植治疗中使用的细胞的免疫原性的系统、方法和组合物。在一般的实施方案中，使细胞群经受一种或多种组合物，所述组合物包含一种或多种类型的培养基和/或一种或多种物质(其能够降低细胞群的免疫原性)。在本公开内容的具体实施方案中，方法涉及细胞群，其中所述细胞至少包含成纤维细胞。
本公开内容的实施方案提供了通过改变培养条件以降低成纤维细胞的免疫原性来利用成纤维细胞作为同种异体治疗细胞的手段。在本公开内容的一个实施方案中，从具有较低免疫原性的来源(例如胎盘成纤维细胞等)提取成纤维细胞。在另一个实施方案中，成纤维细胞例如在离体培养时经受干扰素γ(IFN-γ)，不受限于机理，本发明人已证明其降低免疫原性。在具体实施方案中，通过抑制成纤维细胞引起同种异体反应性T细胞应答的能力来举例说明免疫原性的降低。在本公开内容的具体实施方案中，这些修饰的成纤维细胞是通用供体成纤维细胞。
本公开内容的某些方法涉及降低任何种类的成纤维细胞的免疫原性，包括作为实例的包皮成纤维细胞。在某些实施方案中，成纤维细胞重悬浮于培养基中的离体培养物中，所述培养基是例如补充有血清或血清替代物的培养基。血清可以是任何来源，包括胎牛血清、人血清或血清替代物。在某些实施方案中，利用人血清或血清替代物以给成纤维细胞(例如，包皮饲养细胞)提供无异种成分的环境。在一个实施方案中，用一种或多种一定浓度的IFN-γ处理成纤维细胞。
本公开内容的实施方案涉及使用自体或同种异体的成纤维细胞治疗炎性和自身免疫病况的系统和方法。本公开内容的方法和组合物包括用于治疗炎症和自身免疫病况的某些经操纵的细胞。特别地，细胞包括至少任何种类的成纤维细胞。公开了操纵成纤维细胞的手段，以及不同组织来源的成纤维细胞，其主动抑制炎症和/或自身免疫过程。在本公开内容的一个实施方案中，成纤维细胞被利用来抑制免疫应答，并且还被用作预防和/或治疗自身免疫疾病的细胞疗法。在一个实施方案中，成纤维细胞被产生或被操纵并且被用于混合淋巴细胞反应中以评估它们抑制免疫活化的能力。在一个具体实施方案中，用一种或多种具体的物质和/或条件处理成纤维细胞，以能够直接或间接地治疗炎性和/或自身免疫过程。在具体实施方案中，物质包含干扰素γ和/或富含血小板的血浆，并且在某些情况下，至少干扰素γ和/或富含血小板的血浆(和/或富含血小板的裂解物)可以赋予成纤维细胞直接或间接主动抑制免疫反应的能力。在这些条件下培养的成纤维细胞被施用至患有自身免疫性或炎性病症或处于患有自身免疫性或炎性病症的风险的个体。施用途径、剂量和频率取决于疾病过程以及疾病阶段，并且可以根据医学中的常规实践进行优化。
在一个实施方案中，同种异体(或异种或同基因)成纤维细胞以非操纵方式(例如，无需事先暴露于一种或多种具体物质，例如干扰素γ)施用至个体，但选自由免疫调节活性天然表征的来源，例如胎盘成纤维细胞或与脂肪组织相关的成纤维细胞。在本公开内容的其他实施方案中，在能够诱导逆分化的条件下培养任何成纤维细胞，以赋予成纤维细胞不成熟的表型，其中该不成熟的表型与增强的抗炎和/或免疫调节潜力相关。例如，成纤维细胞可以在一种或多种组蛋白脱乙酰酶抑制剂例如丙戊酸的存在下培养(Moon等人，2008；Huang等人，2011)。除HDAC抑制剂外，在本公开内容的上下文中还可以使用其他诱导成纤维细胞的去分化的手段，例如8-Br-cAMP(Wang等人，2011)；M-CSF处理(Li等人，2016)；暴露于reveresine(Li等人，2016)；和/或暴露于干细胞提取物(Xiong等人，2014)。成纤维细胞去分化的表征可以通过评估细胞外标志物(例如CXCR4，VEGFR-2，CD34和/或CD133)以及细胞内标志物(例如SOX-2，NANOG和/或OCT-4)来进行。
在本公开内容的一些实施方案中，已去分化的可以用于免疫调节的成纤维细胞表达选自以下的一种或多种标志物：端粒酶、Nanog、Sox2、β-III-微管蛋白、NF-M、MAP2、APP、GLUT、NCAM、NeuroD、Nurr1、GFAP、NG2、Olig1、碱性磷酸酶、波形蛋白、骨结合素、骨保护蛋白、Osterix、降脂蛋白、促红细胞生成素、SM22-α、HGF、c-MET、α-1-抗胰蛋白酶、血浆铜蓝蛋白、AFP、PEPCK 1、BDNF、NT-4/5、TrkA、BMP2、BMP4、FGF2、FGF4、PDGF、PGF、TGFα、TGFβ、VEGF及其组合。
在本公开内容的一个实施方案中，将成纤维细胞与一种或多种具有免疫调节特性的物质一起施用。这样的物质包括以下实例：1)羟氯喹，其部分充当toll样受体(TLR)7/9拮抗剂，从而降低先天免疫活化(Sun等人，2007)；2)来氟米特，一种抗代谢物，其抑制嘧啶合成和蛋白酪氨酸激酶活性(Chong等人，1999)，其导致抑制T细胞反应(Dimitrova等人，2002)，并且还被证明抑制树突状细胞(DC)活化(Kirsch等人，2005)；3)可注射金化合物(如金诺芬)，已证明其直接或通过代谢产物例如双氰金(i)抑制T细胞和抗原呈递细胞活化(Tepperman等人，1999；Han等人，2008)，以及导致Th2偏差(Kim等人，2001)；4)柳氮磺胺吡啶，其自1950年以来一直使用，主要通过抑制环氧化酶和脂氧合酶起作用(Taggart等人，1987)；和5)氨甲蝶呤，一种抑制T细胞活化和增殖并且是RA的黄金标准之一的抗叶酸剂(Bansard等人，2009)。通常，使用改变疾病的抗风湿药(DMARD)与糖皮质激素的组合，或者可选择地施用一个或多个脉冲的高剂量糖皮质激素以引起炎症的一般性抑制(Bijlsma等人，2006)。所用成纤维细胞的浓度取决于疾病的阶段，以及患者的病史和对先前治疗的反应性。
在本公开内容的一个实施方案中，将待用于免疫调节的成纤维细胞进行遗传工程改造，例如以表达：a)一种或多种自身抗原；和/或b)一种或多种免疫调节蛋白。随后将工程改造的细胞用于诱导免疫耐受。至少在某些情况下，个体的特征和疾病可能决定将哪些基因用于成纤维细胞的工程改造。例如，在1型糖尿病的情况下，本领域已知许多自身抗原，例如IGRP(Fuchs等人，2017)、IA-2(Guerra等人，2016)、胰岛素原-2(Babon等人，2016)和GAD65(Phelps等人，2016)。在这些情况下，可以将自身抗原以多核苷酸形式转染到成纤维细胞中，然后培养成纤维细胞以允许免疫调节，或用允许免疫调节的基因转染。用于转染以诱导免疫调节的特别感兴趣的基因至少包括以下基因：Fas配体、TGF-β、IL-4、IL-10、HLA-G、吲哚胺2,3脱氧酶、半乳凝素家族成员、半乳凝素3、精氨酸酶和/或IL-20(de Jesus等人,2016；Wang等人,2011；Zhao等人,2010；Min等人,2001；Cancedda等人,2001)。可以将本文描述的任何基因或其活性部分克隆到哺乳动物表达构建体中，所述哺乳动物表达构建体包含能够在成纤维细胞中表达的启动子序列，例如CMV启动子(Artuc等人,Exp.Dermatol.1995,4:317-21)。合适的构建体的实例包括但不限于pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pGL3、PzeoSV2(+/-)、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto(其各自可商购自例如Invitrogen)，或pSH表达载体，其使得能够在人包皮细胞中实现调节的多核苷酸表达(Ventura and Villa,1993,Biochem.Biophys.Commun.192:867-9)。逆转录病毒载体和包装系统的实例是可从Clontech,San Diego,Calif.,USA商购的那些，包括Retro-X载体pLNCX和pLXSN，它们允许克隆到多个克隆位点中，并且转基因从CMV启动子转录。还包括来源于Mo-MuLV的载体，例如pBabe，其中转基因将从5'LTR启动子转录。在完成质粒转染后，通过允许从组织培养板分离的方法，例如通过胰蛋白酶消化，收获成纤维细胞，并转移至6孔板(Nunc，Denmark)或24孔板(Nunc)中进行增殖。转染后约3天，将细胞培养基更换为适合于修饰的成纤维细胞的增殖和扩增的培养基。一个实例是Neurobasal A(NBA)增殖培养基，其包含Neurobasal-A(Invitrogen)、1％D-葡萄糖(Sigma Aldrich)、1％青霉素/链霉素/谷氨酰胺(Invitrogen)、2％含视黄酸的B27补充剂(Invitrogen)、0.2％EGF(Peprotech,USA)、0.08％FGF-2(Peprotech)、0.2％肝素(Sigma Aldrich,USA)和丙戊酸(Sigma Aldrich)至1μM的浓度。然后更换培养基，例如每周三次，并定期重新铺板细胞(例如，每周重新铺板最多2-8次，随着集落开始发展而变得更加频繁)以去除未重编程的细胞，直到实现广泛的集落形成。对于本公开内容的从业者来说，执行细胞的临床施用的各种质量控制手段是本领域已知的。细胞鉴定的示例标准包括使用诸如流式细胞术、生存力、内毒素含量的手段进行标志物鉴定，以及评估微生物和支原体污染。
在本公开内容的一个实施方案中，使用本领域已知的用于保存成纤维细胞的生存力和增殖能力的方法离体培养成纤维细胞。本公开内容提供了对已知培养技术的修改，以减少受体免疫系统对成纤维细胞的识别。在一个实施方案中，在缺乏异种成分例如胎牛血清的条件下培养成纤维细胞。已知异种成分触发免疫反应，包括引发抗体和T细胞反应(Selvaggi等人,1997；Mackensen等人,2000；Kadri等人,2007；Forni等人,1976；Lauer等人,1983)。在许多个体中，存在针对胎牛血清相关成分的IgM同种型天然抗体(Irie等人，1974)，导致在胎牛血清存在下生长的细胞施用后引起排斥、炎症或过敏反应(Macy等人，1989)。在具体实施方案中，本公开内容包括用富含人血小板的血浆、血小板裂解物、脐带血血清、自体血清和/或确定的细胞因子混合物作为另外的特征替换胎牛血清以降低人成纤维细胞的免疫原性。对于其他细胞类型的在无异种成分的培养基中培养组织的方法在本领域中是已知的，并且通过引用并入本文(Riordan等人，2015)。
本公开内容的实施方案提供了降低具体类型的成纤维细胞的免疫原性的方法。成纤维细胞可来源于各种组织或器官，例如皮肤、心脏、血管、骨髓、骨骼肌、肝脏、胰腺、脑和/或包皮，其可通过活检(适当时)或尸检获得。在一些方面，细胞包含成纤维细胞，其可以来自胎儿、新生儿、成体来源或其组合。
包皮成纤维细胞可以重悬于补充有用于降低免疫原性的一种或多种物质、血清和/或血清替代物的培养基中的离体培养物中。血清可以是任何来源，包括胎牛血清、人血清或血清替代物(例如，用人血小板裂解物替代(Riordan等人,2007；Schallmoser等人,2007；Capelli等人,2007；Carrancio等人,2008；Salvade等人,2010；Bieback等人,2009))。在一些实施方案中，利用人血清或血清替代物以给包皮饲养细胞提供无异种成分的环境。培养后，本公开内容的人包皮饲养细胞在附着于固相例如组织培养板时能够形成单层(Dugdale and Siddall(1969)J.Med.Lab.Technol.26:31-5)。本公开内容的人包皮饲养细胞的这一特征使得这些细胞适合作为通用供体，因为其高的复制能力和在降低免疫原性方面对用IFN-γ治疗的高响应性。本领域技术人员将理解，在不同浓度的干扰素γ下，来自不同来源的成纤维细胞可能具有不同的免疫原性降低。在具体实施方案中，本公开内容提供了用于待进行的评估免疫原性的方法，例如，定量调节混合淋巴细胞反应的能力。
通常，为了测量成纤维细胞的免疫原性，混合淋巴细胞反应通过将已用干扰素γ处理的成纤维细胞与同种异体淋巴细胞共培养来进行。通常采用同种异体淋巴细胞的增殖指数来表示刺激性成纤维细胞的免疫原性程度。在本公开内容的一些实施方案中，成纤维细胞在与淋巴细胞培养之前被有丝分裂失活。有丝分裂失活可以通过用抑制增殖而不降低生存力的一种或多种物质例如丝裂霉素C或其他物质处理来进行。当使用化学剂进行有丝分裂失活时，可以将化学剂从细胞上洗掉，以防止抑制响应性淋巴细胞。
在本公开内容的其他实施方案中，表征经处理的成纤维细胞的免疫原性水平，例如通过响应性淋巴细胞评估细胞因子产生。值得注意的细胞因子的实例包括IL-1，其与炎症过程和巨噬细胞的刺激相关。IL-2，与T细胞和NK细胞活化相关；干扰素γ，其可活化巨噬细胞并有助于Th1极化；和/或IL-12和/或IL-18，其活化NK细胞并与细胞毒性反应的发展相关。对于本公开内容的实践，期望混合淋巴细胞反应中的响应性淋巴细胞产生较少的炎性细胞因子。因此，在具体实施方案中，当成纤维细胞在响应性淋巴细胞中引起IL-2、IFN-γ、IL-12和/或IL-18的产生时，选择使用成纤维细胞。相反，也可以在本公开内容的范围内进行免疫抑制或抗炎细胞因子的评估。细胞因子包括刺激Th2细胞的IL-4、刺激除其他以外T调节细胞等的IL-10和抑制炎症的TGF-B。
在本公开内容的一些实施方案中，进行了对成纤维细胞的遗传修饰以引起成纤维细胞的免疫原性降低。一种方法提供了遗传修饰，包括用具有降低的免疫原性的细胞如未成熟的树突状细胞进行细胞质转移。在另一个实施方案中，利用基因编辑来选择性切除引起炎症的基因，例如HLA或共刺激分子，例如CD40、CD80、CD86、TNF-α、HMGB-1、IFN-γ、IL-1β、IL-17、FAP、IL-18、IL-33或其组合。
在本公开内容的具体实施方案中，一种或多种免疫调节剂通过可在真核细胞中操作的重组表达载体在通用供体成纤维细胞中表达，并且所述免疫调节剂的表达可以由组成型启动子或诱导型启动子或组织特异性启动子调节。在具体实施方案中，载体是病毒载体，例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒，或载体是非病毒载体，例如裸DNA或质粒DNA或微环DNA。转染到成纤维细胞中的特别感兴趣的多核苷酸至少包括以下各项：Fas配体、TGF-β、IL-4、IL-10、HLA-G、吲哚胺2,3脱氧酶(IDO)、半乳凝素家族成员、半乳凝素3、精氨酸酶、IL-20、HGF、PDGF-BB、EGF、IGF、GDF-5、GDF-11、血管生成素、FGF-1、FGF-2、FGF-5、FGF-15或其组合。在具体情况下，重组表达的血管生成剂可以包括FAS配体、IL-2、IL-4、IL-10、IL-20、IL-35、HLA-G、I-309、IDO、iNOS、CD200、半乳凝素3、精氨酸酶、PGE-2、TGF-β、CTLA-4、PD-L1、IFN-γ或其组合。
本领域的从业者已知各种质量控制手段来执行细胞的临床施用。细胞鉴定的示例标准包括使用诸如流式细胞术、生存力、内毒素含量的手段的标志物鉴定以及微生物和支原体污染的评估。
在本公开内容的一个实施方案中，将通用供体成纤维细胞施用至个体以治疗自身免疫或炎性病况。在本公开内容的一些实施方案中，将细胞离体培养并经受降低免疫原性和刺激抗炎和/或免疫调节特性的条件。其他实施方案涉及为了治疗自身免疫和/或炎性病况而向需要其的个体施用细胞的方法。
本公开内容的具体实施方案提供了用于治疗一种或多种自身免疫或炎性病况的方法，所述自身免疫或炎性病况是例如急性弥散性脑脊髓炎，急性坏死性出血性白质脑炎，艾迪生氏病，粘连性囊炎，无丙种球蛋白血症，斑秃，淀粉样变性病，强直性脊柱炎，抗GBM肾炎，抗磷脂综合征(APS)，抗TBM肾炎，节肢纤维化，心房纤维化，自身免疫性血管水肿，自身免疫性再生障碍性贫血，自身免疫性自主神经功能异常，自身免疫性肝炎，自身免疫性高脂血症，自身免疫性免疫缺陷，自身免疫性内耳疾病(AIED)，自身免疫性心肌炎，自身免疫性嗜中性粒细胞减少症，自身免疫性卵巢炎，自身免疫性胰腺炎，自身免疫性视网膜病，自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)，自身免疫性甲状腺疾病，自身免疫性荨麻疹，轴突和神经元神经病，巴洛氏病，贝塞特氏病，良性粘膜性类天疱疮，大疱性类天疱疮，心肌病，Castleman病，乳糜泻，查加斯病，慢性疲劳综合征，慢性炎性脱髓磷脂性多发性神经病(CIDP)，慢性莱姆病，慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)，Churg-Strauss综合征，瘢痕性类天疱疮，肝硬化，Cogans综合征，冷凝集素病，先天性心脏传导阻滞，柯萨奇心肌炎，CREST病，克罗恩病，囊性纤维化，白介素-1受体拮抗剂缺乏，脱髓磷脂性神经病，疱疹样皮炎，皮肌炎，德维克氏病(视神经脊髓炎)，盘状狼疮，德莱瑟氏综合征，多普特氏挛缩症，子宫内膜异位，心内膜心肌纤维化，嗜酸性食管炎，嗜酸性筋膜炎，结节性红斑，原发性混合性冷球蛋白血症，埃文斯综合征，实验性变应性脑脊髓炎，家族性地中海热，纤维肌痛，纤维化肺泡炎，巨细胞动脉炎(颞动脉炎)，巨细胞心肌炎，肾小球肾炎，血管球性肾炎，Goodpasture综合征，移植物抗宿主病(GVHD)，肉芽肿伴多血管炎，格雷夫斯病，格林-巴利综合征，桥本脑炎，桥本甲状腺炎，溶血性贫血，Henoch-Schonlein紫癜，肝炎，妊娠疱疹，低丙球蛋白血症，特发性肺纤维化，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，IgA肾病，IgG4相关硬化性疾病，免疫调节脂蛋白，包涵体肌炎，炎症性肠病，间质性膀胱炎，青少年关节炎，青少年糖尿病(1型糖尿病)，青少年肌炎，川崎综合征，瘢痕疙瘩，Lambert-Eaton综合征，白细胞碎裂性血管炎，扁平苔藓，苔癣硬化症，木质结膜炎，线性IgA病，狼疮(SLE)，莱姆病，纵隔纤维化，美尼尔氏病，显微镜下多血管炎，混合结缔组织病(MCTD)，Mooren溃疡，Mucha-Habermann病，多发性硬化(MS)，重症肌无力，骨髓纤维化，肌炎，发作性睡病，新生儿期起病多系统炎性疾病，肾源性系统性纤维化，视神经脊髓炎(Devic's)，嗜中性粒细胞减少症，非酒精性脂肪肝疾病，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，眼瘢痕性类天疱疮，视神经炎，复发性风湿病，副肿瘤性小脑变性，阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)，Parry Romberg综合征，睫状体扁平部炎(周围性葡萄膜炎)，Parsonnage-Turner综合征，与链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神疾病(PANDAS)，天疱疮，周围神经病变，周围性脑脊髓炎，恶性贫血，佩罗尼氏病，POEMS综合征，结节性多动脉炎，风湿性多肌痛，多发性肌炎，心肌梗死后综合征，心包切开术后综合征，原发性胆汁性肝硬化，原发性硬化性胆管炎，孕酮性皮炎，进行性大规模纤维化，牛皮癣，牛皮癣性关节炎，纯红细胞发育不全，坏疽性脓皮病，雷诺现象，反应性关节炎，反射交感性营养不良，Reiter综合征，复发性多发性软骨炎，不安腿综合征，腹膜后纤维化，风湿热，类风湿性关节炎，结节病，施密特综合征，巩膜炎，硬皮病，干燥综合征，精子和睾丸自身免疫性，僵人综合征，亚急性细菌性心内膜炎，Susac综合征，交感性眼炎，系统性红斑狼疮(SLE)，Takayasu动脉炎，颞动脉炎，血小板减少性紫癜(TTP)，Tolosa-Hunt综合征，横贯性脊髓炎，肿瘤坏死因子受体相关的周期性综合征，1型糖尿病，I型自身免疫性多腺综合征，II型自身免疫性多腺综合征，III型自身免疫性多腺综合征，溃疡性结肠炎，未分化的结缔组织病，葡萄膜炎，血管炎，水疱性皮肤病，白癜风，以及韦格纳肉芽肿病(现称为肉芽肿伴多血管炎(GPA))。
本公开内容的某些方法涉及降低成纤维细胞包括至少包皮成纤维细胞的免疫原性。在某些实施方案中，成纤维细胞冲悬浮在补充有血清或血清替代物的培养基中的离体培养物中。血清可以是任何来源，包括胎牛血清、人血清和/或血清替代物。在某些实施方案中，利用人血清或血清替代物以给包皮饲养细胞提供无异种成分的环境。在一个实施方案中，用0.1-500单位/毫升(IU/ml)的浓度(包括本文其他地方所述的浓度范围)的IFN-γ处理包皮成纤维细胞。
在某些实施方案中，将治疗有效量的经修饰的细胞与一种或多种免疫调节剂共同施用至个体。示例性免疫调节剂可包括FAS配体，IL-2R，IL-1Ra，IL-2，IL-4，IL-8，IL-10，IL-20，IL-35，HLA-G，PD-L1，I-309，IDO，iNOS，CD200，半乳凝素3，sCR1，精氨酸酶，PGE-2，阿司匹林，阿托伐他汀，氟伐他汀，洛伐他汀，普伐他汀，瑞舒伐他汀，辛伐他汀，匹伐他汀，正乙酰半胱氨酸，雷帕霉素，IVIG，纳曲酮，TGF-β，VEGF，PDGF，CTLA-4，抗CD45RB抗体，羟氯喹，来氟米特，金诺芬，双氰金，柳氮磺吡啶，氨甲蝶呤，糖皮质激素，依那西普，阿达木单抗，阿巴西普，阿那白滞素，赛妥珠单抗，依那西普-szzs，戈利木单抗，英夫利昔单抗，利妥昔单抗，托珠单抗，环孢霉素，IFN-γ，依维莫司，雷帕霉素或其组合。
本公开内容的具体实施方案提供了用于治疗或预防一种或多种自身免疫或炎性病况的方法，所述自身免疫或炎性病况包括：急性弥散性脑脊髓炎，急性坏死性出血性白质脑炎，艾迪生氏病，粘连性囊炎，无丙种球蛋白血症，斑秃，淀粉样变性病，强直性脊柱炎，抗GBM肾炎，抗磷脂综合征(APS)，抗TBM肾炎，节肢纤维化，心房纤维化，自身免疫性血管水肿，自身免疫性再生障碍性贫血，自身免疫性自主神经功能异常，自身免疫性肝炎，自身免疫性高脂血症，自身免疫性免疫缺陷，自身免疫性内耳疾病(AIED)，自身免疫性心肌炎，自身免疫性嗜中性粒细胞减少症，自身免疫性卵巢炎，自身免疫性胰腺炎，自身免疫性视网膜病，自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)，自身免疫性甲状腺疾病，自身免疫性荨麻疹，轴突和神经元神经病，巴洛氏病，贝塞特氏病，良性粘膜性类天疱疮，大疱性类天疱疮，心肌病，Castleman病，乳糜泻，查加斯病，慢性疲劳综合征，慢性炎性脱髓磷脂性多发性神经病(CIDP)，慢性莱姆病，慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)，Churg-Strauss综合征，瘢痕性类天疱疮，肝硬化，Cogans综合征，冷凝集素病，先天性心脏传导阻滞，柯萨奇心肌炎，CREST病，克罗恩病，囊性纤维化，白介素-1受体拮抗剂缺乏，脱髓磷脂性神经病，疱疹样皮炎，皮肌炎，德维克氏病(视神经脊髓炎)，盘状狼疮，德莱瑟氏综合征，多普特氏挛缩症，子宫内膜异位，心内膜心肌纤维化，嗜酸性食管炎，嗜酸性筋膜炎，结节性红斑，原发性混合性冷球蛋白血症，埃文斯综合征，实验性变应性脑脊髓炎，家族性地中海热，纤维肌痛，纤维化肺泡炎，巨细胞动脉炎(颞动脉炎)，巨细胞心肌炎，肾小球肾炎，血管球性肾炎，Goodpasture综合征，移植物抗宿主病(GVHD)，肉芽肿伴多血管炎，格雷夫斯病，格林-巴利综合征，桥本脑炎，桥本甲状腺炎，溶血性贫血，Henoch-Schonlein紫癜，肝炎，妊娠疱疹，低丙球蛋白血症，特发性肺纤维化，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，IgA肾病，IgG4相关硬化性疾病，免疫调节脂蛋白，包涵体肌炎，炎症性肠病，间质性膀胱炎，青少年关节炎，青少年糖尿病(1型糖尿病)，青少年肌炎，川崎综合征，瘢痕疙瘩，Lambert-Eaton综合征，白细胞碎裂性血管炎，扁平苔藓，苔癣硬化症，木质结膜炎，线性IgA病，狼疮(SLE)，莱姆病，纵隔纤维化，美尼尔氏病，显微镜下多血管炎，混合结缔组织病(MCTD)，Mooren溃疡，Mucha-Habermann病，多发性硬化(MS)，重症肌无力，骨髓纤维化，肌炎，发作性睡病，新生儿期起病多系统炎性疾病，肾源性系统性纤维化，视神经脊髓炎(Devic's)，嗜中性粒细胞减少症，非酒精性脂肪肝疾病，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，眼瘢痕性类天疱疮，视神经炎，复发性风湿病，副肿瘤性小脑变性，阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)，Parry Romberg综合征，睫状体扁平部炎(周围性葡萄膜炎)，Parsonnage-Turner综合征，与链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神疾病(PANDAS)，天疱疮，周围神经病变，周围性脑脊髓炎，恶性贫血，佩罗尼氏病，POEMS综合征，结节性多动脉炎，风湿性多肌痛，多发性肌炎，心肌梗死后综合征，心包切开术后综合征，原发性胆汁性肝硬化，原发性硬化性胆管炎，孕酮性皮炎，进行性大规模纤维化，牛皮癣，牛皮癣性关节炎，纯红细胞发育不全，坏疽性脓皮病，雷诺现象，反应性关节炎，反射交感性营养不良，Reiter综合征，复发性多发性软骨炎，不安腿综合征，腹膜后纤维化，风湿热，类风湿性关节炎，结节病，施密特综合征，巩膜炎，硬皮病，干燥综合征，精子和睾丸自身免疫性，僵人综合征，亚急性细菌性心内膜炎，Susac综合征，交感性眼炎，系统性红斑狼疮(SLE)，Takayasu动脉炎，颞动脉炎，血小板减少性紫癜(TTP)，Tolosa-Hunt综合征，横贯性脊髓炎，肿瘤坏死因子受体相关的周期性综合征，1型糖尿病，I型自身免疫性多腺综合征，II型自身免疫性多腺综合征，III型自身免疫性多腺综合征，溃疡性结肠炎，未分化的结缔组织病，葡萄膜炎，血管炎，水疱性皮肤病，白癜风，以及肉芽肿伴多血管炎(GPA)。
例如，可以在多种组织培养基中进行用于免疫调节的成纤维细胞的生长。在本公开内容的一个实施方案中，用于细胞培养的一种培养基包括Dublecco改良的基础培养基(DMEM)，包括DMEM-低葡萄糖(DMEM-LG)(Invitrogen，Carlsbad，CA)。DMEM-LG可以补充有血清，例如胎牛血清和/或人血清。通常，添加15％(v/v)的胎牛血清(例如确定的胎牛血清，Hyclone,Logan Utah)以及抗生素/抗真菌药(优选100单位/毫升青霉素，100毫克/毫升链霉素和0.25微克/毫升两性霉素B；Invitrogen，Carlsbad，Calif.)和0.001％(v/v)2-巯基乙醇(Sigma,St.Louis MO)。在某些情况下，使用不同的生长培养基，或提供不同的补充剂，这些通常在本文中指示为生长培养基的补充剂。在某些化学成分确定的培养基中，细胞可以在完全不含血清的情况下生长。在这种情况下，细胞可能需要某些生长因子，可以将其添加到培养基中以支持和维持细胞。在某些情况下，要添加以用于在无血清培养基上生长的某些因子包括bFGF、EGF、IGF-I和PDGF中的一种或多种。在一些实施方案中，将所述因子中的两种、三种或全部四种添加到无血清或化学成分确定的培养基中。在其他实施方案中，将LIF添加到无血清培养基中以支持或改善细胞的生长。
C.离体培养中调节性T细胞的扩增
本实例提供了本领域中对扩增具体的T细胞的长期需求的解决方案。
T调节细胞是保护身体免受自身免疫攻击的免疫系统的重要组成部分。早期的研究表明了这一点，其中新生的经胸腺切除的小鼠患有全身性自身免疫，这些小鼠通过CD4细胞的转移得以挽救(Hori等人，2003)。随后的研究鉴定T调节(Treg)表型为具有IL-2受体CD25，考虑到该受体也存在于活化的T细胞上，因此存在一定问题。外周血含有少量T细胞淋巴细胞群，其表达T调节表型(“Treg”)，即对CD4和CD25抗原均为阳性。存在Treg细胞的几个子集。调节性细胞的一个子集在胸腺中发育。胸腺来源的Treg细胞通过不依赖细胞因子的机制发挥作用，该机制涉及细胞间的接触。它们对于诱导和维持自我耐受以及预防自身免疫是必不可少的(Shevach等人，2000)。这些调节性细胞阻止已逃避胸腺删除或识别胸腺外抗原的自身反应性T细胞的活化和增殖，因此它们对于体内稳态和免疫调节以及保护宿主抵抗自身免疫发展至关重要。因此，免疫调节性CD4+CD25+T细胞通常被称为“职业抑制细胞”。Treg细胞对免疫的抑制通过几种机制发生。一种是直接裂解活化的T细胞(Onishi等人，2008；Gondek等人，2005)，另一种是抑制树突状细胞成熟(Miyara等人，2007)，从而抑制免疫系统的抗原呈递细胞武器启动或维持T细胞反应的能力。
天然产生的CD4+CD25+Treg细胞(nTreg)是在胸腺中的高亲和力配体上阳性选择并已显示在建立和维持对自身抗原的免疫耐受性中起重要作用的独特细胞群(Sakaguchi等人,2009)。这些细胞的发育和/或功能的缺陷与人和先天性或诱导性自身免疫的各种动物模型中的严重自身免疫相关。
Treg细胞通过细胞间接触直接地或通过可溶性因子间接地显示其致耐受作用。尽管这些细胞的抑制机制尚待充分阐明，但阻断效应T细胞(Teff)中IL-2的表达、物理清除Teff细胞、通过CTLA-4/B7轴诱导耐受性树突状细胞(DC)和通过TGF-β和IL-10抑制Teff细胞是以及迄今为止已牵涉的机制中的一些。还已显示通过CTLA-4/CD80进入Teff细胞的反向信号传导在其通过Treg细胞的抑制中起重要作用。类似地，Treg细胞上的CTLA-4与DC上的CD80之间的相互作用可导致吲哚胺双加氧酶(其牵涉通过色氨酸代谢的调节的耐受性)的上调和反向信号传导。
本公开内容的实施方案提供了用于向有需要的个体提供或改善细胞疗法的组合物和方法。实施方案涵盖用于需要细胞疗法的个体例如患有一种或多种自身免疫或其他疾病的个体的疗法和生成疗法的方法。
在具体实施方案中，存在用于扩增Treg包括nTreg的方法和组合物，使得该Treg可用于个体的疗法。在具体实施方案中，Treg被扩增而没有随后的将细胞逆转为不期望的类型，例如将nTreg逆转为T效应细胞。因此，这种扩增方法允许建立可用于刺激免疫调节特性例如免疫抑制特性的细胞库。
在本公开内容的一个方面，nTreg扩增可以通过从所需细胞源分离nTreg并随后在主要信号和共刺激信号(发现于成纤维细胞上的)(或成纤维细胞与其他物质的组合)的存在的情况下扩增培养的细胞来进行。如本文所述，可用于刺激Treg上的主要信号和共刺激信号的物质可以以可溶形式使用、附着于成纤维细胞的表面和/或固定在如本文所述的表面上。
在一个实施方案中，主要和共刺激剂均共同固定至表面，例如基底(例如珠子)或工程改造的细胞。在一个实施方案中，提供主要活化信号的分子例如CD3配体(例如，交联抗体或凝集素)和共刺激分子例如CD28配体被偶联或负载在同一基底例如颗粒、珠子或工程改造的细胞上。扩增后，可将细胞单独施用或与其他免疫调节细胞一起施用，以治疗一种或多种自身免疫性疾病。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了使用重复刺激程序将Treg(例如nTreg)扩增至显著量的方法。例如，将同种异体幼稚细胞(例如CD4细胞)与干扰素γ和/或富含血小板的血浆培养的成纤维细胞一起培养。在一个实施方案中，扩增nTreg的方法包括例如基于细胞大小重复刺激nTreg。在具体情况下，选择表现出约为静止nTreg的大小的细胞大小的nTreg用于重复刺激。在某些情况下，静止nTreg的大小约为8.5μm。即，本公开内容包括以下发现：细胞大小是有助于成功扩增nTreg而不损失nTreg表型和抑制活性的参数。在另一个实施方案中，扩增nTreg的方法包括在具体物质(例如雷帕霉素或依维莫司，或雷帕霉素的哺乳动物靶标的任何其他抑制剂(mTOR))的存在下重复刺激nTreg。在某些情况下，从外周血分离的nTreg在雷帕霉素的存在下被重新刺激。即，本公开内容包括其中在将成纤维细胞添加至共培养物的情况下雷帕霉素有助于成功地扩增从外周血分离的nTreg而不损失nTreg表型和抑制活性的实施方案。在具体实施方案中，通过本公开内容的方法产生的扩增的细胞维持指示nTreg的Foxp3特征谱。在一个实施方案中，扩增的nTreg的群体表达具体的天然Treg标志物，例如Foxp3和潜在联系肽(LAP)；在Foxp3基因中显示Treg特异的去甲基化，并且含有很少的分泌IL-2、IFN-γ、IL-17的细胞。如在示例性胶原蛋白诱导的关节炎模型中所观察到的，本公开内容的扩增的细胞也能够抑制自身免疫。在其他实施方案中，可以存储至少一部分活性细胞群以用于以后的植入/输注。该群体可以被分成多于一个等分试样或单位，以使得一部分nTreg群体被保留用于以后的应用，而一部分则立即被应用至患者。细胞库中的全部或部分细胞的中等到长期的存储也在本公开内容的范围内。为了公开的目的，可以在方法的上下文中利用Treg和nTreg。
在本公开内容的一个实施方案中，通过调节宿主微生物组，在体外或体内产生的Treg细胞的活性进一步增强。微生物组的调节可通过施用益生菌和/或益生元来进行。本领域已知，肠道菌群通过调节Treg、Th1和Th2细胞的分化和扩增来驱动宿主免疫稳态。已证明Foxp3+Treg细胞缺乏导致肠道微生物生态失调和自身免疫。重塑微生物组的手段包括施用罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，这在自身免疫的动物模型中与延长的生存期和减少的多器官炎症相关。在本公开内容的一个实施方案中，施用罗伊氏乳杆菌以改变被Treg细胞缺乏破坏的代谢组学特征谱和/或恢复嘌呤代谢物肌苷的水平。因此，在本公开内容的一个实施方案中，肌苷的施用与Treg细胞的产生一起被用于刺激增强的抑制活性，从而治疗自身免疫。在以下论文中描述了施用肌苷和调节微生物组以增加Treg细胞的方法，这些论文通过引用并入本文：He等人,2017；Hrdy等人,2016；Thakur等人,2016；Haileselassie等人,2016；Liu等人,2014；Kim等人,2014；Narushima等人,2014；Mercadante等人,2014；Yoshida等人,2013；Barletta等人,2013；Smelt等人,2013；Atarashi等人,2013；Smelt等人,2013；Qiu等人,2013；Liu等人,2013；Zhao等人,2013；Jeon等人,2012；Jang等人,2012；Lopez等人,2012；Lopez等人,2012；Fink等人,2010；Lavasani等人,2010；Lyons等人,2010；de Rooks等人,2010；Karimi等人,2009；和Feleszko等人,2007。
在一个实施方案中，通过在成纤维细胞的存在下活化成熟的外周CD4+T细胞来产生Treg细胞。在一些实施方案中，在与免疫调节相关的条件下培养成纤维细胞。研究表明，外周来源的Treg细胞通过产生免疫抑制细胞因子(例如转化生长因子-β(TGF-β)和IL-10)来介导其抑制活性。因此，在一个实施方案中，成纤维细胞和T细胞的共培养以各种浓度和水平的TFG-β和IL-10进行，并被评估为选择最佳Treg产生条件的标志物。在以下论文中描述了基于IL-10和TGF-β的产生的致耐受活性的评估，并且其通过引用并入本文：Kingsley等人,2002J.Immunol.168:1080；Nakamura等人,2001J.Exp.Med.194:629-644。在任何情况下，本公开内容的实施方案包括其中成纤维细胞和/或T细胞暴露于TGF-β和/或IL-10以有效产生Treg的方法。
在本公开内容的一个实施方案中，利用了体外扩增Treg细胞的现有方法，其中作了适应性修改以利用成纤维细胞作为饲养层。用于实施本公开内容的成纤维细胞的浓度通常为每1个T细胞1个成纤维细胞到每1个成纤维细胞100个T细胞(或其近似值)。在更具体实施方案中，成纤维细胞与T细胞的比率为每个T细胞约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个成纤维细胞。在一些实施方案中，添加一种或多种生长因子例如IL-2用于要扩增的成纤维细胞和/或T细胞的暴露。Trenado等人提供了在不存在成纤维细胞的情况下培养Treg细胞的方法，其报道了在疾病的体内小鼠模型中离体活化和扩增的CD4+CD25+调节细胞的治疗功效的首次评估(Trenado等人,2002J.Clin.Invest.112(11):1688-1696)。
在本公开内容的一个实施方案中，处理的成纤维细胞用于代替间充质干细胞以用于Treg细胞的体外或体内扩增，尽管在某些情况下两者均被利用。使用间充质干细胞(MSC)在体外诱导Treg生成的方法被根据本公开内容可以通过用成纤维细胞替代间充质干细胞来适应性修改的技术替代(参见Chen等人，2017，通过引用并入本文)。先前的研究表明，间充质干细胞能够产生与细胞增殖相关的生长因子，例如FGF(Lai等人，2011；Coutu等人，2011)，VEGF(Kinnaird等人，2004；Kinnarid等人，2004；Kwon等人，2014)，IGF-1(Montes等人，2009)和HGF(Shen等人，2015)。实际上，MSC饲养层以前曾用于扩增造血(Walenda等人，2011；Fong等人，2012)和多能干细胞(Zou等人，2016；Silva等人，2014)，同时维持这些细胞处于未分化状态。此外，已证明MSC可以在体外(Cahill等人,2015；Wang等人,2015；Kwon等人,2014；Luz-Crawford等人,2013；Erkers等人,2013；Engela等人,2013)和体内(Bai等人，2012；Lee等人，2015；Treacy等人，2014)促进Treg细胞的生成。在本公开内容的一个实施方案中，成纤维细胞被用作MSC的替代物。
本公开内容的一般实施方案提供了针对暴露于一种或多种物质和/或暴露于成纤维细胞(包括修饰的成纤维细胞)后免疫细胞的扩增的改进的方法、系统和组合物。在具体实施方案中，本文提供了在暴露于已暴露于IFN-γ、富含血小板的血浆(包括人)或其组合的成纤维细胞时，例如在离体培养中扩增T调节细胞群的方法。
在某些实施方案中，从包含T细胞的组织中分离T细胞，例如用于本公开内容的治疗或预防方法的调节性T细胞，所述组织为例如胸腺、外周血、月经血、脂肪组织、骨髓、胎盘、脐带血、脑脊髓液或其组合，并且在具体情况下，使用本公开内容的方法从T细胞扩增后将接受T细胞的个体分离T细胞。在具体情况下，T细胞获自一个个体的组织，使用本公开内容的方法扩增细胞，然后提供给另一个体。在其他情况下，可以以其他方式，例如商购获得待经受成纤维细胞的T细胞。
在具体实施方案中，使T细胞群经受包含成纤维细胞(包括修饰的成纤维细胞)和任选地一种或多种另外的物质和/或条件的一种或多种组合物一次或多次。在具体实施方案中，修饰的成纤维细胞是已至少暴露于IFN-γ的成纤维细胞。当成纤维细胞和/或IFN-γ是外源提供给个体时，成纤维细胞的暴露可以离体发生，也可以在体内发生(相对于在未经修饰的天然环境下在体内暴露于IFN-γ的成纤维细胞)。在具体实施方案中，在该方法的至少一个步骤中，由人来手动操纵成纤维细胞。
在某些实施方案中，成纤维细胞可以来源于包括皮肤、心脏、血管、骨髓、骨骼肌、肝脏、胰腺、脑和/或包皮的组织。在具体实施方案中，成纤维细胞是胎盘的、胎儿的、新生儿的或成体的或其混合物。在另外的实施方案中，培养物中成纤维细胞与T细胞的比率包括以下比率：1:1,1:2,1:3,1:4,1:5,1:6,1:7,1:8,1:9,1:10,1:15,1:20,1:25,1:30,1:35,1:40,1:45,1:50,1:55,1:60,1:65,1:70,1:75,1:80,1:85,1:90,1:95,1:100,2:1,3:1,4:1,5:1,6:1,7:1,8:1,9:1,10:1,15:1,20:1,25:1,30:1,35:1,40:1,45:1,50:1,55:1,60:1,65:1,70:1,75:1,80:1,85:1,90:1,95:1,100:1,200:1,300:1等。在具体实施方案中，共培养物中成纤维细胞与T细胞的比率为2:1。在替代实施方案中，培养物中T细胞与成纤维细胞的比率包括以下比率：1:1,1:2,1:3,1:4,1:5,1:6,1:7,1:8,1:9,1:10,1:15,1:20,1:25,1:30,1:35,1:40,1:45,1:50,1:55,1:60,1:65,1:70,1:75,1:80,1:85,1:90,1:95,1:100,2:1,3:1,4:1,5:1,6:1,7:1,8:1,9:1,10:1,15:1,20:1,25:1,30:1,35:1,40:1,45:1,50:1,55:1,60:1,65:1,70:1,75:1,80:1,85:1,90:1,95:1,100:1,200:1,300:1等。
在具体实施方案中，包含T细胞和修饰的成纤维细胞(和/或一种或多种另外的物质和/或条件)组合物的共培养物可包含一种或多种另外的物质包括CD3配体(例如交联抗体或凝集素)、CD28配体(例如CD80或CD86或交联抗体)、雷帕霉素、IL-10、TGF-β、IL-2、hCG、PGE-2、雌激素、孕酮、水杨酸、依维莫司，或其组合。在具体实施方案中，一种或多种另外的物质与成纤维细胞在溶液中、附着于成纤维细胞的表面、固定在珠子上、固定在工程改造的细胞(例如，经工程改造以表达一种或多种共刺激分子和/或一种或多种交联抗体和/或一种或多种工程改造受体例如嵌合抗原受体或T细胞受体的成纤维细胞或CHO细胞)上和/或在成纤维细胞内表达。
在具体实施方案中，调节性T细胞来源于同种异体的幼稚CD4+T细胞、CD8细胞、γδT细胞或其混合物。
在另外的实施方案中，成纤维细胞暴露于的组合物包含富含人血小板的血浆，其浓度占组合物体积的至少或不大于1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49或50％。
在具体实施方案中，调节性T细胞的群体被选择为具有约7-12、7-11、7-10、7-9、7-8、8-12、8-11、8-10、8-9、9-12、9-11、9-10、10-12、10-11或11-12μm的直径。直径可以是7、8、9、10、11或12μm。在具体情况下，大多数调节性T细胞的直径为约8.5μm。在其他情况下，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％或更多的细胞直径为约7-12μm。
在暴露于修饰的成纤维细胞后的Treg细胞的扩增后，可以利用产生的调节性T细胞群或可以将其储存以供以后使用。另外的实施方案提供了将细胞群分成两个或更多个等分试样的手段，使得保存至少一个等分试样以供以后使用，并且将至少一个等分试样施用至个体以治疗自身免疫或炎性病况。
其他实施方案涉及其中将调节性T细胞施用至个体以治疗至少一种自身免疫或炎性病况的方法。在某些情况下，一部分制备的T细胞群被提供给一个个体用于治疗一种病况，而另一部分制备的T细胞群被提供给另一个个体用于治疗相同或不同的自身免疫或炎症病况。
在具体实施方案中，将制备的T细胞群提供给患有自身免疫或炎性病况的个体，所述自身免疫或炎性病况是例如急性弥散性脑脊髓炎，急性坏死性出血性白质脑炎，艾迪生氏病，粘连性囊炎，无丙种球蛋白血症，斑秃，淀粉样变性病，强直性脊柱炎，抗GBM肾炎，抗磷脂综合征(APS)，抗TBM肾炎，节肢纤维化，心房纤维化，自身免疫性血管水肿，自身免疫性再生障碍性贫血，自身免疫性自主神经功能异常，自身免疫性肝炎，自身免疫性高脂血症，自身免疫性免疫缺陷，自身免疫性内耳疾病(AIED)，自身免疫性心肌炎，自身免疫性嗜中性粒细胞减少症，自身免疫性卵巢炎，自身免疫性胰腺炎，自身免疫性视网膜病，自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)，自身免疫性甲状腺疾病，自身免疫性荨麻疹，轴突和神经元神经病，巴洛氏病，贝塞特氏病，良性粘膜性类天疱疮，大疱性类天疱疮，心肌病，Castleman病，乳糜泻，查加斯病，慢性疲劳综合征，慢性炎性脱髓磷脂性多发性神经病(CIDP)，慢性莱姆病，慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)，Churg-Strauss综合征，瘢痕性类天疱疮，肝硬化，Cogans综合征，冷凝集素病，先天性心脏传导阻滞，柯萨奇心肌炎，CREST病，克罗恩病，囊性纤维化，白介素-1受体拮抗剂缺乏，脱髓磷脂性神经病，疱疹样皮炎，皮肌炎，德维克氏病(视神经脊髓炎)，盘状狼疮，德莱瑟氏综合征，多普特氏挛缩症，子宫内膜异位，心内膜心肌纤维化，嗜酸性食管炎，嗜酸性筋膜炎，结节性红斑，原发性混合性冷球蛋白血症，埃文斯综合征，实验性变应性脑脊髓炎，家族性地中海热，纤维肌痛，纤维化肺泡炎，巨细胞动脉炎(颞动脉炎)，巨细胞心肌炎，肾小球肾炎，血管球性肾炎，Goodpasture综合征，移植物抗宿主病(GVHD)，肉芽肿伴多血管炎，格雷夫斯病，格林-巴利综合征，桥本脑炎，桥本甲状腺炎，溶血性贫血，Henoch-Schonlein紫癜，肝炎，妊娠疱疹，低丙球蛋白血症，特发性肺纤维化，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，IgA肾病，IgG4相关硬化性疾病，免疫调节脂蛋白，包涵体肌炎，炎症性肠病，间质性膀胱炎，青少年关节炎，青少年糖尿病(1型糖尿病)，青少年肌炎，川崎综合征，瘢痕疙瘩，Lambert-Eaton综合征，白细胞碎裂性血管炎，扁平苔藓，苔癣硬化症，木质结膜炎，线性IgA病，狼疮(SLE)，莱姆病，纵隔纤维化，美尼尔氏病，显微镜下多血管炎，混合结缔组织病(MCTD)，Mooren溃疡，Mucha-Habermann病，多发性硬化(MS)，重症肌无力，骨髓纤维化，肌炎，发作性睡病，新生儿期起病多系统炎性疾病，肾源性系统性纤维化，视神经脊髓炎(Devic's)，嗜中性粒细胞减少症，非酒精性脂肪肝疾病，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，眼瘢痕性类天疱疮，视神经炎，复发性风湿病，副肿瘤性小脑变性，阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)，Parry Romberg综合征，睫状体扁平部炎(周围性葡萄膜炎)，Parsonnage-Turner综合征，与链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神疾病(PANDAS)，天疱疮，周围神经病变，周围性脑脊髓炎，恶性贫血，佩罗尼氏病，POEMS综合征，结节性多动脉炎，风湿性多肌痛，多发性肌炎，心肌梗死后综合征，心包切开术后综合征，原发性胆汁性肝硬化，原发性硬化性胆管炎，孕酮性皮炎，进行性大规模纤维化，牛皮癣，牛皮癣性关节炎，纯红细胞发育不全，坏疽性脓皮病，雷诺现象，反应性关节炎，反射交感性营养不良，Reiter综合征，复发性多发性软骨炎，不安腿综合征，腹膜后纤维化，风湿热，类风湿性关节炎，结节病，施密特综合征，巩膜炎，硬皮病，干燥综合征，精子和睾丸自身免疫性，僵人综合征，亚急性细菌性心内膜炎，Susac综合征，交感性眼炎，系统性红斑狼疮(SLE)，Takayasu动脉炎，颞动脉炎，血小板减少性紫癜(TTP)，Tolosa-Hunt综合征，横贯性脊髓炎，肿瘤坏死因子受体相关的周期性综合征，1型糖尿病，I型自身免疫性多腺综合征，II型自身免疫性多腺综合征，III型自身免疫性多腺综合征，溃疡性结肠炎，未分化的结缔组织病，葡萄膜炎，血管炎，水疱性皮肤病，白癜风，或韦格纳肉芽肿病(现称为肉芽肿伴多血管炎(GPA))。
在具体实施方案中，将调节性T细胞与一种或多种另外的免疫调节细胞例如未成熟的树突状细胞、NKT细胞、TR1细胞、γδT细胞、CD5B细胞或其混合物一起施用至个体。
在另外的实施方案中，调节性T细胞可以与一种或多种免疫调节剂一起施用至个体，免疫调节剂是例如肌苷，FAS配体，IL-2R，IL-1Ra，IL-2，IL-4，IL-8，IL-10，IL-20，IL-35，HLA-G，PD-L1，I-309，IDO，iNOS，CD200，半乳凝素3，sCR1，精氨酸酶，PGE-2，阿司匹林，阿托伐他汀，氟伐他汀，洛伐他汀，普伐他汀，瑞舒伐他汀，辛伐他汀，匹伐他汀，正乙酰半胱氨酸，雷帕霉素，IVIG，纳曲酮，TGF-β，VEGF，PDGF，CTLA-4，抗CD45RB抗体，羟氯喹，来氟米特，金诺芬，双氰金，柳氮磺吡啶，氨甲蝶呤，糖皮质激素，依那西普，阿达木单抗，阿巴西普，阿那白滞素，赛妥珠单抗，依那西普-szzs，戈利木单抗，英夫利昔单抗，利妥昔单抗，托珠单抗，环孢霉素，IFN-γ，依维莫司，雷帕霉素或其组合。
本公开内容的具体实施方案包括修饰施用的调节性T细胞(在某些情况下，除了修饰的成纤维细胞以外)，这通过调节细胞所提供至的个体(“宿主”)的微生物组来进行。在具体实施方案中，宿主微生物组通过包含一种或多种益生元和/或一种或多种益生菌的组合物调节。宿主微生物组可以在通过成纤维细胞递送扩增的T细胞之前、期间和/或之后进行修饰，并且宿主中的微生物组修饰可以通过口服一种或多种微生物、直肠植入和/或粪便移植等来发生。在具体实施方案中，通过向宿主添加一种或多种细菌来修饰宿主微生物组。
在具体实施方案中，向宿主提供包含一种或多种益生菌的组合物，其中益生菌包括Acetanaerobacterium,醋酸弧菌属(Acetivibrio),环脂酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus),嗜碱菌属(Alkaliphilus),Anaerofustis,Anaerosporobacter,Anaerostipes,Anaerotruncus,无氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus),芽孢杆菌属(Bacillus),类杆菌属(Bacteroides),Blautia,短螺菌属(Brachyspira),芽孢杆菌(Brevibacillus),Bryantella,Bulleidia,Butyricicoccus,丁酸弧菌属(Butyrivibrio),Catenibacterium,衣原体目(Chlamydiales),梭菌科(Clostridiaceae),梭菌目(Clostridiales),梭菌属(Clostridium),Collinsella,粪芽孢菌属(Coprobacillus),粪球菌属(Coprococcus),考克斯体属(Coxiella),脱铁杆菌纲(Deferribacteres),Desulfitobacterium,脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum),Dorea,Eggerthella,丹毒丝菌属(Erysipelothrix),丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae),Ethanoligenens,真细菌属(Eubacterium),粪杆菌属(Faecalibacterium),产线菌属(Filifactor),Flavonifractor,Flexistipes,Fulvimonas,梭杆菌属(Fusobacterium),Gemmiger,土芽孢杆菌属(Geobacillus),粘杆菌属(Gloeobacter),Holdemania,产氢厌氧杆菌属(Hydrogenoanaerobacterium),考克氏菌属(Kocuria),Lachnobacterium,毛螺菌属(Lachnospira),毛螺菌科(Lachnospiraceae),乳杆菌属(Lactobacillus),Lactonifactor,钩端螺旋体属(Leptospira),Lutispora,赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus),柔膜体纲(Mollicutes),穆尔氏菌属(Moorella),诺卡尔菌属(Nocardia),颤杆菌属(Oscillibacter),颤螺菌属(Oscillospira),类芽孢杆菌属(Paenibacillus),Papillibacter,Pseudoflavonifractor,Robinsoniella,Roseburia,瘤胃球菌科(Ruminococcaceae),瘤胃球菌属(Ruminococcus),糖单胞菌属(Saccharomonospora),八叠球菌(Sarcina),Solobacterium,Sporobacter,芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillus),链霉菌属(Streptomyces),Subdoligranulum,苏特拉菌属(Sutterella),互营球菌属(Syntrophococcus),好热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter),温双岐菌属(Thermobifida),Turicibacter,醋丝菌属(Acetonema),兼性芽孢杆菌属(Amphibacillus),Ammonifex,厌氧杆菌属(Anaerobacter),热解纤维素菌属(Caldicellulosiruptor),喜热菌属(Caloramator),Candidatus,Carboxydibrachium,Carboxydothermus,Cohnella,Dendrosporobacter Desulfitobacterium,Desulfosporosinus,盐拟杆菌属(Halobacteroides),太阳杆菌属(Heliobacterium),嗜日菌属(Heliophilum),Heliorestis,Lachnoanaerobaculum,大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus),Orenia(S.),嗜草酸菌属(Oxalophagus),产醋杆菌属(Oxobacter),Pelospora,Pelotomaculum,Propionispora,孢盐杆菌属(Sporohalobacter),鼠孢菌属(Sporomusa),芽孢八叠球菌属(Sporosarcina),Sporotomaculum,Symbiobacterium,Syntrophobotulus,Syntrophospora,土地芽孢杆菌属(Terribacillus),Thermosinus或其组合。在具体实施方案中，益生菌的组合物包含罗伊氏乳杆菌。
在某些实施方案中，益生菌组合物可以包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：不超过1,不超过2,不超过3,不超过4,不超过5,不超过6,不超过7,不超过8,不超过9,不超过10,不超过11,不超过12,不超过13,不超过14,不超过15,不超过16,不超过17,不超过18,不超过19,不超过20,不超过50或不超过100种益生菌。在某些实施方案中，益生菌组合物可以包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：至少1，至少2，至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少组成9，至少10，至少11，至少12，至少13，至少14，至少15，至少16，至少17，至少18，至少19，至少20，至少50，或至少100种益生菌。
在具体实施方案中，组合物可以包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：1至100；1至50；1至20；1至10；2至10；3至10；4至10；5至10；6至10；7至10；8至10；9至10；1至9；2至9；3至9；4至9；5至9；6至9；7至9；8至9；1至8；2至8；3至8；4至8；5至8；6至8；7至8；1至7；2至7；3至7；4至7；5至7；6至7；1至6；2至6；3至6；4至6；5至6；1至5；2至5；3至5；4至5；1至4；2至4；3至4；1至3；2至3；或1至2；或仅1种类型的益生菌。
在一些实施方案中，益生菌组合物包含一种类型的益生菌或由其组成或基本上由其组成，所述益生菌的存在的量是存在于待递送至宿主的组合物中的任何其他类型的益生菌的至少2、5、10、25、50、75、100倍或大于100倍。
在具体实施方案中，益生菌组合物中的大多数益生菌是罗伊氏乳杆菌。在选择的实施方案中，罗伊氏乳杆菌为益生菌组合物中至少或不超过25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或大于99％的益生菌。
在某些实施方案中，组合物中益生菌的相对存在表示为第一类型的益生菌与第二类型的益生菌的比率，该比率包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：1:1,1:2,1:3,1:4,1:5,1:6,1:7,1:8,1:9,1:10,1:15,1:20,1:25；1:50；1:75,1:100,1:200,1:500,1:1000,1:10,000,1:100,000或大于1:100,000。
在具体实施方案中，将一种或多种益生元给予接受经成纤维细胞扩增的T细胞的个体。益生元组合物中的益生元可以包含选自以下的单体或聚合物、由其组成或基本上由其组成：阿拉伯木聚糖，木糖，可溶性纤维葡聚糖，可溶性玉米纤维，聚葡萄糖，乳糖，N-乙酰基-乳糖胺，葡萄糖，半乳糖，果糖，鼠李糖，甘露糖，糖醛酸，3'-岩藻糖基乳糖，3'唾液乳糖，6'-唾液乳糖，乳糖-N-新四糖，2'-2'-岩藻糖基乳糖，阿拉伯糖，果糖，岩藻糖，乳糖，半乳糖，葡萄糖，甘露糖，D-木糖，木糖醇，核糖，木二糖，蔗糖，麦芽糖，乳糖，乳果糖，海藻糖，纤维二糖及其组合。
在某些实施方案中，组合物可以包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：不超过1种，不超过2种，不超过3种，不超过4种，不超过5种，不超过6种，不超过7种，大于8种，不超过9种，不超过10种，不超过11种，不超过12种，不超过13种，不超过14种，不超过15种，不超过16种，不超过17种，不超过18种，不超过19种，不超过20种，不超过25种，不超过30种或不超过35种类型的益生元。在某些实施方案中，组合物可以包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：至少1，至少2，至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少9，至少10，至少11，至少12，至少13，至少14，至少15，至少16，至少17，至少18，至少19，至少20，至少25，至少30或至少35种类型的益生元。
在另外的实施方案中，益生元组合物可以包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：1至35,1至30,1至25,1至20；1至10,2至10,3至10,4至10,5至10,6至10,7至10,8至10,9至10；1至9,2至9,3至9,4至9,5至9,6至9,7至9,8至9；1至8,2至8,3至8,4至8,5至8,6至8,7至8；1至7,2至7,3至7,4至7,5至7,6至7；1至6,2至6,3至6,4至6,5至6；1至5,2至5,3至5,4至5；1至4,2至4,3至4；1至3,2至3；或1至2；或仅1种类型的益生元。
在具体实施方案中，益生元组合物可以包含一种类型的益生元、由其组成或基本上由其组成，该益生元存在的量是存在于所述组合物中的任何其他类型的益生元的至少或不大于2、5、10、25、50、75、100倍或大于100倍。
在一些实施方案中，组合物中的一种或多种益生元以以下浓度存在：至少1μM,或至少2μM,或至少3μM,或至少4μM,或至少5μM,或至少6μM,或至少7μM,或至少8μM,或至少9μM,或至少10μM,或至少20μM,或至少30μM,或至少40μM,或至少50μM,或至少60μM,或至少70μM,或至少80μM,或至少90μM,或至少100μM,或至少150μM,或至少200μM,或至少250μM,或至少300μM,或至少350μM,或至少400μM,或至少450μM,或至少500μM,或至少550μM,或至少600μM,或至少650μM,或至少700μM,或至少750μM,或至少800μM,或至少850μM,或至少900μM,或至少950μM,或至少1mM,或至少2mM,或至少3mM,或至少4mM,或至少5mM,或至少6mM,或至少7mM,或至少8mM,或至少9mM,或至少10mM。
D.肝脏医学病况的治疗
本公开内容的实施方案涉及治疗或预防肝脏医学病况诸如肝功能衰竭的领域，包括用于在有需要的个体中增强肝脏再生过程。更具体地，本公开内容涉及利用已赋予免疫调节特性的成纤维细胞来刺激肝脏再生，并且至少在某些情况下同时减少肝脏纤维化。
肝功能衰竭是医疗保健系统的主要负担，并且是工业化国家中第七大死亡原因。迄今为止，肝功能衰竭的唯一治愈方法是移植，由于缺乏供体和慢性免疫抑制的不良影响，移植受到了严重限制。尽管目前正在开发用于治疗肝功能衰竭的干细胞疗法，但是它们具有许多缺点。胚胎干细胞和iPS衍生的干细胞都难以大量生长，并且具有致癌或畸胎瘤形成的可能性。另外，肝微环境中的异位组织分化可能具有毁灭性的后果。成体干细胞提供了诱发某些临床益处的可能性，但是迄今为止的反应还不深远。部分原因是成体干细胞无法完全接管肝组织。本公开内容包括免疫调节(无论是通过成体干细胞还是通过免疫细胞)例如作为抑制肝功能衰竭和诱导疾病消退的手段。
在一些实施方案中，存在通过向个体提供有效量的已暴露于以下的成纤维细胞群来治疗个体的肝功能衰竭的方法：免疫细胞；间充质干细胞，CD34+细胞；非常小的胚胎样干细胞；睾丸支持细胞或其混合物。
在本公开内容的一方面，将已被致敏增强的肝原性活性的成纤维细胞提供给患有肝脏医学病况或有肝脏医学病况风险的个体，例如以加速正常肝再生的过程或者以保护正常肝脏再生避免纤维化的过程。已证明，高达70％的肝脏切除导致完全再生(Fausto等人，2006；Michalopoulos，2011)。但是，这是在没有肝细胞增殖的抑制的情况下。在这些情况下，肝脏依赖于卵圆细胞的增殖。
在本公开内容的一方面，施用经致敏的成纤维细胞以允许个体经历诸如活体供体移植、两阶段肝切除和/或劈离式肝移植的程序，这对于具有各种肝脏病理或纤维化的某些个体本是不可能的。
肝再生有三个阶段，其中可以通过使用根据本公开内容已被预活化或“致敏”的成纤维细胞进行干预，这三个阶段为如下：a)致敏；b)增殖；c)终止(Fausto等人，2006)。重要的是要注意，肝细胞不是终末分化的细胞，而是处于增殖静息状态的细胞。具体而言，它们与其他再生细胞(例如造血干细胞)共有特征，因为它们通常处于细胞周期的G0期。这在肝再生过程中被改变[NRF1]。虽然在某些情况下(例如肝功能衰竭)经典的肝再生是由肝细胞介导的(Fausto等人，2006；Miyaoka和Miyajima，2013)，但肝细胞介导再生的能力是有限的，并且肝祖细胞(LPC)必须执行该过程。
考虑到肝脏的强力再生特性，结合肝外细胞源可能促进再生的可能性，已进行了许多尝试来利用细胞疗法来治疗肝功能衰竭。最初的肝细胞疗法涉及同种异体肝细胞的施用，这是在30多年前在动物模型中尝试的，并在临床上进行了实验性使用。不幸的是，存在阻碍该程序常规使用的主要障碍。在本公开内容的具体实施方案中，LPC的刺激可以通过施用免疫细胞来进行，所述免疫细胞为这些细胞提供生长因子支持。在具体实施方案中，这包括施用已培养以具有增加的HGF和其他肝原性生长因子的脐带血单核细胞(mononuclearcell)或单核细胞(monocyte)。
在本领域中已知，MSC能够具有一些抗肝功能衰竭的活性，但是在临床环境中尚未适当地利用这些活性。在本公开内容的实施方案中，对MSC进行免疫学操作以诱导用于治疗肝功能衰竭的最佳治疗效果。尽管就临床转化而言，骨髓MSC是最先进的，但已知其他几种MSC来源具有对具体病况可能有用的各种特性。骨髓也是造血干细胞(HSC)(其也已用于肝脏再生)的来源。同样，人胎盘是丰富的MSC(其可以在体外进行分化)的易于获得的来源。最后，具有组织再生能力的MSC也可以从脂肪组织分离，并被大量诱导成肝细胞。
脂肪组织是一种有吸引力的作为干细胞来源的骨髓的替代物，用于治疗一般的退化性疾病和特别是肝功能衰竭(Ishikawa等人，2010；Puglisi等人，2011)，原因如下：a)脂肪来源的细胞的提取是一种较简单的方法，其侵袭性比骨髓提取小得多；b)与骨髓相比，脂肪组织中间充质干细胞(MSC)含量更高，因此需要的体外扩增时间更短；以及c)来自脂肪组织的MSC不会随着衰老而数量减少(Strioga等人，2012；Yi和Song，2012；Mosna等人，2010)。
在本公开内容的方法中利用的MSC可以来源于任何组织，包括脂肪、肝、胎盘来源的、脐带来源的、月经血来源的、外周血来源的、pacental来源的等。在本公开内容的一个实施方案中，将MSC与内皮细胞和/或内皮祖细胞一起使用以加速肝再生的过程和/或诱导纤维化组织的复原。
实际上，在本公开内容的上下文范围内的是用免疫调节基因转染脂肪组织MSC(AT-MSC)，以将它们用于免疫调节。可用于实施本公开内容方法的选定基因取决于寻求调节的肝再生阶段。例如，如果寻求增加的致敏，则可以用以下转染MSC：IL-6，补体成分C1q，C1r，C1s，C3a和/或C3b，或TLR活化剂如BCG，咪喹莫特，β-葡聚糖，hsp65，hsp90，HMGB-1，脂多糖，Pam3CSK4，多聚I:多聚C，鞭毛蛋白，MALP-2，咪唑喹啉瑞喹莫德，CpG寡核苷酸，zymozan，肽聚糖，脂磷壁酸，革兰氏阳性细菌的脂蛋白，分枝杆菌的脂阿拉伯糖甘露聚糖，聚腺苷酸-多尿苷酸，单磷酰基脂质A，单链RNA，双链RNA，852A，林他莫德，嘎德莫特，和脂多糖肽。如果寻求增加增殖阶段，则MSC可以用例如HGF、VEGF或PDGF的生长因子转染。如果需要刺激抗纤维化机制，则可用各种MMP(例如MMP-1、MMP-3、MMP-9)转染细胞。
在具体实施方案中，所使用的骨髓单核细胞(BMMC)用于本公开内容涵盖的方法中。在具体实施方案中，BMMC是CD133阳性和/或CD34阳性的。MMP在肝再生中很重要，不仅因为它们通过纤维化组织裂解以改变局部环境的能力，而且还因为它们在血管生成中的作用，这对肝再生很重要(Bellayr等人，2009；Malemud，2006；Kawai等人，2012)。因此，在此实施方案的上下文范围内的是刺激MMP表达的物质与MSC一起的组合用作为治疗混合物。
各种间充质干细胞群可用于实施本公开内容的实施方案。除骨髓、脂肪或脐带来源的间充质干细胞外，羊膜间充质干细胞也可用作免疫调节细胞。在一个具体实施方案中，获得8×8cm2的羊膜切片。将它们用含有300IU/ml青霉素和300mg/ml链霉素(Gibco，GrandIsland，NY，USA)的1.0M磷酸盐缓冲盐水(PBS；pH 7.2)洗涤，并立即浸入Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)-高葡萄糖(Gibco)中，其补充有10％胎牛血清(FBS；Gibco)、300IIU/ml青霉素和300mg/ml链霉素。所有样品在收集后的12-15小时内进行处理。羊膜用1.0M PBS(pH 7.2)中的0.1％胶原酶I(Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)处理，并在37℃下孵育20分钟。羊膜各自用低葡萄糖DMEM(Gibco)洗涤3次，轻柔按摩羊膜后收集分离的细胞。将细胞在37℃下于300g离心10分钟，然后重悬于含10％FBS的RPMI 1640培养基中，然后在25cm2培养瓶中以1×106个细胞/ml的密度生长。孵育24小时后，去除非贴壁细胞。每3天更换一次培养基。培养贴壁细胞，直到它们达到80-90％汇合为止。随后基于质量控制程序选择细胞，质量控制程序包括纯度(例如，>90％CD90和CD105阳性)，无菌性(例如，缺乏内毒素和支原体/细菌污染)和效力(例如，通过抑制炎症细胞因子例如IFN-γ的产生来体外免疫调节的能力)。随后可将细胞用于淋巴管周或淋巴管内施用。本公开内容涵盖了来源于胎盘/脐带、骨髓、皮肤或牙髓组织的天然存在的MSC群的收集和递送。根据本公开内容，MSC通常可以是如通过流式细胞术检测到的表达标志物CD90和CD105(>90％)并且缺乏CD34和CD45和II类MHC表达(<5％)的贴壁细胞群，但是可以利用本文描述的其他标志物。
源于任何上述组织的细胞的细胞扩增可发生在专门建造用于细胞疗法制造并符合GMP洁净室分类的洁净室设施中。在位于10,000级清洁生产套件中的无菌II级生物安全柜中，将细胞在受控条件下解冻，并在15mL锥形管中用10ML完全DMEM低葡萄糖培养基(cDMEM)(GibcoBRL，Grand Island，N.Y.)洗涤，该培养基补充有来自奶牛的20％胎牛血清(Atlas)，该奶牛被证实为没有被规定为具有小于或等于100EU/mL(水平通常小于或等于10EU/mL)的内毒素水平和小于或等于30mg/dl(水平通常小于或等于25mg/dl)的血红蛋白水平的BSE％胎牛血清。汇集(sequester)使用的血清批次，并且所有实验均使用一个批次。随后将细胞置于含有45mL cDMEM的T-225培养瓶中，并在37℃、5％CO2的完全潮湿的气氛中培养24小时。这允许MSC贴壁。通过轻轻冲洗培养瓶，使用cDMEM洗掉非贴壁细胞。每个启用的T-225培养瓶产生大约600万个细胞。然后将第一个培养瓶的细胞分到4个培养瓶中。细胞生长4天，之后每个培养瓶中存在约600万个细胞(总计2400万个细胞)。重复该方案，但是细胞不扩增超过10代，然后将其以600万个细胞的等分试样分装在密封小瓶中入库以进行递送。生成、扩增和产品生产中的所有过程均在符合当前良好生产规范(Good ManufacturingProcesses)和适当控制的条件和测试下进行，以及FDA在1998年发布的Guidance forIndustry:Guidance for Human Somatic Cell Therapy and Gene Therapy；2008年的Guidance for FDA Reviewers and Sponsors Content and Review of Chemistry,Manufacturing,and Control(CMC)Information for Human Somatic Cell TherapyInvestigational New Drug Applications(INDs)；以及1993年FDA的有关主细胞库的指导性文件均得到遵守以用于生成所描述的细胞产品。供体细胞在无菌条件下收集、运送到合同制造厂、评估为没有污染并扩增。扩增的细胞存储在约600万个细胞/小瓶的冷冻小瓶中，每个供体约100个小瓶。在扩增的每个步骤中，都有质量控制程序以确保没有污染或异常细胞生长。
在具体实施方案中，优化间充质干细胞以具有增强的免疫调节特性。在一个实施方案中，这可以通过使间充质干细胞暴露于低氧条件进行；具体而言，低氧条件可包含低于10％的氧气水平。在一些实施方案中，低氧条件包含最多约7％的氧气。例如，低氧条件可包含最多约7％，最多约6％，最多约5％，最多约4％，最多约3％，最多约2％或最多约1％的氧气。作为另一个实例，低氧条件可以包含最多7％，最多6％，最多5％，最多4％，最多3％，最多2％或最多1％的氧气。在一些实施方案中，低氧条件包含约1％的氧至最多约7％的氧气。例如，低氧条件可包含约1％的氧气至最多约7％的氧气；约2％的氧气至最多约7％的氧气；约3％的氧气至最多约7％的氧气；约4％的氧气至最多约7％的氧气；约5％的氧气至最多约7％的氧气；或约6％的氧气至最多约7％的氧气。作为另一个实例，低氧条件可以包含1％的氧气至最多7％的氧气；2％的氧气至最多7％的氧气；3％的氧气至最多7％的氧气；4％的氧气至最多7％的氧气；5％的氧气至最多7％的氧气；或6％的氧气至最多7％的氧气。作为另一个实例，低氧条件可包含约1％的氧气至最多约7％的氧气；约1％的氧气至最多约6％的氧气；约1％的氧气至最多约5％的氧气；约1％的氧气至最多约4％的氧气；约1％的氧气至最多约3％的氧气；或约1％的氧气至最多约2％的氧气。作为另一个实例，低氧条件可以包含1％的氧气至最多7％的氧气；1％的氧气至最多6％的氧气；1％的氧气至最多5％的氧气；1％的氧气至最多4％的氧气；1％的氧气至最多3％的氧气；或1％的氧气至最多2％的氧气。作为另一个实例，低氧条件可包含约1％的氧气至最多约7％的氧气；约2％的氧气至最多约6％的氧气；或约3％的氧气至最多约5％的氧气。作为另一个实例，低氧条件可以包含1％的氧气至最多7％的氧气；2％的氧气至最多6％的氧气；或3％的氧气至最多5％的氧气。在一些实施方案中，低氧条件可包含不超过约2％的氧气。例如，低氧条件可以包含不超过2％的氧气。在具体情况下，低氧条件包括<5％，<4％，<3％，<2％，<1％或0％。
E.使用成纤维细胞将巨噬细胞体外和体内重编程为M2表型
本公开内容的某些实施方案包括可用于在有需要的个体中抑制炎症和/或刺激血管生成的细胞制剂。在具体实施方案中，通过本公开内容的方法产生的细胞用于在有需要的个体中抑制炎症和/或刺激血管生成。在一个实施方案中，与单核细胞和/或单核细胞性祖细胞一起培养成纤维细胞(和/或一种或多种物质)产生了可用于抑制炎症和/或刺激血管生成的免疫细胞。在一个实施方案中，M2巨噬细胞通过与成纤维细胞一起培养某些细胞而产生，并用作治疗性细胞以刺激血管生成和抑制炎症并被表征。在某些实施方案中，治疗性细胞由精氨酸酶的表达和/或具有产生一氧化氮(NO)的降低的能力来表示。尽管在一些情况下在递送给个体之前测试通过该方法产生的细胞的精氨酸酶的表达和/或产生NO的能力的降低，但在其他情况下则不这样做。
某些实施方案涉及血管生成刺激的问题，并且在具体实施方案中，本公开内容涉及使用从单核细胞和/或单核祖细胞与成纤维细胞群(包括某些成纤维细胞)的培养产生的巨噬细胞产生血管生成。
在一个实施方案中，成纤维细胞用于在其与单核细胞和/或单核细胞性前体(也可以称为单核细胞性祖细胞)共培养时，增强M2巨噬细胞的产生，然后由单核细胞和/或单核细胞性前体产生的M2巨噬细胞可用于在治疗上多种场合。例如，M2巨噬细胞可用于减轻梗塞后的心肌损伤，并且这种M2巨噬细胞可抑制炎症，它们可刺激血管生成和/或它们可抑制M1巨噬细胞形成(M1巨噬细胞与病理性心脏重塑和进展至心脏衰竭相关)(Liu等人,2015；He等人,2015)。因此，在本公开内容的一方面，M2巨噬细胞在体外产生，并全身或局部施用至患有心肌梗塞或处于其风险中的个体。
在本公开内容的一些实施方案中，将成纤维细胞培养的M2细胞与一种或多种血管生成生长因子(例如TPO、SCF、IL-1、IL-3、IL-6、IL-7、IL-11、flt-3L、G-CSF、GM-CSF、Epo、FGF-1、FGF-2、FGF-4、FGF-20、IGF、EGF、NGF、LIF、PDGF、BMP、活化素A、VEGF或其组合)一起施用至需要心脏修复的个体中的区域。
在本公开内容的一些实施方案中，在至少PGE-2的存在下，将成纤维细胞与任何种类的免疫细胞(包括单核细胞、单核细胞祖细胞、PBMC、MSC等)共培养。在进一步的实施方案中，暴露于细胞的PGE-2的浓度约为1-10,000ng/mL,7500ng/mL,1-5000ng/mL,1-2500ng/mL,1,000ng/mL,1-750ng/mL,1-500ng/mL,250-10000ng/mL,250-7500ng/mL,250-5000ng/mL,500-10000ng/mL,500-5000ng/mL,500-2500ng/mL,1000-10000ng/mL,1000-7500ng/mL,1000-5000ng/mL,5000-10000ng/mL,5000-7500ng/mL等。在一些实施方案中，PGE-2的浓度约为1ng/mL,5ng/mL,10ng/mL,20ng/mL,25ng/mL,50ng/mL,75ng/mL,100ng/mL,125ng/mL,150ng/mL,200ng/mL,250ng/mL,500ng/mL,750ng/mL,1,000ng/mL,2,000ng/mL,2,500ng/mL,5,000ng/mL,7,500ng/mL或10,000ng/mL。在具体实施方案中，在PGE-2的存在下将成纤维细胞与免疫细胞共培养至少或不大于或不小于例如1-72、1-50、1-25、25-72、25-50或50-72小时的时间。在一些实施方案中，在PGE-2的存在下将成纤维细胞与免疫细胞共培养约1小时,2小时,3小时,4小时,5小时,6小时,7小时,8小时,9小时,10小时,12小时,14小时,16小时,18小时,20小时,22小时,24小时,26小时,28小时,30小时,32小时,34小时,36小时,38小时,40小时,42小时,44小时,46小时,48小时,50小时,52小时,54小时,56小时,58小时,60小时,62小时,64小时,66小时,68小时,70小时或72小时。在某些实施方案中，成纤维细胞和免疫细胞与PGE-2的共培养赋予组合的培养物产生协同量的VEGF、PDGF-BB和/或EGF的能力，这在至少一些方面有益于心脏再生。在另一个实施方案中，在PGE-2存在下成纤维细胞和免疫细胞的共培养产生与成纤维细胞协同作用以诱导心脏再生的M2巨噬细胞的治疗性群体。在某些实施方案中，将培养的成纤维细胞和免疫细胞的组合在患者遭受心肌梗塞后至少或不超过3天至15天施用至患者。在某些实施方案中，将培养的成纤维细胞和免疫细胞的组合在患者遭受心肌梗塞后约3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或15天施用至患者。
某些实施方案提供了在心肌梗塞后治疗患者的方法，其包括以下步骤：任选地获得成纤维细胞；与免疫细胞一起培养成纤维细胞以获得心脏修复特性；和将成纤维细胞-免疫细胞的组合施用至已患有梗塞或怀疑患有或正患有或将患有梗塞的患者。细胞可以来自相对于个体自体或异体的来源。成纤维细胞可以来源于选自脂肪、皮肤、脐带、包皮、胎盘、网膜及其组合的组织。在一些实施方案中，成纤维细胞-免疫细胞组合的培养包括在至少PGE-2的存在下培养。在进一步的实施方案中，提供给细胞的PGE-2的浓度约为1-10,000ng/mL。在进一步的实施方案中，PGE-2的浓度为1-1,000ng/mL。在一些实施方案中，PGE-2的浓度约为1ng/mL,5ng/mL,10ng/mL,20ng/mL,25ng/mL,50ng/mL,75ng/mL,100ng/mL,125ng/mL,150ng/mL,200ng/mL,250ng/mL,500ng/mL,750ng/mL,1,000ng/mL,2,000ng/mL,2,500ng/mL,5,000ng/mL,7,500ng/mL或10,000ng/mL。在具体实施方案中，在PGE-2的存在下将成纤维细胞与免疫细胞共培养至少或不超过1小时至72小时。在一些实施方案中，在PGE-2的存在下将成纤维细胞与免疫细胞共培养约1小时,2小时,3小时,4小时,5小时,6小时,7小时,8小时,9小时,10小时,12小时,14小时,16小时,18小时,20小时,22小时,24小时,26小时,28小时,30小时,32小时,34小时,36小时,38小时,40小时,42小时,44小时,46小时,48小时,50小时,52小时,54小时,56小时,58小时,60小时,62小时,64小时,66小时,68小时,70小时或72小时。在某些实施方案中，成纤维细胞和免疫细胞与PGE-2的共培养赋予组合的培养物产生协同量的VEGF、PDGF-BB和EGF的能力，这有益于心脏再生。在另一个实施方案中，在PGE-2存在下成纤维细胞和免疫细胞的共培养产生与成纤维细胞协同作用以诱导心脏再生的M2巨噬细胞的治疗性群体。在某些实施方案中，将培养的成纤维细胞和免疫细胞的组合在患者遭受心肌梗塞后至少或不超过3天和15天施用至患者。在某些实施方案中，将培养的成纤维细胞和免疫细胞的组合在患者遭受心肌梗塞后约3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或15天施用至患者。
本公开内容涵盖成纤维细胞与免疫细胞的共培养，其允许产生M2巨噬细胞，但是，至少在某些情况下，最佳产生可以在至少PGE-2的存在下的培养后是明显的。成纤维细胞-免疫共培养的细胞的使用可以施加至其中已施加了M2细胞的区域。例如，已显示了在机制上，M2巨噬细胞通过刺激血管生成与梗塞后减少的心肌损伤相关(Dayan等人，2011)，并且其通过引用并入本文。M2刺激性细胞因子白介素13基因缺陷的小鼠中的精妙研究显示，M2巨噬细胞缺陷的小鼠中梗塞面积增大并且梗塞后愈合减少。这些结果在另一项研究中得到了重复，其中M2巨噬细胞的耗竭通过CSF-1受体信号传导途径的缺陷来实现。加速梗塞后心脏衰竭的治疗减少M2巨噬细胞的积累。另外，在许多情况下已显示出诱导愈合加速和血管生成的疗法刺激M2巨噬细胞的产生。例如，间充质干细胞的施用已显示出诱导M1巨噬细胞的减少和M2巨噬细胞的增加，这与通过刺激血管生成实现的梗塞后恢复的改善相关。在机制上，已知M2巨噬细胞抑制炎症以及刺激血管生成，这是梗塞后愈合的重要方面。另外，M2巨噬细胞抑制M1巨噬细胞形成。这很重要，因为M1巨噬细胞与病理性心脏重塑和发展至心脏衰竭相关。因此，在本公开内容的一方面，M2巨噬细胞在体外产生并被全身性或局部施用至患有心肌梗塞的患者中。
本公开内容的实施方案包括治疗或预防或延迟有此需要的个体的心肌梗塞的发作和/或严重程度的方法。方法可以包括将治疗有效量的成纤维细胞递送至个体，包括局部递送至心脏。在某些情况下，成纤维细胞已被修饰。在具体实施方案中，成纤维细胞在赋予成纤维细胞和/或免疫细胞单核细胞具有心脏修复特性的条件下暴露于足够量的免疫细胞，例如单核细胞(例如自体或同种异体的)；在具体情况下，将成纤维细胞和/或免疫细胞提供给有需要的个体。该个体可能因曾患有心肌梗塞、目前患有心肌梗塞或由于个人或家族心脏病史(包括曾患有心肌梗塞)而处于患心肌梗塞的风险中而有需要。在个体已患有心肌梗塞的情况下，可提供成纤维细胞和/或免疫细胞以从第一次心肌梗塞导致的损害修复心脏和/或预防或减轻第二次或更多次心肌梗塞的严重程度(或延缓其发作)。
在将成纤维细胞和/或免疫细胞(无论它们是否已如本文所述在培养物中彼此暴露)针对心脏病况提供给个体的情况下，它们可以心肌内施用，通过气囊导管施用到梗塞相关的动脉中，或使用气囊碰撞逆行施用至冠状窦。
在具体实施方案中，用于培养物的免疫细胞可以是通过塑料粘附获得的单核细胞，通过针对标志物CD14的流式细胞术纯化获得的单核细胞，或通过针对标志物CD14的磁活化分选(MACS)纯化获得的单核细胞。成纤维细胞和单核细胞可以以约1比1的比率培养。在与成纤维细胞一起进行组织培养后，单核细胞可以表达精氨酸酶活性。
本公开内容的某些实施方案提供了用于治疗体内任何类型的炎症的方法和组合物，包括治疗性组合物。具体实施方案提供了通过诱导巨噬细胞的M2极化来治疗心肌梗塞和/或加速梗塞后愈合过程的方法和治疗性组合物。方法包括那些包括向巨噬细胞和/或炎症的一个或多个部位施用包含成纤维细胞的组合物的方法，并且该组合物可以进一步包含一种或多种选自白介素-4、白介素-10、IL-1Ra、TGF-β、sTNF-RII、IGF-I、EGF、HGF、PDGF-AB、PDGF-BB、VEGF和sIL-1RII及其组合的蛋白质。在具体实施方案中，组合物中每种蛋白质的浓度大于正常血液中蛋白质的浓度以及成纤维细胞的存在。在具体实施方案中，组合物中蛋白质的浓度大于正常血液中蛋白质的浓度，并且在具体方面，在成纤维细胞的存在下施用蛋白质。所述组合物还可以包含白细胞、血小板、浓缩血浆、骨髓抽吸物、脂肪组织，其级分及其组合。在具体实施方案中，通过从需要治疗的受试者获得细胞因子细胞悬液并分级分离细胞因子细胞悬液以产生包含IL-4、IL-10、IL-1Ra和/或TGF-β的自体蛋白溶液来产生蛋白质溶液，其与成纤维细胞一起施用。成纤维细胞对于受体个体可以是同种异体的，或者它们对于个体可以是自体的。然后可以将组合物施用至人或其他动物受试者的炎症部位。在具体情况下，分级分离包括将血液放置在具有可操作以将血液分离成两个或更多个级分的分离器的容器中；和离心分离器以产生富含血小板的血浆级分。可使富含血小板的血浆与固体提取材料接触。
F.用成纤维细胞重编程的自体T细胞刺激血管生成和/或加速伤口愈合
公开了通过向需要其的个体施用某些细胞来刺激血管生成和/或加速伤口愈合的方法。在具体实施方案中，所述个体接受有效量的自体T细胞，所述自体T细胞在能够赋予T细胞抑制Th1细胞因子谱和增加Th2/Th3谱以及某些情况下在T细胞中诱导遗传程序以允许反应性T细胞启动促血管生成基因程序的表达的条件下通过成纤维细胞(例如包括同种异体的)重编程，其中促血管生成基因程序至少在一些情况下包括HIF-1α的核易位。在一个实施方案中，提供了治疗体内的一种或多种缺血性疾病的新颖手段。
在关于血管生成领域的具体实施方案中，本公开内容涉及使用免疫细胞刺激血管生成，包括通过事先将T细胞与成纤维细胞(例如，同种异体细胞)共培养赋予免疫系统的T细胞刺激血管生成的能力。这样的T细胞可以被称为活化的T细胞。
本公开内容的实施方案包括使用同种异体成纤维细胞以通过共培养系统赋予T细胞促血管生成表型。在一些实施方案中，共培养物包含成纤维细胞(包括贴壁的成纤维细胞)以及包含T细胞的非贴壁细胞群或纯化的T细胞。在本公开内容的一个实施方案中，在合适的组织培养基以及浓度约为10％(体积)的胎牛血清和/或血小板裂解物和/或富含血小板的血浆中培养成纤维细胞，所述组织培养基可以选自已知的培养基，例如Roswell ParkMemorial Institute(RPMI-1640)、Dublecco改良的基础培养基(DMEM)、Eagle改良的基础培养基(EMEM)、Optimem、Iscove培养基或其组合。在某些情况下，允许成纤维细胞粘附于基底(其可天然存在)，然后添加T细胞。在一个具体实施方案中，T细胞是外周血单核细胞群的一部分。将成纤维细胞和T细胞一起培养具体的时间，例如1小时至两周。在具体实施方案中，将它们一起培养至少约或不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17，18、19、20、21、22、23或24小时或1、2、3、4、5、6、7天或1或2周。在具体实施方案中，将成纤维细胞和T细胞一起培养约48小时。随后，提取非贴壁性T细胞和包含T细胞的细胞群，并用于施用以刺激血管生成。不限于机制，通过与成纤维细胞进行组织培养而产生的T细胞可通过直接充当内皮细胞的有丝分裂原来刺激血管生成和/或可通过诱导机体细胞中例如血液细胞中促血管生成细胞因子的产生来刺激血管生成。
在一些实施方案中，通过除去非贴壁细胞从与成纤维细胞的共培养物中提取T细胞，并且在不进行进一步处理的情况下，在一些情况下，通过一种或多种测定进一步纯化T细胞。在一些情况下，可使用磁活化细胞分选(MACS)进一步纯化非贴壁细胞。在使用MACS的情况下，进行针对一种或多种T细胞标志物的选择。在一个实施方案中，T细胞标志物CD25用于选择活化的T细胞，之后将CD25+T细胞施用以治疗需要其的个体中的医学病况，例如缺血性疾病、伤口等。在一个具体实施方案中，缺血性疾病的治疗通过在用成纤维细胞培养T细胞之后肌内施用T细胞来进行。缺血性疾病包括至少严重肢体缺血、心脏缺血、腰部缺血和肠缺血。在其他实施方案中，施用T细胞以加速具有伤口(例如烧伤、割伤、擦伤、裂伤、穿刺、撕脱伤或其组合)的个体的伤口愈合。
在一些实施方案中，在暴露于成纤维细胞之后，将T细胞作为可生物降解的植入物的一部分施用至个体，尽管在替代实施方案中，植入物是不可生物降解的，或在不存在植入物的情况下施用T细胞。在具体实施方案中，植入物包含T细胞和由T细胞释放的一种或多种血管生成因子(包括在植入物的植入后)。在这种类型的实施方案中，植入物可以包括载体，该载体可以被选择以便长时间保留在植入部位内并且将血管生成因子从其中所包含的T细胞缓慢释放到周围环境中。这种递送方式允许血管生成因子以治疗有效量在部位内长期保留。通过提供在载体内的血管生成因子，可以实现将血管生成因子直接释放到靶区域中的优点。在一些实施方案中，用于植入物的载体以可注射形式提供。可注射性允许以微创方法递送载体，例如，递送可以是经皮、肌内、皮下、网膜内、心室内和/或鞘内递送。在一些实施方案中，可注射的载体是凝胶。在其他实施方案中，作为示例，可注射的载体包括透明质酸(HA)。
在T细胞移植物或植入物的一些实施方案中，载体包含平均孔径为至少25微米的多孔基质。在某些实施方案中，多孔基质的平均孔径为25微米至110微米。当平均孔径在该范围内时，在具体实施方案中，多孔基质还将充当用于能够成为刺激靶区域中的血管生成的细胞的细胞迁移的支架，所述细胞是例如单核细胞、内皮祖细胞、髓样祖细胞和/或间充质干细胞。可用于形成多孔基质的有机材料的许多实例是本领域技术人员已知的，包括但不限于胶原蛋白、聚氨基酸或明胶。胶原蛋白来源可以是人造的(即，重组的)或相对于接受植入物的哺乳动物是自体的或同种异体的或异种的。胶原蛋白还可以是非端肽或端肽胶原的形式。另外，可以使用来自与高水平的血管生成相关的来源的胶原蛋白，例如胎盘来源的胶原蛋白。可用于形成基质的合成聚合物的实例包括但不限于聚乳酸、聚乙醇酸或聚乳酸/聚乙醇酸的组合。基质材料可以由一种或多种可吸收的聚合物和/或一种或多种不可吸收的聚合物组成。本领域技术人员将理解，术语多孔或半多孔是指基质中孔的变化密度。支架结构可以在一些实施方案中用于锚定或增强或基本上引起植入物与解剖结构之间的粘附(例如，这种解剖结构可以是骨、软骨、神经、腱和/或韧带)。在一些实施方案中，将植入物粘附至解剖结构的手段可以是凝胶。在一些实施方案中，在关节镜流体条件下，可以将凝胶与植入物一起注射到移植部位。凝胶可以是由可生物吸收或可生物吸附的材料(至少在某些情况下具有在身体环境中及时再吸收的能力)形成的生物或合成凝胶。合适的支架剂也是本领域技术人员已知的，并且可以包括透明质酸，纤维蛋白胶，纤维蛋白凝块，胶原蛋白凝胶，藻酸胶，明胶-间苯二酚-福尔马林粘附剂，贻贝基粘附剂，二羟基苯丙氨酸基粘附剂，壳聚糖，转谷氨酰胺酶，聚(氨基酸)基粘附剂，纤维素基粘附剂，多糖基粘附剂，合成的丙烯酸酯基粘附剂，富血小板的血浆(PRP)凝胶，贫血小板血浆(PPP)凝胶，PRP凝块，PPP凝块，基质胶，单硬脂酰甘油共琥珀酸酯。(MGSA)，单硬脂酰甘油共琥珀酸酯/聚乙二醇(MGSA/PEG)共聚物，层粘连蛋白，弹性蛋白，蛋白聚糖，聚(N-异丙基丙烯酰胺)，聚(氧化烯)，聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)的共聚物，聚(乙烯醇)及其组合。
在一些实施方案中，使用柔韧的支架以便允许支架调节至植入的靶位点的尺寸。例如，支架可以包括凝胶状材料或粘附材料，以及泡沫或网状结构。在某些实施方案中，支架是可生物吸收的材料。支架可由具有孔的聚合物泡沫组分形成，所述孔具有开孔结构。孔的尺寸可以变化，但是在具体情况下，孔的尺寸使得允许组织或血管生成向内生长。在一些实施方案中，孔径在约40至900微米的范围内。聚合物泡沫组分可任选地包含增强组分，例如织造、针织、弯曲针织(即，花边状)、非织造和/或辫状结构。在一些实施方案中，当聚合物泡沫组分包含增强组分时，泡沫组分可以与增强组分整合，使得泡沫组分的孔穿透增强组分的网孔并与增强组分互锁。在一些实施方案中，一种或多种血管生成生长因子主要通过其扩散通过持续递送装置(例如通过聚合物)而从持续递送装置释放。在其他情况下，血管生成因子主要通过持续递送装置的生物降解(例如聚合物的生物降解)从持续递送装置释放。在一些实施方案中，植入物包含可生物吸收的材料，其的逐渐腐蚀导致血管生成因子的逐渐释放。在一些实施方案中，植入物包含可生物吸收的聚合物。在具体实施方案中，可生物吸收的聚合物具有至少一个月的半衰期。因此，在一些实施方案中，植入物包含与一种或多种血管生成因子混合的聚-DL-丙交酯-共-乙交酯共聚物(PLG)。
在一些实施方案中，植入物包含水凝胶，包括由水凝胶组成或基本上由水凝胶组成。水凝胶还可以用于以时间释放的方式将一种或多种血管生成因子递送至一个或多个灌注不足的区域。如本文所定义，“水凝胶”是当有机聚合物(天然或合成的)固化或凝固以产生三维开放晶格结构时形成的物质，该三维开放晶格结构截留水或其他溶液的分子以形成凝胶。固化可以例如通过聚集、凝结、疏水相互作用或交联发生。水凝胶可快速固化以使血管生成因子保持在引起灌注不足的血管或与灌注不足相关的区域附近。在一些实施方案中，水凝胶是细粉状合成水凝胶。合适的水凝胶表现出诸如与所选基质聚合物的相容性和生物相容性的性质的最佳组合。水凝胶可包括以下一种或多种：多糖，蛋白质，聚磷腈，聚(氧乙烯)-聚(氧丙烯)嵌段聚合物，乙二胺的聚(氧乙烯)-聚(氧丙烯)嵌段聚合物，聚(丙烯酸)，聚(甲基丙烯酸)，丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物，聚(乙酸乙烯酯)和/或磺化聚合物。
在具体实施方案中，本公开内容包括能够产生一种或多种血管生成生长因子的T细胞。在某些实施方案中，可以通过包括以下的步骤产生T细胞(包括CD4、CD8、γδ、NK T细胞或其混合物)：a)提供成纤维细胞群(例如胎盘的、胎儿的、新生儿的或成体的或其混合物)；b)使成纤维细胞群与同种异体细胞群接触，所述同种异体细胞群包含T细胞；和c)将同种异体成纤维细胞与包含T细胞的同种异体细胞群在足以赋予T细胞一种或多种血管生成特性(例如产生一种或多种血管生成生长因子的能力，包括以前未暴露于成纤维细胞的T细胞所缺乏的能力)的条件下培养足够长时间。血管生成生长因子的实例包括至少(a)PDGF-BB；(b)血管生成素；(c)VEGF；(d)EGF；(e)FGF-1；(f)FGF-2；(g)FGF-5；(h)MMP3；(i)MMP9；和/或(j)溶基质蛋白酶。
在一些情况下，成纤维细胞和T细胞的共培养物包含一种或多种另外的物质，例如一种或多种免疫调节剂。在具体实施方案中，免疫调节剂包括FAS配体，IL-2R，IL-1Ra，IL-2，IL-4，IL-8，IL-10，IL-20，IL-35，HLA-G，PD-L1，I-309，IDO，iNOS，CD200，半乳凝素3，sCR1，精氨酸酶，PGE-2，阿司匹林，阿托伐他汀，氟伐他汀，洛伐他汀，普伐他汀，瑞舒伐他汀，辛伐他汀，匹伐他汀，正乙酰半胱氨酸，雷帕霉素IVIG，纳曲酮，TGF-β，VEGF，PDGF，CTLA-4，抗CD45RB抗体，羟氯喹，来氟米特，金诺芬，双氰金，柳氮磺吡啶，氨甲蝶呤，糖皮质激素，依那西普，阿达木单抗，阿巴西普，阿那白滞素，赛妥珠单抗，依那西普-szzs，戈利木单抗，英夫利昔单抗，利妥昔单抗，托珠单抗，环孢霉素，IFN-γ，依维莫司，雷帕霉素或其组合。
在具体实施方案中，在液体培养基中培养成纤维细胞和包含T细胞的群体，所述液体培养基为例如Roswell Park Memorial Institute(RPMI-1640)、Dublecco改良的基础培养基(DMEM)、Eagle改良的基础培养基(EMEM)、Optimem、Iscove培养基或其组合。在具体情况下，将一种或多种另外的物质(例如人富含血小板的血浆、血小板裂解物、脐带血血清、自体血清、人血清、、血清替代物或其组合)添加到培养基中。在一些情况下，血清替代物占培养基组合物体积的至少或不超过1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49或50％。在具体实施方案中，富含人血小板的血浆占培养基组合物体积的至少或不超过1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49或50％。在一些情况下，血小板裂解物占培养基组合物体积的至少或不超过1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49或50％。在一些情况下，脐带血血清占培养基组合物体积的至少或不超过1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49或50％。在某些情况下，自体血清占培养基组合物体积的至少或不超过1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49或50％。在具体情况下，人血清占培养基组合物体积的至少或不超过1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49或50％。
在具体实施方案中，IL-2、IL-3、IL-7和/或IL-15与成纤维细胞和包含T细胞的细胞群(例如PBMC)一起包含在组织培养物中以增强T细胞增殖，并且在具体情况下，IL-2可以以每毫升组织培养基约10皮克到每毫升组织培养基约1微克的浓度添加。
在一些情况下，将一种或多种某些物质暴露于组织培养物以诱导T细胞中一种或多种具体基因产物的表达。例如，在某些情况下，抗CD3和/或抗CD28抗体暴露于T细胞以诱导T细胞中CD25的表达。在具体情况下，例如，将抗CD3和/或抗CD28抗体固定在诸如珠子和/或组织培养瓶的固体表面上，并且还以足以诱导CD25、CD69和/或CTLA4的T细胞表达的浓度和时间暴露于组织培养基。
G.使用应激的成纤维细胞优化树突状细胞成熟
在一些实施方案中，本公开内容涉及免疫疗法领域，更具体地，本公开内容涉及抗原呈递细胞用于诱导针对具体抗原的免疫的用途，更具体地，本公开内容涉及应激的成纤维细胞(应激是任何非生理性的条件)用于增强树突状细胞的免疫原性的用途。本公开内容的具体实施方案利用应激的成纤维细胞的性质以诱导树突状细胞成熟。
提供了增加树突状细胞的抗原呈递能力的方法，其中某些细胞用早已被应激的成纤维细胞培养(尽管成纤维细胞可以在树突状细胞存在的情况下被应激)。在本公开内容的一个实施方案中，在适合于树突状细胞分化的条件下培养单核细胞，然后与应激的成纤维细胞培养，例如以诱导由单核细胞产生的树突状细胞的成熟和优化的抗原呈递活性。在一个实施方案中，树突状细胞对于成纤维细胞是同种异体的。在另一个实施方案中，尽管它们在具体情况下可以是同种异体的，树突状细胞对于成纤维细胞是自体的。
本实施方案提供了应激的成纤维细胞在刺激树突状细胞成熟中的用途。至少在一些情况下，刺激树突状细胞成熟包括增强共刺激分子(例如CD40、CD80和CD86)在树突状细胞中的表达，以及增强增加T细胞活化的能力。在一个实施方案中，本公开内容包括成纤维细胞暴露于非生理条件足够长的时间以诱导一种或多种热激蛋白的表达和/或改变成纤维细胞的生长因子产生活性，并且示例性生长因子包括EGF、FGF-1、FGF-2、FGF-5、VEGF、PDGF、PDGF-BB、血管生成素、IGF-I和/或HGF。在一个实施方案中，成纤维细胞对于树突状细胞是同种异体的，而在另一个实施方案中，成纤维细胞对于树突状细胞是自体的。
成纤维细胞的应激的暴露可以使用本领域已知的各种方法进行。在一个实施方案中，将成纤维细胞暴露于高热，并且高热可包括至少或不超过1至8小时的温度升高，并且在一些情况下，温度升高至少或不超过39、40、41或42摄氏度。在具体情况下，将细胞在约40摄氏度的温度下暴露于高热约4小时。在一些实施方案中，树突状细胞从个体的外周血单核细胞(PBMC)产生，并且CD8细胞使用磁活化细胞分选(MACS)从PBMC(例如)纯化。在其他实施方案中，从肿瘤浸润淋巴细胞提取CD8T细胞。
在本公开内容的一方面，根据常规方案分离树突状细胞，并将其暴露于应激的成纤维细胞。在具体实施方案中，刺激树突状细胞活化的机理是以模拟先天免疫系统活化信号的方式产生成纤维细胞，所述信号被描述为“危险”信号，例如与组织损伤或致病性威胁相关的toll样受体(TLR)激动剂。本实施方案集中于树突状细胞的活化，因为与诸如巨噬细胞或B细胞的其他抗原呈递细胞相比，树突状细胞在抗原特异性系统以及多克隆实验例如在混合淋巴细胞反应中均表现出更高量级的刺激T细胞应答的能力(Banchereau和Steinman，1998)。已知在外周组织中(在淋巴结外)，DC通过几种互补机制(包括吞噬作用和受体介导的内吞作用)捕获抗原。已知未成熟的DC具有高度的吞噬活性和低水平的抗原呈递活性。通常，外周组织中的DC不成熟。这些未成熟的DC具有有效捕获抗原的能力；它们可以在晚期的核糖体-溶酶体区室中积累II类MHC分子；它们可以表达低水平的共刺激分子；它们可以表达一组独特的趋化因子受体(例如CCR7)，其允许它们迁移至淋巴组织；并且它们具有有限的分泌细胞因子的能力(Trombette和Mellman，2005)。本公开内容涵盖模拟体内发生的DC活化的天然过程的手段，但是在本公开内容中涵盖其离体诱导。
本公开内容提供了产生活化的DC的手段，例如通过暴露于在应激的成纤维细胞上表达的一种或多种刺激信号，例如toll样受体激动剂，包括热激蛋白，例如hsp90和/或hsp70。至少在一些情况下，暴露于应激的成纤维细胞导致DC吞噬活性降低，并允许DC随后通过传入淋巴管迁移到引流淋巴结中。在运输过程中，DC将摄入的蛋白质降解为与MHC I类分子和MHC II类分子两者结合的肽。这允许DC：a)执行交叉呈递，因为它们摄入外源抗原，但呈递MHC I途径中的肽；和b)活化CD8(通过MHC I)和CD4(通过MHC II)。有趣的是，脂质抗原是通过不同的途径加工的，并被加载到CD1家族的非经典MHC分子上(Itano和Jenkins，2003)。
本公开内容包括诱导DC成熟的方法，并且在一些情况下，该成熟与抗原捕获活性的下调、表面MHC II类分子和共刺激分子的表达增加、分泌细胞因子的能力以及CCR7的获得(其允许DC迁移到引流淋巴结中)相关。共刺激受体CD40(也称为TNFRSF5)的连接是将未成熟DC分化为能够启动适应性T细胞介导的免疫的完全成熟DC的必需信号(Caux等人，1994)。但是，仅DC成熟不会导致独特的DC表型。相反，由不同微生物或病毒直接或通过周围的免疫细胞提供的不同信号诱导DC获得不同的表型，其最终导致不同的免疫反应。实际上，DC成熟根据不同的微生物而变化，因为微生物表达不同的病原体相关分子模式(PAMP)，其触发不同的DC分子传感器(其被称为模式识别受体(PPR))。令人惊讶的是，尽管大多数微生物活化DC，但少数微生物可通过各种途径阻止DC成熟(Pulendran等人，2001)。组织定位的DC也可以通过周围免疫细胞响应于损伤而释放的产物极化为不同的表型。例如，γd-T细胞和NK细胞释放干扰素-γ(IFNγ)，肥大细胞释放预先形成的IL-4和TNF，pDC分泌IFNa，基质细胞分泌IL-15和胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)。因此，在本公开内容的一方面，在另外的细胞和/或细胞产生的因子例如IFN-γ、IL-4、TNF、IFN-α、IL-15和/或TSLP的存在下培养应激的成纤维细胞/未成熟的树突状细胞祖细胞以模拟体内免疫反应。
这些细胞因子诱导祖细胞或前体细胞(例如单核细胞)分化为产生独特类型的T细胞的不同的炎性DC。在CD4和CD8T细胞与DC相互作用后，这些细胞可随后分化为具有不同功能的抗原特异性效应T细胞。CD4 T细胞可以成为T辅助1(TH1)细胞、TH2细胞、TH17细胞或T滤泡辅助(T)细胞(其帮助B细胞分化为分泌抗体的细胞)以及Treg细胞。幼稚CD8T细胞可产生效应细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。DC的有趣的活性是除了通过活化幼稚T细胞来刺激免疫反应外，DC还能够充当抑制性细胞。这是直接通过抑制T细胞活化和/或诱导T细胞无能(Lutz等人，2000)，或间接地通过刺激T调节(Treg)细胞(Turnquist和Thomson，20908；Pletinckx等人，2011)。有趣的是，不仅Treg细胞而且无能T细胞都能够抑制DC活化(Frasca等人，2002；Vendetti等人，2000；Veldhoen等人，2006)，从而可能刺激自我维持免疫调节反馈回路。实际上，以前已报道过这样的情况，其中Treg刺激未成熟的DC，未成熟的DC进而刺激新的Treg细胞的产生(Guillot等人，2003；Roelofs-Haarhuis等人，2003)。
在应激的成纤维细胞的暴露以增加DC的活化时，可以产生许多种类型的基于DC的疗法。此类疗法包括Provenge(sipuleucel-T)，其已获FDA批准用于治疗雄激素抵抗性前列腺癌，并且是来源于以下细胞的细胞产物：自体外周血单核细胞(PBMC)衍生的树突状细胞，其已使用包含GM-CSF和前列腺特异抗原前列腺酸磷酸酶的嵌合蛋白生长(Sternberg等人，2014；Gomela等人，2014)；用具体肽(例如PSM-P1或–P2)脉冲的DC；用GM-CSF-PAP融合蛋白脉冲的DC；PSA蛋白脉冲的DC(Barrou等人，2004)；装载有来源于前列腺干细胞抗原(PSCA(14-22))、前列腺酸磷酸酶(PAP(299-307))、前列腺特异性膜抗原(PSMA(4-12))和/或前列腺特异性抗原(PSA(154-163))的抗原肽的DC(Waeckerle-Men等人，2006)等。
在本公开内容的一个实施方案中，存在诱导树突状细胞成熟(成熟的树突状细胞，例如髓样树突状细胞或淋巴样树突状细胞)的方法，包括以下步骤：(a)获得未成熟状态的树突状细胞(髓样树突状细胞或淋巴样树突状细胞)；(b)在应激的成纤维细胞群的存在下培养未成熟的树突状细胞(成纤维细胞可从任何组织中获得，包括至少真皮、阴茎包皮、脂肪组织、胎盘组织等)。在具体实施方案中，处于未成熟状态的髓样树突状细胞表达高水平的CD83和/或IL-10和/或表达低水平的IL-12、CD40、CD80和/或CD86。在具体实施方案中，未成熟的髓样树突状细胞表达高水平的CD83、IL-10或两者，例如与红细胞相比超过50％。在具体实施方案中，未成熟的树突状细胞是混合淋巴细胞反应的不良刺激物和/或T细胞活化的不良刺激物。在具体实施方案中，CD8T细胞对于树突状细胞和/或成纤维细胞是自体的或同种异体的。在具体情况下，未成熟的树突状细胞包括单核细胞或髓样祖细胞。
成纤维细胞可以暴露于一种或多种应激源以产生应激的成纤维细胞，并且可以利用任何合适的应激源。在具体实施方案中，应激源是高热，并且在某些情况下，高热包括暴露于升高的温度持续能够诱导热激蛋白90的表达的一段时间。可以在暴露于40摄氏度的温度下至少或不超过约1、2、3、4、5、6、7或8小时来引发高热。在某些情况下，使用高热和其他应激源，例如血清剥夺，尽管在某些情况下，在没有高热的情况下使用血清剥夺。在具体实施方案中，应激源包括暴露于血清剥夺至少或不超过约12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27，28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48小时。在具体情况下，应激源是暴露于血清剥夺24小时或暴露于血清剥夺12-48小时。
H.使用同种异体成纤维细胞饲养细胞扩增CD8T细胞的方法
已显示最初来源于胸腺的T细胞在免疫系统的功能中起关键作用。广义上讲，T细胞分为表达标志物CD4的T辅助细胞和表达标志物CD8的T细胞毒性细胞。在癌症免疫治疗领域，研究表明CD8T细胞在肿瘤中的浸润与生存期增加相关。不幸的是，肿瘤通过分泌免疫抑制因子来保护自己免受免疫介导的破坏(Wile等人,1984；Medoff等人,1986；Stratton andDiSaia等人,1982；O’Mahony等人,1993；Spellman等人,1996；Avradopoulos等人,1997；Young等人,1997；Pope,1985；Pope,1985b,Pillay等人,1986；Kppi and Halliday,1983)。离体(体外)刺激免疫细胞比体内容易得多，因为在前者中，它们在不存在肿瘤分泌的免疫抑制因子的情况下进行维持，因此使得活化更加容易。一些研究人员试图通过用免疫调节剂“淹没”患者来体内活化宿主免疫细胞。但是，这些方案是有问题的，因为实现适当活化所需的大量细胞因子会诱导毒性。一个著名的例子是白介素2(IL-2)试验，其中获得免疫活化所需的剂量非常高以使得许多患者由于毒性而不得不停止治疗(Atkins等人,1999；Rubin等人,1989；Rosenberg等人,1987；Lotze等人,1986；Rosenberg等人,1986；Bruton andKoieller,1994；Richards等人,1988；Du Bois等人,1995；Shulman等人,1996)。目前有几个研究小组试图通过与多种物质(包括地塞米松(Mier等人，1990)、己酮可可碱(Edwards等人，1991)，消炎痛(Mertens等人，1993)和褪黑素(Lissoni等人，1996))共同施用来降低IL-2的毒性。离体刺激免疫细胞的毒性比全身免疫调节的毒性小，并且由于使用的免疫刺激剂的量较少，因此也较便宜。
离体刺激方法开始于小鼠研究，其中可以通过脾细胞的转移将针对肿瘤的免疫从抗性小鼠传递至对照小鼠(Takeichi and Boone,1975；Ting,1976；Ting,1978；Igarashi等人,1979；Ting等人,1979；Rodrigues and Ting,1981；Mule等人,1979；Whitney等人,1975)。进一步的分析表明，为了最佳地转移保护性，CD4和CD8T细胞必须一起转移(Peng等人，1997；Peng等人，2000；Kjaergaard等人，2001；Li等人，1994)。但是，这些小鼠研究并不是真正的离体实验，因为淋巴细胞的刺激发生在小鼠体内。问题是“我们是否可以非特异性地离体活化免疫细胞？”甚至更好的是，“我们是否可以离体活化特异性针对癌症的T细胞？”后一种方法优于前一种方法，因为非特异性离体活化可导致自身反应性免疫细胞重新活化，从而触发自身免疫。实际上，早期尝试确实通过取出白细胞、离体添加多克隆T细胞有丝分裂原PHA并随后将活化的细胞重新注入宿主来非特异性活化患者细胞。这种疗法的成功率并不优于常规治疗例如化学疗法或放射疗法，因此被放弃了(Cheema nd hersh，1972；Garovoy等人，1973)。
另一种离体刺激方法具有更强的成功率。该方法涉及纯化外周血单核细胞(即淋巴细胞)，用免疫刺激性白介素2活化它们，并将活化的淋巴细胞重新注入自体患者中。与旨在非特异性活化T细胞的第一种方法相比，该方法活化天然杀伤(NK)细胞和具有类似NK的能力的一部分T细胞，称为淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞(Lindemann等人，1989；Glassman，1989；Grimm，1986)。这些细胞具有杀死表达异常MHC水平的肿瘤细胞(Timonen和helander，1997)以及不表达空1类MHC的靶细胞(RG Miller，个人交流)的能力。
另一种离体活化免疫细胞的免疫治疗方法涉及使用针对实体瘤的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。TIL已在各种肿瘤中发现，并与某些癌症的良好预后相关，包括肝癌(Kaata等人，1992)、黑素瘤(Miwa，1984；Lipponen等人，1992)、膀胱癌(Lipponen等人，1992)、结直肠癌(Ropponen等人，1997)和卵巢癌(Ma和Gu，1991；Tomsova等人，2008)。许多肿瘤免疫学家相信，TIL渗透到肿瘤中以诱导其根除，但是由于肿瘤分泌的免疫抑制因子抑制免疫活化，因此这在体内不会发生。TIL疗法涉及手术切除肿瘤块，在密度梯度上将TIL与肿瘤细胞分离，在免疫刺激性体外条件下扩增淋巴细胞以及将活化的杀伤细胞重新注入患者体内(Filgueira等人,1993；Topalian等人,1988)。将TIL疗法与LAK疗法的抗肿瘤功效进行对比的小鼠模型显示，TIL疗法具有约一百倍的杀肿瘤效果(Spiess等人，1987；Yang等人，1990)。TIL具有增强的肿瘤消除效果的可能原因是该疗法仅活化识别肿瘤并对其做出反应的淋巴细胞。相比之下LAK疗法则活化过多的细胞，其中只有一小部分是特异性针对肿瘤的。在临床上，使用TIL的结果是清楚的，其中在大约20％的黑素瘤患者中具有可重复的反应(Whiteside，1991)。增强TIL功效的一种方法是通过用TNF的cDNA转染TIL来增强其杀伤潜力(Rosenberg等人，1993)。
过继性T细胞疗法的可能最有效和临床上成功的实例之一是嵌合抗原受体(CAR)T细胞的使用。这方面的一个实例是一份最近的出版物，其中通过利用掺入连接至Fc受体γ链的信号传导域的抗FR单链抗体的嵌合基因对自体T细胞进行遗传修饰，来产生具有针对卵巢癌相关抗原α-叶酸受体(FR)的反应性的T细胞。患者被分配到研究中的两个队列之一。队列1中的8名患者接受与高剂量白介素2联合的剂量递增的T细胞，队列2中的6名患者接受双重特异性T细胞(与FR和同种异体细胞都具有反应性)随后用同种异体外周血单核细胞免疫。队列1中的5名患者经历一些3至4级的治疗相关的毒性反应，这可能是由于白介素2的施用所致，其可以使用标准措施进行管理。队列2中的患者经历1至2级症状的相对较轻的副作用。任何患者中均未见肿瘤负荷的减少。在队列1中追踪111In标记的过继转移的T细胞表明，除了一名患者的腹膜沉积物中检测到某些信号外，没有T细胞针对肿瘤的特异性定位。PCR分析表明，基因修饰的T细胞在转移后的前2天大量存在于循环系统中，但是在大多数患者中，这些修饰的T细胞在1个月后迅速下降到几乎无法检测到的水平(Kershaw等人，2006)。对于神经母细胞瘤(Park等人，2007；Louis等人，2011)、B细胞恶性肿瘤(Park andBrentjens,2010；Kochenderfer等人,2010；Porter等人,2011；Kalos等人,2011；Brentjens等人,2011；Kebriaei等人,2012；Kochenderfer等人,2012；Till等人,2012；Brentjens等人,2013；Kochenderfer and Rosenberg,2013；Davila and Brentjens,2013；Cruz等人,2013；Kochenderer等人,2013)、黑素瘤(Wu等人，2012)、卵巢癌(Kandalaft等人，2012)、肾癌(Lamers等人，2013)、间皮瘤(Schuberth等人，2013)和头颈癌(van Schalwyk等人，2013)，已报道了类似的CAR-T临床研究。
本公开内容的实施方案解决了本领域的缺陷，并且包括通过离体培养来增强CD8T细胞的活性的方法。本公开内容的实施方案涉及扩增CD8谱系的T细胞和赋予T细胞一种或多种能力(例如产生细胞因子、增殖和/或引起细胞毒性)的领域。在具体实施方案中，对CD8T细胞进行工程改造，使其表达非内源性受体，包括非内源性CAR、T细胞受体、αβ受体等。
在本公开内容的具体实施方案中，将成纤维细胞暴露于一种或多种应激源，然后将其与CD8谱系的T细胞一起培养；应激的成纤维细胞然后能够强力地扩展增殖，增加细胞因子的产生并增加CD8T细胞的细胞毒性活性。在一个实施方案中，将成纤维细胞暴露于一种或多种应激源(例如血清剥夺)约24小时。在另一个实施方案中，将成纤维细胞暴露于一种或多种应激源(包括高热)，例如在约40摄氏度下持续4小时。
本公开内容提供了“应激的”成纤维细胞作为饲养细胞用于刺激CD8T细胞的用途。CD8T细胞的刺激包括增强增殖能力、增加细胞因子分泌、增加细胞毒性活性和/或降低共刺激需求。在本公开内容的一个实施方案中，将成纤维细胞暴露于非生理条件足够长的时间以诱导热激蛋白的表达并改变成纤维细胞的生长因子产生活性。在对成纤维细胞进行应激的同时，或在对成纤维细胞进行应激之后，使成纤维细胞经受CD8T细胞。在一个实施方案中，成纤维细胞对于CD8T细胞是同种异体的，而在另一个实施方案中，成纤维细胞对于CD8T细胞是自体的。
成纤维细胞的应激的暴露可以使用本领域已知的各种方法进行。在一个实施方案中，将成纤维细胞暴露于高热，并且高热可以包括温度升高1至8小时，并且温度升高可以为39-42摄氏度。在具体情况下，将细胞在约40摄氏度的温度下暴露于高热4小时。在一些实施方案中，T细胞从患者的外周血单个核细胞(PBMC)分离，并且CD8细胞使用磁活化细胞分选(MACS)纯化。在其他实施方案中，从肿瘤浸润淋巴细胞提取CD8T细胞。分离肿瘤浸润淋巴细胞的方法是本领域已知的，并且通过引用并入本文(Igarashi等人，2002)。
在一个实施方案中，CD8T细胞群获自受试者的血液样品，例如通过单采血液分离术获得。在一个实施方案中，洗涤通过单采血液分离术收集的免疫效应细胞以除去血浆级分，并且任选地，将细胞提供于适当的缓冲液或介质中以用于随后的处理步骤。在一个实施方案中，用缓冲液例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一个实施方案中，将细胞在缺乏一种或多种二价阳离子例如钙和/或镁的洗涤溶液中洗涤。在一个实施方案中，免疫效应细胞在基本上没有二价阳离子的缓冲液中洗涤。
在一个实施方案中，该方法包括从免疫效应细胞群中产生瞬时表达外源siRNA的siRNA工程改造的T细胞群。该方法包括在暴露于成纤维细胞之前或之后，将体外转录的siRNA或合成的siRNA引入免疫细胞。siRNA转染可以在从免疫细胞提取CD8T细胞之前或之后进行。在具体情况下，siRNA靶向免疫抑制分子，例如免疫检查点。许多免疫学检查点是本领域已知的，例如包括CTLA-4、STAT6、IL-10和/或PD-1。在一个实施方案中，通过电穿孔将siRNA引入免疫效应细胞。在一个实施方案中，至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的免疫效应细胞表达siRNA。在一个实施方案中，通过在配体例如同源抗原分子或抗独特型抗体的存在下培养免疫效应细胞来扩增和/或活化免疫效应细胞。在一个实施方案中，在将siRNA引入免疫效应细胞后使免疫效应细胞与同源抗原分子或抗独特型抗体接触至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、28、32、36、36或48小时。在一个实施方案中，在将RNA引入免疫效应细胞后，使免疫效应细胞与同源抗原分子或抗独特型抗体接触少于24、15、12、10或8小时。在具体实施方案中，在将siRNA引入免疫效应细胞后，使免疫效应细胞与同源抗原分子或抗独特型抗体接触至少一定小时数。在这种情况下，尚未提取CD8细胞，并且免疫效应细胞被活化；随后，提取CD8细胞。
在本公开内容的一些实施方案中，将能够刺激T细胞增殖的抗原添加到应激的成纤维细胞/T细胞培养物中。可以将抗原作为蛋白质、肽和/或改变的肽配体添加到培养物中，或者可以将它们中的任何一种基因工程改造到成纤维细胞中。在用于肿瘤免疫疗法的CD8细胞的扩增的情况下，可以利用肿瘤抗原。示例性肿瘤抗原包括例如CD19，CD123，CD22，CD30，CD171，CS-1，CLL-1(CLECL1)，CD33，EGFRvIII，GD2，GD3，BCMA，Tn Ag，PSMA，ROR1，FLT3，TAG72，CD38，CD44v6，CEA，EPCAM，B7H3，KIT，IL-13Ra2，间皮素，IL-11Rα，PSCA，PRSS21，VEGFR2，LewisY，CD24，PDGFR-β，SSEA-4，CD20，叶酸受体α，ERBB2(Her2/neu)，MUC1，EGFR，NCAM，蛋白酶，PAP，ELF2M，Ephrin B2，FAP，IGF-I受体，CAIX，LMP2，gp100，bcr-abl，酪氨酸酶，EphA2，岩藻糖基GM1，sLe，GM3，TGS5，HMWMAA，o-乙酰基GD2，叶酸受体β，TEM1/CD248，TEM7R，CLDN6，TSHR，GPRCSD，CXORF61，CD97，CD179a，ALK，聚唾液酸，PLAC1，GloboH，NY-BR-1，UPK2，HAVCR1，ADRB3，PANX3，GPR20，LY6K，OR51E2，TARP，WT1，NY-ESO-1，LAGE-1a，MAGE-A1，MAGE A1，ETV6-AML，精子蛋白17，XAGE1，Tie 2，MAD-CT-1，MAD-CT-2，Fos相关抗原1，p53，p53突变体，prostein，存活素和端粒酶，PCTA-1/半乳凝素8，MelanA/MART1，Ras突变体，hTERT，肉瘤易位断点，ML-IAP，ERG(TMPRSS2ETS融合基因)，NA17，PAX3，雄激素受体，细胞周期蛋白B1，MYCN，RhoC，TRP-2，CYP1B1，BORIS，SART3，PAX5，OY-TES1，LCK，AKAP-4，SSX2，RAGE-1，人端粒酶逆转录酶，RU1，RU2，豆荚蛋白，HPV E6，E7，肠羧基酯酶，mut hsp70-2，CD79a，CD79b，CD72，LAIR1，FCAR，LILRA2，CD300LF，CLEC12A，BST2，EMR2，LY75，GPC3，FCRL5和/或IGLL1。
在一个实施方案中，在具有或没有抗原的情况下成纤维细胞和CD8T细胞的培养物进一步包含一种或多种增强增殖和/或生存力的因子，包括血清(例如胎牛或人血清)，例如以下的一种、两种、三种、四种、五种或更多种：白介素2(IL-2)，胰岛素，IFN-γ，IL-4，IL-7，GM-CSF，IL-10，IL-12，IL-15，IL-21，TGF-β和TNF-α或任何其他用于细胞生长的添加剂。在一个实施方案中，反应混合物进一步包含IL-15和/或IL-7。在一个实施方案中，细胞在IL-2的存在下扩增。
在一个实施方案中，已被应激的成纤维细胞充当抗原呈递细胞，在其他实施方案中，将抗原呈递细胞添加到培养物中。
本公开内容的实施方案包括增强CD8T细胞的活性的方法，所述方法包括：a)将成纤维细胞群暴露于一种或多种应激源；b)与CD8谱系的T细胞一起培养成纤维细胞；c)从培养物中提取CD8T细胞。在具体实施方案中，应激源是高热，例如暴露于升高的温度持续能够诱导热激蛋白90的表达的一段时间。高热可以是暴露于40摄氏度的温度持续1、2、3、4、5、6、7或8小时或其之间的任何范围。应激源可包括暴露于血清剥夺12、13、14、15、16、1、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31，32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48小时，或其之间的任何范围，包括12-48小时。
在具体实施方案中，在将CD8T细胞暴露于应激的成纤维细胞之后，与不暴露于应激的成纤维细胞的CD8T细胞的活性相比，改变了CD8T细胞的一种或多种活性。此类活性包括至少选自以下的活性：a)增殖；b)细胞因子产生；c)细胞毒性；和d)其组合。细胞因子产生可包括IL-2、IL-7和/或IL-15的分泌增加。在具体实施方案中，响应于细胞因子的施用，增殖被增强，并且这种细胞因子可以选自：a)IL-2；和b)IL-7；c)IL-15；和d)其组合。在CD8T细胞的某些情况下，在将CD8T细胞暴露于应激的成纤维细胞后，其增殖被增强，包括响应于T细胞受体连接(例如通过抗原或有丝分裂原完成)。在具体实施方案中，在将CD8T细胞暴露于应激的成纤维细胞之后，CD8T细胞具有增强的细胞毒性，包括杀死靶细胞的能力，增加的穿孔素产生；和/或增加颗粒酶产生。
本公开内容的实施方案包括将CD8T细胞暴露于应激的成纤维细胞后与未在暴露于应激源的成纤维细胞的存在下培养的CD8T细胞相比增强的活性，包括CD8T细胞a)增殖；b)产生细胞因子；和/或c)诱导细胞毒性的能力，其中对共刺激分子的需求较低。这样的共刺激分子包括CD80；CD86；CD40；CD28的连接；IL-2；和/或IL-12。
I.通过成纤维细胞及其群体治疗移植物抗宿主病
在具体实施方案中，本公开内容涉及细胞治疗剂，更具体地涉及能够转移具有刺激移植物抗宿主病的潜力的细胞元件的器官和/或细胞移植物的移植。在具体实施方案中，本公开内容涉及利用用于预防、抑制和逆转移植物抗宿主病的细胞疗法。在具体实施方案中，成纤维细胞被用于抑制个体中的移植物抗宿主病(GVHD)。
本实施方案解决了刺激GVHD的移植物中的供体细胞。在具体情况下，这些供体细胞是存在于供体细胞或组织(例如，干细胞接种物)中的供体T淋巴细胞，并且需要启动有效的免疫反应。尽管功能性免疫系统能够排斥来自外来供体的T细胞，但是当受体的免疫系统因使用各种免疫消融剂(化学疗法和/或放射疗法)而受损时，受体就无法排斥移植的细胞。在具体实施方案中，在供体和受体中不同的组织抗原是主要和次要人白细胞抗原(HLA)，并且它们在细胞表面上的表达对于同种异体T细胞的活化和疾病的开始至关重要。
在一个实施方案中，成纤维细胞谱系的细胞用于预防和/或治疗有需要的个体的移植物抗宿主反应。在本公开内容的一个实施方案中，将成纤维细胞在合适的条件下施用至移植物(例如同种异体细胞移植物、组织移植物或器官移植物)的受体。在具体情况下，此类成纤维细胞阻止供体淋巴细胞引起针对受体组织的免疫反应。在具体实施方案中，将同种异体真皮成纤维细胞施用至同种异体细胞移植物的受体，以防止供体淋巴细胞激发针对受体组织的免疫反应。
在一个具体实施方案中，针对抑制由TLR4激动剂(例如脂多糖或HMBG-1)刺激的单核细胞产生TNF-α的能力选择成纤维细胞。作为示例，可以基于与抑制树突状细胞成熟的能力相关的一种或多种标志物的表达(包括例如IL-10、人绒毛膜促性腺激素和/或IL-20的分泌)来分离成纤维细胞。
本发明教导了同种异体成纤维细胞减少慢性病况中炎症细胞因子的产生而不诱导系统性免疫抑制的先前未预料到的能力。具体地，本发明教导了在炎性病况例如肿瘤相关的恶病质中，同种异体来源的成纤维细胞的引入导致炎症的减轻和免疫学参数的恢复。
在一个具体实施方案中，在造血干细胞移植的背景下，利用同种异体成纤维细胞的施用来减少GVHD。在其他实施方案中，在引入细胞移植物例如骨髓、胰岛或其他单细胞或复合细胞移植物之前和/或之后施用受体和/或供体成纤维细胞。
成纤维细胞可以来源于各种组织。在一个实施方案中，分离的细胞表达很少的SSEA-1标志物或不表达SSEA-1标志物。本公开内容的有用的细胞还表达高水平的细胞表面抗原，其通常在人间充质干细胞上发现，但在人干细胞上通常不存在，其中包括CD56(99.6％)、氨基肽酶N、CD44(99.7％)透明质酸结合受体、CD49b(99.8％)胶原蛋白/层粘连蛋白结合整合素α2和CD105(97％)内皮联蛋白。胚胎干细胞标志物和专有标志物在成纤维细胞培养物上的存在表明，如本文所述生长和繁殖的成纤维细胞代表了一类新的再生细胞。
在本公开内容的一些实施方案中，培养物中至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞表达CD56。在另外的实施方案中，培养物中至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞表达CD37。在本公开内容的一些实施方案中，培养物中至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞表达CD127。在本公开内容的其他实施方案中，培养物中至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞表达CD127。
在本公开内容的一个具体实施方案中，再生细胞是成纤维细胞，其可以以未分化状态在连续培养中无限期繁殖。术语“未分化”是指尚未成为特化细胞类型的细胞。“营养培养基”是用于培养细胞的含有促进增殖的营养物质的培养基。营养培养基可以适当组合的形式包含以下任何物质：等渗盐水、缓冲液、氨基酸、抗生素、血清或血清替代物以及外源添加的因子。羊水成纤维细胞可以在未分化状态下生长所需的时间(并且如上所述任选地储存)，然后可以在某些条件下培养以允许发展成分化状态。虽然已知一旦达到足够的细胞量，细胞可以在体外和体内分化为内胚层、中胚层和外胚层来源的组织。从未分化细胞到具体细胞类型或组织类型的这种计划的特化分化称为“定向分化”。可以使用针对抗炎表型的定向分化从再生细胞制备的示例性细胞类型包括但不限于具有与选自包含以下的组的细胞相关的CD105的细胞的衍生：脂肪细胞，心肌细胞，上皮细胞，肝细胞，脑细胞，血细胞，神经元，神经胶质细胞，胰腺细胞等。
在某些实施方案中，存在通过将治疗有效量的成纤维细胞递送至需要其的个体来治疗或预防GVHD的方法。在一些情况下，该方法还可以包括获得成纤维细胞群和离体扩增成纤维细胞群的步骤。个体可能需要治疗或预防GVHD，因为他们已接受、正在接受和/或将接受可能引起有害免疫反应的疗法(例如免疫疗法)。成纤维细胞的施用可以延迟GVHD的发作和/或降低其严重性。
J.通过施用成纤维细胞单核细胞混合物治疗梗塞后重塑
在一些实施方案中，存在可用于通过施用在成纤维细胞的存在下培养的自体单核细胞修复梗塞后心脏损伤的物质的组合物、治疗和方案。在一个实施方案中，在前列腺素-E2的存在下成纤维细胞和单核细胞的共培养产生能够诱导心肌再生并抑制病理性梗塞后重塑的细胞组合物。
本公开内容包括通过在例如PGE-2的存在下将成纤维细胞与单核细胞一起培养获得的生长因子产生和抗炎作用的出乎意料的协同作用。这种培养赋予的特性在动物模型中诱导心肌再生，并在梗塞后保留心脏容量。
在本公开内容的一个实施方案中，各种浓度的PGE-2赋予单核细胞和成纤维细胞的联合培养物产生协同量的VEGF、PDGF-BB和EGF的能力，这有益于心脏再生。在另一个实施方案中，本公开内容提供了产生与成纤维细胞协同作用并赋予成纤维细胞具有诱导心脏再生的能力的M2细胞的治疗性群体的手段。
本公开内容涵盖单核细胞与成纤维细胞的共培养的施用，以允许产生M2细胞，然而，在一些情况下，PGE2被用于最佳产生。成纤维细胞-单核细胞共培养细胞的使用可以施加于其中已施加从了M2细胞的区域。例如，已显示出在机制上，M2巨噬细胞与通过刺激血管生成引起的梗塞后心肌损伤减少相关，这通过引用并入本文(Dayan等人，2011)。对M2刺激性细胞因子白介素13基因缺陷的小鼠的研究表明，M2巨噬细胞缺陷的小鼠中梗塞面积增大并且梗塞后愈合减少(Hofmann等人，2014)。这些结果在另一项研究中得到了重复，在该研究中，M2巨噬细胞的耗竭通过CSF-1受体信号传导途径的缺陷来实现(Leblond等人，2015)。使梗塞后心脏衰竭恶化的治疗减少M2巨噬细胞的积累(Wan等人，2015)。此外，在许多情况下已显示出诱导愈合加速和血管生成的疗法刺激M2巨噬细胞的产生(Ben-Mordechai等人,2013；Hall and Wei,2014；Courties等人,2014；Weirather等人,2014；Rafatian等人,2014；Di Filippo等人,2014；Zhou等人,2015；Singla等人,2015；Yabluchanskiy等人,2016；Tian等人,2015；Gross等人,2016)。例如，间充质干细胞的施用已显示出诱导M1巨噬细胞的减少和M2巨噬细胞的增加，这与通过刺激血管生成实现的梗塞后恢复的改善相关(Cho等人，2014；Zhang等人，2015)。在机制上，已知M2巨噬细胞抑制炎症以及刺激血管生成(Barbay等人，2015)，这是梗塞后愈合的重要方面。另外，M2巨噬细胞抑制M1巨噬细胞形成。这很重要，因为M1巨噬细胞与病理性心脏重塑和发展至心脏衰竭相关(Liu等人，2015；He等人，2015)。因此，在本公开内容的一方面，M2巨噬细胞在体外产生并被全身性或局部施用至患有心肌梗塞的患者中。
在一些实施方案中，存在于心肌梗塞之后治疗个体的方法，其包括以下步骤：a)获得成纤维细胞群；b)将成纤维细胞群与单核细胞(相对于被治疗的个体而言是自体的、同种异体的或异种的)在足以赋予成纤维细胞和/或单核细胞具有心脏修复特性的浓度下一起培养一段时间，从而产生具有心脏修复特性的成纤维细胞和/或单核细胞；和c)将群体施用至个体。成纤维细胞可获自自体来源、同种异体来源或异种来源。成纤维细胞可以是任何种类，包括来源于选自以下的组织的成纤维细胞：a)脂肪成纤维细胞；b)皮肤成纤维细胞；c)脐带成纤维细胞；d)包皮成纤维细胞；e)胎盘成纤维细胞；f)网膜成纤维细胞；和g)其组合。
在这样的方法中，单核细胞可以通过塑料粘附获得。单核细胞可通过流式细胞术纯化获得，包括针对标志物CD14进行。在具体实施方案中，单核细胞是通过针对标志物CD14进行磁性活化分选(MACS)纯化获得的。
当成纤维细胞和单核细胞共培养时，它们可以在任何合适的条件下和以任何合适的比率共同养。在具体实施方案中，以约1:1、2:1、5:1、10:1、50:1、100:1、1:2、1:5、1:10、1:50、1:100等的比率培养成纤维细胞和单核细胞。可以在PGE 2的存在下培养成纤维细胞和单核细胞约1-72,1-60,1-50,1-48,1-36,1-24,1-19,1-18,1-17,1-16,1-15,1-14,1-13,1-12,1-11,1-10,1-9,1-8,1-7,1-6,1-5,1-4,1-3,1-2,2-72,2-60,2-50,2-48,2-36,2-24,2-19,2-18,2-17,2-16,2-15,2-14,2-13,2-12,2-11,2-10,2-9,2-8,2-7,2-6,2-5,2-4,2-3,6-72,6-60,6-50,6-48,6-36,6-24,6-18,6-12,6-10,10-72,10-60,10-50,10-48,10-36,10-24,10-18,10-12,18-72,18-60,18-50,18-48,18-36,18-24,18-20,20-72,20-60,20-50,20-40,20-30,24-72,24-48,24-36,24-28,30-72,30-60,30-48,30-36,48-72,48-60,48-50,50-72,50-60或60-72小时。可以在PGE 2的存在下培养成纤维细胞和单核细胞约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72或更多小时。
培养物中前列腺素E2的量可以为约1-10000,1-7500,1-5000,1-1000,1-500,1-250,1-100,1-50,50-10000,50-7500,50-5000,50-1000,50-500,50-100,100-10000,100-7500,100-5000,100-2500,100-1000,100-500,500-10000,500-7500,500-5000,500-2500,500-1000,500-750,750-10000,750-7500,750-5000,750-2500,750-2000,750-1000,1000-10000,1000-7500,1000-5000,1000-2500,2500-10000,2500-5000,5000-10000或7500-10000纳克/ml。培养物中前列腺素E2的量可以为约1,50,75,100,250,500,1000,1250,1500,1750,2000,2500,2750,3000,3250,3500,3750,4000,4250,4500,4750,5000,5250,5500,5750,6000,6250,6500,6750,7000,7250,7500,7750,8000,8250,8500,8750,9000,9250,950,9750或10000或更多纳克/ml。
在具体实施方案中，在与成纤维细胞一起组织培养后，单核细胞表达精氨酸酶活性。
在单核细胞和成纤维细胞的共培养之后，可以在梗塞后约3-15,3-14,3-13,3-12,3-11,3-10,3-9,3-8,3-7,3-6,3-5,3-4,4-15,4-14,4-13,4-12,4-11,4-10,4-9,4-8,4-7,4-6,4-5,5-15,5-14,5-13,5-12,5-11,5-10,5-9,5-8,5-7,5-6,6-15,6-14,6-13,6-12,6-11,6-10,6-9,6-8,6-9,7-15,7-14,7-13,7-12,7-11,7-10,7-9,7-8,8-15,8-14,8-13,8-12,8-11,8-10,8-9,9-15,9-14,9-13,9-12,9-11,9-10,10-15,10-14,10-13,10-12,10-11,11-15,11-14,11-13,11-12,12-15,12-14,12-13,13-15,13-14或14-15天将它们施用至个体。在一些情况下，在梗塞后少于3天，例如1-2天递送单核细胞和成纤维细胞的共培养物。
共培养的单核细胞和成纤维细胞的组合可以通过任何合适的途径施用，包括心肌内施用。可以例如通过气囊导管将其施用到梗塞相关的动脉中。在具体情况下，培养的单核细胞和成纤维细胞的组合使用气囊碰撞逆行施用至冠状窦。
K.通过成纤维细胞施用治疗多发性硬化
在此实施方案中，存在刺激能够抑制个体中多发性硬化的发展的免疫过程的手段。在本公开内容的一个具体实施方案中，施用成纤维细胞(包括静脉内)用于抑制多发性硬化和/或刺激多发性硬化中的再生。其他具体的治疗方法包括施用成纤维细胞然后施用低剂量的白介素-2，以增强对髓磷脂碱性蛋白及其抗原性片段具有特异性的T调节细胞。
本公开内容的实施方案包括治疗多发性硬化的方法，所述方法包括向有需要的个体施用成纤维细胞。例如，施用可以是或可以不是静脉内的。在具体实施方案中，成纤维细胞来源于：a)网膜；b)皮肤；c)脐带血；d)胎盘；e)脐带胶质；f)外周血；或g)脂肪组织。在具体情况下，成纤维细胞表达选自CD73、CD105、CD90及其组合的标志物。成纤维细胞可能缺乏选自CD14、CD34、CD45及其组合的一种或多种标志物的表达。成纤维细胞可以粘附于塑料。成纤维细胞相对于个体可以是自体的、同种异体的或异种的。当添加到进行中的混合淋巴细胞反应中时，成纤维细胞可具有将混合淋巴细胞反应抑制＞50％的能力。在该方法的具体实施方案中，评估了响应性淋巴细胞的增殖。可以评估从响应性淋巴细胞产生的干扰素γ。
在具体实施方案中，成纤维细胞以每剂量(例如每次输注)约10,000-2,000,000/kg的浓度施用。剂量可以是例如每剂量10,000-2,000,000；10,000-1,000,000；10,000-500,000；10,000-250,000；10,000-100,000；100,000-2,000,000；100,000-1,000,000；100,000-500,000；100,000-250,000；250,000-2,000,000；250,000-1,000,000；250,000-500,000；500,000-2,000,000；或500,000-1,000,000/kg。成纤维细胞可以以每剂量10,000/kg；每剂量50,000/kg；每剂量100,000/kg；每剂量500,000/kg；每剂量1,000,000/kg；或每剂量2,000,000/kg的浓度施用。
在具体实施方案中，T调节细胞(例如，每剂量10,000-2,000,000；10,000-1,000,000；10,000-500,000；10,000-250,000；10,000-100,000；100,000-2,000,000；100,000-1,000,000；100,000-500,000；100,000-250,000；250,000-2,000,000；250,000-1,000,000；250,000-500,000；500,000-2,000,000；或500,000-1,000,000/kg)与成纤维细胞一起施用。在具体情况下，例如当在96孔板中以每孔100,000个细胞的浓度培养时，成纤维细胞能够产生至少10、20、50、100或更多pg/ml的TGF-β。
多发性硬化可以或可以不与针对神经系统组织的T细胞攻击相关。在一些情况下，雷帕霉素与成纤维细胞一起施用以增强耐受性的产生，例如当成纤维细胞是同种异体或异种的时。在某些实施方案中，例如当成纤维细胞是同种异体或异种的时，抗CD3抗体与成纤维细胞一起施用以增强耐受性的产生。在某些实施方案中，例如当成纤维细胞是同种异体或异种的时，抗CD52抗体与成纤维细胞一起施用以增强耐受性的产生。
在本公开内容的一个实施方案中，施用成纤维细胞作为降低引起多发性硬化或至少与多发性硬化的病理相关的自身反应性T细胞的水平和/或活性的手段。
本公开内容提供了各种成纤维细胞群，其能够通过体内刺激增加的T调节细胞数量来减少自身反应性T细胞。这些细胞是免疫系统保护机体免受自身免疫攻击的重要组成部分。早期的研究表明了这一点，在该研究中，新生的经胸腺切除的小鼠患有全身性自身免疫，这些小鼠通过CD4细胞的转移得以挽救。根据本公开内容的一个实施方案，T调节(Treg)表型被描述为具有IL-2受体CD25。外周血含有少量T细胞淋巴细胞，这些细胞表达T调节表型(“Treg”)，即对CD4和CD25抗原均为阳性。通过实施本公开内容的方法，定义了Treg细胞的几个子集。调节性细胞的一个子集在胸腺中发育。胸腺来源的Treg细胞通过不依赖细胞因子的机制起作用，该机制涉及细胞间的接触。它们对于诱导和维持自我耐受以及预防自身免疫是必不可少的。这些调节性细胞阻止已逃避胸腺删除或识别胸腺外抗原的自身反应性T细胞的活化和增殖，因此它们对于体内稳态和免疫调节以及保护宿主抵抗自身免疫发展至关重要。因此，免疫调节性CD4+CD25+T细胞通常被称为“职业抑制细胞”。
在本公开内容的一个实施方案中，通过静脉内施用成纤维细胞来刺激天然产生的CD4+CD25+Treg细胞的产生。已知天然产生的Treg是在胸腺中的高亲和力配体上阳性选择并已显示在建立和维持对自身抗原的免疫耐受性中起重要作用的独特细胞群。这些细胞的发育和/或功能的缺陷与人和先天性或诱导性自身免疫的各种动物模型中的严重自身免疫相关。
在本公开内容的一个实施方案中，由于静脉内成纤维细胞施用而发生的通过致耐受性细胞因子的增加产生的Treg细胞通过细胞间接触直接地或通过可溶性因子间接地显示其致耐受作用。尽管不希望受到理论的束缚，但阻断效应T细胞(Teff)中IL-2的表达、物理清除Teff细胞、通过CTLA-4/B7轴诱导耐受性树突状细胞(DC)和通过TGF-β和IL-10抑制Teff细胞是以及迄今为止已牵涉的机制中的一些。还已显示通过CTLA-4/CD80进入Teff细胞的反向信号传导在其通过Treg细胞的抑制中起重要作用。类似地，Treg细胞上的CTLA-4与DC上的CD80之间的相互作用可导致吲哚胺双加氧酶(其牵涉通过色氨酸代谢的调节的耐受性)的上调和反向信号传导。
根据本发明的各种实施方案适合使用的成纤维细胞的剂量将取决于许多因素。对于不同的情况，它可能会有很大的不同。确定待施用用于初级和辅助治疗的成纤维细胞的最佳剂量的参数通常包括以下中的部分或全部：正在治疗的疾病及其阶段；受试者的种类，其健康状况、性别、年龄、体重和代谢率；受试者的免疫能力；正在施用的其他疗法；以及来自受试者的病史或基因型的预期潜在并发症。这些参数还可以包括：成纤维细胞是否是同基因的、自体的、同种异体的或异种的；其效力(具体活性)；为使成纤维细胞有效而必须靶向的部位和/或分布；位点的此类特征，例如成纤维细胞的可及性和/或成纤维细胞的植入。其他参数包括其他因子(例如生长因子和细胞因子)与成纤维细胞的共同施用。在给定情况下的最佳剂量还将考虑细胞的配制方式、施用方式以及施用后细胞在靶位点的定位程度。最后，最佳剂量的确定将必然提供有效剂量，该有效剂量既不低于最大有益作用的阈值，也不高于与成纤维细胞剂量相关的有害作用超过增加的剂量的优点的阈值。
对于一些实施方案，成纤维细胞的最佳剂量将在用于同种异体间充质干细胞的剂量的范围内。对于相当纯的成纤维细胞制剂，在各种实施方案中，最佳剂量为每次施用104至108个成纤维细胞/kg受体质量。在一些实施方案中，每次施用的最佳剂量将是105至107个成纤维细胞/kg。在许多实施方案中，每次施用的最佳剂量将是5×105至5×106个成纤维细胞/kg。作为参考，前述中的较高剂量类似于在同种异体间充质干细胞移植中使用的有核细胞的剂量。应当理解的是，可以在一段时间内一次、零星或连续地递送单个剂量。也可以将整个剂量递送至单个位置或在多个位置上零星散布。值得注意的是，人受试者的治疗时间通常比实验动物更长；但是，治疗的时间长度通常与疾病过程的长度和治疗效果成正比。本领域技术人员将使用在人和/或动物(例如大鼠、小鼠、非人灵长类动物等)中执行的其他程序的结果来考虑这一点，以确定适合人的剂量。基于这些考虑并且考虑到本公开内容和现有技术提供的指导，这样的确定将使得技术人员能够这样做而无需过多的实验。初始施用和进一步剂量或连续施用的合适方案可以全部相同或可以变化。熟练的技术人员可以从本公开内容、本文引用的文献以及本领域的知识中确定适当的方案。
在本公开内容的一个实施方案中，将成纤维细胞与获自同一人(自体)或另一人(同种异体)的T调节细胞一起静脉内施用至患有多发性硬化的患者。Treg细胞可以通过各种实验室已知的和常规使用的方式产生。根据本教导内容，可以使用任何细胞分离方法。从外周血中分离调节性细胞的一种示例性方法包括在有或没有梯度(例如Percoll梯度)的情况下离心。该技术基于密度分离细胞。可以使用的另一示例性方法包括分别使用固定在表面或磁珠上的分子(例如识别和结合细胞表面上的分子(例如CD4、CD8、CD20等)的抗体)进行淘选和免疫磁分离。固定在表面或与磁珠缀合的分子识别并结合具体细胞类型的一种或多种细胞特异性表面标志物。具有一种或多种细胞表面标志物的细胞通过固定的分子或将磁珠缀合的细胞暴露于磁场而结合，允许冲洗掉任何其他细胞。在阳性选择程序中，保留感兴趣的细胞类型，而在阴性选择程序中，清除感兴趣的细胞类型。根据本教导内容可以使用的另一种分离程序包括荧光活化细胞分选(FACS)。具有荧光标签的抗体可用于结合感兴趣的细胞。抗体与细胞表面分子(例如CD4、CD8、CD20等)结合，然后FACS分选仪可以根据观察到的荧光分选并收集细胞。然后可以分离出显示某些荧光的细胞。分离免疫调节细胞后，可以进一步培养、扩增和/或刺激细胞。分离的免疫调节细胞的离体扩增包括例如针对T调节细胞的方案：在高IL-2浓度、IL-10和树突状细胞的刺激/教育的存在下使用CD3/CD28刺激(例如抗CD3抗体和抗CD28抗体)培养细胞。本文所述的细胞的离体扩增(即用抗原呈递细胞)也可以选择性地富集抗原特异性免疫调节细胞。应当理解，免疫调节细胞也可以在体内扩增，以便在分离和离体操作之前增加这些细胞的数量。
L.自身免疫的成纤维细胞介导的治疗
此实施方案涉及通过遗传修饰成纤维细胞以可诱导方式或组成性方式表达感兴趣的抗原来诱导抗原特异性耐受的手段。本领域的先前工作涉及以非免疫原性途径(例如口服、鼻内或使用未成熟的树突状细胞递送)施用自身抗原，这些已显示出一些临床功效的迹象；然而，这种作用还不够强大以允许成功的人治疗。在本实施方案中，存在成纤维细胞的遗传修饰以受控方式诱导自身抗原的过表达，以便产生通用供体抗原特异性致耐受性疫苗作为治疗例如用于自身免疫。基于发现成纤维细胞的先前未知的以下能力，成纤维细胞被用作诱导抗原特异性耐受的基础：a)诱导T调节细胞；b)抑制T辅助细胞、T细胞毒性细胞和NK细胞(例如)；和c)刺激导致抗原呈递细胞进行抗原呈递过程的能力降低的抑制过程。考虑到在本公开内容的一个实施方案中成纤维细胞将以同种异体方式使用，耐受性的诱导将主要通过抗原呈递的间接途径(其在免疫调节因子的情况下更易于致耐受)发生。
免疫学耐受性是免疫系统的关键特征，其允许识别和消除病理学威胁，同时选择性地忽略属于人体的抗原。了解免疫耐受机制并具有诱导该过程的能力将对自身免疫疾病(其影响约8％的美国人口)产生重大影响。
主要的自身免疫疾病包括类风湿性关节炎、多发性硬化、1型糖尿病、系统性红斑狼疮和炎性肠病。传统上，自身免疫疾病是用非特异性炎症抑制剂(例如类固醇)以及免疫抑制剂(例如环孢素、5-咪唑硫嘌呤和氨甲蝶呤)治疗的。这些方法总体上抑制免疫功能，并具有许多不良副作用。不幸的是，鉴于在自身免疫患者中观察到的生活质量大大下降，缓解自身免疫症状的潜力比诸如机会性感染和对瘤形成的易感性增加等副作用更重要。尽管由于干预措施的非特异性性质而仍然存在副作用，但“生物疗法”诸如抗TNF-α抗体的引入已使预后有所改善。无论如何，TNF-α抑制剂的销售已相当成功：Humira(92亿美元；2012),Enbrel(78亿美元；2011),Remicade(67亿美元；2011)。这些方法不能“治愈”自身免疫，而只是减轻症状。
为了“治愈”自身免疫，必须以选择性的方式删除/失活识别自身抗原的T细胞克隆。这类似于重新进行容忍诱导的天然过程。尽管胸腺删除是被鉴定为负责选择性删除自身反应性T细胞的原始过程，但很明显，存在不限于新生儿时期的许多冗余机制。具体而言，已证明“镜像图像”免疫系统与常规免疫系统共存。常规的T细胞被自身抗原活化而在胸腺中死亡，而未被活化的常规T细胞则收到生存信号(Ramsdell和Fowlkes，1990)；实际上，通过与自身抗原相遇来选择“镜像图像”T调节(Treg)细胞以存活，并删除不结合自身抗原的Treg细胞(Apostolou等人，2002；Aschenbrenner等人，2007)。因此，免疫系统的自我-非自我区分部分地基于消耗自身反应性T细胞同时促进Treg细胞的产生的自身抗原。研制抗原特异性致耐受性疫苗的重要点在于，在成体生活和周围环境中，自身反应性T细胞通过在不存在危险信号的情况下自身抗原的呈递而“无能”并且自身反应性Treg响应于自身抗原而产生。尽管胸腺中T细胞删除的过程不同于诱导T细胞无能的诱导，并且胸腺中Treg的产生导致与外周诱导的Treg相比不同类型的Treg，但在许多方面，成体致耐受性的最终结果与新生儿期中的相似。在本公开内容的一个实施方案中，将成纤维细胞用自身抗原转染，并且所述转染的成纤维细胞以其中产生针对这种抗原的免疫耐受性的方式施用。进行成纤维细胞的施用以诱导T调节细胞的产生并抑制自身反应性T细胞的活化。这在其中自身抗原被良好定义的自身免疫疾病中尤其重要。
本公开内容试图通过施用使用自身抗原转染的成纤维细胞来复制致耐受性的天然过程。例如，已知致耐受性在例如妊娠、癌症和口服耐受性的背景下发生在成体中。本公开内容教导了利用在这些情况下发生的分子、细胞和过程以修饰成纤维细胞作为致耐受介质。
在妊娠的情况下，研究表明识别胎儿抗原的母体T细胞克隆的选择性失活是通过多种机制发生的，包括在胎儿和胎盘细胞上的FasL表达(Vacchio和Hodes，2005)，PD1-L背景下的抗原呈递(D'Addio等人，2011)和HLA-G与免疫抑制受体(例如ILT4)相互作用(Kuroki和Maenaka，2007)。因此，本发明教导了使用与诱导死亡的分子例如FasL、共抑制分子例如PD-L1和免疫调节分子例如ILT4结合的自身抗原的成纤维细胞的共转染。
在妊娠中，“致耐受性抗原呈递”仅通过抗原呈递的间接途径发生(Erlebacher等人，2007)。妊娠中选择性致耐受性的其他途径包括刺激Treg细胞，其已被证明对成功妊娠至关重要(Chen等人，2013)。在一个实施方案中，本公开内容涉及通过用MHC或MHC类似分子转染来修饰成纤维细胞，以便从所述成纤维细胞产生抗原呈递细胞，其中所述抗原呈递细胞在以治疗上足够的浓度和频率施用到宿主中时能够诱导抗原特异性耐受。
在癌症的情况下，已通过肿瘤本身或与肿瘤相关的细胞证明肿瘤特异性T细胞的耗竭，而保留对其他抗原具有特异性的T细胞(Harimoto等人，2013；Ney等人，2009；Cheung等人，2008；Bai等人，2008)。这是癌症可以选择性地诱导“库中的孔(hole intherepertoire)”而同时允许宿主通常具有免疫能力的机制。此外，已证明Treg细胞主动抑制抗肿瘤T细胞，这可能是肿瘤免疫逃逸的“后备”机制(Jacobs等人，2012；Pedroza-Gonzalez等人，2013；Donkor等人，2011)。在临床水平上，在许多研究中，肿瘤抑制外周T细胞活性的能力与预后不良相关(Whiteside，2004；Whiteside，1999；Reichert等人，2002)。因此，在本公开内容的一个实施方案中，利用了刺激Treg产生的分子的使用，以及扩增已产生的Treg的分子的施用。在一个实施方案中，用自身抗原以及白介素-2一起转染成纤维细胞，以增强Treg的产生。在其他实施方案中，全身施用白介素2以增强Treg的体内增殖。
本发明使用作为用于修饰成纤维细胞的模板的耐受性的另一个天然实例是口服耐受。口服耐受是摄入的抗原诱导生成抗原特异性TGF-β产生细胞(有人称为“Th3”)(Fariaand Weiner,2005；Weiner,2001；Fukaura等人,1996)以及Treg细胞(Palamares等人，2012；Yamashita等人，2012)的过程。抗原包括自身抗原胶原蛋白II(Park等人，2009)的摄入已显示以具体方式诱导抑制T和B细胞反应(Womer等人，2008；Faria and Weiner，2006)。似乎调节性细胞的诱导以及效应细胞的缺失/无能在致耐受的方式上与抗原呈递相关(Park等人，2012)。通过口服自身抗原报道了RA动物模型中的疾病(Thompson等人，1993)、多发性硬化(Song等人，2004)和I型糖尿病(Hanninen and Harrison，2004)的缓解。临床试验显示了口服耐受在自身免疫性疾病例如类风湿性关节炎(ei等人，2009)、自身免疫性葡萄膜炎(Thurau等人，1997)和多发性硬化(Weiner等人，1993)中发挥功效的信号。在所有这些天然的耐受条件下，常见的分子和机制似乎在起作用。因此，诱导耐受性的天然方法会是施用具有致耐受性潜力的“通用供体”细胞，其产生与在耐受性诱导的生理条件下发现的分子相似的分子。在一些实施方案中，与本发明的自身抗原转染的成纤维细胞一起利用口服耐受性。例如，如果治疗患有1型糖尿病的患者，则可以给该患者施用已用糖尿病特异性自身抗原(如GAD65)转染的成纤维细胞；另外，可以用致耐受性分子例如IL-10转染成纤维细胞，并且当施用成纤维细胞时，可以利用口服递送的GAD65以增强致耐受性过程。在另一个实施方案中，本公开内容涉及用与口服致耐受性相关的分子例如TGF-β结合的自身抗原转染成纤维细胞。
在一些实施方案中，用生物学有效的分子转染成纤维细胞以类似于间充质干细胞的免疫调节活性。例如，已知这些细胞通过抑制IL-2受体α(CD25)来抑制T细胞活化(LeBlanc等人，2004)。因此，在一个实施方案中，将成纤维细胞用一种或多种自身抗原以及IL-2受体转染，以“吸收”IL-2，从而防止T细胞被活化。在其他实施方案中，在用于培养间充质干细胞的条件下培养成纤维细胞，以赋予所述成纤维细胞具有以下特性：诱导分裂停滞(Glennie等人,2005；Kim等人,2007)，直接(Zappia等人，2005)或通过未成熟的DC(Wang等人，2008)诱导T细胞无能，刺激活化的T细胞的凋亡(Lumas等人，2005；Lim等人，2010)，IL-2信号传导的阻滞和PGE2产生的诱导(Rasmusson等人,2005；Xu等人,2007；English等人,2009；Spaggiari等人,2009；Yanez等人,2010；Zafranskaya等人,2013)，TGF-β的诱导(Nasef等人，2007)，HLA-G的产生(Magatti等人，2008)，丝氨酸蛋白酶抑制剂6的表达(ElHaddad等人，2011)，一氧化氮释放的刺激(Sato等人，2007；Oh等人，2007；Ren等人，2008)，刺激吲哚胺2,3脱氧酶(DelaRosa等人,2009；Tipnis等人,2010；Ge等人,2010；Francois等人,2012)，表达腺苷生成外切酶例如CD39和CD73(Sattler等人，2011；Saldhana-Araujo等人，2011；Barry等人，2001)，半乳凝素表达(Xue等人,2010；Gieseke等人,2010)，血红素氧合酶1的诱导(Chabannes等人，2007；Mougiakakos等人，2011)，PD1途径的活化(Xue等人，2010；Augello等人，2005；Sheng等人，2008；Luz-Crawford等人，2012)，Fas配体表达(Akiyama等人，2012；Gu等人，2013)，CD200表达(Najar等人，2012)，Th2偏差(Batten等人，2006；Lu等人，2009；Zanone等人，2010)，抑制Th17分化(Ko等人，2008；Rafei等人，2009；Tatara等人，2011；Duffy，等人，2011；Luz-Crawford等人，2013)，TSG-6表达(Kota等人，2013)，NOTCH-1表达(Del Pap等人，2013)，Treg细胞生成的刺激(Maccario等人，2005；Prevosto等人，2007；Di Ianni等人，2008；Casiraghi等人，2008；Boumaza等人，2009；Ye等人，2008；Madec等人，2009；Melief等人，2013)。Treg产生的机制可以是直接的，或者可以是通过DC的调节进行的。我们和其他人已报道，在没有共刺激信号的情况下活化T细胞导致产生免疫抑制性CD4+CD25+T调节(Treg)细胞(Zhang等人，2008；Ichim等人，2003)。因此，理论上，淋巴结中免疫的局部活化将与MSC施用后降低的共刺激分子表达DC相关，这可能偏向于Treg生成。相反，已知Treg参与维持DC2表型的DC(Tiemessen等人，2007)。实际上，许多研究已证明了MSC诱导Treg细胞的能力(Di Ianni等人，2008；Casiraghi等人，2008；Ye等人，2008；Gonzalez-Rey等人，2009)。
本公开内容的实施方案涉及治疗个体中的自身免疫的方法，其包括将修饰的成纤维细胞施用至需要治疗的个体的步骤。在一些情况下，该方法包括以下步骤：a)获得成纤维细胞群；b)用一种或多种目的自身抗原(免疫系统识别的通常属于人体的分子实体)转染所述成纤维细胞群，以产生修饰的成纤维细胞；和c)将所述修饰的成纤维细胞施用至需要治疗的个体。在具体情况下，成纤维细胞是脂肪组织来源的贴壁细胞，包括表达选自CD73、CD105、CD90及其组合的一种或多种标志物的细胞。在具体情况下，成纤维细胞缺乏选自CD14、CD34、CD45及其组合的一种或多种标志物的表达。在至少一些实施方案中，自身抗原选自：a)髓磷脂少突胶质细胞蛋白；b)髓磷脂碱性蛋白；c)胶原蛋白II；d)肌原纤维蛋白；和e)其组合。任何转染的细胞均可借助于质粒DNA或病毒载体例如慢病毒、逆转录病毒或腺病毒转染。在具体实施方案中，成纤维细胞选自以下组织来源：a)脂肪；b)网膜；c)骨髓；d)胎盘；e)脐带；f)皮肤；g)脐带胶质；和h)其组合。
在治疗1型糖尿病的实施方案中，自身抗原可以选自胰岛素、胰岛素原、GAD65(谷氨酸脱羧酶)、IA-2(胰岛抗原2；酪氨酸磷酸酶)和ZnT8转运蛋白(锌转运蛋白8，位于胰岛素分泌颗粒的膜上)。可以使用来源于任何自身抗原的功能片段，以及免疫调节肽DiaPep277(来源于hsp60蛋白)，并且其他HSP60衍生的肽也可以用作自身抗原。
在治疗多发性硬化的实施方案中，自身抗原可以选自髓磷脂碱性蛋白(MBP)、髓磷脂少突胶质细胞蛋白(MOG)，蛋白脂质蛋白(PLP)及其组合。自身抗原的片段可用作用于转染目的的自身抗原。片段的实例包括BP13-32、MBP83-99、MBP111-129、MBP146-170、MOG1-20、MOG35-55和PLP139-154。
III.一般实施方案
在一些情况下，包括将成纤维细胞暴露于免疫细胞(和/或某些物质)的方法可以共享共同的参数。下面将讨论这样的参数的示例，但是在实践中可以适当地改变一个或多个参数。
用于施用至个体的任何类型的细胞的量可以取决于待治疗的疾病的类型、疾病的严重性和阶段和/或待注射用于治疗的细胞的类型。可以制备细胞以在药学上可接受的载体例如无菌盐水等渗溶液中施用。在一些实施方案中，药学上可接受的载体可以包含一种或多种另外的物质，例如FAS配体，IL-2R，IL-1Ra，IL-2，IL-4，IL-8，IL-10，IL-20，IL-35，HLA-G，PD-L1，I-309，IDO，iNOS，CD200，半乳凝素3，sCR1，精氨酸酶，PGE-2，阿司匹林，阿托伐他汀，氟伐他汀，洛伐他汀，普伐他汀，瑞舒伐他汀，辛伐他汀，匹伐他汀，正乙酰半胱氨酸，雷帕霉素，IVIG，纳曲酮，TGF-β，VEGF，PDGF，CTLA-4，抗CD45RB抗体，羟氯喹，来氟米特，金诺芬，双氰金，柳氮磺吡啶，氨甲蝶呤，糖皮质激素，依那西普，阿达木单抗，阿巴西普，阿那白滞素，赛妥珠单抗，依那西普-szzs，戈利木单抗，英夫利昔单抗，利妥昔单抗，托珠单抗，环孢霉素，IFN-γ，依维莫司，雷帕霉素，VEGF，FGF-1，FGF-2，血管生成素，HIF-1-α或其组合。
在本公开内容的一个实施方案中，通过任何合适的途径(包括通过注射(例如肌内注射))，将成纤维细胞施用至受试者，包括在低氧区域中。合适的途径包括静脉内、皮下、鞘内、口服、直肠内、囊内、网膜内、心室内、肝内和肾内。
在某些实施方案中，成纤维细胞可来源于包括皮肤、心脏、血管、骨髓、骨骼肌、肝脏、胰腺、脑、脂肪组织、包皮、胎盘和/或脐带的组织。在具体实施方案中，成纤维细胞是胎盘的、胎儿的、新生儿的或成体的或其混合物。
向个体施用细胞的次数将至少部分取决于本文所述的因素，并且可以使用本领域的常规方法进行优化。在具体实施方案中，需要单次施用。在其他实施方案中，需要多次施用细胞。应当理解，该系统受到变量的影响，例如个体的特殊需要(其可能随时间和环境而变化)、由于细胞或个体细胞活性的损失导致的细胞活性损失速率，等等。因此，期望可以监测每个个体的合适剂量，并且这种监测个体的实践在本领域中是常规的。
在某些实施方案中，利用IFN-γ，并且组合物中IFN-γ的浓度包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：0.1-500单位/毫升(IU/ml)，0.5-500IU/mL,1-500IU/mL,5-500IU/mL,10-500IU/mL,15-500IU/mL,20-500IU/mL,25-500IU/mL,30-500IU/mL,35-500IU/mL,40-500IU/mL,45-500IU/mL,50-500IU/mL,60-500IU/mL,70-500IU/mL,80-500IU/mL,90-500IU/mL,100-500IU/mL,150-500IU/mL,200-500IU/mL,250-500IU/mL,300-500IU/mL,350-500IU/mL,400-500IU/mL,450-500IU/mL；或0.1-450IU/mL,0.5-450IU/mL,1-450IU/mL,5-450IU/mL,10-450IU/mL,15-450IU/mL,20-450IU/mL,25-450IU/mL,30-450IU/mL,35-450IU/mL,40-450IU/mL,45-450IU/mL,50-450IU/mL,60-450IU/mL,70-450IU/mL,80-450IU/mL,90-450IU/mL,100-450IU/mL,150-450IU/mL,200-450IU/mL,250-450IU/mL,300-450IU/mL,350-450IU/mL,400-450IU/mL；或0.1-400IU/mL,0.5-400IU/mL,1-400IU/mL,5-400IU/mL,10-400IU/mL,15-400IU/mL,20-400IU/mL,25-400IU/mL,30-400IU/mL,35-400IU/mL,40-400IU/mL,45-400IU/mL,50-400IU/mL,60-400IU/mL,70-400IU/mL,80-400IU/mL,90-400IU/mL,100-400IU/mL,150-400IU/mL,200-400IU/mL,250-400IU/mL,300-400IU/mL,350-400IU/mL；或0.1-350IU/mL,0.5-350IU/mL,1-350IU/mL,5-350IU/mL,10-350IU/mL,15-350IU/mL,20-350IU/mL,25-350IU/mL,30-350IU/mL,35-350IU/mL,40-350IU/mL,45-350IU/mL,50-350IU/mL,60-350IU/mL,70-350IU/mL,80-350IU/mL,90-350IU/mL,100-350IU/mL,150-350IU/mL,200-350IU/mL,250-350IU/mL,300-350IU/mL；或0.1-300IU/mL,0.5-300IU/mL,1-300IU/mL,5-300IU/mL,10-300IU/mL,15-300IU/mL,20-300IU/mL,25-300IU/mL,30-300IU/mL,35-300IU/mL,40-300IU/mL,45-300IU/mL,50-300IU/mL,60-300IU/mL,70-300IU/mL,80-300IU/mL,90-300IU/mL,100-300IU/mL,150-300IU/mL,200-300IU/mL,250-300IU/mL；或0.1-250IU/mL,0.5-250IU/mL,1-250IU/mL,5-250IU/mL,10-250IU/mL,15-250IU/mL,20-250IU/mL,25-250IU/mL,30-250IU/mL,35-250IU/mL,40-250IU/mL,45-250IU/mL,50-250IU/mL,60-250IU/mL,70-250IU/mL,80-250IU/mL,90-250IU/mL,100-250IU/mL,150-250IU/mL,200-250IU/mL；或0.1-200IU/mL,0.5-200IU/mL,1-200IU/mL,5-200IU/mL,10-200IU/mL,15-200IU/mL,20-200IU/mL,25-200IU/mL,30-200IU/mL,35-200IU/mL,40-200IU/mL,45-200IU/mL,50-200IU/mL,60-200IU/mL,70-200IU/mL,80-200IU/mL,90-200IU/mL,100-200IU/mL,150-200IU/mL；或0.1-150IU/mL,0.5-150IU/mL,1-150IU/mL,5-150IU/mL,10-150IU/mL,15-150IU/mL,20-150IU/mL,25-150IU/mL,30-150IU/mL,35-150IU/mL,40-150IU/mL,45-150IU/mL,50-150IU/mL,60-150IU/mL,70-150IU/mL,80-150IU/mL,90-150IU/mL,100-150IU/mL；或0.1-100IU/mL,0.5-100IU/mL,1-100IU/mL,5-100IU/mL,10-100IU/mL,15-100IU/mL,20-100IU/mL,25-100IU/mL,30-100IU/mL,35-100IU/mL,40-100IU/mL,45-100IU/mL,50-100IU/mL,60-100IU/mL,70-100IU/mL,80-100IU/mL,90-100IU/mL；或0.1-90IU/mL,0.5-90IU/mL,1-90IU/mL,5-90IU/mL,10-90IU/mL,15-90IU/mL,20-90IU/mL,25-90IU/mL,30-90IU/mL,35-90IU/mL,40-90IU/mL,45-90IU/mL,50-90IU/mL,60-90IU/mL,70-90IU/mL,80-90IU/mL；或0.1-80IU/mL,0.5-80IU/mL,1-80IU/mL,5-80IU/mL,10-80IU/mL,15-80IU/mL,20-80IU/mL,25-80IU/mL,30-80IU/mL,35-80IU/mL,40-80IU/mL,45-80IU/mL,50-80IU/mL,60-80IU/mL,70-80IU/mL；或0.1-70IU/mL,0.5-70IU/mL,1-70IU/mL,5-70IU/mL,10-70IU/mL,15-70IU/mL,20-70IU/mL,25-70IU/mL,30-70IU/mL,35-70IU/mL,40-70IU/mL,45-70IU/mL,50-70IU/mL,60-70IU/mL；或0.1-60IU/mL,0.5-60IU/mL,1-60IU/mL,5-60IU/mL,10-60IU/mL,15-60IU/mL,20-60IU/mL,25-60IU/mL,30-60IU/mL,35-60IU/mL,40-60IU/mL,45-60IU/mL,50-60IU/mL；或0.1-50IU/mL,0.5-50IU/mL,1-50IU/mL,5-50IU/mL,10-50IU/mL,15-50IU/mL,20-50IU/mL,25-50IU/mL,30-50IU/mL,35-50IU/mL,40-50IU/mL,45-50IU/mL；或0.1-45IU/mL,0.5-45IU/mL,1-45IU/mL,5-45IU/mL,10-45IU/mL,15-45IU/mL,20-45IU/mL,25-45IU/mL,30-45IU/mL,35-45IU/mL,40-45IU/mL；或0.1-40IU/mL,0.5-40IU/mL,1-40IU/mL,5-40IU/mL,10-40IU/mL,15-40IU/mL,20-40IU/mL,25-40IU/mL,30-40IU/mL,35-40IU/mL；或0.1-35IU/mL,0.5-35IU/mL,1-35IU/mL,5-35IU/mL,10-35IU/mL,15-35IU/mL,20-35IU/mL,25-35IU/mL,30-35IU/mL；或0.1-30IU/mL,0.5-30IU/mL,1-30IU/mL,5-30IU/mL,10-30IU/mL,15-30IU/mL,20-30IU/mL,25-30IU/mL；或0.1-25IU/mL,0.5-25IU/mL,1-25IU/mL,5-25IU/mL,10-25IU/mL,15-25IU/mL,20-25IU/mL；或0.1-20IU/mL,0.5-20IU/mL,1-20IU/mL,5-20IU/mL,10-20IU/mL,15-20IU/mL；或0.1-15IU/mL,0.5-15IU/mL,1-15IU/mL,5-15IU/mL,10-15IU/mL；或0.1-10IU/mL,0.5-10IU/mL,1-10IU/mL,5-10IU/mL；或0.1-5IU/mL,0.5-5IU/mL,1-5IU/mL；或0.1-1IU/mL,0.5-1IU/mL；或0.1-0.5IU/mL。
本公开内容的方法可以包括使细胞群经受IFN-γ持续限定的时间段。在某些实施方案中，使细胞经受IFN-γ持续约1小时至约14天。在某些实施方案中，使细胞经受IFN-γ持续至少约或不超过约1小时至14天,2小时至14天,3小时至14天,4小时至14天,5小时至14天,6小时至14天,7小时至14天,8小时至14天,9小时至14天,10小时至14天,11小时至14天,12小时至14天,18小时至14天,1天至14天,2天至14天,3天至14天,4天至14天,5天至14天,6天至14天,7天至14天,8天至14天,9天至14天,10天至14天,11天至14天,12天至14天,13天至14天；或1小时至13天,2小时至13天,3小时至13天,4小时至13天,5小时至13天,6小时至13天,7小时至13天,8小时至13天,9小时至13天,10小时至13天,11小时至13天,12小时至13天,1天至13天,2天至13天,3天至13天,4天至13天,5天至13天,6天至13天,7天至13天,8天至13天,9天至13天,10天至13天,11天至13天,12天至13天；或1小时至12天,2小时至12天,3小时至12天,4小时至12天,5小时至12天,6小时至12天,7小时至12天,8小时至12天,9小时至12天,10小时至12天,11小时至12天,12小时至12天,1天至12天,2天至12天,3天至12天,4天至12天,5天至12天,6天至12天,7天至12天,8天至12天,9天至12天,10天至12天,11天至12天；或1小时至11天,2小时至11天,3小时至11天,4小时至11天,5小时至11天,6小时至11天,7小时至11天,8小时至11天,9小时至11天,10小时至11天,11小时至11天,12小时至11天,1天至11天,2天至11天,3天至11天,4天至11天,5天至11天,6天至11天,7天至11天,8天至11天,9天至11天,10天至11天11天；或1小时至10天,2小时至10天,3小时至10天,4小时至10天,5小时至10天,6小时至10天,7小时至10天,8小时至10天,9小时至10天,10小时至10天,11小时至10天,12小时至10天,1天至10天,2天至10天,3天至10天,4天至10天,5天至10天,6天至10天,7天至10天,8天至10天,9天至10天10天；或1小时至9天,2小时至9天,3小时至9天,4小时至9天,5小时至9天,6小时至9天,7小时至9天,8小时至9天,9小时至9天,10小时至9天,11小时至9天,12小时至9天,1天至9天,2天至9天,3天至9天,4天至9天,5天至9天,6天至9天,7天至9天,8天至9天9天；或1小时至8天,2小时至8天,3小时至8天,4小时至8天,5小时至8天,6小时至8天,7小时至8天,8小时至8天,9小时至8天,10小时至8天,11小时至8天,12小时至8天,1天至8天,2天至8天,3天至8天,4天至8天,5天至8天,6天至8天,7天至8天；或1小时至7天,2小时至7天,3小时至7天,4小时至7天,5小时至7天,6小时至7天,7小时至7天,8小时至7天,9小时至7天,10小时至7天,11小时至7天,12小时至7天,1天至7天,2天至7天,3天至7天,4天至7天,5天至7天,6天至7天；或1小时至6天,2小时至6天,3小时至6天,4小时至6天,5小时至6天,6小时至6天,7小时至6天,8小时至6天,9小时至6天,10小时至6天,11小时至6天,12小时至6天,1天至6天,2天至6天,3天至6天,4天至6天,5天至6天；或1小时至5天,2小时至5天,3小时至5天,4小时至5天,5小时至5天,6小时至5天,7小时至5天,8小时至5天,9小时至5天,10小时至5天,11小时至5天,12小时至5天,1天至5天,2天至5天,3天至5天,4天至5天；或1小时至4天,2小时至4天,3小时至4天,4小时至4天,5小时至4天,6小时至4天,7小时至4天,8小时至4天,9小时至4天,10小时至4天,11小时至4天,12小时至4天,1天至4天,2天至4天,3天至4天；或1小时至3天,2小时至3天,3小时至3天,4小时至3天,5小时至3天,6小时至3天,7小时至3天,8小时至3天,9小时至3天,10小时至3天,11小时至3天,12小时至3天,1天至3天,2天至3天；或1小时至2天,2小时至2天,3小时至2天,4小时至2天,5小时至2天,6小时至2天,7小时至2天,8小时至2天,9小时至2天,10小时至2天,11小时至2天,12小时至2天,1天至2天；或1小时至1天,2小时至1天,3小时至1天,4小时至1天,5小时至1天,6小时至1天,7小时至1天,8小时至1天,9小时至1天,10小时至1天,11小时至1天,12小时至1天；或1小时至12小时,2小时至12小时,3小时至12小时,4小时至12小时,5小时至12小时,6小时至12小时,7小时至12小时,8小时至12小时,9小时至12小时,10小时至12小时,11小时至12小时；或1小时至11小时,2小时至11小时,3小时至11小时,4小时至11小时,5小时至11小时,6小时至11小时,7小时至11小时,8小时至11小时,9小时至11小时,10小时至11小时；或1小时至10小时,2小时至10小时,3小时至10小时,4小时至10小时,5小时至10小时,6小时至10小时,7小时至10小时,8小时至10小时,9小时至10小时；或1小时至9小时,2小时至9小时,3小时至9小时,4小时至9小时,5小时至9小时,6小时至9小时,7小时至9小时,8小时至9小时；或1小时至8小时,2小时至8小时,3小时至8小时,4小时至8小时,5小时至8小时,6小时至8小时,7小时至8小时；或1小时至7小时,2小时至7小时,3小时至7小时,4小时至7小时,5小时至7小时,6小时至7小时；或1小时至6小时,2小时至6小时,3小时至6小时,4小时至6小时,5小时至6小时；或1小时至5小时,2小时至5小时,3小时至5小时,4小时至5小时；或1小时至4小时,2小时至4小时,3小时至4小时；或1小时至3小时,2小时至3小时,或1小时至2小时。
在一些实施方案中，使细胞经受一种或多种培养基组合物，所述培养基组合物包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：Roswell Park Memorial Institute(RPMI-1640)、Dublecco改良的基础培养基(DMEM)、Eagle改良的基础培养基(EMEM)、Optimem、Iscove培养基或其组合。
在本公开内容的一个实施方案中，使用本领域已知的方法离体培养细胞(例如成纤维细胞)，以保持细胞的生存力和增殖能力。在成纤维细胞的具体实施方案中，可以对已知的培养技术进行修改，以实现细胞的一种或多种期望的作用，例如降低成纤维细胞对受体免疫系统的可见性。在一个实施方案中，在缺乏一种或多种异种成分例如胎牛血清的条件下培养细胞(例如成纤维细胞)。在具体实施方案中，本公开内容涵盖胎牛血清被富含人血小板丰富的血浆、血小板裂解物、脐带血血清、自体血清和/或确定的细胞因子混合物替代以作为另外的特征，例如以降低细胞(例如成纤维细胞)的免疫原性。
在某些实施方案中，使细胞经受一种或多种组合物，所述组合物包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：富含人血小板丰富的血浆、血小板裂解物、脐带血血清、自体血清、人血清、血清替代物或它们的组合。在具体实施方案中，具有这样的元件的组合物是培养基组合物。在一个实施方案中，血清替代物占组合物体积的至少或不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50％。在另一个实施方案中，富含人血小板的血浆占组合物体积的至少或不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50％。在另一个实施方案中，血小板裂解物占组合物体积的至少或不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50％。在一个实施方案中，脐带血清占组合物体积的至少或不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50％。在一个实施方案中，自体血清占组合物体积的至少或不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50％。在另一个实施方案中，人血清占组合物体积的至少或不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50％。
在采用重组技术的情况下，操纵一种或多种类型的细胞以携带编码感兴趣的基因产物的表达载体。重组表达载体可以作为一种或多种DNA分子或构建体引入，其中可以存在至少一种标志物，其将允许选择包含该载体的宿主细胞。可以以常规方式制备载体，其中基因和调节区可以视情况分离、连接、克隆在合适的克隆宿主中，并通过测序或其他方便的方法进行分析。特别地，通过使用PCR，可以分离包括功能单元的全部或部分的个体片段，其中在某些情况下，可以在适当情况下使用“引物修复”、连接、体外诱变等来引入一个或多个突变。一旦完成并证明具有适当序列，载体就可以通过任何方便的方式引入宿主细胞。可以将构建体整合并包装到非复制的、有缺陷的病毒基因组(例如慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)或其他，包括逆转录病毒载体)中，以进行感染或转导进入细胞。如果需要，载体可以包括用于转染的病毒序列。或者，可以通过融合、电穿孔、基因枪、转染、脂转染等引入构建体。可以在引入载体之前使宿主细胞生长并在培养中扩增，然后进行适当的处理以用于引入载体和整合载体。然后扩增细胞和借助于存在于构建体中的标志物来进行筛选。可以成功使用的各种标志物包括hprt、新霉素抗性、胸苷激酶、潮霉素抗性等。
可以将本文所述的任何基因或基因产物或其活性部分克隆到哺乳动物表达构建体中，所述哺乳动物表达构建体包含使得能够在细胞中表达的一个或多个启动子序列，例如CMV启动子(Artuc等人,Exp.Dermatol.1995,4:317-21)。合适的构建体的实例包括但不限于pcDNA3，pcDNA3.1(+/-)，pGL3，PzeoSV2(+/-)，pDisplay，pEF/myc/cyto，pCMV/myc/cyto，其各自可商购自Invitrogen Co.(www.invitrogen.com)，或使得能够人包皮细胞中实现调节的多核苷酸表达的pSH表达载体(Ventura and Villa,1993,Biochem.Biophys.Commun.192:867-9)。逆转录病毒载体和包装系统的实例是由Clontech,San Diego,Calif.,USA销售的那些，包括Retro-X载体pLNCX和pLXSN，它们允许克隆到多个克隆位点中，并且转基因是从CMV启动子转录的。还包括来源于Mo-MuLV的载体，例如pBabe，其中转基因将从5'LTR启动子转录。在完成质粒转染后，通过允许从组织培养板分离的方法例如通过胰蛋白酶消化收获成纤维细胞，并转移至6孔板(Nunc，Denmark)或24孔板(Nunc)中用于增殖。转染后约3天，将细胞培养基更换为允许修饰的成纤维细胞的增殖和扩增的培养基。一个实例是Neurobasal A(NBA)增殖培养基，其包含Neurobasal-A(Invitrogen)、1％D-葡萄糖(Sigma Aldrich)、1％青霉素/链霉素/谷氨酰胺(Invitrogen)、2％含视黄酸的B27补充剂(Invitrogen)、0.2％EGF(Peprotech,USA)、0.08％FGF-2(Peprotech)、0.2％肝素(Sigma Aldrich,USA)和丙戊酸(Sigma Aldrich)至1μM的浓度。然后每周更换三次培养基，并定期重新铺板细胞(例如，每周重新铺板最多2-8次，随着集落开始发展而变得更加频繁)，以去除未重编程的细胞，直到实现广泛分布的集落形成。
在一些情况下，可以将一种或多种物质例如血管生成剂或其功能片段作为用于瞬时表达的RNA分子引入到细胞中。RNA可以通过各种方式递送至本公开内容的任何细胞、包括任何修饰的细胞，所述方式包括例如显微注射、电穿孔和脂质介导的转染。在具体方面，可通过转座子将载体引入细胞。用于使用的合成转座子的一个实例是Sleeping Beauty转座子，其包含表达盒，该表达盒包含其血管生成剂基因。备选地，可以具有用于同源重组的靶位点，其中期望使用本领域已知的用于同源重组的材料和方法在具体的基因座整合载体。对于同源重组，可以使用OMEGA或O-载体。参见，例如，Thomas and Capecchi,1987；Mansour,等人,1988；和Joyner,等人,1989。
载体可以作为编码至少一种物质(包括一种或多种血管生成剂或其功能片段)和任选地另一种多核苷酸(例如基因)的单个DNA分子或具有一个或多个多核苷酸(例如基因)的不同DNA分子引入。可以同时或相继引入载体，每个载体具有相同或不同的标志物。在举例说明性实例中，一种载体将在具体调节序列的控制下包含一种或多种物质(例如一种或多种血管生成剂)。
包含可用于制备载体DNA的储库和用于进行转染的有用的元件(例如细菌或酵母的复制起点、选择性和/或可扩增的标志物，用于在原核生物或真核生物中表达的启动子/增强子元件等)的载体是本领域众所周知的，并且许多是可商购的。
在某些实施方案中，考虑了RNA或蛋白质序列可以与其他选择的RNA或蛋白质序列在同一宿主细胞中共表达。共表达可以通过用两种或更多种不同的重组载体共转染宿主细胞来实现。或者，可以构建单个重组载体以包含RNA的多个不同的编码区，然后可以在用单个载体转染的宿主细胞中表达它们。
在一些情况下，可能需要杀死修饰的细胞，例如当目的是要终止治疗、细胞成为赘生性的、在其中细胞在其存在后的不存在是感兴趣的研究中和/或其他事件时。为此目的，可以提供某些基因产物的表达，其中可以在受控条件下杀死修饰的细胞，例如自杀基因。自杀基因在本领域是已知的，例如iCaspase9系统，其中胱天蛋白酶9的修饰形式与小分子例如AP1903二聚化。参见例如Straathof等人，Blood 105：4247-4254(2005)。
V.本公开内容的试剂盒
本文所述的或与其类似的任何细胞和/或非细胞组合物可包含在试剂盒中。在非限制性实例中，试剂盒中可包含用于制备细胞疗法的方法中使用的一种或多种试剂。这样的试剂可以包括细胞、IFN-γ、富含血小板的血浆、血小板裂解物、一种或多种血管生成因子、一种或多种生长因子、载体、一种或多种共刺激因子、培养基、酶、缓冲液、核苷酸、盐、引物等。试剂盒可包含本公开内容中列出的任何蛋白质。试剂盒组分以适当的容器装置提供。
试剂盒的某些组分可以包装在水性介质中或为冻干形式。试剂盒的容器装置通常将包括至少一个小瓶、试管、培养瓶、瓶、注射器或其他容器装置，可以将组分放置在其中，并且优选适当地等分。如果试剂盒中有多个组分，则试剂盒通常还将包含第二、第三或其他另外的容器，可以将另外的组分单独放入其中。但是，小瓶中可以包含各种组分的组合。本公开内容的试剂盒通常还将包括用于紧密封闭地容纳组分用于商业销售的装置。这样的容器可以包括注射或吹塑的塑料容器，所需的小瓶保留在其中。
当试剂盒的组分以一种和/或多种液体溶液提供时，该液体溶液是水溶液，其中无菌水溶液是特别有用的。在某些情况下，容器装置本身可以是注射器、移液管和/或其他类似装置，或者可以是具有多个用于所需反应的隔室的基材。
试剂盒的某些组分可以作为干粉提供。当试剂和/或组分以干粉形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来重构粉末。预期的是溶剂也可以在另一个容器装置中提供。试剂盒还可包括第二容器装置，用于容纳无菌可接受的缓冲液和/或其他稀释剂。
在具体实施方案中，试剂和材料包括用于扩增所需序列的引物、核苷酸、合适的缓冲液或缓冲剂、盐等，并且在某些情况下，试剂包括用于分离具体所需细胞的装置或试剂。
在具体实施方案中，试剂盒中存在一种或多种器械，其适于从个体提取一种或多种样品。该器械可以是注射器、细针、手术刀等。
实施例
包括以下实施例以证明本公开内容的具体实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术代表本发明人发现的在实践本公开内容的方法中发挥良好作用的技术，因此可以认为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，可以在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下在所公开的具体实施方案中进行许多改变，并且仍可获得类似或相似的结果。
实施例1
干扰素γ预处理降低成纤维细胞的同种异体刺激活性
本实施例表征了使用IFN-γ降低包皮成纤维细胞(作为一种类型的成纤维细胞的实例)的同种异体刺激活性。
包皮成纤维细胞购自ATCC(Manassas VA)，并在5％二氧化碳的完全湿润的气氛中用指示浓度的干扰素γ(25和50单位)预处理24小时(图2)。照射细胞并用作混合淋巴细胞反应(MLR)的刺激物。MLR中的响应细胞是外周血单核细胞(PBMC)，其通过Ficoll密度梯度(Sigma-Aldrich)从5ml血液分离而来。细胞在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤两次，并铺在圆底96孔板(Nunc)中。在每孔中，在含有10％胎牛血清(Life Technologies)的RPMI培养基中，将10,000、20,000或100,000个PBMC添加至总体积200μL。将细胞培养48小时，并且在培养的最后8小时中，在用1微居里的氚化胸苷加载后，通过胸苷掺入来评估增殖(图2)。
如其中所示，将IFN-γ暴露于成纤维细胞导致成纤维细胞的同种异体刺激活性的降低。
实施例2
干扰素γ处理的成纤维细胞抑制从同种异体淋巴细胞产生干扰素γ
如实施例1中所述，用两种浓度的干扰素γ处理包皮成纤维细胞，并用于刺激混合淋巴细胞反应。培养48小时后，通过对培养上清液进行ELISA测定来评估干扰素γ的分泌(图3)。如其中所示，经处理的成纤维细胞抑制从淋巴细胞产生IFN-γ。
实施例3
γ-干扰素处理的成纤维细胞刺激从同种异体淋巴细胞产生白介素-4
如实施例1中所述，用干扰素γ处理包皮成纤维细胞，并用于刺激混合淋巴细胞反应。培养48小时后，通过对培养物上清液进行ELISA测定来评估白介素-4的分泌(图4)。
与对照相比，IFN-γ处理的成纤维细胞的IL-4的产生增加。
实施例4
干扰素γ处理的成纤维细胞抑制从同种异体淋巴细胞产生TNF-α
如实施例1中所述，用干扰素γ处理包皮成纤维细胞，并用于刺激混合淋巴细胞反应。培养48小时后，通过对培养物上清液进行ELISA测定来评估TNF-α的分泌(图5)，并显示其对于IFN-γ处理的成纤维细胞是减少的。
实施例5
富含血小板的血浆预处理降低成纤维细胞的同种异体刺激活性
包皮成纤维细胞购自ATCC(Manassas VA)，并在5％二氧化碳的完全湿润的气氛中用指示浓度的富含血小板的血浆(按体积比5％和10％)预处理24小时(图6)。照射细胞并用作混合淋巴细胞反应(MLR)的刺激物。MLR中的响应细胞是外周血单核细胞(PBMC)，其通过Ficoll密度梯度(Sigma-Aldrich)从5ml血液分离而来。细胞在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤两次，并铺在圆底96孔板(Nunc)中。在每孔中，在含有10％胎牛血清(LifeTechnologies)的RPMI培养基中，将10,000、20,000或100,000个PBMC添加至总体积200μL。将细胞培养48小时，并且在培养的最后8小时中，在用1微居里的氚化胸苷加载后，通过胸苷掺入来评估增殖(图6)。
用富含血小板的血浆进行预处理导致处理的成纤维细胞的同种异体刺激活性的降低。
实施例6
用于免疫调节的细胞移植疗法
本实施例涉及对有需要的个体进行细胞疗法的免疫调节的方法。
通过成纤维细胞和IFN-γ预处理的成纤维细胞治疗胶原蛋白诱导的关节炎
包皮成纤维细胞购自ATCC(Manassas VA)，并在5％二氧化碳的完全湿润的气氛中用指示浓度的干扰素γ(25单位)预处理24小时。在第一次胶原蛋白II免疫后第7天和第14天两次将500万个成纤维细胞静脉注射到如下所述产生的胶原蛋白诱导的关节炎小鼠中。在关节炎发作后(第二次CII免疫后7天)观察动物4周。对每个肢按0到4的评分进行分级，并计算每只患足的平均临床评分。
在7周龄的DBA/1LacJ小鼠中进行胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)的诱导，用溶于100μl 0.05M乙酸中并与等体积的CFA(Sigma-Aldrich)混合的200μg牛II型胶原蛋白(CII)(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)在尾巴基部中的几个部位进行皮内免疫(第0天)。通过在4℃搅拌过夜将CII以2mg/ml的浓度溶解。初免后第21天，小鼠接受等体积(100μl)PBS中的200μg CII的腹膜内加强注射。每周对小鼠进行三次视觉检查，以检查在外周关节中的关节炎的出现，并且针对疾病严重程度的关节炎评分指数如下给出：0，没有红斑和肿胀的迹象；1，限于中足(跗骨)或踝关节的轻度肿胀和红斑；2，从脚踝延伸到中足的轻度肿胀和红斑；3，从脚踝延伸到跖关节的中度肿胀和红斑；4，包括脚踝、脚和足趾的严重肿胀和红斑。评分是由两名独立的观察员进行的，他们对实验组和对照组不知情。图7显示通过静脉内成纤维细胞或IFN-γ处理的成纤维细胞实现的关节炎评分的降低。
通过成纤维细胞和经PRP预处理的成纤维细胞治疗胶原蛋白诱发的关节炎
包皮成纤维细胞购自ATCC(Manassas VA)，并在5％二氧化碳的完全湿润的气氛中用指定浓度的PRP(5％v/v)预处理24小时。在第一次胶原蛋白II免疫后第7天和第14天两次将500万个成纤维细胞静脉注射到如下所述产生的胶原蛋白诱导的关节炎小鼠中。在关节炎发作后(第二次CII免疫后7天)观察动物4周。对每个肢按0到4的评分进行分级，并计算每只患足的平均临床评分。
在7周龄的DBA/1LacJ小鼠中进行胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)的诱导，用溶于100μl 0.05M乙酸中并与等体积的CFA(Sigma-Aldrich)混合的200μg牛II型胶原蛋白(CII)(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)在尾巴基部中的几个部位进行皮内免疫(第0天)。通过在4℃搅拌过夜将CII以2mg/ml的浓度溶解。初免后第21天，小鼠接受等体积(100μl)PBS中的200μg CII的腹膜内加强注射。每周对小鼠进行三次视觉检查，以检查在外周关节中的关节炎的出现，并且针对疾病严重程度的关节炎评分指数如下给出：0，没有红斑和肿胀的迹象；1，限于中足(跗骨)或踝关节的轻度肿胀和红斑；2，从脚踝延伸到中足的轻度肿胀和红斑；3，从脚踝延伸到跖关节的中度肿胀和红斑；4，包括脚踝、脚和足趾的严重肿胀和红斑。评分是由两名独立的观察员进行的，他们对实验组和对照组不知情。图8证明了通过静脉内成纤维细胞或PRP处理的成纤维细胞实现的关节炎评分的降低。
因此，本实施例涉及个体中一种或多种自身免疫或炎性病况的治疗。在具体实施方案中，使细胞群经受IFN-γ(和任选地一种或多种另外的物质和/或条件)以产生组合物。在另外的实施方案中，将有效量的组合物施用至个体以治疗自身免疫或炎性病况。
实施例7
T调节细胞的培养和扩增
本实施例涉及使用成纤维细胞在体外和体内产生能够抑制自身免疫的T调节细胞。
本公开内容的实施方案包括用于制备和临床使用已和/或正暴露于修饰的成纤维细胞的某些T调节细胞的方法和组合物。在具体情况下，成纤维细胞已通过暴露于至少IFN-γ进行修饰。另外的实施方案包括将成纤维细胞暴露于一种或多种物质，例如CD3配体、CD28配体、雷帕霉素、IL-10、TGF-β、IL-2或其组合。以下研究证明了具体实施方案：
将冷冻保存的脐带血袋(1个单位的袋)在含有0.5％HAS(Baxter Healthcare,Westlake Village,CA)的CliniMACS缓冲液(Miltenyi Biotec，Bergish Gladbach，Germany)中解冻并洗涤，以纯化单核细胞。随后，根据制造商的说明(Miltenyi Biotec，Bergish Gladbach，Germany)，使用磁活化细胞分选(MACS)通过阳性选择进行CD25+细胞富集。检查细胞的生存力，然后通过与CD3/28共表达
Figure BDA0002581683610001101
(ClinExVivoTMCD3/CD28,Invitrogen Dynal AS,Oslo,Norway)以1个细胞:3个珠子的比率(Thakur等人，2016)共培养来刺激，并以1×106个细胞/ml的浓度重悬于X-VIVO 15培养基(CambrexBioScience，Walkersville，MD)中，该培养基补充了10％的人AB血清(Gemini Bio-Products，Sacramento，CA)、2mM L-谷氨酰胺(Sigma，St.Louis，MO)、1％青霉素-链霉素(Gibco/Invitrogen，Grand Island，NY)和200IU/ml白介素(IL)-2(CHIRON Corporation，Emeryville，CA)。CD25+细胞和珠子的离体共培养在37℃在空气中5％CO2的气氛中在组织培养瓶中进行。每48-72小时通过添加新鲜培养基和IL-2(维持200IU/ml)，将CB衍生的CD25+富集T细胞维持在1×106个细胞/ml。在一些培养物中提供了包皮成纤维细胞的添加。在具体实施方案中，如上所述，在添加脐带血细胞之前，将包皮成纤维细胞以50％汇合度预铺板。图9证明了T调节细胞的培养和扩增，其中“X”表示成纤维细胞和混合物的培养物。正方形代表仅成纤维细胞，三角形代表仅混合物。培养开始时，添加50,000个Treg细胞。通过流式细胞术进行Treg的计数。
实施例8
使用同种异体淋巴细胞活化的成纤维细胞治疗肝功能衰竭
本实施例涉及通过利用采用同种异体外周血单核细胞预处理的成纤维细胞来治疗肝功能衰竭和增加肝再生的方法。在一个实施方案中，用先前已与同种异体外周血单核细胞培养以增加肝细胞生长因子的产生的成纤维细胞治疗肝功能衰竭。
在具有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养鼠成纤维细胞BALB/c来源，并在传代后通过暴露于等量的同种异体C57BL/6脾细胞24小时来“致敏”细胞。成纤维细胞随后被洗去脾细胞并用于实验。
将重18至20g、年龄6-8周的健康雄性C57BL/6小鼠饲养于常规实验环境下，在Animal Care Facility中进行12小时的明暗循环。小鼠可以自由获取商业标准的小鼠饲料和水。所有实验均按照批准的方案进行。如先前所述完成动物模型的制备(Li等人，2014)。简而言之，将十八只小鼠随机分为以下三组(n＝6)。(1)正常对照组，首先接受玉米油的腹膜内(i.p.)注射的小鼠随后在30分钟后静脉内注射200μL PBS。(2)未经治疗的组，首先接受单剂量的CCl4(Sigma-aldrich,St Louis,United States)(用于诱导急性肝损伤)的腹膜内注射的小鼠在30分钟后静脉内注射200μl PBS(Fan等人，1995)。(3)活化的成纤维细胞治疗的组，首先接受CCl4的腹膜内注射的小鼠在30分钟后静脉内注射重悬于200μl PBS中的在第4代的1×106个活化的成纤维细胞(Spiewak-Rinaudo and Thorgeirsson,1997)。注射CCl4后24小时处死小鼠，并收集血液。然后迅速取出肝脏和脾脏用于以后的分析或在-80℃冷冻保存。血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的活性分别通过标准的分光光度法使用ChemiLab ALT和AST测定试剂盒(IVDLab Co.,Ltd.,Korea)进行测量。酶活性以每升的国际单位(IU/L)显示。肝切片从左叶的一部分制成，固定在10％中性福尔马林缓冲液中，包埋在石蜡中，并切成5μm的切片。对样品进行脱蜡、水合并用标准苏木精和伊红(H&E)以常规方式染色以检查形态。
在图10A和10B中，从正常对照的小鼠、用四氯化碳和四氯化碳与静脉内注射的106个淋巴细胞活化的成纤维细胞处理的小鼠中收集血清样品。与未经治疗的ALI组的那些相比，淋巴细胞活化的成纤维细胞显著降低ALT(图10A)和AST(图10B)的血清水平。条形图代表三个独立实验的平均值±SEM。p值通过单向ANOVA确定。数据显示代表进行的三个独立实验(与正常对照组相比，##p<0.01。与未经治疗的组相比，*p<0.05和**p<0.01，n＝6)。
用CCl4(1ml/kg体重和以1:3稀释于玉米油)处理小鼠以诱导急性肝损伤，然后在CCl4注射后30分钟用淋巴细胞活化的成纤维细胞(1×106/0.2ml/小鼠，悬浮于PBS中)静脉内施用，24小时中仅进行一次。CCl4注射后24小时拍摄肝脏照片。图11A表示肝脏的总体病理变化。图11B显示了肝脏的组织学切片的代表性显微照片(200×，苏木精和伊红染色)。与正常对照组相比，未经治疗组中的肝脏显示出更多的气球样肝细胞、凋亡和坏死，这通过ppMSC治疗得到显著缓解(n＝6)。
实施例9
通过成纤维细胞重编程的单核细胞刺激从HUVEC培养物产生
VEGF
巨噬细胞是先天免疫系统的关键组成部分，其在炎症调节以及诸如组织重构的生理过程中起主要作用(van Furth and Cohn,1968；Wynn等人,2013)。在从伤口愈合(Smith等人,2017；Vannella and Wynn,2017；Boddupalli等人,2016；Snyder等人,2016)到心肌梗塞(Gombozhapova等人,2017；Hu等人,2011；Ma等人,2013；Lee等人,2013；Yan等人,2013；Fernandez-Velasco等人,2014)，到肾功能衰竭(Guiteras等人,2016；Meng等人,2015；Yamamoto等人,2015；Li等人,2015)和肝功能衰竭(Sun等人，2017)的病况中，可见到巨噬细胞的多种多样的作用。
分化的巨噬细胞及其前体是可以通过改变其表型和功能来适应微环境信号的通用细胞(Gratchev等人，2006)。尽管已对它们进行了多年研究，但直到最近才证明这些细胞包含不同的亚群，称为经典M1和替代M2(Mills，2012)。反映Th1细胞的命名法，M1巨噬细胞被描述为由IFN-γ和LPS诱导的巨噬细胞的促炎性亚型。它们产生效应分子(例如活性氧)和促炎性细胞因子(例如IL-12、TNF-α和IL-6)，并且它们触发Th1极化反应(Mills andLey,2014)。M2巨噬细胞进一步细分为M2a(暴露于IL-4或IL-13之后)、M2b(免疫复合物和Toll样受体或IL-1b配体)和M2c(由IL-10、TGF-β和糖皮质激素诱导)。所有这三种亚型均具有抗炎表型，其特征在于IL-10高(特别是M2b+M2c)、RELM-α高(仅小鼠)、CD206高和IL-12低(M2a)(Mantovani等人，2004)。
在正常炎症期间，巨噬细胞经历在这些极化状态之间的动态切换。M1巨噬细胞在早期阶段更为丰富，并介导清除和募集其他效应细胞，M2巨噬细胞则在到炎症结束时占主导地位，促进血管形成和新组织形成(Ferrante and Leibovich，2012)。炎症过程在很大程度上取决于M1/M2巨噬细胞的此适当平衡比率。无法从M1的主导转换为M2的主导可能导致慢性炎症中促炎环境的延续和增强。因此，M1阻滞可能阻止炎症消退(Hu等人，2011)。
在几种自身免疫性和慢性炎性疾病以及与代谢相关的疾病如糖尿病和代谢综合征中已观察到M1/M2比率的破坏(Ma等人，2013)。肥胖个体的脂肪组织巨噬细胞(ATM)已显示出经历从M2(CD206+、CD301+、Arg1+)到M1(NOS2+、CD11c+)的表型转变，产生促炎性细胞因子例如IL-6、TNF-α和IL-1β(Lee等人，2013)，从而拮抗瘦素和脂连蛋白的作用(Yan等人，2013)。类似的与M1相关的病理学也与心血管疾病如动脉粥样硬化(Fernandez-Velasco等人，2014)和自体免疫疾病如类风湿关节炎(de Couto等人，2015)、多发性硬化(Guiteras等人，2016)、系统性红斑狼疮(Meng等人，2015)和克罗恩氏病(Yamamoto等人，2015)相关。
在初始炎症反应期间M1巨噬细胞的持续存在还可以防止几种慢性皮肤疾病中炎症的消除。糖尿病相关皮肤溃疡中促炎性M1巨噬细胞的数量的减少可以减轻伤口发炎并促进伤口闭合。在患有慢性静脉溃疡的人患者中，M1巨噬细胞的持续存在诱导活性氧的产生，其导致DNA损伤并导致组织修复缺陷。活化的(可能是M1)巨噬细胞也与特应性皮炎相关，特应性皮炎是另一种流行率不断升高的慢性皮肤病，在工业化国家中影响着10-20％的儿童和1-3％的成人，经济影响达到十亿美元。
鉴于M1和M2巨噬细胞的重要性，在本领域中有用的是产生M2巨噬细胞的手段和方法。本公开内容解决了该需求。
为了在体外复制血管生成过程，在96孔板中进行人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的培养。将HUVEC细胞以每孔20,000个细胞的浓度铺板。将各种浓度的单核细胞、成纤维细胞或先前已与成纤维细胞一起孵育的单核细胞添加到HUVEC细胞中。
通过外周血单核细胞的塑料粘附获得单核细胞，并通过CD14磁活化分离(MACS)纯化。成纤维细胞购自ATCC。为了将单核细胞与成纤维细胞一起孵育，在含10％胎牛血清的RMPI培养基中，于37摄氏度在具有5％二氧化碳的完全湿润气氛中，将单核细胞和成纤维细胞以1比1的比率培养48小时。培养后，用胰蛋白酶消化细胞，并使用MACS通过CD14选择纯化单核细胞。随后将细胞与HUVEC细胞以指定比率在每孔总计200μL的培养基中孵育。培养48小时后提取条件培养基，并通过ELISA分析VEGF的产生(图12)。
实施例10
通过成纤维细胞重编程的单核细胞刺激从HUVEC培养物产生IL-33为了在体外复制血管生成过程，在96孔板中进行人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的培养。将HUVEC细胞以每孔20,000个细胞的浓度铺板。将各种浓度的单核细胞、成纤维细胞或先前已与成纤维细胞孵育的单核细胞添加到HUVEC细胞中。通过外周血单核细胞的塑料粘附获得单核细胞，并通过CD14磁活化分离(MACS)纯化。成纤维细胞购自ATCC。为了将单核细胞与成纤维细胞一起孵育，在含10％胎牛血清的RMPI培养基中，于37摄氏度在具有5％二氧化碳的完全湿润气氛中，将单核细胞和成纤维细胞以1比1的比率培养48小时。培养后，用胰蛋白酶消化细胞，并使用MACS通过CD14选择纯化单核细胞。随后将细胞与HUVEC细胞以指定比率在每孔总计200μL的培养基中孵育。培养48小时后提取条件培养基，并通过ELISA分析IL-33的产生(图13)。
实施例11
通过成纤维细胞重编程的单核细胞刺激HUVEC的增殖
为了在体外复制血管生成过程，在96孔板中进行人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的培养。将HUVEC细胞以每孔20,000个细胞的浓度铺板。将各种浓度的单核细胞、成纤维细胞或先前已与成纤维细胞孵育的单核细胞添加到HUVEC细胞中。通过外周血单核细胞的塑料粘附获得单核细胞，并通过CD14磁活化分离(MACS)纯化。成纤维细胞购自ATCC。为了将单核细胞与成纤维细胞一起孵育，在含10％胎牛血清的RMPI培养基中，于37摄氏度在具有5％二氧化碳的完全湿润气氛中，将单核细胞和成纤维细胞以1比1的比率培养48小时。培养后，用胰蛋白酶消化细胞，并使用MACS通过CD14选择纯化单核细胞。
通过与丝裂霉素C(5μg/ml，12小时)一起孵育使添加的细胞有丝分裂失活。随后将细胞与HUVEC细胞以指定比率在每孔总计200μL的培养基中孵育72小时。在培养的最后12小时中加入1uCurie/ml氚化胸苷，并通过闪烁计数来定量增殖。增殖表示为每分钟的计数(图14)。
实施例12
用成纤维细胞重编程的自体T细胞刺激血管生成/加速伤口愈合
缺血性疾病是当今社会的严重发病率和死亡率的一个原因。当前使用的干预措施例如手术或血管内干预措施取得的成功有限，并且经常需要重新干预，部分原因是再狭窄和炎症反应。治疗缺血性疾病的一种有前途的方法是通过使用血管生成疗法。但是，虽然例如对具有严重肢体缺血的患者施用血管生成因子确实在早期试验中带来了一定的益处，但迄今为止的随机试验数据并不支持广泛使用。上游转录因子如HIF-1α的转染是一种有前途的方法，因为它模仿天然的血管生成，因为转染后诱导多种生长因子。然而，临床结果还太不成熟而无法得出确切结论。本公开内容通过使用由成纤维细胞重编程的PBMC对T细胞进行重编程克服了在血管生成疗法中的使用限制。
实施例13
通过成纤维细胞重编程的外周血单核细胞刺激HUVEC的增殖
为了在体外复制血管生成过程，在96孔板中进行人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的培养。将HUVEC细胞以每孔20,000个细胞的浓度铺板。将各种浓度的PBMC、成纤维细胞或先前已与成纤维细胞一起孵育的PBMC加入到HUVEC细胞中。
通过Ficoll密度梯度获得外周血单核细胞(PBMC)。成纤维细胞购自ATCC。
为了使PBMC与成纤维细胞一起孵育，在含10％胎牛血清的RMPI培养基中，于37摄氏度在具有5％二氧化碳的完全湿润气氛中，将PBMC和成纤维细胞以1比1的比率培养48小时。培养后，通过移液收获非贴壁细胞。将细胞在磷酸盐缓冲液中洗涤，重悬于RPMI培养基中，然后与HUVEC细胞以指定比率在每孔总计200μL的培养基中孵育。通过氚化胸苷掺入在48小时评估增殖(图15)。
实施例14
通过应激的成纤维细胞刺激树突状细胞CD80
通过Ficoll方法从外周血分离外周血单核细胞。简而言之，使用肝素EDTA提取血液并覆盖在50ml锥形管中的Ficoll Histopaque上。以1200g离心细胞30分钟，并分离单核细胞。将所述单核细胞在磷酸盐缓冲液中洗涤2次，并重悬于含有10％胎牛血清的RPMA培养基中。将细胞铺在6孔培养瓶中，并使其贴壁2小时。贴壁细胞用作单核细胞的来源。在对照成纤维细胞以及应激的成纤维细胞的存在下，将单核细胞在IL-4 10ng/ml和GM-CSF 10ng/ml中培养7天。
为了产生对照和应激的成纤维细胞，从ATCC购买包皮成纤维细胞并按照制造商的说明(Thermo Fischer)在补充有10％的胎牛血清和抗生素/抗真菌混合物的Media 106(Thermo Fisher)中培养。将细胞在37℃在5％CO2的完全湿润的气氛中在T-175培养瓶中培养，直到达到75％汇合。通过在40摄氏度的水浴中加热细胞4个小时来应用高热。将对照细胞置于37摄氏度水浴中。对于血清剥夺，如上所述培养包皮成纤维细胞，并将其暴露于没有胎牛血清的Media106 24小时。
组织培养后七天，通过流式细胞术针对成熟标志物CD80评估树突状细胞。如图16所示，与对照成纤维细胞相比，在具有应激的成纤维细胞的培养物中观察到CD80的表达增加。
实施例15
通过应激的成纤维细胞刺激树突状细胞CD86
通过Ficoll方法从外周血分离外周血单核细胞。简而言之，使用肝素EDTA提取血液并覆盖在50ml锥形管中的Ficoll Histopaque上。以1200g离心细胞30分钟，并分离单核细胞。将所述单核细胞在磷酸盐缓冲液中洗涤2次，并重悬于含有10％胎牛血清的RPMA培养基中。将细胞铺在6孔培养瓶中，并使其贴壁2小时。贴壁细胞用作单核细胞的来源。在对照成纤维细胞以及应激的成纤维细胞的存在下，将单核细胞在IL-4 10ng/ml和GM-CSF 10ng/ml中培养7天。
为了产生对照和应激的成纤维细胞，从ATCC购买包皮成纤维细胞并按照制造商的说明(Thermo Fischer)在补充有10％的胎牛血清和抗生素/抗真菌混合物的Media 106(Thermo Fisher)中培养。将细胞在37℃在5％CO2的完全湿润的气氛中在T-175培养瓶中培养，直到达到75％汇合。通过在40摄氏度的水浴中加热细胞4个小时来应用高热。将对照细胞置于37摄氏度水浴中。对于血清剥夺，如上所述培养包皮成纤维细胞，并将其暴露于没有胎牛血清的Media106 24小时。
组织培养后七天，通过流式细胞术针对成熟标志物CD86评估树突状细胞。如图17所示，与对照成纤维细胞相比，在具有应激的成纤维细胞的培养物中观察到CD86的表达增加。
实施例16
通过在高热培养或血清衍生的成纤维细胞增加CD8增殖
包皮成纤维细胞购自ATCC，并按照制造商的说明(Thermo Fischer)在补充有10％的胎牛血清和抗生素/抗真菌混合物的Media106(Thermo Fisher)中培养。将细胞在37℃在5％CO2的完全湿润的气氛中在T-175培养瓶中培养，直到达到75％汇合。通过在40摄氏度的水浴中加热细胞4个小时来应用高热。将对照细胞置于37摄氏度水浴中。
对于血清剥夺，如上所述培养包皮成纤维细胞，并将其暴露于没有胎牛血清的Media 106 24小时。
细胞随后被胰蛋白酶消化并与磁活化细胞分选(MACS)分离的CD8细胞一起以50％汇合度铺在T-175培养瓶上。来自健康供体的外周血单核细胞被用作用于分离的T细胞来源。以指定的比率建立CD8细胞和成纤维细胞的培养物。
孵育48小时后，通过洗涤分离非贴壁细胞，并用植物凝集素(5ug/ml)刺激24小时。通过使用1微居里/ml的氚化胸苷脉冲12小时由氚化胸苷掺入评估增殖。通过闪烁计数将增殖表示为每分钟的计数(图18)。
实施例17
通过施用PGE2中的成纤维细胞和单核细胞来保留舒张末期容积
对C57BL/6小鼠进行左前降支结扎以模拟冠状动脉梗塞。在第1天用人单核细胞、人成纤维细胞或其组合治疗小鼠。通过在100ng/ml PGE-2中培养36小时来进行人单核细胞和成纤维细胞培养的组合。用胰蛋白酶消化将细胞解离，洗涤并静脉内施用。使用100万个细胞进行施用。用超声心动图测量舒张末期容积。每组使用十只小鼠。在组合治疗的动物中观察到心室容量的显著保留(图19)。菱形是单核细胞，正方形是成纤维细胞，三角形是盐水，“x”是单核细胞和成纤维细胞的组合。
实施例18
通过成纤维细胞及其群体治疗移植物抗宿主病
实施例A：临床前研究
在第0天用150mg/kg的5-FU(Sigma Chemical Corp.,St.Louis,MO)的腹膜内注射治疗8-12周的雌性B6小鼠，以诱导能够允许同种异体重建的造血损伤状态。
在施用5-FU后第1天向每次治疗10只小鼠的组施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)对照或来自BALB/c小鼠的15,000、30,000或60,000个骨髓单核细胞。
同时使用安慰剂(盐水)和受体来源(B6)、供体来源(BALB/c)或第三方对照(C3H)的成纤维细胞以每只小鼠100,000个细胞的浓度经尾静脉静脉内治疗小鼠。
在基于临床病理学接受来自BALB/c小鼠的30,000或60,000个骨髓单核细胞的所有对照B6小鼠中都经历了GVHD。接受来自同种异体、受体或供体来源的成纤维细胞的小鼠没有经历GVHD或与对照相比具有明显的减少。
实施例B：炎症标志物的临床减少
十二名患有GVHD且C反应蛋白(CRP)升高至正常水平以上的患者被静脉内施用2000万个来源于表达>80％CD73和>80％CD105的皮肤来源的成纤维细胞。在细胞施用之前以及在第1、2和3周测量CRP(图20A-20C)、TNFα(图21A-21C)和IL-6(图22A-22C)的水平。
浓度以皮克/毫升表示。重要的是，成纤维细胞的施用与IFN-γ产生(图23A-23C)和NK活性(图24A-24C)的增加相关，表明选择性的抗癌作用同时减少炎症。
实施例19
患有多发性硬化的患者中成纤维细胞的临床试验
进行临床试验以确定静脉内施用的成纤维细胞在患有治疗抗性的继发性进行性MS的患者中的安全性。安全性定义为缺乏与治疗相关的不良事件。功效参数包括以下方面的变化的终点：a)EDSS；b)Scripps神经学评定量表(NRS)；c)同步听觉系列加法测试(PASAT)；d)九孔钉测试；e)25英尺步行时间；f)简易格式的36(SF-36)QoL问卷；g)钆MRI和e)由CD4、CD25和FoxP3表达所定义的T调节(Treg)细胞的变化。
将患者随机分组以在第0天静脉内接受悬浮在Isolyte中的50ml体积的25、50或100×106个成纤维细胞。向患有多发性硬化的患者施用成纤维细胞的原因是因为先前的研究表明这些细胞在抑制多发性硬化的动物模型中具有功效，并且证明了与以前在MS动物模型中临床使用的骨髓间充质干细胞相比具有更高的免疫调节活性。具体而言，已证明成纤维细胞增加IL-4、IL-10、吲哚胺2,3脱氧酶(IDO)和HLA-G的表达，同时抑制TNF-α、IFN-γ、IL-12和IL-17表达。
在具体实施方案中，可以利用以下访问时间表。
访问1：筛查访问和基线评估(输液前1周)
知情同意
历史
体检
根据McDonald和Poser标准的MS诊断。
实验室–化学和CBC
EDSS
Scripps神经学评定量表(NRS)
同步听觉系列加法测试(PASAT)
九孔钉测试
25英尺步行时间
简易格式的36(SF-36)QoL问卷
钆MRI
Treg评估
访问2：第0天，第一次输液(ERC-124施用)
静脉JD-001注射
注射部位评估
EKG
访问3：第7天，电话
-不良事件。
访问4：第30天评估
-EKG
-不良事件评估
-实验室–化学和CBC
-EDSS
-Scripps神经学评定量表(NRS)
-同步听觉系列加法测试(PASAT)
-九孔钉测试
-25英尺步行时间
-简易格式的36(SF-36)QoL问卷
-钆MRI
-Treg评估
访问5：第90天评估
-实验室–化学和CBC
-EDSS
-Scripps神经学评定量表(NRS)
-同步听觉系列加法测试(PASAT)
-九孔钉测试
-25英尺步行时间
-简易格式的36(SF-36)QoL问卷
-Treg评估
访问6：第180天评估
-实验室–化学和CBC
-EDSS
-Scripps神经学评定量表(NRS)
-同步听觉系列加法测试(PASAT)
-九孔钉测试
-25英尺步行时间
-简易格式的36(SF-36)QoL问卷
-钆MRI
-Treg评估
受试者必须在细胞给药前7天内进行筛选访问并进行基线评估，并且必须符合所有纳入和排除标准。确保所有纳入和排除标准均得到满足的所有基线评估的结果必须由首席研究人员或其指定人员在注册该受试者之前进行审查。必须告知受试者有关研究的所有方面的信息，并且必须在研究开始之前获得受试者的书面知情同意。
纳入标准：
-18-65岁，根据McDonald和Poser标准，具有临床明确的继发性进行性MS
-扩展的残疾状态量表(EDSS)评分为2·0–6·5
-在过去的两年中，疾病的稳定进展而不是复发必须是导致残疾增加的主要原因。从EDSS增加至少1个点或患者记录中残疾增加的临床记录中可以明显看出疾病进展
-能够进行钆MRI
排除标准：
-出血障碍
-在进入试验的6个月内接受了干扰素β或醋酸格拉替雷，
-心血管状态不稳定的患者
-有活动性感染的患者，除非研究者认为没有必要进行治疗
-有血清学证据证明感染了艾滋病毒、乙型肝炎或丙型肝炎的患者。
-并非a)绝经后，b)手术不育或c)使用可接受的避孕方法的性活跃女性：口服避孕药、Norplant、Depo-provera和与杀精凝胶结合使用的屏障装置是可接受的。
-有已知的或先前的恶性肿瘤的患者。研究者认为在任何状况或任何情况下都无法安全接受成纤维细胞的治疗的患者。
-视网膜病变患者
-对牛产品过敏的患者
将对成纤维细胞提供每批次的分析证书，证明根据WHO血库法规和针对同种异体产品的21CFR1271C子部分供体法规的纯度和无污染物。Charter CF-50袋将填充有已产生并经过测试的来自细胞库的细胞产品。袋子的填充将由General BioTechnology使用先前在第9代从工作细胞库中扩增的细胞进行。将细胞重悬于50mL的含10％DMSO的Isolyte SMulti-Electrolyte溶液(B.Braun Medical)中。每个Charter CF-50袋将在50ml的体积中包含25、50或100×106个细胞。每个临床剂量需要约25、50或100×106个细胞。
接受成纤维细胞的患者经历EDSS评分和钆MRI上斑块消除的依赖性降低。
本说明书中提到的所有专利和出版物都指示了本公开内容所属领域的技术人员的水平。所有专利和出版物都以相同的程度通过引用并入本文，就如同每个单独的出版物均被明确地和单独地指出通过引用并入本文一样。
美国专利
美国专利号9,637,721
美国专利号9,580,687
美国专利号7,709,229
美国专利号6,162,643
美国专利号6,103,529
美国专利号6,048,728
美国专利号5,324,666
美国专利号4,560,655
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尽管已详细描述了本公开内容及其优点，但是应当理解，在不脱离由所附权利要求书限定的本公开内容的精神和范围的情况下，可以在本文中进行各种改变、替换和变更。而且，本申请的范围不旨在限于本说明书中描述的过程、机器、制造、物质组合、手段、方法和步骤的具体实施方案。如本领域的普通技术人员将从本发明的公开内容中容易地理解的是，可以根据本公开内容利用目前存在或将要开发的执行与本文所述的相应实施方案基本相同的功能或实现基本相同的结果的过程、机器、制造、物质组合、手段、方法或步骤。因此，所附权利要求旨在将这样的过程、机器、制造、物质组合、手段、方法或步骤包括在它们的范围内。

Claims (243)

1.一种产生活化的成纤维细胞或活化的免疫细胞或活化的免疫细胞衍生物的体外方法，其包括以下步骤：
(a)在使得来自免疫细胞的一种或多种物质活化成纤维细胞成为活化的成纤维细胞并且使得来自成纤维细胞的一种或多种抗原触发从免疫细胞产生一种或多种细胞因子以产生活化的免疫细胞的条件下，使成纤维细胞暴露于免疫细胞；和/或
(b)在使得一种或多种生长因子和/或一种或多种细胞因子活化成纤维细胞成为活化的成纤维细胞的条件下，使成纤维细胞暴露于一种或多种生长因子和/或一种或多种细胞因子。
2.权利要求1的方法，其中将治疗有效量的活化的成纤维细胞和/或活化的免疫细胞提供给有需要的个体。
3.权利要求1或2的方法，其中所述免疫细胞是外周血单核细胞(PBMC)、单核细胞、单核细胞祖细胞、淋巴细胞、巨噬细胞或其混合物。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中在步骤(a)中，来自免疫细胞的活化成纤维细胞成为活化的成纤维细胞的一种或多种物质是细胞因子、生长因子或其混合物。
5.权利要求4的方法，其中所述细胞因子选自IFN-γ、TNF-α、白介素(IL)-1、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-33及其组合。
6.权利要求4或5的方法，其中所述生长因子选自FGF-1、VEGF及其组合。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中在步骤(a)中，来自成纤维细胞的触发从免疫细胞产生一种或多种细胞因子的一种或多种抗原是IL-10、TGF-β、IL-32、IL-35、IL-12p40同型二聚体、ILA-G、ILT-3、吲哚酰胺2,3脱氧酶或其组合。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中在步骤(b)中，活化成纤维细胞成为活化的成纤维细胞的一种或多种细胞因子选自IFN-γ、TNF-α、白介素(IL)-1、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-33或其组合。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中在步骤(b)中，活化成纤维细胞成为活化的成纤维细胞的一种或多种生长因子选自IFN-γ、TNF-α、白介素(IL)-1、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-33或其组合。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中步骤(a)和步骤(b)同时发生。
11.权利要求1-9中任一项的方法，其中步骤(a)和步骤(b)在不同的时间发生。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中将所述成纤维细胞暴露于一种或多种另外的物质和/或条件。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中将所述免疫细胞暴露于一种或多种另外的物质和/或条件。
14.权利要求12或13的方法，其中所述另外的条件包括暴露于培养基。
15.权利要求14的方法，其中所述培养基包括Roswell Park Memorial Institute(RPMI-1640)、Dublecco改良基础培养基(DMEM)、Eagle改良基础培养基(EMEM)、Optimem、Iscove培养基或其组合。
16.权利要求12-15中任一项的方法，其中所述另外的物质包括富含人血小板的血浆、血小板裂解物、脐带血血清、自体血清、人血清、血清替代物或其组合。
17.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述免疫细胞是CD25+T调节细胞。
18.权利要求17的方法，其中所述CD25+T调节细胞来源于同种异体的幼稚CD4+T细胞。
19.权利要求17或18的方法，其中所述CD25+T调节细胞分离自胸腺、外周血、脐带血、G-CSF动员的外周血、脂肪组织和胎盘或其组合。
20.权利要求17-19中任一项的方法，其中调节性T细胞的群体在选择下保持在培养物中。
21.权利要求20的方法，其中培养物中的调节性T细胞被选择为具有约7-12μm的直径。
22.权利要求1-21中任一项的方法，其中将所述成纤维细胞暴露于有效量的PBMC以增加从所述成纤维细胞产生肝细胞生长因子和/或赋予所述成纤维细胞活性以能够增加卵圆细胞增殖。
23.权利要求1-22中任一项的方法，其中所述免疫细胞是单核细胞、单核细胞祖细胞或其混合物。
24.权利要求23的方法，其中所述单核细胞和/或单核细胞祖细胞具有以下特征中的一个或多个：(a)来源于外周血单核细胞；(b)表达CD14、CD16、CD11b中的一种或多种；CD14、CD16(c)是塑料粘附的；(d)是骨髓祖细胞；(e)来源于骨髓；和/或(f)来源于动员的外周血。
25.权利要求24的方法，其中所述动员的外周血是通过用G-CSF、flt-3配体和/或普乐沙福中的一种或多种预处理个体来产生的。
26.权利要求1-25中任一项的方法，其中所述成纤维细胞在适于成纤维细胞增殖的培养基中培养。
27.权利要求26的方法，其中允许成纤维细胞增殖的所述培养基包含一种或多种促有丝分裂因子。
28.权利要求1-27中任一项的方法，其中暴露步骤在离体培养中或在体内进行。
29.权利要求1-28中任一项的方法，其中所述免疫细胞是未成熟的树突状细胞，并且所述成纤维细胞是应激的成纤维细胞。
30.权利要求1-29中任一项的方法，其中所述CD8 T细胞获自免疫细胞，并且其中所述成纤维细胞是应激的成纤维细胞。
31.一种降低细胞群的免疫原性的方法，其中使所述细胞群经受包含IFN-γ和任选地一种或多种另外的物质和/或条件的组合物。
32.权利要求31的方法，其中所述细胞群是成纤维细胞、胰腺β细胞、胰岛、肝细胞、神经元、软骨细胞、多能干细胞或其衍生物或混合物的群体。
33.权利要求32的方法，其中所述多能干细胞包括诱导性多能干细胞、应激诱导干细胞、孤雌生殖来源的干细胞、胚胎干细胞、体细胞核转移来源的干细胞或其衍生物或混合物。
34.权利要求31-33中任一项的方法，其中所述另外的条件包括Roswell ParkMemorial Institute(RPMI-1640)、Dublecco改良的基础培养基(DMEM)、Eagle改良的基础培养基(EMEM)、Optimem、Iscove培养基或其组合。
35.权利要求31-34中任一项的方法，其中所述另外的物质包括富含人血小板的血浆、血小板裂解物、脐带血血清、自体血清、人血清、血清替代物或其组合。
36.权利要求31-35中任一项的方法，其中所述另外的物质包括一种或多种免疫调节剂。
37.权利要求36的方法，其中所述免疫调节剂包括FAS配体、IL-2R、IL-1Ra、IL-2、IL-4、IL-8、IL-10、IL-20、IL-35、HLA-G、PD-L1、I-309、IDO、iNOS、CD200、半乳凝素3、sCR1、精氨酸酶、PGE-2、阿司匹林、阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀、匹伐他汀、正乙酰半胱氨酸、雷帕霉素、IVIG、纳曲酮、TGF-β、VEGF、PDGF、CTLA-4、抗CD45RB抗体、羟氯喹、来氟米特、金诺芬、双氰金、柳氮磺吡啶、氨甲蝶呤、糖皮质激素、依那西普、阿达木单抗、阿巴西普、阿那白滞素、赛妥珠单抗、依那西普-szzs、戈利木单抗、英夫利昔单抗、利妥昔单抗、托珠单抗、环孢霉素、IFN-γ、依维莫司、雷帕霉素或其组合。
38.权利要求31-37中任一项的方法，其中所述细胞被修饰以重组表达一种或多种免疫调节剂。
39.权利要求38的方法，其中所述免疫调节剂是FAS配体、IL-2、IL-4、IL-10、IL-20、IL-35、HLA-G、I-309、IDO、iNOS、CD200、半乳凝素3、精氨酸酶、PGE-2、TGF-β、CTLA-4、PD-L1、IFN-γ或其组合。
40.权利要求38-39中任一项的方法，其中一种或多种免疫调节剂的表达由组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或其组合调节。
41.权利要求31-40中任一项的方法，其中将治疗有效量的所述细胞施用至需要细胞移植疗法的个体。
42.权利要求31-41中任一项的方法，其中将治疗有效量的所述细胞施用至需要血管生成疗法的个体。
43.权利要求42的方法，其中将治疗有效量的细胞与血管生成剂共同施用至个体。
44.权利要求31-43中任一项的方法，其中所述细胞被修饰以重组表达一种或多种血管生成剂。
45.权利要求44的方法，其中一种或多种血管生成剂的表达由组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或其组合调节。
46.权利要求43-45中任一项的方法，其中所述血管生成剂是VEGF、FGF-1、FGF-2、血管生成素、HIF-1-α或其组合。
47.权利要求31-46中任一项的方法，其中将治疗有效量的细胞施用至需要免疫调节疗法的个体。
48.权利要求47的方法，其中所述个体患有以下疾病或处于患有以下疾病的风险中：急性弥散性脑脊髓炎，急性坏死性出血性白质脑炎，艾迪生氏病，粘连性囊炎，无丙种球蛋白血症，斑秃，淀粉样变性病，强直性脊柱炎，抗GBM肾炎，抗磷脂综合征(APS)，抗TBM肾炎，节肢纤维化，心房纤维化，自身免疫性血管水肿，自身免疫性再生障碍性贫血，自身免疫性自主神经功能异常，自身免疫性肝炎，自身免疫性高脂血症，自身免疫性免疫缺陷，自身免疫性内耳疾病(AIED)，自身免疫性心肌炎，自身免疫性嗜中性粒细胞减少症，自身免疫性卵巢炎，自身免疫性胰腺炎，自身免疫性视网膜病，自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)，自身免疫性甲状腺疾病，自身免疫性荨麻疹，轴突和神经元神经病，巴洛氏病，贝塞特氏病，良性粘膜性类天疱疮，大疱性类天疱疮，心肌病，Castleman病，乳糜泻，查加斯病，慢性疲劳综合征，慢性炎性脱髓磷脂性多发性神经病(CIDP)，慢性莱姆病，慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)，Churg-Strauss综合征，瘢痕性类天疱疮，肝硬化，Cogans综合征，冷凝集素病，先天性心脏传导阻滞，柯萨奇心肌炎，CREST病，克罗恩病，囊性纤维化，白介素-1受体拮抗剂缺乏，脱髓磷脂性神经病，疱疹样皮炎，皮肌炎，德维克氏病(视神经脊髓炎)，盘状狼疮，德莱瑟氏综合征，多普特氏挛缩症，子宫内膜异位，心内膜心肌纤维化，嗜酸性食管炎，嗜酸性筋膜炎，结节性红斑，原发性混合性冷球蛋白血症，埃文斯综合征，实验性变应性脑脊髓炎，家族性地中海热，纤维肌痛，纤维化肺泡炎，巨细胞动脉炎(颞动脉炎)，巨细胞心肌炎，肾小球肾炎，血管球性肾炎，Goodpasture综合征，移植物抗宿主病(GVHD)，肉芽肿伴多血管炎，格雷夫斯病，格林-巴利综合征，桥本脑炎，桥本甲状腺炎，溶血性贫血，Henoch-Schonlein紫癜，肝炎，妊娠疱疹，低丙球蛋白血症，特发性肺纤维化，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，IgA肾病，IgG4相关硬化性疾病，免疫调节脂蛋白，包涵体肌炎，炎症性肠病，间质性膀胱炎，青少年关节炎，青少年糖尿病(1型糖尿病)，青少年肌炎，川崎综合征，瘢痕疙瘩，Lambert-Eaton综合征，白细胞碎裂性血管炎，扁平苔藓，苔癣硬化症，木质结膜炎，线性IgA病，狼疮(SLE)，莱姆病，纵隔纤维化，美尼尔氏病，显微镜下多血管炎，混合结缔组织病(MCTD)，Mooren溃疡，Mucha-Habermann病，多发性硬化(MS)，重症肌无力，骨髓纤维化，肌炎，发作性睡病，新生儿期起病多系统炎性疾病，肾源性系统性纤维化，视神经脊髓炎(Devic's)，嗜中性粒细胞减少症，非酒精性脂肪肝疾病，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，眼瘢痕性类天疱疮，视神经炎，复发性风湿病，副肿瘤性小脑变性，阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)，ParryRomberg综合征，睫状体扁平部炎(周围性葡萄膜炎)，Parsonnage-Turner综合征，与链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神疾病(PANDAS)，天疱疮，周围神经病变，周围性脑脊髓炎，恶性贫血，佩罗尼氏病，POEMS综合征，结节性多动脉炎，风湿性多肌痛，多发性肌炎，心肌梗塞后综合征，心包切开术后综合征，原发性胆汁性肝硬化，原发性硬化性胆管炎，孕酮性皮炎，进行性大规模纤维化，牛皮癣，牛皮癣性关节炎，纯红细胞发育不全，坏疽性脓皮病，雷诺现象，反应性关节炎，反射交感性营养不良，Reiter综合征，复发性多发性软骨炎，不安腿综合征，腹膜后纤维化，风湿热，类风湿性关节炎，结节病，施密特综合征，巩膜炎，硬皮病，干燥综合征，精子和睾丸自身免疫性，僵人综合征，亚急性细菌性心内膜炎，Susac综合征，交感性眼炎，系统性红斑狼疮(SLE)，Takayasu动脉炎，颞动脉炎，血小板减少性紫癜(TTP)，Tolosa-Hunt综合征，横贯性脊髓炎，肿瘤坏死因子受体相关的周期性综合征，1型糖尿病，I型自身免疫性多腺综合征，II型自身免疫性多腺综合征，III型自身免疫性多腺综合征，溃疡性结肠炎，未分化的结缔组织病，葡萄膜炎，血管炎，水疱性皮肤病，白癜风，韦格纳肉芽肿病(现称为肉芽肿伴多血管炎(GPA))。
49.一种治疗个体的自身免疫或炎性病况的方法，包括向所述个体施用包含治疗有效量的经受IFN-γ和任选地一种或多种另外的物质和/或条件的细胞的组合物。
50.权利要求49的方法，其中所述细胞是成纤维细胞，胰腺β细胞、胰岛、肝细胞、神经元、软骨细胞、多能干细胞或其衍生物。
51.权利要求50的方法，其中所述多能干细胞是诱导性多能干细胞、应激诱导干细胞、孤雌生殖来源的干细胞、胚胎干细胞、体细胞核转移来源的干细胞或其衍生物。
52.权利要求49-51中任一项的方法，其中所述另外的条件包括具体的细胞培养基。
53.权利要求52的方法，其中所述培养基包括Roswell Park Memorial Institute(RPMI-1640)、Dublecco改良的基础培养基(DMEM)、Dublecco改良的低葡萄糖基础培养基(DMEM-LG)、Eagle改良的基础培养基(EMEM)、Optimem、Iscove培养基或其组合。
54.权利要求49-53中任一项的方法，其中所述另外的物质包括富含人血小板的血浆、血小板裂解物、脐带血血清、自体血清、人血清、血清替代物或其组合。
55.权利要求49-54中任一项的方法，其中所述另外的物质包括一种或多种免疫调节剂。
56.权利要求55的方法，其中所述免疫调节剂包括FAS配体、IL-2R、IL-1Ra、IL-2、IL-4、IL-8、IL-10、IL-20、IL-35、HLA-G、PD-L1、I-309、IDO、iNOS、CD200、半乳凝素3、sCR1、精氨酸酶、PGE-2、阿司匹林、阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀、匹伐他汀、正乙酰半胱氨酸、雷帕霉素IVIG、纳曲酮、TGF-β、VEGF、PDGF、CTLA-4、抗CD45RB抗体、羟氯喹、来氟米特、金诺芬、双氰金、柳氮磺吡啶、氨甲蝶呤、糖皮质激素、依那西普、阿达木单抗、阿巴西普、阿那白滞素、赛妥珠单抗、依那西普-szzs、戈利木单抗、英夫利昔单抗、利妥昔单抗、托珠单抗、环孢霉素、IFN-γ、依维莫司、雷帕霉素或其组合。
57.权利要求49-56中任一项的方法，其中所述细胞被修饰以重组表达一种或多种免疫调节剂。
58.权利要求57的方法，其中所述免疫调节剂是FAS配体、IL-2、IL-4、IL-10、IL-20、IL-35、HLA-G、I-309、IDO、iNOS、CD200、半乳凝素3、精氨酸酶、PGE-2、TGF-β、CTLA-4、PD-L1、IFN-γ或其组合。
59.权利要求57-58中任一项的方法，其中所述一种或多种免疫调节剂的表达由组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或其组合调节。
60.权利要求49-59中任一项的方法，其中所述自身免疫或炎性病况包括急性弥散性脑脊髓炎，急性坏死性出血性白质脑炎，艾迪生氏病，粘连性囊炎，无丙种球蛋白血症，斑秃，淀粉样变性病，强直性脊柱炎，抗GBM肾炎，抗磷脂综合征(APS)，抗TBM肾炎，节肢纤维化，心房纤维化，自身免疫性血管水肿，自身免疫性再生障碍性贫血，自身免疫性自主神经功能异常，自身免疫性肝炎，自身免疫性高脂血症，自身免疫性免疫缺陷，自身免疫性内耳疾病(AIED)，自身免疫性心肌炎，自身免疫性嗜中性粒细胞减少症，自身免疫性卵巢炎，自身免疫性胰腺炎，自身免疫性视网膜病，自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)，自身免疫性甲状腺疾病，自身免疫性荨麻疹，轴突和神经元神经病，巴洛氏病，贝塞特氏病，良性粘膜性类天疱疮，大疱性类天疱疮，心肌病，Castleman病，乳糜泻，查加斯病，慢性疲劳综合征，慢性炎性脱髓磷脂性多发性神经病(CIDP)，慢性莱姆病，慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)，Churg-Strauss综合征，瘢痕性类天疱疮，肝硬化，Cogans综合征，冷凝集素病，先天性心脏传导阻滞，柯萨奇心肌炎，CREST病，克罗恩病，囊性纤维化，白介素-1受体拮抗剂缺乏，脱髓磷脂性神经病，疱疹样皮炎，皮肌炎，德维克氏病(视神经脊髓炎)，盘状狼疮，德莱瑟氏综合征，多普特氏挛缩症，子宫内膜异位，心内膜心肌纤维化，嗜酸性食管炎，嗜酸性筋膜炎，结节性红斑，原发性混合性冷球蛋白血症，埃文斯综合征，实验性变应性脑脊髓炎，家族性地中海热，纤维肌痛，纤维化肺泡炎，巨细胞动脉炎(颞动脉炎)，巨细胞心肌炎，肾小球肾炎，血管球性肾炎，Goodpasture综合征，移植物抗宿主病(GVHD)，肉芽肿伴多血管炎，格雷夫斯病，格林-巴利综合征，桥本脑炎，桥本甲状腺炎，溶血性贫血，Henoch-Schonlein紫癜，肝炎，妊娠疱疹，低丙球蛋白血症，特发性肺纤维化，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，IgA肾病，IgG4相关硬化性疾病，免疫调节脂蛋白，包涵体肌炎，炎症性肠病，间质性膀胱炎，青少年关节炎，青少年糖尿病(1型糖尿病)，青少年肌炎，川崎综合征，瘢痕疙瘩，Lambert-Eaton综合征，白细胞碎裂性血管炎，扁平苔藓，苔癣硬化症，木质结膜炎，线性IgA病，狼疮(SLE)，莱姆病，纵隔纤维化，美尼尔氏病，显微镜下多血管炎，混合结缔组织病(MCTD)，Mooren溃疡，Mucha-Habermann病，多发性硬化(MS)，重症肌无力，骨髓纤维化，肌炎，发作性睡病，新生儿期起病多系统炎性疾病，肾源性系统性纤维化，视神经脊髓炎(Devic's)，嗜中性粒细胞减少症，非酒精性脂肪肝疾病，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，眼瘢痕性类天疱疮，视神经炎，复发性风湿病，副肿瘤性小脑变性，阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)，Parry Romberg综合征，睫状体扁平部炎(周围性葡萄膜炎)，Parsonnage-Turner综合征，与链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神疾病(PANDAS)，天疱疮，周围神经病变，周围性脑脊髓炎，恶性贫血，佩罗尼氏病，POEMS综合征，结节性多动脉炎，风湿性多肌痛，多发性肌炎，心肌梗塞后综合征，心包切开术后综合征，原发性胆汁性肝硬化，原发性硬化性胆管炎，孕酮性皮炎，进行性大规模纤维化，牛皮癣，牛皮癣性关节炎，纯红细胞发育不全，坏疽性脓皮病，雷诺现象，反应性关节炎，反射交感性营养不良，Reiter综合征，复发性多发性软骨炎，不安腿综合征，腹膜后纤维化，风湿热，类风湿性关节炎，结节病，施密特综合征，巩膜炎，硬皮病，干燥综合征，精子和睾丸自身免疫性，僵人综合征，亚急性细菌性心内膜炎，Susac综合征，交感性眼炎，系统性红斑狼疮(SLE)，Takayasu动脉炎，颞动脉炎，血小板减少性紫癜(TTP)，Tolosa-Hunt综合征，横贯性脊髓炎，肿瘤坏死因子受体相关的周期性综合征，1型糖尿病，I型自身免疫性多腺综合征，II型自身免疫性多腺综合征，III型自身免疫性多腺综合征，溃疡性结肠炎，未分化的结缔组织病，葡萄膜炎，血管炎，水疱性皮肤病，白癜风，韦格纳肉芽肿病(现称为肉芽肿伴多血管炎(GPA))。
61.权利要求49-60中任一项的方法，其中所述另外的物质包括bFGF、EGF、IGF-I、PDGF或其组合。
62.权利要求49-61中任一项的方法，其中所述自身免疫或炎性病况是关节炎。
63.一种产生用于细胞疗法的调节性T细胞群的方法，其包括将包含活化的成纤维细胞和任选地一种或多种另外的物质的组合物暴露于CD25+T调节细胞的步骤。
64.权利要求63的方法，其中所述活化的成纤维细胞已暴露于IFN-γ。
65.权利要求63或64的方法，其中所述暴露步骤在离体培养中或在体内进行。
66.权利要求63-65中任一项的方法，其中所述CD25+T调节细胞分离自胸腺、外周血、脐带血、G-CSF动员的外周血、脂肪组织和胎盘或其组合。
67.权利要求63-66中任一项的方法，其中培养物中成纤维细胞与T细胞的比率包括1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1。
68.权利要求63-67中任一项的方法，其中所述另外的物质包括CD3配体、CD28配体、雷帕霉素、IL-10、TGF-β、IL-2或其组合。
69.权利要求63-68中任一项的方法，其中所述一种或多种另外的物质可溶于所述组合物中。
70.权利要求63-68中任一项的方法，其中在所述组合物中，一种或多种另外的物质附着于所述成纤维细胞的表面。
71.权利要求63-68中任一项的方法，其中在所述组合物中，一种或多种另外的物质固定在珠子上。
72.权利要求63-68中任一项的方法，其中在所述组合物中，一种或多种另外的物质可以固定在工程改造的细胞的表面上。
73.权利要求63-72中任一项的方法，其中在所述组合物中，一种或多种另外的物质由所述成纤维细胞表达。
74.权利要求73的方法，其中所述一种或多种另外的物质包括IL-2和/或IL-12。
75.权利要求63-74中任一项的方法，其中所述CD25+T调节细胞来源于同种异体的幼稚CD4+T细胞。
76.权利要求63-75中任一项的方法，其中所述另外的物质包括富含人血小板的血浆。
77.权利要求63-76中任一项的方法，其中所述调节性T细胞的群体在选择下保持在培养物中。
78.权利要求77的方法，其中培养物中的调节性T细胞被选择为具有约7-12μm的直径。
79.权利要求63-78中任一项的方法，其中所述另外的物质包括雷帕霉素、IL-2、IL-10、TGF-β或其组合。
80.权利要求63-79中任一项的方法，其中所述调节性T细胞群的至少一部分在合适的条件下存储。
81.权利要求63-80中任一项的方法，其中将有效量的调节性T细胞施用至个体以治疗自身免疫或炎性病况。
82.权利要求81的方法，其中所述自身免疫或炎性病况包括急性弥散性脑脊髓炎，急性坏死性出血性白质脑炎，艾迪生氏病，粘连性囊炎，无丙种球蛋白血症，斑秃，淀粉样变性病，强直性脊柱炎，抗GBM肾炎，抗磷脂综合征(APS)，抗TBM肾炎，节肢纤维化，心房纤维化，自身免疫性血管水肿，自身免疫性再生障碍性贫血，自身免疫性自主神经功能异常，自身免疫性肝炎，自身免疫性高脂血症，自身免疫性免疫缺陷，自身免疫性内耳疾病(AIED)，自身免疫性心肌炎，自身免疫性嗜中性粒细胞减少症，自身免疫性卵巢炎，自身免疫性胰腺炎，自身免疫性视网膜病，自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)，自身免疫性甲状腺疾病，自身免疫性荨麻疹，轴突和神经元神经病，巴洛氏病，贝塞特氏病，良性粘膜性类天疱疮，大疱性类天疱疮，心肌病，Castleman病，乳糜泻，查加斯病，慢性疲劳综合征，慢性炎性脱髓磷脂性多发性神经病(CIDP)，慢性莱姆病，慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)，Churg-Strauss综合征，瘢痕性类天疱疮，肝硬化，Cogans综合征，冷凝集素病，先天性心脏传导阻滞，柯萨奇心肌炎，CREST病，克罗恩病，囊性纤维化，白介素-1受体拮抗剂缺乏，脱髓磷脂性神经病，疱疹样皮炎，皮肌炎，德维克氏病(视神经脊髓炎)，盘状狼疮，德莱瑟氏综合征，多普特氏挛缩症，子宫内膜异位，心内膜心肌纤维化，嗜酸性食管炎，嗜酸性筋膜炎，结节性红斑，原发性混合性冷球蛋白血症，埃文斯综合征，实验性变应性脑脊髓炎，家族性地中海热，纤维肌痛，纤维化肺泡炎，巨细胞动脉炎(颞动脉炎)，巨细胞心肌炎，肾小球肾炎，血管球性肾炎，Goodpasture综合征，移植物抗宿主病(GVHD)，肉芽肿伴多血管炎，格雷夫斯病，格林-巴利综合征，桥本脑炎，桥本甲状腺炎，溶血性贫血，Henoch-Schonlein紫癜，肝炎，妊娠疱疹，低丙球蛋白血症，特发性肺纤维化，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，IgA肾病，IgG4相关硬化性疾病，免疫调节脂蛋白，包涵体肌炎，炎症性肠病，间质性膀胱炎，青少年关节炎，青少年糖尿病(1型糖尿病)，青少年肌炎，川崎综合征，瘢痕疙瘩，Lambert-Eaton综合征，白细胞碎裂性血管炎，扁平苔藓，苔癣硬化症，木质结膜炎，线性IgA病，狼疮(SLE)，莱姆病，纵隔纤维化，美尼尔氏病，显微镜下多血管炎，混合结缔组织病(MCTD)，Mooren溃疡，Mucha-Habermann病，多发性硬化(MS)，重症肌无力，骨髓纤维化，肌炎，发作性睡病，新生儿期起病多系统炎性疾病，肾源性系统性纤维化，视神经脊髓炎(Devic's)，嗜中性粒细胞减少症，非酒精性脂肪肝疾病，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，眼瘢痕性类天疱疮，视神经炎，复发性风湿病，副肿瘤性小脑变性，阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)，Parry Romberg综合征，睫状体扁平部炎(周围性葡萄膜炎)，Parsonnage-Turner综合征，与链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神疾病(PANDAS)，天疱疮，周围神经病变，周围性脑脊髓炎，恶性贫血，佩罗尼氏病，POEMS综合征，结节性多动脉炎，风湿性多肌痛，多发性肌炎，心肌梗塞后综合征，心包切开术后综合征，原发性胆汁性肝硬化，原发性硬化性胆管炎，孕酮性皮炎，进行性大规模纤维化，牛皮癣，牛皮癣性关节炎，纯红细胞发育不全，坏疽性脓皮病，雷诺现象，反应性关节炎，反射交感性营养不良，Reiter综合征，复发性多发性软骨炎，不安腿综合征，腹膜后纤维化，风湿热，类风湿性关节炎，结节病，施密特综合征，巩膜炎，硬皮病，干燥综合征，精子和睾丸自身免疫性，僵人综合征，亚急性细菌性心内膜炎，Susac综合征，交感性眼炎，系统性红斑狼疮(SLE)，Takayasu动脉炎，颞动脉炎，血小板减少性紫癜(TTP)，Tolosa-Hunt综合征，横贯性脊髓炎，肿瘤坏死因子受体相关的周期性综合征，1型糖尿病，I型自身免疫性多腺综合征，II型自身免疫性多腺综合征，III型自身免疫性多腺综合征，溃疡性结肠炎，未分化的结缔组织病，葡萄膜炎，血管炎，水疱性皮肤病，白癜风，韦格纳肉芽肿病(现称为肉芽肿伴多血管炎(GPA))。
83.权利要求63-82中任一项的方法，其中将调节性T细胞与有效量的一种或多种另外的免疫调节细胞一起施用至个体。
84.权利要求63-83中任一项的方法，其中将调节性T细胞与一种或多种免疫调节剂一起施用至个体。
85.权利要求84的方法，其中所述一种或多种免疫调节剂是肌苷、FAS配体、IL-2R、IL-1Ra、IL-2、IL-4、IL-8、IL-10、IL-20、IL-35、HLA-G、PD-L1、I-309、IDO、iNOS、CD200、半乳凝素3、sCR1、精氨酸酶、PGE-2、阿司匹林、阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀、匹伐他汀、正乙酰半胱氨酸、雷帕霉素、IVIG、纳曲酮、TGF-β、VEGF、PDGF、CTLA-4、抗CD45RB抗体、羟氯喹、来氟米特、金诺芬、双氰金、柳氮磺吡啶、氨甲蝶呤、糖皮质激素、依那西普、阿达木单抗、阿巴西普、阿那白滞素、赛妥珠单抗、依那西普-szzs、戈利木单抗、英夫利昔单抗、利妥昔单抗、托珠单抗、环孢霉素、IFN-γ、依维莫司、雷帕霉素或其组合。
86.权利要求63-85中任一项的方法，其中接受调节性T细胞的个体正在经受、已经受和/或将经受所述个体的微生物组的调节。
87.权利要求86的方法，其中所述微生物组由包含一种或多种益生元和/或一种或多种益生菌的组合物调节。
88.权利要求87的方法，其中所述益生元包含选自以下的单体或聚合物：阿拉伯木聚糖、木糖、可溶性纤维葡聚糖、可溶性玉米纤维、聚葡萄糖、乳糖、N-乙酰基-乳糖胺、葡萄糖、半乳糖、果糖、鼠李糖、甘露糖、糖醛酸、3'-岩藻糖基乳糖、3'唾液乳糖、6'-唾液乳糖、乳糖-N-新四糖、2'-2'-岩藻糖基乳糖、阿拉伯糖、果糖、岩藻糖、乳糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、D-木糖、木糖醇、核糖、木二糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、乳果糖、海藻糖、纤维二糖及其组合。
89.权利要求87或88的组合物，其中所述组合物包含不超过1种、不超过2种、不超过3种、不超过4种、不超过5种、不超过6种、不超过7种、大于8种、不超过9种、不超过10种、不超过11种、不超过12种、不超过13种、不超过14种、不超过15种、不超过16种、不超过17种、不超过18种、不超过19种、不超过20种、不超过25种、不超过30种或不超过35种类型的益生元。
90.权利要求87或88的组合物，其中所述组合物包含1至35、1至30、1至25、1至20、1至10、2至10、3至10、4至10、5至10、6至10、7至10、8至10、9至10、1至9、2至9、3至9、4至9、5至9、6至9、7至9、8至9、1至8、2至8、3至8、4至8、5至8、6至8、7至8、1至7、2至7、3至7、4至7、5至7、6至7、1至6、2至6、3至6、4至6、5至6；1至5、2至5、3至5、4至5、1至4、2至4、3至4、1至3、2至3、1至2或1种类型的益生元。
91.权利要求87-90中任一项的组合物，其中所述组合物包含一种类型的益生元，其存在的量是存在于所述组合物中的任何其他类型的益生元的至少2、5、10、50、100倍或大于100倍。
92.权利要求87-91中任一项的组合物，其中所述组合物中的益生元以以下浓度存在：至少1μM,或至少2μM,或至少3μM,或至少4μM,或至少5μM,或至少6μM,或至少7μM,或至少8μM,或至少9μM,或至少10μM,或至少20μM,或至少30μM,或至少40μM,或至少50μM,或至少60μM,或至少70μM,或至少80μM,或至少90μM,或至少100μM,或至少150μM,或至少200μM,或至少250μM,或至少300μM,或至少350μM,或至少400μM,或至少450μM,或至少500μM,或至少550μM,或至少600μM,或至少650μM,或至少700μM,或至少750μM,或至少800μM,或至少850μM,或至少900μM,或至少950μM,或至少1mM,或至少2mM,或至少3mM,或至少4mM,或至少5mM,或至少6mM,或至少7mM,或至少8mM,或至少9mM,或至少10mM。
93.权利要求87-92中任一项的方法，其中所述益生菌包括罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)。
94.权利要求87-93中任一项的方法，其中所述益生菌包括Acetanaerobacterium,醋酸弧菌属,环脂酸芽孢杆菌属,嗜碱菌属,Anaerofustis,Anaerosporobacter,Anaerostipes,Anaerotruncus,无氧芽孢杆菌属,芽孢杆菌属,类杆菌属,Blautia,短螺菌属,芽孢杆菌,Bryantella,Bulleidia,Butyricicoccus,丁酸弧菌属,Catenibacterium,衣原体目,梭菌科,梭菌目,梭菌属,Collinsella,粪芽孢菌属,粪球菌属,考克斯体属,脱铁杆菌纲,Desulfitobacterium,脱硫肠状菌属,Dorea,Eggerthella,丹毒丝菌属,丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae),Ethanoligenens,真细菌属,粪杆菌属,产线菌属,Flavonifractor,Flexistipes,Fulvimonas,梭杆菌属,Gemmiger,土芽孢杆菌属,粘杆菌属,Holdemania,产氢厌氧杆菌属(Hydrogenoanaerobacterium),考克氏菌属,Lachnobacterium,毛螺菌属,毛螺菌科,乳杆菌属,Lactonifactor,钩端螺旋体属,Lutispora,赖氨酸芽孢杆菌属,柔膜体纲,穆尔氏菌属,诺卡尔菌属,颤杆菌属(Oscillibacter),颤螺菌属,类芽孢杆菌属,Papillibacter,Pseudoflavonifractor,Robinsoniella,Roseburia,瘤胃球菌科,瘤胃球菌属,糖单胞菌属,八叠球菌,Solobacterium,Sporobacter,芽孢乳杆菌属,链霉菌属,Subdoligranulum,苏特拉菌属,互营球菌属,好热厌氧杆菌属,温双岐菌属,Turicibacter,醋丝菌属,兼性芽孢杆菌属,Ammonifex,厌氧杆菌属,热解纤维素菌属,喜热菌属,Candidatus,Carboxydibrachium,Carboxydothermus,Cohnella,Dendrosporobacter Desulfitobacterium,Desulfosporosinus,盐拟杆菌属,太阳杆菌属,嗜日菌属,Heliorestis,Lachnoanaerobaculum,大洋芽孢杆菌属,Orenia(S.),嗜草酸菌属,产醋杆菌属,Pelospora,Pelotomaculum,Propionispora,孢盐杆菌属,鼠孢菌属,芽孢八叠球菌属,Sporotomaculum,Symbiobacterium,Syntrophobotulus,Syntrophospora,土地芽孢杆菌属,Thermosinus或其组合。
95.权利要求87-94中任一项的方法，其中所述组合物可以包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：不超过1、不超过2、不超过3、不超过4、不超过5、不超过6、不超过7、不超过8、不超过9、不超过10、不超过11、不超过12、不超过13、不超过14、不超过15、不超过16、不超过17、不超过18、不超过19、不超过20、不超过50或不超过100种类型的益生菌。
96.权利要求87-94中任一项的方法，其中所述组合物可以包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：1至100、1至50、或1至20、或1至10、2至10、3至10、4至10、5至10、6至10、7至10、8至10、或9至10、或1至9、2至9、3至9、4至9、5至9、6至9、7至9、或8至9、或1至8、2至8、3至8、4至8、5至8、6至8、或7至8、或1至7、2至7、3至7、4至7、5至7、或6至7、或1至6、2至6、3至6、4至6、或5至6；或1至5、2至5、3至5、或4至5、或1至4、2至4、3至4、1至3、2至3、1至2或1种类型的益生菌。
97.权利要求87-96中任一项的方法，其中所述组合物包含一种类型的益生菌或由其组成或基本上由其组成，所述益生菌的存在的量是存在于所述组合物中的任何其他类型的益生菌的至少2、5、10、50、100倍或大于100倍。
98.权利要求87-97中任一项的方法，其中在所述组合物中，大多数益生菌是罗伊氏乳杆菌。
99.权利要求87-98中任一项的方法，其中在所述组合物中，罗伊氏乳杆菌为组合物中至少25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或大于99％的益生菌。
100.权利要求87-99中任一项的方法，其中所述组合物中益生菌的相对存在表示为第一类型的益生菌与第二类型的益生菌的比率，所述比率包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:25；1:50；1:75、1:100、1:200、1:500、1:1000、1:10,000、1:100,000或大于1:100,000。
101.权利要求87-100中任一项的方法，其中给定益生菌的浓度或聚集组合物的浓度包括每克组合物1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015或大于1×1015个的活益生菌。
102.一种治疗个体的肝功能衰竭的方法，包括对所述个体施用有效量的细胞群的步骤，其中所述细胞群是已暴露于以下的成纤维细胞群：免疫细胞；间充质干细胞，CD34+细胞；非常小的胚胎样干细胞；睾丸支持细胞或其混合物。
103.权利要求102的方法，其中所述免疫细胞是同种异体PBMC；T调节细胞；2型单核细胞；CD5阳性B细胞；2型NKT细胞；致耐受性树突状细胞；γδT细胞；具有免疫调节特性的T细胞；或其混合物。
104.权利要求102或103的方法，其中所述细胞群中的细胞具有一种或多种肝再生因子的增强的产生。
105.权利要求104的方法，其中所述肝再生因子是肝细胞生长因子。
106.权利要求102-105中任一项的方法，其中所述细胞群中的细胞具有增强的增加肝脏中卵圆细胞增殖的能力。
107.权利要求103的方法，其中所述PBMC是脐带血单核细胞。
108.权利要求102-107中任一项的方法，其中在暴露于成纤维细胞群之前，用免疫调节剂处理免疫细胞。
109.权利要求108的方法，其中所述用免疫调节剂处理免疫细胞是在足以使免疫细胞抑制活化的T细胞的增殖的条件下进行的。
110.权利要求108或109的方法，其中所述用免疫调节剂处理免疫细胞是在足以使免疫细胞抑制活化的T细胞的干扰素γ产生的条件下进行的。
111.权利要求108-110中任一项的方法，其中所述免疫调节剂选自IL-4、IL-10、IL-13、IL-20、TGF-β、CXCL12、抑制素、VEGF、PGE-2及其组合。
112.权利要求102-111中任一项的方法，其中所述间充质干细胞来源于选自以下的组织：a)脐带胶质；b)骨髓；c)外周血；d)动员的外周血；e)子宫内膜；f)毛囊；g)乳牙；h)睾丸；i)脂肪组织；j)皮肤；k)羊水；l)脐带血；m)网膜；n)肌肉；o)羊膜；o)室周液；p)胎盘组织；和q)其混合物。
113.权利要求102-112中任一项的方法，其中所述间充质干细胞表达选自以下的一种或多种标志物：STRO-1、CD90、CD73、CD105、CD54、CD106、HLA-I标志物、波形蛋白、ASMA、胶原蛋白-1、纤连蛋白、LFA-3、ICAM-1、PECAM-1、P-选择素、L-选择素、CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD61、CD18、CD29、血栓调节蛋白、端粒酶、CD10、CD13、STRO-2、VCAM-1、CD146、THY-1及其组合。
114.权利要求102-113中任一项的方法，其中所述间充质干细胞不表达实质水平的HLA-DR、CD117、CD45或其组合。
115.权利要求102-114中任一项的方法，其中所述间充质干细胞是从多能干细胞产生的。
116.权利要求115的方法，其中所述多能干细胞选自：a)胚胎干细胞；和b)诱导性多能干细胞；c)孤雌生殖干细胞；d)来源于体细胞核转移的干细胞；及其混合物。
117.权利要求116的方法，其中所述胚胎干细胞表达选自以下的基因：阶段特异性胚胎抗原(SSEA)3、SSEA 4、Tra-1-60和Tra-1-81、Oct-3/4、Cripto、胃泌素释放肽(GRP)受体、足细胞标志蛋白样蛋白(PODXL)、Rex-1、GCTM-2、Nanog、人端粒酶逆转录酶(hTERT)及其组合。
118.权利要求116的方法，其中所述诱导性多能干细胞具有选自以下的标志物：CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、PD-L2和HLA-A、B、C，并且其中所述诱导性多能干细胞具有在培养中经历至少约40次倍增同时在传代时保持正常核型的能力。
119.权利要求116的方法，其中通过添加钙通量诱导剂以活化卵母细胞然后富集表达选自SSEA-4、TRA 1-60、TRA 1-81及其组合的标志物的细胞来产生所述孤雌生殖干细胞。
120.权利要求116的方法，其中所述来源于体细胞核转移的干细胞包含：a)SSEA-1阴性的表型；b)SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81和/或碱性磷酸酶阳性的表型；或c)两者。
121.权利要求102-120中任一项的方法，其中所述间充质干细胞通过在SMAD-2/3途径的一种或多种抑制剂的存在下培养而从多能干细胞来源分化。
122.权利要求121的方法，其中所述抑制剂是核酸。
123.权利要求122的方法，其中所述核酸抑制剂选自：a)反义寡核苷酸；和b)发夹环短干扰RNA；c)化学合成的短干扰RNA分子；d)锤头状核酶；和e)其组合或混合物。
124.权利要求121的方法，其中所述SMAD-2/3途径的抑制剂是小分子抑制剂。
125.权利要求124的方法，其中所述小分子抑制剂是SB-431542。
126.权利要求102-125中任一项的方法，其中使用选择过程来富集成纤维细胞群已暴露于的细胞。
127.权利要求126的方法，其中在将所述成纤维细胞暴露于间充质干细胞之前，所述间充质干细胞已经受选择过程以富集从多能干细胞群中分化的间充质干细胞。
128.权利要求127的方法，其中选择过程阳性地选择表达与间充质干细胞相关的一种或多种标志物的细胞。
129.权利要求128的方法，其中所述标志物选自STRO-1、CD90、CD73、CD105、CD54、CD106、HLA-1标志物、波形蛋白、ASMA、胶原蛋白-1、纤连蛋白、LFA-3、ICAM-1、PECAM-1、P-选择素、L-选择素、CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD61、CD18、CD29、血栓调节蛋白、端粒酶、CD10、CD13、STRO-2、VCAM-1、CD146、THY-1及其组合。
130.权利要求102-129中任一项的方法，其中所述成纤维细胞所暴露于的细胞是表现出增强的免疫调节活性的间充质干细胞。
131.权利要求130的方法，其中通过暴露于在所述间充质干细胞中诱导应激反应的一种或多种物质来诱导增强的免疫调节活性。
132.权利要求130或131的方法，其中所述免疫调节活性是抑制肝星状细胞活化的能力；抑制肝纤维化的能力；刺激肝再生的能力；和/或增强卵圆细胞或肝祖细胞活性的能力。
133.权利要求132的方法，其中星状细胞活性的抑制与肝纤维化的减少相关。
134.权利要求132-133中任一项的方法，其中所述肝再生包括损伤后肝组织生长的起始或增殖阶段的刺激。
135.权利要求102-134中任一项的方法，其中所述细胞群中的细胞具有增强的增加肝中卵圆细胞增殖的能力，并且其中所述卵圆细胞或肝祖细胞在肝细胞响应损伤或损坏而停止增殖的条件下产生新的肝组织。
136.权利要求131的方法，其中能够诱导应激反应的所述物质的特征在于在所述间充质干细胞中诱导与选自以下的一种或多种因子的基线相比超过15％的转录上调的能力：a)核因子κB(NF-kB)；b)缺氧诱导因子α(HIF-1α)，c)血红素氧合酶-1(HO-1)；d)吲哚胺2,3脱氧酶；e)热激蛋白65(hsp-65)；和f)其组合。
137.权利要求131或136的方法，其中能够诱导应激反应的所述物质选自：a)干扰素γ；b)IVIG；c)单核细胞条件培养基；d)来自嗜中性粒细胞胞外陷阱暴露的外周血单核细胞的上清液；e)与单核细胞共培养；f)与经IVIG预处理的单核细胞共培养；g)与T细胞共培养；h)与已暴露于T细胞刺激的T细胞共培养；i)与NK细胞共培养；j)从革兰氏阳性细菌分离的肽聚糖；k)从革兰氏阳性菌分离的脂磷壁酸；l)从革兰氏阳性细菌分离的脂蛋白；m)从分枝杆菌分离的脂阿拉伯糖甘露聚糖，n)从酵母细胞壁分离的酵母聚糖；o)聚腺苷酸-多尿苷酸；p)聚(IC)；q)脂多糖；r)单磷酰基脂质A；s)鞭毛蛋白；t)嘎德莫特；u)咪喹莫特；v)R848；w)含有CpG基序的寡核苷；x)23S核糖体RNA；和y)其组合。
138.权利要求102-137中任一项的方法，其中所述间充质干细胞选自：a)脂肪来源的间充质干细胞；b)骨髓间充质干细胞；c)脐带间充质干细胞；d)脐带胶质间充质干细胞；e)牙齿间充质干细胞；f)羊水间充质干细胞；g)胎盘间充质干细胞；h)循环血液间充质干细胞；i)毛囊间充质干细胞；和j)其组合。
139.权利要求138的方法，其中所述脂肪来源的间充质干细胞表达选自以下的一种或多种标志物：CD13、CD29、CD44、CD63、CD73、CD90、CD166、醛脱氢酶(ALDH)、ABCG2及其组合。
140.权利要求138或139的方法，其中所述脂肪来源的间充质干细胞包括从脂肪组织提取的能够在培养物中增殖超过大约1个月的纯化的单核细胞群。
141.权利要求138的方法，其中所述骨髓间充质干细胞来源于骨髓单核细胞。
142.权利要求138或141的方法，其中所述骨髓间充质干细胞是基于在暴露于分化刺激后分化成以下一种或多种细胞类型的能力而选择的：骨；软骨或脂肪组织。
143.权利要求138、141或142中任一项的方法，其中所述骨髓间充质干细胞是基于以下一种或多种抗原的表达来选择的：CD90、c-kit、flk-1、Stro-1、CD105、CD73、CD31、CD146、血管内皮钙粘蛋白、CD133和/或CXCR-4。
144.权利要求138、141、142或143中任一项的方法，其中所述骨髓间充质干细胞针对CD90和/或CD73的表达进行富集。
145.权利要求138、141、142、141、144或145中任一项的方法，其中所述骨髓间充质干细胞缺乏CD34的显著表达。
146.权利要求138的方法，其中所述胎盘间充质干细胞基于选自以下的一种或多种抗原的表达鉴定：Oct-4、Rex-1、CD9、CD13、CD29、CD44、CD166、CD90、CD105、SH-3、SH-4、TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-4Sox-2及其组合。
147.权利要求138的方法，其中所述羊水间充质干细胞通过在超声引导下将液体提取装置引入羊膜腔中分离。
148.权利要求138或147的方法，其中所述羊水间充质干细胞是基于以下一种或多种抗原的表达来选择的：SSEA3、SSEA4、Tra-1-60、Tra-1-81、Tra-2-54、HLAI类、CD13、CD44、CD49b、CD105、Oct-4、Rex-1、DAZL和/或Runx-1。
149.权利要求138、147或148中任一项的方法，其中所述羊水间充质干细胞是基于缺乏以下一种或多种抗原的表达来选择的：CD34、CD45和/或HLAII类。
150.权利要求138的方法，其中所述循环血液间充质干细胞的特征在于能够在体外增殖超过1个月。
151.权利要求138或150的方法，其中所述循环血液间充质干细胞的特征在于CD34、CXCR4、CD117、CD113和/或c-met的表达。
152.权利要求138、150或151中任一项的方法，其中所述循环血液间充质干细胞缺乏一种或多种分化相关标志物的实质性表达。
153.权利要求152的方法，其中所述分化相关标志物选自CD2、CD3、CD4、CD11、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、CD56、CD64、CD68、CD86、CD66b、HLA-DR及其组合。
154.权利要求102-153中任一项的方法，其中所述间充质干细胞表达一种或多种以下标志物：STRO-1、CD105、CD54、CD106、HLA-1标志物、波形蛋白、ASMA、胶原蛋白-1、纤连蛋白、LFA-3、ICAM-1、PECAM-1、P-选择素、L-选择素、CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD61、CD18、CD29、血栓调节蛋白、端粒酶、CD10、CD13、STRO-2、VCAM-1、CD146和/或THY-1。
155.权利要求102-154中任一项的方法，其中所述间充质干细胞不表达实质水平的HLA-DR、CD117和/或CD45。
156.权利要求138的方法，其中所述细胞是脐带胶质来源的间充质干细胞，其已用干扰素γ处理了约1小时至约160小时、约3小时至约72小时或约48小时的时间。
157.权利要求138的方法，其中所述细胞是脐带胶质来源的间充质干细胞，其已用总浓度为约20-1000IU/ml、约50-500IU/ml或约150IU/ml的干扰素γ处理过。
158.一种治疗个体的病毒诱导的肝功能衰竭的方法，包括向该个体施用有效量的已用一种或多种应激诱导刺激预先调节的成纤维细胞群。
159.权利要求158的方法，其中所述应激诱导刺激包括干扰素γ。
160.权利要求158或159的方法，其中所述应激诱导刺激包括暴露于选自以下的培养条件：a)臭氧和/或臭氧化的培养基；b)过氧化氢；c)小于7、6、5、4、3或2的pH；和d)其组合。
161.权利要求158-160中任一项的方法，其中所述成纤维细胞已暴露于免疫活性细胞。
162.权利要求161的方法，其中向所述个体同时施用成纤维细胞和免疫活性细胞。
163.权利要求161或162的方法，其中所述免疫活性细胞是单核细胞。
164.权利要求163的方法，其中所述单核细胞已分化成M2巨噬细胞。
165.权利要求164的方法，其中所述M2巨噬细胞是通过在白介素4中在将单核细胞的精氨酸酶的产量增加到未经白介素4处理的单核细胞产生的基线的超过50％的条件下培养单核细胞产生的。
166.一种产生血管生成性巨噬细胞的方法，包括以下步骤：a)获得单核细胞和/或单核细胞祖细胞；b)在赋予所述单核细胞和/或单核细胞祖细胞刺激血管生成的能力的条件下，使所述单核细胞和/或单核细胞祖细胞与成纤维细胞接触。
167.权利要求166的方法，其中所述单核细胞和/或单核细胞祖细胞具有以下特征中的一种或多种：(a)来源于外周血单核细胞；(b)表达CD14、CD16、CD11b中的一种或多种；CD14、CD16(c)是塑料粘附的；(d)是骨髓祖细胞；(e)来源于骨髓；和/或(f)来源于动员的外周血。
168.权利要求167的方法，其中所述动员的外周血是通过用G-CSF、flt-3配体和/或普乐沙福中的一种或多种预处理个体而产生的。
169.权利要求166-168中任一项的方法，其中所述成纤维细胞在适于成纤维细胞增殖的培养基中培养。
170.权利要求169的方法，其中所述培养基包括一种或多种促有丝分裂因子。
171.权利要求170的方法，其中所述促有丝分裂因子选自：a)FGF-1；b)FGF-2；c)FGF-5；d)EGF；e)CNTF；f)KGF-1；g)PDGF；h)富含血小板的血浆；i)TGF-α；j)HGF-1；和k)其组合。
172.权利要求166-171中任一项的方法，其中所述成纤维细胞在缺氧条件下培养。
173.权利要求166-172中任一项的方法，其中所述成纤维细胞用一种或多种炎性刺激处理。
174.权利要求173的方法，其中所述炎性刺激包括一种或多种炎性细胞因子。
175.权利要求174的方法，其中所述炎性细胞因子选自TNF-α、IL-1、IL-6、IL-11、IL-12、IL-17、IL-18、IL-21、IL-33及其组合。
176.权利要求174或175的方法，其中所述炎性细胞因子能够刺激成纤维细胞中选自以下的基因的表达：IL-6，肌球蛋白1，IL-33，低氧诱导因子-1，鸟苷酸结合蛋白同种型I，氨基酮戊酸δ合酶2，AMP脱氨酶，IL-17，DNAJ样2蛋白，组织蛋白酶L，转录因子20，M31724，苯烷胺结合蛋白；HEC，GA17，芳基硫酸酯酶D基因，芳基硫酸酯酶E基因，细胞周期素蛋白基因，血小板原碱性蛋白基因，PDGFRA，人STS WI-12000，甘露糖苷酶，βA，溶酶体MANBA基因，UBE2D3基因，Igγ重链的人DNA，STRL22，BHMT，智人唐氏综合征关键区域，含有ZNF基因家族成员的FI5613，IL8，ELFR，双特异性磷酸酶MKP-5的智人mRNA，G蛋白信号传导的智人调节剂10完整mRNA，智人Wnt-13 Mma，智人N末端乙酰基转移酶复合物ard1亚基，核糖体蛋白L15 mRNA，PCNA mRNA，ATRM基因外显子21，无毛蛋白外显子2的HR基因，N端乙酰基转移酶复合物ard 1亚基，HSM801431智人mRNA，CDNA DKFZp434N2072，RPL26，和无毛蛋白的HR基因，G蛋白信号传导的调节剂。
177.权利要求166-176中任一项的方法，其中所述单核细胞和/或单核细胞祖细胞与所述成纤维细胞以以下比率进行培养：1个单核细胞和/或单核细胞祖细胞比100个成纤维细胞的比率；1个单核细胞和/或单核祖细胞比10个成纤维细胞的比率；1个单核细胞和/或单核祖细胞比10个成纤维细胞的比率；或1个单核细胞和/或单核祖细胞比1个成纤维细胞的比率。
178.权利要求166-177中任一项的方法，其中将所述单核细胞和/或单核祖细胞与所述成纤维细胞一起培养1小时至7天的时间；12小时至5天的时间；或1至3天的时间。
179.权利要求166-178中任一项的方法，其中所述单核细胞和/或单核细胞祖细胞与所述成纤维细胞在选自以下的培养基中培养：Roswell Park Memorial Institute(RPMI-1640)、Dublecco改良的基础培养基(DMEM)、Dublecco改良的低葡萄糖基础培养基(DMEM-LG)、Eagle改良的基础培养基(EMEM)、Optimem、Iscove培养基或其组合。
180.权利要求179的方法，其中所述培养基补充有一种或多种生长因子，所述生长因子选自富含人血小板的血浆、血小板裂解物、脐带血血清、自体血清、人血清、血清替代物或其组合。
181.权利要求166-179中任一项的方法，其中所述血管生成巨噬细胞能够刺激新血管的生长。
182.权利要求166-181中任一项的方法，其中所述血管生成巨噬细胞是M2巨噬细胞。
183.权利要求166-182中任一项的方法，其中所述巨噬细胞表达IL-33。
184.一种治疗个体的缺血性病况的方法，其包括以下步骤：向所述个体施用包含治疗有效量的经受IFN-γ或PGE-2以及任选地一种或多种另外的物质和/或条件的细胞的组合物的步骤。
185.权利要求184的方法，其中所述另外的物质包括一种或多种免疫调节剂。
186.权利要求185的方法，其中所述免疫调节剂包括FAS配体、IL-2R、IL-1Ra、IL-2、IL-4、IL-8、IL-10、IL-20、IL-35、HLA-G、PD-L1、I-309、IDO、iNOS、CD200、半乳凝素3、sCR1、精氨酸酶、阿司匹林、阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀、匹伐他汀、正乙酰半胱氨酸、雷帕霉素IVIG、纳曲酮、TGF-β、VEGF、PDGF、CTLA-4、抗CD45RB抗体、羟氯喹、来氟米特、金诺芬、双氰金、柳氮磺吡啶、氨甲蝶呤、糖皮质激素、依那西普、阿达木单抗、阿巴西普、阿那白滞素、赛妥珠单抗、依那西普-szzs、戈利木单抗、英夫利昔单抗、利妥昔单抗、托珠单抗、环孢霉素、IFN-γ、依维莫司、雷帕霉素或其组合。
187.权利要求184-186中任一项的方法，其中所述细胞被修饰以重组表达一种或多种免疫调节剂。
188.权利要求187的方法，其中免疫调节剂包括FAS配体、IL-2R、IL-1Ra、IL-2、IL-4、IL-8、IL-10、IL-20、IL-35、HLA-G、PD-L1、I-309、IDO、iNOS、CD200、半乳凝素3、sCR1、精氨酸酶、PGE-2、阿司匹林、阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀、匹伐他汀、正乙酰半胱氨酸、雷帕霉素IVIG、纳曲酮、TGF-β、VEGF、PDGF、CTLA-4、抗CD45RB抗体、羟氯喹、来氟米特、金诺芬、双氰金、柳氮磺吡啶、氨甲蝶呤、糖皮质激素、依那西普、阿达木单抗、阿巴西普、阿那白滞素、赛妥珠单抗、依那西普-szzs、戈利木单抗、英夫利昔单抗、利妥昔单抗、托珠单抗、环孢霉素、IFN-γ、依维莫司、雷帕霉素或其组合。
189.权利要求187或188的方法，其中所述一种或多种免疫调节剂的表达由组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或其组合调节。
190.权利要求184-189中任一项的方法，其中所述个体需要血管生成治疗。
191.权利要求184-190中任一项的方法，其中所述一种或多种另外的物质是一种或多种血管生成剂。
192.权利要求191的方法，其中所述细胞被修饰以重组表达一种或多种血管生成剂。
193.权利要求192的方法，其中所述一种或多种血管生成剂的表达由组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子调节。
194.权利要求191-193中任一项的方法，其中所述血管生成剂是VEGF、FGF-1、FGF-2、血管生成素、HIF-1-α或其组合。
195.权利要求184-194中任一项的方法，其中所述另外的物质包括富含人血小板的血浆、血小板裂解物、脐带血血清、自体血清、人血清、血清替代物或其组合。
196.一种诱导树突状细胞成熟的方法，包括将未成熟的树突状细胞暴露于应激的成纤维细胞的步骤。
197.权利要求196的方法，其中将所述应激的成纤维细胞暴露于高热、血清剥夺或两者中。
198.权利要求197的方法，其中所述高热暴露导致所述成纤维细胞中一种或多种热激因子的表达。
199.权利要求198的方法，其中所述热激因子是热激蛋白90。
200.权利要求197-199中任一项的方法，其中所述高热包括39-42摄氏度的温度。
201.权利要求197-200中任一项的方法，其中所述高热持续时间为1-8小时。
202.权利要求197-201中任一项的方法，其中所述血清剥夺持续12-48小时。
203.权利要求197-202中任一项的方法，其中通过所述方法产生的成熟树突状细胞是髓样树突状细胞或淋巴样树突状细胞。
204.权利要求203的方法，其中所述未成熟的髓样树突状细胞表达高水平的CD83、IL-10或两者。
205.权利要求203或204的方法，其中所述未成熟的髓样树突状细胞表达低水平的IL-12、CD40、CD80、CD86或其组合。
206.权利要求196-205中任一项的方法，其中所述未成熟的树突状细胞是混合淋巴细胞反应的不良刺激物、T细胞活化的不良刺激物(例如，与LPS活化的DC相比少于50％)或两者。
207.权利要求196-205中任一项的方法，其中所述未成熟的树突状细胞对于所述成纤维细胞是同种异体的。
208.权利要求196-207中任一项的方法，其中所述未成熟的树突状细胞对于所述成纤维细胞是自体的。
209.权利要求196-208中任一项的方法，其中所述未成熟的树突状细胞包括单核细胞。
210.一种增强CD8 T细胞的一种或多种活性的方法，包括将应激的成纤维细胞暴露于免疫细胞或由免疫细胞产生或获得的CD8 T细胞的步骤。
211.权利要求210的方法，包括从暴露于或已暴露于应激的成纤维细胞的免疫细胞中提取CD8 T细胞的步骤。
212.权利要求210或211的方法，其中所述一种或多种活性包括与没有暴露于应激的成纤维细胞的CD8 T细胞的相应活性相比，增强的增殖、细胞因子产生、细胞毒性和/或对共刺激分子的减少的需求。
213.权利要求212的方法，其中所述细胞因子产生包括IL-2、IL-7和/或IL-15的分泌。
214.权利要求212或213的方法，其中增殖响应于将一种或多种细胞因子施用至所述CD8 T细胞而增强。
215.权利要求214的方法，其中所述细胞因子包括IL-2、IL-7和/或IL-15。
216.权利要求212或213的方法，其中增殖响应于T细胞受体连接而增强。
217.权利要求216的方法，其中所述T细胞受体连接是通过一种或多种抗原和/或一种或多种有丝分裂原完成的。
218.权利要求212-217中任一项的方法，其中所述细胞毒性包括杀死靶细胞的能力、穿孔素产生和/或颗粒酶产生。
219.权利要求212的方法，其中对共刺激分子的减少的需求包括对CD80、CD86、CD40、IL-2、IL-21和/或CD28的连接的减少的需求。
220.权利要求210-219中任一项的方法，其中所述免疫细胞和/或CD8 T细胞被操纵以表达非内源基因产物。
221.权利要求220的方法，其中所述免疫细胞和/或CD8 T细胞被操纵以表达siRNA、嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体。
222.权利要求221的方法，其中所述siRNA靶向免疫抑制分子。
223.权利要求222的方法，其中所述免疫抑制剂分子是CTLA-4、STAT6、IL-10或PD-1。
224.权利要求221的方法，其中所述CAR靶向肿瘤抗原。
225.权利要求210-224中任一项的方法，其中所述暴露步骤在包含能够刺激T细胞增殖的一种或多种抗原的培养基中进行。
226.权利要求210-224中任一项的方法，其中所述成纤维细胞表达一种或多种非内源基因产物。
227.权利要求226的方法，其中所述成纤维细胞表达能够刺激T细胞增殖的一种或多种抗原。
228.权利要求210-227中任一项的方法，其中所述暴露步骤在包含胎牛血清、人血清、IL-2、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、TGF-β和/或TNF-α的培养基中发生。
229.权利要求1-228中任一项的方法，其中所述成纤维细胞来源于包括皮肤、心脏、血管、骨髓、骨骼肌、肝脏、胰腺、脑、脂肪组织、胎盘和/或包皮的组织。
230.权利要求1-229中任一项的方法，其中所述成纤维细胞是胎盘的、胎儿的、新生儿的或成体的或其混合物。
231.权利要求1-230中任一项的方法，其中所述成纤维细胞来源于活检，其中所述活检来自待治疗的个体或来自不同于待治疗的个体的个体。
232.权利要求1-231中任一项的方法，其中所述成纤维细胞和免疫细胞是同种异体细胞。
233.权利要求1-232中任一项的方法，其中所述成纤维细胞和免疫细胞是自体细胞。
234.权利要求5、9、31、37、39、49、56、58、64、85、184、186、188或228中任一项的方法，其中组合物中的IFN-γ分子包含1-500IU/mL,5-500IU/mL,10-500IU/mL,15-500IU/mL,20-500IU/mL,25-500IU/mL,30-500IU/mL,35-500IU/mL,40-500IU/mL,45-500IU/mL,50-500IU/mL,60-500IU/mL,70-500IU/mL,80-500IU/mL,90-500IU/mL,100-500IU/mL,150-500IU/mL,200-500IU/mL,250-500IU/mL,300-500IU/mL,350-500IU/mL,400-500IU/mL,450-500IU/mL；或0.1-450IU/mL,0.5-450IU/mL,1-450IU/mL,5-450IU/mL,10-450IU/mL,15-450IU/mL,20-450IU/mL,25-450IU/mL,30-450IU/mL,35-450IU/mL,40-450IU/mL,45-450IU/mL,50-450IU/mL,60-450IU/mL,70-450IU/mL,80-450IU/mL,90-450IU/mL,100-450IU/mL,150-450IU/mL,200-450IU/mL,250-450IU/mL,300-450IU/mL,350-450IU/mL,400-450IU/mL；或0.1-400IU/mL,0.5-400IU/mL,1-400IU/mL,5-400IU/mL,10-400IU/mL,15-400IU/mL,20-400IU/mL,25-400IU/mL,30-400IU/mL,35-400IU/mL,40-400IU/mL,45-400IU/mL,50-400IU/mL,60-400IU/mL,70-400IU/mL,80-400IU/mL,90-400IU/mL,100-400IU/mL,150-400IU/mL,200-400IU/mL,250-400IU/mL,300-400IU/mL,350-400IU/mL；或0.1-350IU/mL,0.5-350IU/mL,1-350IU/mL,5-350IU/mL,10-350IU/mL,15-350IU/mL,20-350IU/mL,25-350IU/mL,30-350IU/mL,35-350IU/mL,40-350IU/mL,45-350IU/mL,50-350IU/mL,60-350IU/mL,70-350IU/mL,80-350IU/mL,90-350IU/mL,100-350IU/mL,150-350IU/mL,200-350IU/mL,250-350IU/mL,300-350IU/mL；或0.1-300IU/mL,0.5-300IU/mL,1-300IU/mL,5-300IU/mL,10-300IU/mL,15-300IU/mL,20-300IU/mL,25-300IU/mL,30-300IU/mL,35-300IU/mL,40-300IU/mL,45-300IU/mL,50-300IU/mL,60-300IU/mL,70-300IU/mL,80-300IU/mL,90-300IU/mL,100-300IU/mL,150-300IU/mL,200-300IU/mL,250-300IU/mL；或0.1-250IU/mL,0.5-250IU/mL,1-250IU/mL,5-250IU/mL,10-250IU/mL,15-250IU/mL,20-250IU/mL,25-250IU/mL,30-250IU/mL,35-250IU/mL,40-250IU/mL,45-250IU/mL,50-250IU/mL,60-250IU/mL,70-250IU/mL,80-250IU/mL,90-250IU/mL,100-250IU/mL,150-250IU/mL,200-250IU/mL；或0.1-200IU/mL,0.5-200IU/mL,1-200IU/mL,5-200IU/mL,10-200IU/mL,15-200IU/mL,20-200IU/mL,25-200IU/mL,30-200IU/mL,35-200IU/mL,40-200IU/mL,45-200IU/mL,50-200IU/mL,60-200IU/mL,70-200IU/mL,80-200IU/mL,90-200IU/mL,100-200IU/mL,150-200IU/mL；或0.1-150IU/mL,0.5-150IU/mL,1-150IU/mL,5-150IU/mL,10-150IU/mL,15-150IU/mL,20-150IU/mL,25-150IU/mL,30-150IU/mL,35-150IU/mL,40-150IU/mL,45-150IU/mL,50-150IU/mL,60-150IU/mL,70-150IU/mL,80-150IU/mL,90-150IU/mL,100-150IU/mL；或0.1-100IU/mL,0.5-100IU/mL,1-100IU/mL,5-100IU/mL,10-100IU/mL,15-100IU/mL,20-100IU/mL,25-100IU/mL,30-100IU/mL,35-100IU/mL,40-100IU/mL,45-100IU/mL,50-100IU/mL,60-100IU/mL,70-100IU/mL,80-100IU/mL,90-100IU/mL；或0.1-90IU/mL,0.5-90IU/mL,1-90IU/mL,5-90IU/mL,10-90IU/mL,15-90IU/mL,20-90IU/mL,25-90IU/mL,30-90IU/mL,35-90IU/mL,40-90IU/mL,45-90IU/mL,50-90IU/mL,60-90IU/mL,70-90IU/mL,80-90IU/mL；或0.1-80IU/mL,0.5-80IU/mL,1-80IU/mL,5-80IU/mL,10-80IU/mL,15-80IU/mL,20-80IU/mL,25-80IU/mL,30-80IU/mL,35-80IU/mL,40-80IU/mL,45-80IU/mL,50-80IU/mL,60-80IU/mL,70-80IU/mL；或0.1-70IU/mL,0.5-70IU/mL,1-70IU/mL,5-70IU/mL,10-70IU/mL,15-70IU/mL,20-70IU/mL,25-70IU/mL,30-70IU/mL,35-70IU/mL,40-70IU/mL,45-70IU/mL,50-70IU/mL,60-70IU/mL；或0.1-60IU/mL,0.5-60IU/mL,1-60IU/mL,5-60IU/mL,10-60IU/mL,15-60IU/mL,20-60IU/mL,25-60IU/mL,30-60IU/mL,35-60IU/mL,40-60IU/mL,45-60IU/mL,50-60IU/mL；或0.1-50IU/mL,0.5-50IU/mL,1-50IU/mL,5-50IU/mL,10-50IU/mL,15-50IU/mL,20-50IU/mL,25-50IU/mL,30-50IU/mL,35-50IU/mL,40-50IU/mL,45-50IU/mL；或0.1-45IU/mL,0.5-45IU/mL,1-45IU/mL,5-45IU/mL,10-45IU/mL,15-45IU/mL,20-45IU/mL,25-45IU/mL,30-45IU/mL,35-45IU/mL,40-45IU/mL；或0.1-40IU/mL,0.5-40IU/mL,1-40IU/mL,5-40IU/mL,10-40IU/mL,15-40IU/mL,20-40IU/mL,25-40IU/mL,30-40IU/mL,35-40IU/mL；或0.1-35IU/mL,0.5-35IU/mL,1-35IU/mL,5-35IU/mL,10-35IU/mL,15-35IU/mL,20-35IU/mL,25-35IU/mL,30-35IU/mL；或0.1-30IU/mL,0.5-30IU/mL,1-30IU/mL,5-30IU/mL,10-30IU/mL,15-30IU/mL,20-30IU/mL,25-30IU/mL；或0.1-25IU/mL,0.5-25IU/mL,1-25IU/mL,5-25IU/mL,10-25IU/mL,15-25IU/mL,20-25IU/mL；或0.1-20IU/mL,0.5-20IU/mL,1-20IU/mL,5-20IU/mL,10-20IU/mL,15-20IU/mL；或0.1-15IU/mL,0.5-15IU/mL,1-15IU/mL,5-15IU/mL,10-15IU/mL；或0.1-10IU/mL,0.5-10IU/mL,1-10IU/mL,5-10IU/mL；或0.1-5IU/mL,0.5-5IU/mL,1-5IU/mL；或0.1-1IU/mL,0.5-1IU/mL；或0.1-0.5IU/mL。
235.权利要求55、9、31、37、39、49、56、58、64、85、184、186、188或228中任一项的方法，其中所述细胞经受一定时间的IFN-γ，所述时间的范围包括1小时至14天,2小时至14天,3小时至14天,4小时至14天,5小时至14天,6小时至14天,7小时至14天,8小时至14天,9小时至14天,10小时至14天,11小时至14天,12小时至14天,18小时至14天,1天至14天,2天至14天,3天至14天,4天至14天,5天至14天,6天至14天,7天至14天,8天至14天,9天至14天,10天至14天,11天至14天,12天至14天,13天至14天；或1小时至13天,2小时至13天,3小时至13天,4小时至13天,5小时至13天,6小时至13天,7小时至13天,8小时至13天,9小时至13天,10小时至13天,11小时至13天,12小时至13天,1天至13天,2天至13天,3天至13天,4天至13天,5天至13天,6天至13天,7天至13天,8天至13天,9天至13天,10天至13天,11天至13天,12天至13天；或1小时至12天,2小时至12天,3小时至12天,4小时至12天,5小时至12天,6小时至12天,7小时至12天,8小时至12天,9小时至12天,10小时至12天,11小时至12天,12小时至12天,1天至12天,2天至12天,3天至12天,4天至12天,5天至12天,6天至12天,7天至12天,8天至12天,9天至12天,10天至12天,11天至12天；或1小时至11天,2小时至11天,3小时至11天,4小时至11天,5小时至11天,6小时至11天,7小时至11天,8小时至11天,9小时至11天,10小时至11天,11小时至11天,12小时至11天,1天至11天,2天至11天,3天至11天,4天至11天,5天至11天,6天至11天,7天至11天,8天至11天,9天至11天,10天至11天11天；或1小时至10天,2小时至10天,3小时至10天,4小时至10天,5小时至10天,6小时至10天,7小时至10天,8小时至10天,9小时至10天,10小时至10天,11小时至10天,12小时至10天,1天至10天,2天至10天,3天至10天,4天至10天,5天至10天,6天至10天,7天至10天,8天至10天,9天至10天10天；或1小时至9天,2小时至9天,3小时至9天,4小时至9天,5小时至9天,6小时至9天,7小时至9天,8小时至9天,9小时至9天,10小时至9天,11小时至9天,12小时至9天,1天至9天,2天至9天,3天至9天,4天至9天,5天至9天,6天至9天,7天至9天,8天至9天9天；或1小时至8天,2小时至8天,3小时至8天,4小时至8天,5小时至8天,6小时至8天,7小时至8天,8小时至8天,9小时至8天,10小时至8天,11小时至8天,12小时至8天,1天至8天,2天至8天,3天至8天,4天至8天,5天至8天,6天至8天,7天至8天；或1小时至7天,2小时至7天,3小时至7天,4小时至7天,5小时至7天,6小时至7天,7小时至7天,8小时至7天,9小时至7天,10小时至7天,11小时至7天,12小时至7天,1天至7天,2天至7天,3天至7天,4天至7天,5天至7天,6天至7天；或1小时至6天,2小时至6天,3小时至6天,4小时至6天,5小时至6天,6小时至6天,7小时至6天,8小时至6天,9小时至6天,10小时至6天,11小时至6天,12小时至6天,1天至6天,2天至6天,3天至6天,4天至6天,5天至6天；或1小时至5天,2小时至5天,3小时至5天,4小时至5天,5小时至5天,6小时至5天,7小时至5天,8小时至5天,9小时至5天,10小时至5天,11小时至5天,12小时至5天,1天至5天,2天至5天,3天至5天,4天至5天；或1小时至4天,2小时至4天,3小时至4天,4小时至4天,5小时至4天,6小时至4天,7小时至4天,8小时至4天,9小时至4天,10小时至4天,11小时至4天,12小时至4天,1天至4天,2天至4天,3天至4天；或1小时至3天,2小时至3天,3小时至3天,4小时至3天,5小时至3天,6小时至3天,7小时至3天,8小时至3天,9小时至3天,10小时至3天,11小时至3天,12小时至3天,1天至3天,2天至3天；或1小时至2天,2小时至2天,3小时至2天,4小时至2天,5小时至2天,6小时至2天,7小时至2天,8小时至2天,9小时至2天,10小时至2天,11小时至2天,12小时至2天,1天至2天；或1小时至1天,2小时至1天,3小时至1天,4小时至1天,5小时至1天,6小时至1天,7小时至1天,8小时至1天,9小时至1天,10小时至1天,11小时至1天,12小时至1天；或1小时至12小时,2小时至12小时,3小时至12小时,4小时至12小时,5小时至12小时,6小时至12小时,7小时至12小时,8小时至12小时,9小时至12小时,10小时至12小时,11小时至12小时；或1小时至11小时,2小时至11小时,3小时至11小时,4小时至11小时,5小时至11小时,6小时至11小时,7小时至11小时,8小时至11小时,9小时至11小时,10小时至11小时；或1小时至10小时,2小时至10小时,3小时至10小时,4小时至10小时,5小时至10小时,6小时至10小时,7小时至10小时,8小时至10小时,9小时至10小时；或1小时至9小时,2小时至9小时,3小时至9小时,4小时至9小时,5小时至9小时,6小时至9小时,7小时至9小时,8小时至9小时；或1小时至8小时,2小时至8小时,3小时至8小时,4小时至8小时,5小时至8小时,6小时至8小时,7小时至8小时；或1小时至7小时,2小时至7小时,3小时至7小时,4小时至7小时,5小时至7小时,6小时至7小时；或1小时至6小时,2小时至6小时,3小时至6小时,4小时至6小时,5小时至6小时；或1小时至5小时,2小时至5小时,3小时至5小时,4小时至5小时；或1小时至4小时,2小时至4小时,3小时至4小时；或1小时至3小时,2小时至3小时；或1小时至2小时。
236.一种治疗个体中的移植物抗宿主病的方法，包括以下步骤：将有效量的成纤维细胞提供给具有细胞移植物、组织移植物或器官移植物的个体，和/或在所述移植过程中或之后向个体提供有效量的成纤维细胞。
237.权利要求236的方法，其中所述成纤维细胞是CD105阳性的。
238.权利要求236或237的方法，其中所述成纤维细胞暴露于足够量的前列腺素E2。
239.一种在有需要的个体中进行心脏再生的方法，其包括向所述个体施用有效量的成纤维细胞和单核细胞的共培养物的步骤。
240.权利要求239的方法，其中所述成纤维细胞和单核细胞已在合适的条件下与前列腺素-E2共培养。
241.权利要求239或240的方法，其中所述单核细胞是CD14阳性的。
242.权利要求239-241中任一项的方法，其中所述单核细胞是精氨酸酶阳性的。
243.权利要求239-242中任一项的方法，其中所述单核细胞和/或成纤维细胞产生VEGF、PDGF-BB和/或EGF。
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