JP2023101792A - 人工脂肪組織及びその製造方法、人工皮膚の製造方法並びに脂肪細胞の培養剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】長期間維持が可能な人工脂肪組織を提供すること及び短時間で当該人工脂肪組織を製造可能な製造方法を提供すること。長期間維持が可能な人工脂肪組織を含む人工皮膚を提供すること及び短時間で当該人工皮膚を製造可能な製造方法を提供すること。脂肪細胞の培養剤を提供すること及び上記人工皮膚を用いて化合物の皮膚透過性を評価する方法を提供すること。【解決手段】脂肪細胞を含む細胞と、断片化された細胞外マトリックスとを含む三次元組織体からなる、人工脂肪組織。【選択図】なし
Description
本発明は、人工脂肪組織及びその製造方法、人工皮膚の製造方法並びに脂肪細胞の培養剤に関する。
成熟脂肪細胞のインビトロにおける長期培養維持は、特に化粧品/医薬品アッセイ又は造形手術の分野において重要な課題の一つである。平皿上での従来の二次元培養は培養時間が短く、脂肪細胞は主に1週間後に脱分化してしまう。既存の報告では、単眼成熟脂肪細胞は1週間以上維持することができない(非特許文献1)。また、ある程度以上成熟した脂肪細胞では、その細胞内の脂肪滴の影響で培養皿から浮遊してしまう傾向にあるため、培地の交換が困難であった。
それらの課題を解決するために、三次元細胞培養技術は注目されている。WAQAR HASSANらはPEGをベースにした共重合体とヒアルロン酸で構成されるヒドロゲルに細胞をカプセル化し、培養を行っている(非特許文献2)。しかし、この方法は細胞を単離培養してしまうため、細胞同士のコンタクトが物理的に難しく、分化効率は悪い。
DAQUINAGらは、磁気ナノ粒子を基盤とする三次元立体構造カルチャーシステムによりマウス3T3-L1前脂肪細胞及びGFP発現マウス内皮細胞を用いて血管新生と脂質生成を同時にシミュレートすることを実証している。脂肪細胞と内皮細胞との共培養は、免疫染色によりきれいに見えるが、14日後の脂肪小胞は非常に小さく、成熟度が低い(非特許文献3)。
一方、脂肪細胞を含む皮膚モデルに関して、ウシI型コラーゲンヒドロゲル(3mg/mL)を用いて線維芽細胞及び脂肪幹細胞の2層構造の皮膚モデルの報告があるが、皮膚モデル構築のための培養に56日から63日と非常に長期間必要である。また、厚みもヒトの皮膚構造よりも薄い(非特許文献4)。
また、ヒト凍結血漿ヒドロゲル(1mg/mLフィブリノーゲン)に再懸濁した線維芽細胞、あるいは間葉系幹細胞と脂肪細胞の3層構造による皮膚モデルの報告もあるが、モデル構築に35日と長い培養プロセスが必要である上に、形態的にもヒトの皮膚構造を模倣できておらず、非常に薄い(非特許文献5)。
Toda S, Uchihashi K, Aoki S, et al., Organogenesis. 2009 5(2):50-56
WAQAR HASSAN ET AL., STEM CELL RESEARCH & THERAPY 2013,21;4(2):32
DAQUINAG, ET AL., TISSUE ENGINEERING. PART C, METHODS, 2013May;19(5):336-44.
TROTTIER ET AL., STEM CELLS, 2008 Oct;26 (10): 2713-23
MONFORT ET AL., J Tissue Eng Regen Med., 2013 Jun;7(6):479-90
本発明の一実施態様は、長期間維持が可能な人工脂肪組織を提供すること及び短時間で当該人工脂肪組織を製造可能な製造方法を提供することを目的とする。本発明の一実施態様は、さらに、長期間維持が可能な人工脂肪組織を含む人工皮膚を提供すること及び短時間で当該人工皮膚を製造可能な製造方法を提供することを目的とする。本発明の一実施態様は、さらに、脂肪細胞の培養剤を提供すること及び上記人工皮膚を用いて化合物の皮膚透過性を評価する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、浮遊細胞である脂肪細胞を、断片化された細胞外マトリックスとともに培養して三次元組織体を形成することにより、短時間で脂肪細胞が分化し、且つ形成された三次元組織体からなる人工脂肪組織の長期間維持が可能であることを見出した。さらに、当該人工脂肪組織を用いることにより、ヒトの皮膚の厚みに近い厚さの人工皮膚を製造することが可能であることを見出した。
すなわち、本発明は、例えば以下の[1]~[29]を提供する。
[1]
脂肪細胞を含む細胞と、断片化された細胞外マトリックスとを含む三次元組織体からなる、人工脂肪組織。
[2]
上記細胞外マトリックスがコラーゲンを含む、[1]に記載の人工脂肪組織。
[3]
上記細胞外マトリックスの含有率が、上記人工脂肪組織を基準として10重量%~30重量%である、[1]又は[2]に記載の人工脂肪組織。
[4]
厚さが1mm~10mmである、[1]~[3]のいずれかに記載の人工脂肪組織。
[5]
培養中の収縮率が20%以下である、[1]~[4]のいずれかに記載の人工脂肪組織。
[6]
上記断片化された細胞外マトリックスの平均長が100nm~200μmである、[1]~[5]のいずれかに記載の人工脂肪組織。
[7]
上記脂肪細胞の脂肪滴の大きさの平均値が、20μm~180μmである、[1]~[6]のいずれかに記載の人工脂肪組織。
[8]
第1の層及び第2の層を含み、第1の層が[1]~[7]のいずれかに記載の人工脂肪組織からなる、人工皮膚。
[9]
上記第2の層が、線維芽細胞を含む、[8]に記載の人工皮膚。
[10]
さらに第3の層を含む、[8]又は[9]に記載の人工皮膚。
[11]
上記第3の層が、角化細胞を含む、[10]に記載の人工皮膚。
[12]
厚さが0.2mm~10mmである、[8]~[11]のいずれかに記載の人工皮膚。
[13]
(1)水性媒体中において、脂肪細胞を含む細胞と、断片化された細胞外マトリックスとを接触させる工程、及び
(2)上記断片化された細胞外マトリックスが接触した上記細胞を培養する工程、を含む、人工脂肪組織の製造方法。
[14]
工程(2)における培養時間が10日~30日である、[13]に記載の製造方法。
[15]
工程(1)及び工程(2)の間に、水性媒体中における上記断片化された細胞外マトリックスと、上記細胞とを共に沈降させる工程をさらに含む、[13]又は[14]に記載の製造方法。
[16]
上記細胞外マトリックスがコラーゲンを含む、[13]~[15]のいずれかに記載の製造方法。
[17]
上記断片化された細胞外マトリックスの平均長が100nm~200μmである、[13]~[16]のいずれかに記載の製造方法。
[18]
(1)水性媒体中において、脂肪細胞を含む第1の細胞と、第1の断片化された細胞外マトリックスとを接触させること、及び
(2)上記第1の断片化された細胞外マトリックスが接触した上記第1の細胞を培養すること、を含む第1の層を形成する工程と、
(3)上記第1の層にさらに第2の細胞を接触させ、上記第2の細胞を培養させることを含む、第2の層を形成する工程と
を含む、人工皮膚の製造方法。
[19]
上記第1の断片化された細胞外マトリックスの平均長が100nm~200μmである、[18]に記載の人工皮膚の製造方法。
[20]
工程(2)における培養時間が10日~60日である、[18]又は[19]に記載の製造方法。
[21]
工程(3)が、上記第1の層上で、水性媒体中において、上記第2の細胞と断片化された第2の細胞外マトリックスとを接触させ、上記第2の細胞を培養することを含む工程である、[18]~[20]のいずれかに記載の人工皮膚の製造方法。
[22]
上記第2の細胞外マトリックスがコラーゲンを含む、[21]に記載の人工皮膚の製造方法。
[23]
上記第2の細胞が、線維芽細胞を含む、[18]~[22]のいずれかに記載の人工皮膚の製造方法。
[24]
上記第2の層にさらに第3の細胞を接触させ、上記第3の細胞を培養させることを含む、第3の層を形成する工程
をさらに含む、[18]~[23]のいずれかに記載の人工皮膚の製造方法。
[25]
上記第3の細胞が、角化細胞を含む、[24]に記載の人工皮膚の製造方法。
[26]
断片化された細胞外マトリックスを含む、脂肪細胞の培養剤。
[27]
上記断片化された細胞外マトリックスが、平均長が100nm~200μmのコラーゲンである、[26]に記載の培養剤。
[28]
分化促進剤である、[26]又は[27]に記載の培養剤。
[29]
化合物の皮膚透過性を評価する方法であって、
[8]~[12]のいずれかに記載の人工皮膚を準備する工程と、
被験化合物を人工皮膚に接触させる工程と、
上記被験化合物を接触させた人工皮膚を用いて上記被験化合物の皮膚透過性を測定する工程と、
上記被験化合物の皮膚透過性を基準値と比較する工程と
を含む、方法。
[1]
脂肪細胞を含む細胞と、断片化された細胞外マトリックスとを含む三次元組織体からなる、人工脂肪組織。
[2]
上記細胞外マトリックスがコラーゲンを含む、[1]に記載の人工脂肪組織。
[3]
上記細胞外マトリックスの含有率が、上記人工脂肪組織を基準として10重量%~30重量%である、[1]又は[2]に記載の人工脂肪組織。
[4]
厚さが1mm~10mmである、[1]~[3]のいずれかに記載の人工脂肪組織。
[5]
培養中の収縮率が20%以下である、[1]~[4]のいずれかに記載の人工脂肪組織。
[6]
上記断片化された細胞外マトリックスの平均長が100nm~200μmである、[1]~[5]のいずれかに記載の人工脂肪組織。
[7]
上記脂肪細胞の脂肪滴の大きさの平均値が、20μm~180μmである、[1]~[6]のいずれかに記載の人工脂肪組織。
[8]
第1の層及び第2の層を含み、第1の層が[1]~[7]のいずれかに記載の人工脂肪組織からなる、人工皮膚。
[9]
上記第2の層が、線維芽細胞を含む、[8]に記載の人工皮膚。
[10]
さらに第3の層を含む、[8]又は[9]に記載の人工皮膚。
[11]
上記第3の層が、角化細胞を含む、[10]に記載の人工皮膚。
[12]
厚さが0.2mm~10mmである、[8]~[11]のいずれかに記載の人工皮膚。
[13]
(1)水性媒体中において、脂肪細胞を含む細胞と、断片化された細胞外マトリックスとを接触させる工程、及び
(2)上記断片化された細胞外マトリックスが接触した上記細胞を培養する工程、を含む、人工脂肪組織の製造方法。
[14]
工程(2)における培養時間が10日~30日である、[13]に記載の製造方法。
[15]
工程(1)及び工程(2)の間に、水性媒体中における上記断片化された細胞外マトリックスと、上記細胞とを共に沈降させる工程をさらに含む、[13]又は[14]に記載の製造方法。
[16]
上記細胞外マトリックスがコラーゲンを含む、[13]~[15]のいずれかに記載の製造方法。
[17]
上記断片化された細胞外マトリックスの平均長が100nm~200μmである、[13]~[16]のいずれかに記載の製造方法。
[18]
(1)水性媒体中において、脂肪細胞を含む第1の細胞と、第1の断片化された細胞外マトリックスとを接触させること、及び
(2)上記第1の断片化された細胞外マトリックスが接触した上記第1の細胞を培養すること、を含む第1の層を形成する工程と、
(3)上記第1の層にさらに第2の細胞を接触させ、上記第2の細胞を培養させることを含む、第2の層を形成する工程と
を含む、人工皮膚の製造方法。
[19]
上記第1の断片化された細胞外マトリックスの平均長が100nm~200μmである、[18]に記載の人工皮膚の製造方法。
[20]
工程(2)における培養時間が10日~60日である、[18]又は[19]に記載の製造方法。
[21]
工程(3)が、上記第1の層上で、水性媒体中において、上記第2の細胞と断片化された第2の細胞外マトリックスとを接触させ、上記第2の細胞を培養することを含む工程である、[18]~[20]のいずれかに記載の人工皮膚の製造方法。
[22]
上記第2の細胞外マトリックスがコラーゲンを含む、[21]に記載の人工皮膚の製造方法。
[23]
上記第2の細胞が、線維芽細胞を含む、[18]~[22]のいずれかに記載の人工皮膚の製造方法。
[24]
上記第2の層にさらに第3の細胞を接触させ、上記第3の細胞を培養させることを含む、第3の層を形成する工程
をさらに含む、[18]~[23]のいずれかに記載の人工皮膚の製造方法。
[25]
上記第3の細胞が、角化細胞を含む、[24]に記載の人工皮膚の製造方法。
[26]
断片化された細胞外マトリックスを含む、脂肪細胞の培養剤。
[27]
上記断片化された細胞外マトリックスが、平均長が100nm~200μmのコラーゲンである、[26]に記載の培養剤。
[28]
分化促進剤である、[26]又は[27]に記載の培養剤。
[29]
化合物の皮膚透過性を評価する方法であって、
[8]~[12]のいずれかに記載の人工皮膚を準備する工程と、
被験化合物を人工皮膚に接触させる工程と、
上記被験化合物を接触させた人工皮膚を用いて上記被験化合物の皮膚透過性を測定する工程と、
上記被験化合物の皮膚透過性を基準値と比較する工程と
を含む、方法。
本発明によれば、長期間維持が可能な人工脂肪組織を提供すること及び短時間で当該人工脂肪組織を製造可能な製造方法を提供することが可能になる。また、本発明によれば、長期間維持が可能な人工脂肪組織を含む人工皮膚を提供すること及び短時間で当該人工皮膚を製造可能な製造方法を提供することが可能になる。また、本発明によれば、脂肪細胞の培養剤を提供すること及び上記人工皮膚を用いて化合物の皮膚透過性を評価する方法を提供することが可能になる。
さらに、本発明によれば、ヒトの皮膚の厚みに近い厚さの人工皮膚及びその製造方法を提供することが可能になる。
(人工脂肪組織)
本実施形態に係る人工脂肪組織は、脂肪細胞を含む細胞と、断片化された細胞外マトリックスとを含む三次元組織体からなる。上記細胞の少なくとも一部は断片化された細胞外マトリックスに接着している。本実施形態に係る人工脂肪組織は、平皿上での従来の二次元培養により製造される人工脂肪組織と比較して、分化が促進されており、且つ長期間維持が可能である。
本実施形態に係る人工脂肪組織は、脂肪細胞を含む細胞と、断片化された細胞外マトリックスとを含む三次元組織体からなる。上記細胞の少なくとも一部は断片化された細胞外マトリックスに接着している。本実施形態に係る人工脂肪組織は、平皿上での従来の二次元培養により製造される人工脂肪組織と比較して、分化が促進されており、且つ長期間維持が可能である。
本実施形態に係る人工脂肪組織は、人工的に作られた脂肪組織であり、生体組織から単離しただけの脂肪組織そのものは含まれない。
「三次元組織体」とは、コラーゲン等の細胞外マトリックスを介して細胞が三次元的に配置されている細胞の集合体であって、細胞培養によって人工的に作られる集合体を意味する。三次元組織体の形状には特に制限はなく、例えば、シート状、球体状、楕円体状、直方体状等が挙げられる。ここで、本実施形態の人工脂肪組織は、断片化された細胞外マトリックスを含む三次元組織体からなるため、断片化された細胞外マトリックスの有無により、生体組織及び断片化された細胞外マトリックスを用いない他の方法により製造された三次元組織体と区別することが可能である。
本実施形態において「脂肪細胞」には、成熟脂肪細胞のように分化した細胞だけでなく、脂肪幹細胞のように未分化の細胞も含まれる。脂肪細胞は、例えば、皮下脂肪組織、心外膜由来脂肪組織等から採取した細胞を用いてもよく、採取した細胞を分化誘導して用いてもよい。脂肪細胞は、特に限定されないが、脂肪細胞から構築した脂肪組織を、最終的に生体の特定箇所の組織に見立てて利用する場合には、当該箇所の組織に対応する組織由来のものを用いることが好ましい。脂肪細胞の由来となる動物種としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ブタ等が挙げられる。好ましい脂肪細胞としては、成熟脂肪細胞又は脂肪幹細胞が挙げられる。
「細胞外マトリックス」とは、生物において細胞の外に存在する物質を意味し、具体的には、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸等が挙げられる。本実施形態における細胞外マトリックスは、動物細胞の外に存在する物質、すなわち動物の細胞外マトリックスであることが好ましく、コラーゲン又はエラスチンを含むことがより好ましく、コラーゲン又はエラスチンであることがさらに好ましく、コラーゲンであることが特に好ましい。
コラーゲンとしては、例えば、線維性コラーゲン又は非線維性コラーゲンが挙げられる。線維性コラーゲンとは、コラーゲン線維の主成分となるコラーゲンを意味し、具体的には、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン等が挙げられる。非線維性コラーゲンとしては、例えば、IV型コラーゲンが挙げられる。
従来の三次元組織体は、コラーゲン等の細胞外マトリックスの濃度が低く、且つ細胞密度が高いものであった。そのため、培養中又は培養後に細胞のけん引力によって三次元組織体が収縮したり、培養中又は培養後に細胞が産生する酵素によって三次元組織体が容易に分解される等の問題があった。また、例えば、多孔性の高密度コラーゲンなども市販されているがこれらは、コラーゲンと細胞を均一接着させることが出来ない上に、その後の細胞特性評価のために細胞を回収することが困難であった。本実施形態に係る三次元組織体からなる脂肪組織は、細胞外マトリックスの含有率が従来の三次元組織体の含有率より高く、収縮が起きにくく安定である。
三次元組織体における細胞外マトリックスの含有率は、上記三次元組織体を基準として0.01~90重量%であってよく、10~90重量%であることが好ましく、1~50重量%であることが好ましく、10~30重量%であることがより好ましく、20~30重量%であることが特に好ましい。ここで、「三次元組織体における細胞外マトリックス」とは、三次元組織体を構成する細胞外マトリックスを意味し、内因性の細胞外マトリックスであってもよいし、外因性の細胞外マトリックスであってもよい。また「三次元組織体における細胞外マトリックス」には後述する断片化された細胞外マトリックスも含まれる。すなわち、三次元組織体が内因性の細胞外マトリックスを含む場合、上記三次元組織体を構成する細胞外マトリックスの濃度は、内因性の細胞外マトリックス及び上記断片化された細胞外マトリックスを合わせた濃度を意味する。上記細胞外マトリックスの濃度は、得られた三次元組織体の体積、及び脱細胞化した三次元組織体の質量から算出することが可能である。
「内因性の細胞外マトリックス」とは、細胞外マトリックス産生細胞が産生する細胞外マトリックスを意味し、「内因性コラーゲン」とは、三次元組織体を構成するコラーゲン産生細胞が産生するコラーゲンを意味する。内因性コラーゲンは、線維性コラーゲンであってもよいし、非線維性コラーゲンであってもよい。
「外因性の細胞外マトリックス」とは、外部から供給される細胞外マトリックスを意味する。本実施形態に係る人工脂肪組織は三次元組織体からなり、当該三次元組織体は、断片化された細胞外マトリックスを含む。外因性の細胞外マトリックスは、由来となる動物種が内因性の細胞外マトリックスと同じであっても異なっていてもよい。由来となる動物種としては、例えば、ヒト、ブタ、ウシ等が挙げられる。また、外因性の細胞外マトリックスは、人工の細胞外マトリックスであってもよい。断片化された細胞外マトリックスは外因性の細胞外マトリックスである。細胞外マトリックスがコラーゲンである場合には、「外因性コラーゲン」とも称され、外部から供給されるコラーゲンを意味し、具体的には、線維性コラーゲン、非線維性コラーゲン等が挙げられる。外因性コラーゲンは、線維性コラーゲンであることが好ましい。上記線維性コラーゲンとしては、例えば、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲンが挙げられ、好ましくはI型コラーゲンである。上記線維性コラーゲンは、市販されているコラーゲンを用いてもよく、その具体例としては、日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来I型コラーゲン凍結乾燥体が挙げられる。外因性の非線維性コラーゲンとしては、例えば、IV型コラーゲンが挙げられる。
外因性の細胞外マトリックスにおいて、由来する動物種は、細胞とは異なっていてよい。また、細胞が、細胞外マトリックス産生細胞を含む場合、外因性の細胞外マトリックスにおいて、由来する動物種は、細胞外マトリックス産生細胞とは異なっていてよい。つまり、外因性の細胞外マトリックスは、異種細胞外マトリックスであってよい。
上記三次元組織体は、断片化された細胞外マトリックスを含む。「断片化された細胞外マトリックス」とは、コラーゲン等の細胞外マトリックスを断片化したものを意味する。断片化された細胞外マトリックスの由来となる細胞外マトリックスは、一種類であってもよいし、複数種の細胞外マトリックスを併用してもよい。従来、コラーゲン等の細胞外マトリックスは酸性の水溶液等に溶かしていたが、濃度は0.1~0.3重量%程度であり多く溶かすことはできなかった。そのため従来の方法では三次元組織体におけるコラーゲン等の細胞外マトリックスの量を多くすることが困難であった。本実施形態に係る断片化された細胞外マトリックスは水にほとんど溶解しないが、後述する水性媒体に分散することにより、水性媒体中で脂肪細胞を含む細胞と接触しやすくなり、三次元組織体の形成を促進すると推測される。断片化された細胞外マトリックスの平均長は、100nm~200μmであることが好ましく、22μm~200μmであることがより好ましく、100μm~200μmであることがさらにより好ましい。断片化された細胞外マトリックスの平均径は、50nm~30μmであることが好ましく、4μm~30μmであることがより好ましく、20μm~30μmであることがさらにより好ましい。
細胞外マトリックスがコラーゲンである場合、断片化された細胞外マトリックスは「断片化コラーゲン」とも称される。「断片化コラーゲン」とは、線維性コラーゲン等のコラーゲンを断片化したものであって、三重らせん構造を維持しているものを意味する。断片化コラーゲンの平均長は、100nm~200μmであることが好ましく、22μm~200μmであることがより好ましく、100μm~200μmであることがさらにより好ましい。断片化コラーゲンの平均径は、50nm~30μmであることが好ましく、4μm~30μmであることがより好ましく、20μm~30μmであることがさらにより好ましい。
コラーゲン等の細胞外マトリックスを断片化する方法は、特に制限はなく、例えば、超音波式ホモジナイザー、撹拌式ホモジナイザー、及び高圧式ホモジナイザー等のホモジナイザーを用いて細胞外マトリックスを断片化してもよい。撹拌式ホモジナイザーを用いる場合、細胞外マトリックスをそのままホモジナイズしてもよいし、生理食塩水等の水性媒体中でホモジナイズしてもよい。また、ホモジナイズする時間、回数等を調整することでミリメートルサイズ、ナノメートルサイズの断片化された細胞外マトリックスを得ることも可能である。
断片化された細胞外マトリックスの直径及び長さは、電子顕微鏡によって個々の断片化された細胞外マトリックスを解析することによって求めることが可能である。
本実施形態に係る製造方法によれば、比較的少ない細胞数で、厚さが1mm以上である、サイズが大きい三次元組織体からなる人工脂肪組織を製造できる。
上記三次元組織体からなる人工脂肪組織は、厚さが10μm~20mmであることが好ましく、100μm~15mmであることがより好ましく、1mm~10mmであることが特に好ましい。厚さの下限は特に制限されないが、例えば、10μm、50μm、100μm、200μm、500μm、800μm、1mm、3mm、又は5mmであってよい。厚さの上限は、特に制限されないが、例えば、20mm、15mm、10mm、5mm、3mm、2mm、1.5mm又は1mmであってもよい。このような三次元組織体は、生体組織により近い構造であり、実験動物の代替品、及び移植材料として好適なものとなる。
ここで、「三次元組織体の厚さ」とは、三次元組織体がシート状、又は直方体状である場合、主面に垂直な方向における両端の距離を意味する。上記主面に凹凸がある場合、厚さは上記主面の最も薄い部分における距離を意味する。また、三次元組織体が球体状である場合、その直径を意味する。さらにまた、三次元組織体が楕円体状である場合、その短径を意味する。三次元組織体が略球体状又は略楕円体状であって表面に凹凸がある場合、厚さは、三次元組織体の重心を通る直線と上記表面とが交差する2点間の距離であって最短の距離を意味する。
上記三次元組織体からなる人工脂肪組織は、培養中の収縮率が20%以下であることが好ましく、15%以下であることがより好ましく、10%以下であることがさらに好ましい。上記収縮率は、例えば、以下の式で算出できる。式中L1は、培養後1日目の三次元組織体からなる人工脂肪組織のもっとも長い部分の長さを示し、L3は、培養後3日目の三次元組織体からなる人工脂肪組織における対応する部分の長さを示す。
収縮率(%)={(L1―L3)/L1}×100
上記の例では収縮率を、培養後1日目の人工脂肪組織と培養3日目の人工脂肪組織から算出しているが、例えば、培養後1日目の人工脂肪組織と培養2日目の人工脂肪組織から算出してもよく、培養後1日目の人工脂肪組織と培養5日目の人工脂肪組織から算出してもよく、培養後1日目の人工脂肪組織と培養8日目の人工脂肪組織から算出してもよい。
収縮率(%)={(L1―L3)/L1}×100
上記の例では収縮率を、培養後1日目の人工脂肪組織と培養3日目の人工脂肪組織から算出しているが、例えば、培養後1日目の人工脂肪組織と培養2日目の人工脂肪組織から算出してもよく、培養後1日目の人工脂肪組織と培養5日目の人工脂肪組織から算出してもよく、培養後1日目の人工脂肪組織と培養8日目の人工脂肪組織から算出してもよい。
培養した脂肪細胞の成熟度を示す指標として、脂肪滴の大きさを用いることができる。脂肪滴とは、トリグリセリド(中性脂肪)、コレストロール等の脂質を貯蔵する細胞内小器官であり、上記脂質類がリン脂質の1重膜で覆われることで液滴様の形状を有している。また上記リン脂質の表面には脂肪組織特有のタンパク質(ペリリピン等)の発現が見られる。成熟した脂肪細胞の脂肪滴の大きさにはばらつきがあるが、例えば、脂肪滴の大きさの平均値が20μm以上である場合には、脂肪細胞がある程度成熟している、すなわち、成熟脂肪細胞であるとすることができる。
本実施形態の人工脂肪組織において、脂肪細胞の脂肪滴の大きさの平均値は、20μm~180μmであることが好ましく、100μm~180μmであることがより好ましい。上記脂肪滴の大きさは、250μm以下、200μm以下、180μm以下又は150μm以下であってよい。また、上記脂肪滴の大きさは、15μm以上、30μm以上、50μm以上又は80μm以上であってよい。また上記の脂肪滴の大きさは、培養7日目、培養10日目、培養14日目、又は培養21日目における数値であってよい。
また、培養した脂肪細胞の成熟度を示す指標として、脂肪形成マーカー及び脂肪分解マーカー等の遺伝子マーカーの発現プロファイルを用いることができる。脂肪形成マーカーとしては、例えば、Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ2(PPARγ2)、Fatty Acid Binding Protein 4(FABP4)及びGlucose transporter type 4(GLUT-4)等が挙げられる。PPARγ2及びFABP4は脂肪形成の初期マーカーとして、GLUT-4は脂肪形成の後期マーカーとして利用することができる。脂肪分解マーカーとしては、例えば、hormone-sensitive lipase(HSL)及びAdipocyte Triglyceride Lipase(ATGL)等が挙げられる。
PPARγ2は、脂肪細胞の分化で最も重要な転写因子の一つである。脂肪形成の間、PPARγ2発現は増加し、続いて一定又は減少することが報告されている(B. Galateanu et al., Int. J. Mol. Sci. 2012 (13) 15881-15900及びA. Soukas et al., J. Biol. Chem. 2001 (276) 34167-34174)。したがって、例えば、PPARγ2が増加する段階にある組織体と比較して、PPARγ2が一定に発現する段階にある組織体において脂肪形成はより進行していると考えられる。FABP4は、脂肪酸を流出させるための膜への輸送に必要とされる、もう一つの初期マーカーである。したがって、例えば、より典型的な直線的な増加のFABP4発現プロファイルを示す組織体の方が、より脂肪形成の初期段階にあると考えられる。典型的な直線的な増加のFABP4発現プロファイルについては、例えば、E.C.M. Mariman et al., Cell. Mol. Life Sci. 2010 (67) 1277-1292を参照することができる。
インスリン刺激性GLUT-4は、脂肪細胞における主要なグルコース輸送体である。脂肪形成の分化が初期段階にある組織体では、GLUT-4の発現は弱い(S.-W. Qian et al., BMC Dev. Biol. 2010 (10) 47)。したがって、例えば、より早くGLUT-4の発現が増加している組織体は、脂肪形成の分化がより進行していると考えられる。
本実施形態の人工脂肪組織は、脂肪細胞以外の細胞を含んでいてもよく、細胞外マトリックス産生細胞を含んでいてもよい。「細胞外マトリックス産生細胞」とは、コラーゲン等の細胞外マトリックスを分泌する細胞を意味する。つまり、当該人工脂肪組織は、内生の細胞外マトリックスを含んでもよい。細胞外マトリックス産生細胞としては、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞等の間葉系細胞が挙げられ、好ましくは、線維芽細胞である。好ましい線維芽細胞としては、例えば、ヒト皮膚由来線維芽細胞(NHDF)、ヒト心臓線維芽細胞(NHCF)及びヒト歯肉線維芽細胞(HGF)が挙げられる。その他の脂肪細胞以外の細胞としては、例えば、血管内皮細胞(例えば、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞(HUVEC))、大腸がん細胞(例えば、ヒト大腸がん細胞(HT29))、肝がん細胞等のがん細胞、心筋細胞(例えば、ヒトiPS細胞由来心筋細胞(iPS-CM))、上皮細胞(例えば、ヒト歯肉上皮細胞)、リンパ管内皮細胞、神経細胞、肝細胞、組織幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、接着性細胞(例えば、免疫細胞)、平滑筋細胞(例えば、大動脈平滑筋細胞(Arota-SMC))、角化細胞(例えば、ヒト表皮角化細胞)等が挙げられる。
上記三次元組織体からなる脂肪組織は、実験動物の代替品、移植材料等として適用することができる。具体的には、例えば、セルライト、肥満等に対する化粧品のアッセイスクリーニング、糖尿病、肥満等に対する医薬品のスクリーニング、脂肪組織に関連する炎症性疾患等の他の病理学的なインビトロモデル、外傷や腫瘍摘出により生じた軟部組織欠損や乳房切除等の後の組織再構築に適用することができる。
(人工皮膚)
本実施形態に係る人工皮膚は、複数の層を含み、そのうちの一つの層が上述した人工脂肪組織からなる層である。すなわち、本実施形態に係る人工皮膚は、第1の層及び第2の層を含み、上述した人工脂肪組織を第1の層として含む。当該人工皮膚は、少なくとも第1の層及び第2の層を含んでいればよく、さらに第3の層、第4の層又は第5の層を含んでいてもよく、それ以上の層を含んでいてもよい。各層の順番は問わないが、第1の層、第2の層、第3の層の順番に積層されることが好ましい。ただし、この場合にも、第1の層、第2の層、第3の層がこの順番であればよく、例えば、第1の層の下、第1の層と第2の層の間、第2の層と第3の層の間、又は第3の層の上に別の層を含むことを制限するものではない。
本実施形態に係る人工皮膚は、複数の層を含み、そのうちの一つの層が上述した人工脂肪組織からなる層である。すなわち、本実施形態に係る人工皮膚は、第1の層及び第2の層を含み、上述した人工脂肪組織を第1の層として含む。当該人工皮膚は、少なくとも第1の層及び第2の層を含んでいればよく、さらに第3の層、第4の層又は第5の層を含んでいてもよく、それ以上の層を含んでいてもよい。各層の順番は問わないが、第1の層、第2の層、第3の層の順番に積層されることが好ましい。ただし、この場合にも、第1の層、第2の層、第3の層がこの順番であればよく、例えば、第1の層の下、第1の層と第2の層の間、第2の層と第3の層の間、又は第3の層の上に別の層を含むことを制限するものではない。
本実施形態に係る人工皮膚の各層は、含まれる細胞の種類及び細胞の分布の違い等に基づき区別することができる。例えば、人工皮膚を細胞の種類ごとに異なる色に染色することで、各層が異なった色で示されるため、断面写真等により各層を区別することができる。また、例えば、人工皮膚に含まれるすべての細胞を染色し、断面写真等における染色された細胞の密度の違いから各層を区別することができる。
第1の層以外の層(第2の層、第3の層、第4の層及び第5の層等)は、細胞を含む。当該細胞は、上述した脂肪細胞を含んでもよく、脂肪細胞以外の細胞を含んでもよい。第2の層が、線維芽細胞又は角化細胞を含むことが好ましく、線維芽細胞を含むことがより好ましく、ヒト皮膚由来線維芽細胞又はヒト心臓線維芽細胞を含むことがさらに好ましい。第3の層が、線維芽細胞又は角化細胞を含むことが好ましく、角化細胞を含むことがより好ましく、ヒト表皮角化細胞を含むことがさらに好ましい。第1の層を最下層とする場合には、第2の層が線維芽細胞を含み、第3の層が角化細胞を含むことが好ましい。このように積層することで、よりヒトの生体内の皮膚構造に近い人工皮膚を得ることができるからである。
また、第1の層以外の層(第2の層、第3の層、第4の層及び第5の層等)は、細胞外マトリックスを含んでもよく、断片化された細胞外マトリックスを含んでもよい。第2の層が断片化された細胞外マトリックスを含むことが好ましい。細胞外マトリックス及び断片化された細胞外マトリックスについては上述したものと同じものを用いることができる。断片化された細胞外マトリックスを含めることで、細胞同士の間隔が適切な層を形成することができる。
本実施形態に係る人工皮膚は、厚さが10μm~20mmであることが好ましく、100μm~15mmであることがより好ましく、200μm~10mmであることがさらに好ましく、1mm~10mmであることが特に好ましい。厚さの下限は特に制限されないが、例えば、10μm、50μm、100μm、200μm、500μm、800μm、1mm、3mm、又は5mmであってよい。厚さの上限は、特に制限されないが、例えば、20mm、15mm、10mm、5mm、3mm、2mm、1.5mm又は1mmであってもよい。このような人工皮膚は、生体組織により近い構造であり、実験動物の代替品、及び移植材料として好適なものとなる。
「人工皮膚の厚さ」とは、最上層の組織表面から最下層の組織底面の距離を意味する。例えば、上皮組織、真皮組織、皮下組織を含む3層組織の場合は、上皮組織の表面から、最下層の皮下組織の底面までの距離(3層組織の全厚)を意味する。
本実施形態に係る人工皮膚を構成する細胞数は、1×106個以上であってよい。
本実施形態の人工皮膚の第1の層は、上述した人工脂肪組織からなる。人工脂肪組織において、脂肪細胞の脂肪滴の大きさの平均値は、20μm~180μmであることが好ましく、100μm~180μmであることがより好ましい。上記脂肪滴の大きさは、250μm以下、200μm以下、180μm以下又は150μm以下であってよい。また、上記脂肪滴の大きさは、15μm以上、30μm以上、50μm以上又は80μm以上であってよい。また上記の脂肪滴の大きさは、培養7日目、培養10日目、培養14日目、又は培養21日目における数値であってよい。
上記人工皮膚は、生体の皮膚の代用として、実験動物の代替品、移植材料等として適用することができる。具体的には、例えば、化合物の皮膚透過性、皮膚安全性、皮膚腐食性、及び皮膚刺激性等を評価する試験、化粧品のアッセイスクリーニング、医薬品のスクリーニング、病理学的なインビトロモデル、整形外科手術や火傷手術のための移植材料に適用することができる。
(人工脂肪組織の製造方法)
本実施形態に係る人工脂肪組織の製造方法は、
(1)水性媒体中において、脂肪細胞を含む細胞と、断片化された細胞外マトリックスとを接触させる工程(以下、工程(1)ともいう)、及び
(2)上記断片化された細胞外マトリックスが接触した上記細胞を培養する工程(以下、工程(2)ともいう)、を含む。
本実施形態に係る人工脂肪組織の製造方法は、
(1)水性媒体中において、脂肪細胞を含む細胞と、断片化された細胞外マトリックスとを接触させる工程(以下、工程(1)ともいう)、及び
(2)上記断片化された細胞外マトリックスが接触した上記細胞を培養する工程(以下、工程(2)ともいう)、を含む。
「脂肪細胞」、「断片化された細胞外マトリックス」等については、上述したとおりである。
本実施形態における工程(1)の「脂肪細胞を含む細胞」は、脂肪細胞以外の細胞を含んでいてもよく、細胞外マトリックス産生細胞を含んでいてもよい。「細胞外マトリックス産生細胞」とは、コラーゲン等の細胞外マトリックスを分泌する細胞を意味する。細胞外マトリックス産生細胞としては、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞等の間葉系細胞が挙げられ、好ましくは、線維芽細胞である。好ましい線維芽細胞としては、例えば、ヒト皮膚由来線維芽細胞(NHDF)、ヒト心臓線維芽細胞(NHCF)及びヒト歯肉線維芽細胞(HGF)が挙げられる。その他の脂肪細胞以外の細胞としては、例えば、血管内皮細胞(例えば、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞(HUVEC))、大腸がん細胞(例えば、ヒト大腸がん細胞(HT29))、肝がん細胞等のがん細胞、心筋細胞(例えば、ヒトiPS細胞由来心筋細胞(iPS-CM))、上皮細胞(例えば、ヒト歯肉上皮細胞)、リンパ管内皮細胞、神経細胞、肝細胞、組織幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、接着性細胞(例えば、免疫細胞)、平滑筋細胞(例えば、大動脈平滑筋細胞(Arota-SMC))、角化細胞(例えば、ヒト表皮角化細胞)等が挙げられる。
「水性媒体」とは、水を必須構成成分とする液体を意味する。水性媒体としては、断片化コラーゲン及び細胞が安定に存在できるものであれば、特に制限はない。例えば、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)等の生理食塩水、Dulbecco’sModifiedEagle培地(DMEM)、血管内皮細胞専用培地(EGM2)等の液体培地が挙げられる。液体培地は、二種類の培地を混合した混合培地であってもよい。細胞に対する負荷を軽減する観点から、水性媒体は液体培地であることが好ましい。
水性媒体中において、断片化された細胞外マトリックスと、脂肪細胞を含む細胞とを接触させる方法としては、特に制限はない。例えば、細胞を含む培養液に、断片化された細胞外マトリックスの分散液を加える方法、断片化された細胞外マトリックスの培地分散液に細胞を加える方法、又は予め用意した水性媒体に、断片化された細胞外マトリックス及び細胞をそれぞれ加える方法が挙げられる。
工程(1)における水性媒体中の断片化された細胞外マトリックスの濃度は、目的とする三次元組織体からなる人工脂肪組織の形状、厚さ、培養器のサイズ等に応じて適宜決定できる。例えば、工程(1)における水性媒体中の断片化された細胞外マトリックスの濃度は、0.1~90重量%であってよく、1~30重量%であってよい。
工程(1)における断片化された細胞外マトリックスの量は、1×105cellsの細胞に対して、0.1~100mgであってよく、1~50mgであってよい。
工程(1)における断片化された細胞外マトリックスと、細胞との質量比が、1000:1~1:1であることが好ましく、900:1~9:1であることがより好ましく、500:1~10 :1であることがさらにより好ましい。
脂肪細胞とその他の細胞とを共に用いる場合、工程(1)における脂肪細胞:その他の細胞の比率(細胞数)は、99:1~9:1であってもよいし、80:20~50:50であってもよい。
工程(1)及び工程(2)の間に、脂肪細胞を含む細胞と、水性媒体中における断片化された細胞外マトリックスとを共に沈降させる工程をさらに含んでもよい。このような工程を行うことで、三次元組織体からなる人工脂肪組織における断片化された細胞外マトリックス及び細胞の分布が、より均一になる。具体的な方法としては、特に制限はないが、例えば、断片化された細胞外マトリックスと細胞とを含む培養液を遠心操作する方法が挙げられる。
工程(1)の工程が、水性媒体中で細胞の層を形成させた後、上記断片化された細胞外マトリックスを接触させることにより行われてもよい。細胞の層を断片化された細胞外マトリックスと接触させる前に形成することで、下層部の細胞密度が高い三次元組織体からなる人工脂肪組織を作製することができる。例えば、細胞外マトリックス産生細胞を含む細胞の層を断片化された細胞外マトリックスと接触させる前に形成することで、細胞外マトリックス産生細胞を含む細胞の下層部の細胞密度が高い三次元組織体からなる人工脂肪組織を作製することができる。用いる細胞の種類によっては、この方法により、より生体に近い人工脂肪組織を作製することができる。
本実施形態において、三次元組織体の製造方法は、工程(2)の後、工程(3)として、さらに細胞を接触させ、細胞を培養する工程を含んでもよい。上記細胞は、工程(1)で用いた細胞と同じであってよく、異なってもよい。例えば、工程(1)で用いる細胞が細胞外マトリックス産生細胞以外の細胞を含む場合に、工程(3)で用いる細胞は細胞外マトリックス産生細胞を含んでもよい。また例えば、工程(1)で用いる細胞が細胞外マトリックス産生細胞を含む場合に、工程(3)で用いる細胞は細胞外マトリックス産生細胞以外の細胞を含んでもよい。工程(1)で用いる細胞及び工程(3)で用いる細胞の両方が細胞外マトリックス産生細胞を含んでもよく、工程(1)で用いる細胞及び工程(3)で用いる細胞の両方が細胞外マトリックス産生細胞以外の細胞を含んでもよい。上記工程(3)により、2層構造の三次元組織体からなる人工脂肪組織を作製することができる。同様の方法により複数の層を含む人工皮膚を製造することができる。当該人工皮膚の製造方法については後述する。
工程(2)において、断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を培養する方法は、特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培養方法で行うことができる。例えば、培養温度は20℃~40℃であってもよく、30℃~37℃であってもよい。培地のpHは、6~8であってもよく、7.2~7.4であってもよい。本実施形態に係る製造方法は、従来の二次元培養及び三次元組織の製造に用いられた複雑な組成の培養培地を必要とせず、DMEM等簡単に調製可能な培地を用いることができる。培地は特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培地を選択できる。培地としては、例えば、Eagle’s MEM培地、DMEM、Modified Eagle培地(MEM)、Minimum Essential培地、RPMI、及びGlutaMax培地等が挙げられる。培地は、血清を添加した培地であってもよいし、無血清培地であってもよい。培地は、二種類の培地を混合した混合培地であってもよい。また、本実施形態に係る製造方法によれば、従来の二次元培養と比較して、はるかに短い培養時間で十分に分化した人工脂肪組織を得ることができる。したがって、工程(2)における培養時間は、例えば、10日~60日であってよく、10日~30日であってよく、13日~25日であってよく、14日~17日であってよい。ただし、上記の培養時間はあくまでも十分に分化した脂肪組織を得るために必要とする時間を示すものであり、それ以上の培養を妨げるものではない。
工程(2)における培地中の細胞密度は、目的とする三次元組織体の形状、厚さ、培養器のサイズ等に応じて適宜決定できる。例えば、工程(2)における培地中の細胞密度は、1~108cells/mLであってよく、103~107cells/mLであってよい。また、工程(2)における培地中の細胞密度は、工程(1)における水性媒体中の細胞密度と同じであってもよい。
本実施形態に係る製造方法により製造される三次元組織体からなる人工脂肪組織は、培養中の収縮率が20%以下であることが好ましく、15%以下であることがより好ましく、10%以下であることがさらに好ましい。上記収縮率は、例えば、以下の式で算出できる。式中L1は、培養後1日目の三次元組織体のもっとも長い部分の長さを示し、L3は、培養後3日目の三次元組織体における対応する部分の長さを示す。
収縮率(%)={(L1―L3)/L1}×100
上記の例では収縮率を、培養後1日目の人工脂肪組織と培養3日目の人工脂肪組織から算出しているが、培養の終了時点を含む培養期間の任意の時点での人工脂肪組織から算出してもよい。例えば、培養後1日目の人工脂肪組織と培養2日目の人工脂肪組織から算出してもよく、培養後1日目の人工脂肪組織と培養5日目の人工脂肪組織から算出してもよく、培養後1日目の人工脂肪組織と培養8日目の人工脂肪組織から算出してもよい。
収縮率(%)={(L1―L3)/L1}×100
上記の例では収縮率を、培養後1日目の人工脂肪組織と培養3日目の人工脂肪組織から算出しているが、培養の終了時点を含む培養期間の任意の時点での人工脂肪組織から算出してもよい。例えば、培養後1日目の人工脂肪組織と培養2日目の人工脂肪組織から算出してもよく、培養後1日目の人工脂肪組織と培養5日目の人工脂肪組織から算出してもよく、培養後1日目の人工脂肪組織と培養8日目の人工脂肪組織から算出してもよい。
本実施形態に係る製造方法により製造される三次元組織体からなる人工脂肪組織は、トリプシンの濃度0.25%、温度37℃、pH7.4、反応時間15分でトリプシン処理を行った後の残存率が70%以上であることが好ましく、80%以上であることがより好ましく、90%以上であることがさらにより好ましい。このような三次元組織体は、培養中又は培養後において酵素による分解が起きにくく、安定である。上記残存率は、例えば、トリプシン処理の前後における三次元組織体の質量から算出できる。
本実施形態に係る製造方法により製造される三次元組織体からなる人工脂肪組織は、コラゲナーゼの濃度0.25%、温度37℃、pH7.4、反応時間15分でコラゲナーゼ処理を行った後の残存率が70%以上であることが好ましく、80%以上であることがより好ましく、90%以上であることがさらにより好ましい。このような三次元組織体は、培養中又は培養後における酵素による分解が起きにくく、安定である。
また、本実施形態に係る製造方法によれば、安定で、細胞が均一に分布している三次元組織体からなる人工脂肪組織を製造できる。さらに、本実施形態に係る製造方法により製造した人工脂肪組織は、従来の二次元培養と比較して、成熟脂肪細胞が長期間維持される。また、本実施形態に係る製造方法によれば、比較的少ない細胞数で、厚さが1mm以上である、サイズが大きい三次元組織体からなる人工脂肪組織を製造できる。
(人工皮膚の製造方法)
本実施形態に係る人工皮膚の製造方法は、
(1)水性媒体中において、脂肪細胞を含む第1の細胞と、第1の断片化された細胞外マトリックスとを接触させること(以下、工程(1)’ともいう)、及び
(2)上記第1の断片化された細胞外マトリックスが接触した上記第1の細胞を培養すること、を含む第1の層を形成する工程(以下、工程(2)’ともいう)と、
(3)上記第1の層にさらに第2の細胞を接触させ、上記第2の細胞を培養させることを含む、第2の層を形成する工程(以下、工程(3)’ともいう)と
を含む。
本実施形態に係る人工皮膚の製造方法は、
(1)水性媒体中において、脂肪細胞を含む第1の細胞と、第1の断片化された細胞外マトリックスとを接触させること(以下、工程(1)’ともいう)、及び
(2)上記第1の断片化された細胞外マトリックスが接触した上記第1の細胞を培養すること、を含む第1の層を形成する工程(以下、工程(2)’ともいう)と、
(3)上記第1の層にさらに第2の細胞を接触させ、上記第2の細胞を培養させることを含む、第2の層を形成する工程(以下、工程(3)’ともいう)と
を含む。
工程(1)’及び(2)’については、上記(人工脂肪組織の製造方法)で述べた方法と同様の方法が挙げられる。水性媒体、脂肪細胞を含む第1の細胞、第2の細胞、第1の断片化された細胞外マトリックスについても、上述した水性媒体、脂肪細胞を含む細胞、断片化された細胞外マトリックスと同様のものが挙げられる。
工程(2)’における第1の層を形成する方法は、特に限定されないが、培養された細胞の厚さが所望の厚さになれば、層が形成されたとみなすことができる。工程(2)’において第1の層の形成が完了してから工程(3)’を開始する必要はなく、工程(2)’の培養中に工程(3)’を開始することができる。
第1の断片化された細胞外マトリックスの平均長は、100nm~200μmであることが好ましく、22μm~200μmであることがより好ましく、100μm~200μmであることがさらにより好ましい。断片化された細胞外マトリックスの平均径は、50nm~30μmであることが好ましく、4μm~30μmであることがより好ましく、20μm~30μmであることがさらにより好ましい。
また、本実施形態に係る製造方法によれば、従来の二次元培養と比較して、はるかに短い培養時間で十分に分化した脂肪組織(第1の層)を得ることができる。したがって、工程(2)’における培養時間は、例えば、10日~60日であってよく、10日~30日であってよく、13日~25日であってよく、14日~17日であってよい。ただし、上記の培養時間はあくまでも十分に分化した脂肪組織を得るために必要とする時間を示すものであり、それ以上の培養を妨げるものではない。
第2の細胞は、第1の細胞と同じであってもよく、異なっていてもよい。また、細胞を接触させる方法及び培養方法についても、上記(人工脂肪組織の製造方法)で述べた方法と同様の方法が挙げられる。
第2の細胞として用いる細胞としては、上記(人工脂肪組織)で述べたものと同様のものが挙げられるが、第2の細胞が線維芽細胞を含むことが好ましい。第2の層を線維芽細胞が分化した層とすることで、より生体の皮膚に近い構造とすることができる。
また、工程(3)’が、上記第1の層上で、水性媒体中において、上記第2の細胞と断片化された第2の細胞外マトリックスとを接触させ、上記第2の細胞を培養することを含む工程であることが好ましい。第2の細胞外マトリックスとしては、上記(人工脂肪組織)で述べたものと同様のものが挙げられる。断片化された細胞外マトリックスを含めることで、細胞同士の間隔が適切な層を形成することができる。第2の細胞外マトリックスがコラーゲンを含むことが好ましく、第2の細胞外マトリックスがコラーゲンであることがより好ましい。
本実施形態に係る人工皮膚の製造方法は、上記第2の層にさらに第3の細胞を接触させ、上記第3の細胞を培養させることを含む、第3の層を形成する工程を、さらに含むことができる。
第3の細胞として用いる細胞としては、上記(人工脂肪組織)で述べたものと同様のものが挙げられるが、第3の細胞が角化細胞を含むことが好ましい。第3の層を角化細胞が分化した層とすることで、より生体の皮膚に近い構造とすることができる。
本実施形態に係る人工皮膚の製造方法によれば、上記(人工皮膚)において述べたものと同様に、生体の皮膚に近い厚さの人工皮膚を、従来の二次元培養と比較して、はるかに短い培養時間で得ることができる。
また、本実施形態に係る人工皮膚の製造方法によれば、安定で、細胞が均一に分布している三次元組織体からなる人工脂肪組織を第1の層として含む、人工皮膚を製造することができる。さらに、本実施形態に係る製造方法により製造した人工皮膚における人工脂肪組織は、従来の二次元培養と比較して、成熟脂肪細胞が長期間維持される。また、本実施形態に係る製造方法によれば、比較的少ない細胞数で、厚さが1mm以上である、生体の皮膚に近い厚さの人工皮膚を製造できる。
(脂肪細胞の培養剤)
本実施形態に係る脂肪細胞の培養剤は、断片化された細胞外マトリックスを含む。本実施形態に係る脂肪細胞の培養剤は、上記断片化された細胞外マトリックスの平均長が100nm~200μmであってもよく、上記断片化された細胞外マトリックスの平均径が50nm~30μmであってもよい。また、断片化された細胞外マトリックスの長さについて、断片化された細胞外マトリックス全体のうち95%が100nm~200μmの範囲にあってもよい。さらに、断片化された細胞外マトリックスの直径について、断片化された細胞外マトリックス全体のうち95%が50nm~30μmの範囲にあってもよい。
本実施形態に係る脂肪細胞の培養剤は、断片化された細胞外マトリックスを含む。本実施形態に係る脂肪細胞の培養剤は、上記断片化された細胞外マトリックスの平均長が100nm~200μmであってもよく、上記断片化された細胞外マトリックスの平均径が50nm~30μmであってもよい。また、断片化された細胞外マトリックスの長さについて、断片化された細胞外マトリックス全体のうち95%が100nm~200μmの範囲にあってもよい。さらに、断片化された細胞外マトリックスの直径について、断片化された細胞外マトリックス全体のうち95%が50nm~30μmの範囲にあってもよい。
「脂肪細胞の培養剤」とは、脂肪細胞を培養するための試薬を意味する。脂肪細胞の培養剤は、粉末の状態であってもよいし、水性媒体に断片化された細胞外マトリックスが分散した分散液の状態であってもよい。断片化された細胞外マトリックスの種類、大きさ、製造方法及び上記培養剤の使用方法としては、上記(人工脂肪組織)及び(人工脂肪組織の製造方法)において示されているものと同様のものが挙げられる。断片化された細胞外マトリックスを含むことで、脂肪細胞の分化が促進される。したがって、脂肪細胞の培養剤は、分化促進剤と捉えることもできる。また、断片化された細胞外マトリックスを含むことで、成熟脂肪細胞の脱分化が起こりにくくなる。したがって、脂肪細胞の培養剤は、成熟脂肪細胞の脱分化抑制剤(成熟脂肪細胞の維持剤)と捉えることもできる。さらに、本実施形態に係る培養剤によれば、例えば1mm以上の厚さを持つ組織を形成した場合にも、長期培養による組織収縮が少ない組織を形成可能であるため、分化促進効果および脱分化抑制効果を奏しつつ、長期間形態が安定した組織を形成することができる。
(化合物の皮膚透過性を評価する方法)
本実施形態に係る化合物の皮膚透過性を評価する方法は、
人工皮膚を準備する工程と、
被験化合物を人工皮膚に接触させる工程と、
上記被験化合物を接触させた人工皮膚を用いて上記被験化合物の皮膚透過性を測定する工程と、
上記被験化合物の皮膚透過性を基準値と比較する工程と
を含む。人工皮膚は、上記(人工皮膚)に記載した本実施形態に係る人工皮膚、又は上記(人工皮膚の製造方法)に記載した本実施形態に係る製造方法により製造した人工皮膚を用いる。上述したように、当該人工皮膚は、生体の皮膚と類似の構成及び厚さを有しているため、生体の皮膚の代用として化合物の皮膚透過性試験に用いることができる。
本実施形態に係る化合物の皮膚透過性を評価する方法は、
人工皮膚を準備する工程と、
被験化合物を人工皮膚に接触させる工程と、
上記被験化合物を接触させた人工皮膚を用いて上記被験化合物の皮膚透過性を測定する工程と、
上記被験化合物の皮膚透過性を基準値と比較する工程と
を含む。人工皮膚は、上記(人工皮膚)に記載した本実施形態に係る人工皮膚、又は上記(人工皮膚の製造方法)に記載した本実施形態に係る製造方法により製造した人工皮膚を用いる。上述したように、当該人工皮膚は、生体の皮膚と類似の構成及び厚さを有しているため、生体の皮膚の代用として化合物の皮膚透過性試験に用いることができる。
被験化合物としては、特に制限されず、通常皮膚透過性試験に用いられる化合物であれば何でも用いることができる。
被験化合物を人工皮膚に接触させる接触方法としては、特に制限されないが、被験化合物が液体である場合には、例えば、人工皮膚の表面に直接塗布又は散布することが挙げられ、被験化合物が個体である場合には、溶媒に溶解させた溶液を用いて、同様に人工皮膚の表面に塗布又は散布することが挙げられる。
被験化合物の皮膚透過性の測定は、当業者に周知の皮膚透過性試験法に基づき行うことができる。例えば、化粧品・医薬部外品を対象とした安全性評価については、薬生薬審発1115第1号(平成28年11月15日)のガイダンスに従って試験することができる。
基準値は、被験化合物の種類及び濃度等に基づき適宜設定できる。例えば、基準値が一点である場合には、基準値と比較して高い場合には皮膚透過性が高いと評価することができ、基準値と比較して低い場合には皮膚透過性が低いと評価することができる。また、例えば、基準値は皮膚透過性を段階的に評価するための範囲として設定することもできる。
以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
(実施例1:マウス成熟脂肪細胞を用いた人工脂肪組織の製造)
発明者らは、組織中のコラーゲン密度を増加させるために、コラーゲンマイクロファイバーを用いた三次元組織体の製造方法を開発した(図1)。成熟脂肪細胞を用いた人工脂肪組織は、図1に示す模式図のとおりに以下のように製造した。
発明者らは、組織中のコラーゲン密度を増加させるために、コラーゲンマイクロファイバーを用いた三次元組織体の製造方法を開発した(図1)。成熟脂肪細胞を用いた人工脂肪組織は、図1に示す模式図のとおりに以下のように製造した。
日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来I型コラーゲン凍結乾燥体を10倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水(×10 PBS)に分散し、ホモジナイザーを用いて5分間ホモジナイズすることで、直径が約4.4μmであり、長さが約22.5μmである断片化コラーゲンを得た。得られた断片化コラーゲンを無血清培地(DMEM)で洗浄し、断片化コラーゲンの培地分散液を得た。
血清を含む培地(DMEM)にて濃度が10mg/mLとなるように断片化コラーゲンを分散した。得られた分散液1mL(断片化コラーゲン、約10mg相当)と、DMEM中の1×106cellsの初代成熟マウス脂肪細胞とを24ウェルプレートトランスウェル(IWAKI社製)中で混合した。播種24時間後、上記のトランスウェルを、6mLの培地(DMEM培地、ナカライテスク社製)を含む6ウェルプレート(IWAKI社製)に入れた。成熟脂肪細胞は、4日ごとに培地交換、14日まで培養した。培養開始と共に細胞及び断片化コラーゲンを含む混合物が堆積しているだけで、遠心はしていないので、培養経過とともに自重方向の厚みは減少し、安定していき、14日培養後には厚さ約2mmの三次元組織体が得られた。得られた三次元組織体からなる人工脂肪組織をヘマトキシリン・エオジン(HE)染色及び又は抗ペリリピン抗体による免疫染色で染色し、組織学的評価を行った。また、ナイルレッドを用いて脂質を染色した。生存率は、ライブ/デッドキット(Thermo Fisher Scientific社製)を用いて評価し、脂肪小胞の生存/死亡及び分析の測定は、ImageJソフトウェア(アメリカ国立衛生研究所製)を用いて行った。また、電子顕微鏡を用いて培養7日目及び14日目における脂肪小胞100個の脂肪小胞の直径を測定し、従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織の脂肪細胞と比較した。
従来の二次元培養により人工脂肪組織を製造する方法は以下のように行った。6ウェルプレート(IWAKI社製)中に3×105(cells/ウェル)の初代成熟マウス脂肪細胞を播き、培養した。2mLの培地(DMEM培地、ナカライテスク社製)で培養を続けた。培地は3日毎に交換した。なお、成熟脂肪細胞は脂肪滴の浮力の影響で容器底面に接着しないため、培地に市販のカバーガラスを浮かせ、その下に細胞を接着させて培養した。
HE染色では、成熟脂肪細胞を取り囲む三次元組織体中に高密度の断片化されたコラーゲンが存在することが示された(図2A 矢印)。成熟脂肪細胞は、小さな細胞質及び核を有する典型的な丸い単眼形状を示した(図2A)。
ナイルレッドの脂質染色では、細胞質内の脂肪滴が確認された。成熟脂肪細胞を示す単眼形状の脂肪滴が確認され、三次元組織体内の成熟脂肪細胞の均質で高い再分画が示された(図2B)。14日以上の長時間の培養を行った場合であっても、人工脂肪組織は、2日目の98.5%から14日目の94.6%(図2C グレーが生存、白色が死亡した細胞を示す)の高い生存率で成熟脂肪細胞を良好に維持した。抗ペリリピン抗体による免疫染色の結果から、培養14日目における三次元組織体の成熟した脂肪細胞は、従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織の脂肪細胞と比較して、大きな単眼形状(0日目に54±8μmの脂肪小胞)を維持したことが確認された(図3)。一方、従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織において、成熟脂肪細胞は線維芽細胞様細胞形態に脱分化し、培養14日目における三次元組織体内の成熟脂肪細胞と比較して有意に3.7倍小さい小胞を示した(図4、n>100個の脂肪小胞をカウント、t-検定)。また、断片化コラーゲンを含む三次元組織体からなる人工脂肪組織は、7日目から14日目にかけて脂肪小胞の大きさが維持されていたが、従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織は、7日目から14日目にかけて脂肪小胞の大きさが減少した。このことは、断片化コラーゲンを含む三次元組織体は、従来の二次元培養により製造される人工脂肪組織と比較して、脱分化されるまでの時間が長いため、長期間の維持が可能であり、成熟脂肪細胞の培養時間を少なくとも1週間以上延長することができたことを示す。
(実施例2:ヒト脂肪幹細胞を用いた人工脂肪組織の製造)
脂肪幹細胞を用いた人工脂肪組織は、図1に示す模式図のとおりに以下のように製造した。
脂肪幹細胞を用いた人工脂肪組織は、図1に示す模式図のとおりに以下のように製造した。
日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来I型コラーゲン凍結乾燥体を10倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水(×10 PBS)に分散し、ホモジナイザーを用いて5分間ホモジナイズすることで、直径が約4.4μmであり、長さが約22.5μmである断片化コラーゲンを得た。得られた断片化コラーゲンを無血清培地(DMEM)で洗浄し、断片化コラーゲンの培地分散液を得た。
血清を含む培地(DMEM)にて濃度が10mg/mLとなるように断片化コラーゲンを分散した。得られた分散液300μL(断片化コラーゲン、約3mg相当)と、DMEM中の5×105cellsのヒト脂肪幹細胞とを96ウェルインサート(ACEA Bioscience社製)中で混合した。播種24時間後、200μLの培地(DMEM培地、ナカライテスク社製)を加えた。培地は2日ごとに交換し、19日間培養した。19日間のうち、2日間が増殖期間に相当し、その後の17日間が分化期間に相当する。培養開始と共に細胞及び断片化コラーゲンを含む混合物が堆積しているだけで、遠心はしていないので、培養経過とともに自重方向の厚みは減少し、安定していき、14日培養後には厚さ約2mmの三次元組織体が得られた。分化17日目(培養19日目)の三次元組織体からなる人工脂肪組織をヘマトキシリン・エオジン(HE)染色及び又は抗ペリリピン抗体による免疫染色で染色し、組織学的評価を行った。
HE染色では、三次元組織体中に高密度の断片化されたコラーゲンが存在することが示された(図5 矢印)。また、成熟脂肪細胞を示す大きな丸い単眼形状の脂肪滴が確認された(図5 拡大図)。中には、100μmを超える大きさの成熟脂肪細胞も確認された。
従来の二次元培養により人工脂肪組織を製造する方法は以下のように行った。24ウェルプレート(IWAKI社製)中に、1×104(cells/ウェル)のヒト脂肪幹細胞を播き、培養した。播種後2日間は500μLのD-MEMを用いて培養し、増殖をさせた後、分化促進用の培地に培地交換した。分化促進用の培地は、D-MEMにPGM-2 Singlequot KitPT-9502(LONZA製)を加えたものであり、成長補助剤(Indomethacin、3-イソブチル-1-メチルキサンチン、デキサメタゾン、インスリン)が含まれている。500μLで培養し、培地は週に1回交換した。
従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織は、分化37日目時点でも液滴の状態の脂肪小胞が散見された(図6)。また、ナイルレッドの脂質染色により確認したところ、小さい脂肪滴しか確認されず、断片化コラーゲンを含む三次元組織体のように、100μmを超える大きさの成熟脂肪細胞は確認されなかった。
さらに、従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織は、分化72日目時点でも液滴の状態の脂肪小胞が散見され、すべての脂肪細胞は分化していなかった(図6)。また、より脂肪が増えると、脂肪細胞は離れて培養液中に浮遊し、培養液を交換するのが困難になった。
抗ペリリピン抗体による免疫染色の結果から、培養7日目における三次元組織体の脂肪幹細胞は、従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織の脂肪幹細胞と比較して、大きな単眼形状(7日目に4μm±2μmの脂肪小胞)を形成したことが確認された(図7)。一方、従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織においては、培養7日目における三次元組織体内の脂肪細胞と比較して有意に2倍小さい小胞を示した(図8、n>100個の脂肪小胞をカウント、t-検定)。また、断片化コラーゲンを含む三次元組織体からなる人工脂肪組織は、7日目から14日目にかけて脂肪小胞の大きさが2倍以上(10μm±4μm)となっていたが、従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織は、7日目から14日目にかけて脂肪小胞の大きさはほとんど変わらなかった。
以上により、断片化コラーゲンを含む三次元組織体からなる人工脂肪組織は、従来の二次元培養により製造される人工脂肪組織と比較して、分化が早く進むことが示された。
(実施例3:成熟脂肪細胞を用いた人工皮膚の製造)
成熟脂肪細胞を用いた人工皮膚は、図9に示す模式図のとおりに以下のように製造した。
成熟脂肪細胞を用いた人工皮膚は、図9に示す模式図のとおりに以下のように製造した。
日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来I型コラーゲン凍結乾燥体を10倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水(×10 PBS)に分散し、ホモジナイザーを用いて5分間ホモジナイズすることで、直径が約4.4μmであり、長さが約22.5μmである断片化コラーゲンを得た。得られた断片化コラーゲンを無血清培地(DMEM)で洗浄し、断片化コラーゲンの培地分散液を得た。
血清を含む培地(DMEM)にて濃度が10mg/mLとなるように断片化コラーゲンを分散した。得られた分散液1mL(断片化コラーゲン、約10mg相当)と、ラットの皮下組織から採取した、DMEM中の1×106cellsの成熟ラット脂肪細胞とを24ウェルプレートトランスウェル(IWAKI社製)中で混合した。プレートをインキュベーターに入れ、24時間培養した。
次に、24ウェルのインサートを、PBS(0.04μL/インサート)中の0.04mg/mLフィブロネクチン溶液(#F2006-5G、Sigma社製)でコートし、37℃で20分間インキュベートした。その後、上記断片化コラーゲンの培地分散液1mL(断片化コラーゲン、約10mg相当)と、5×105cellsのヒト皮膚由来線維芽細胞(NHDF)を混合し、100μLを24ウェルのインサートに分配した。プレートをインキュベーターに入れ、24時間培養した。
次に、上記NHDFのコラーゲンゲル上で、インサート中の培地を吸引し、PBS(0.04μL/インサート)中の0.04mg/mLコラーゲンIV溶液でコートし、37℃で少なくとも20分間インキュベートした。NHDFのコラーゲンゲル上に加えたコラーゲンIV溶液を吸引し、NHDFのコラーゲンゲル上に、2×106cellsの正常ヒト表皮角化細胞(#KK-4009、1バイアル=500000細胞、KURABO社製)を加えた。DMEM 5%FBS:EpiLife(#C-2517A、Invitrogen社製)(1:1)培地をインサートの外側に1mL加え、1時間後にインサートの外側に1mLを再度加えた。
内側と外側の培地を静かに吸引し、DMEM 5%FBS:EpiLife(1:1)培地中でアスコルビン酸を100倍に希釈し、インサートの外側に500μLの分化培地として加えた。インサートの内側には培地を加えなかった。分化7日目まで毎日インサートの外の培地を交換した。
上記方法によれば、脂肪組織の培養開始からわずか9日間(脂肪組織の培養24時間+線維芽細胞の培養24時間+角化細胞の分化7日間)で、下部に脂肪組織の層、中間に線維芽細胞の層、上部に角化細胞の層の3層構造の人工皮膚を製造することができる(図9)。
上記のように製造された角化細胞の分化7日目の人工皮膚をヘマトキシリン・エオジン(HE)染色し、組織学的評価を行った。上記人工皮膚は、下部の脂肪細胞を含む層(皮下組織)、中間の線維芽細胞を含む層(真皮組織)、上部の角化細胞を含む層(表皮組織)のいずれの層においても細胞間の距離が適切であり、生体内の皮膚組織に近い構造であることが示された(図10及び図11)。角化細胞は上皮様層を形成しており、角化細胞の分化の形態的な指標の一つである脱核も観察された(図11)。また、角化細胞の分化7日目の人工皮膚は、厚さ(上皮組織の表面から、最下層の皮下組織の底面までの距離)が約4.3mmあり、厚さの点においても生体内の皮膚組織に近い厚さが再現できていることが示された。
脂肪組織の製造に用いる脂肪細胞を1×106cellsから5×105cellsに変更した場合、用いる断片化コラーゲンの量を10mgから15mgに変更した場合にも、上記と同様の結果が示された(図12、図13)。角化細胞の分化時間と3層構造の人工皮膚の厚さの関係を図14に示す。角化細胞の分化3~7日目にかけて、皮膚の厚みの減少が収束し、スタグネーションすることが示された。
(実施例4:三次元組織における脂肪幹細胞の脂肪形成促進)
実施例2と同様にヒト脂肪幹細胞を用いて製造した断片化コラーゲンを含む三次元組織体及び従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織体における、脂肪形成遺伝子の発現をリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)により確認した(図15)。
実施例2と同様にヒト脂肪幹細胞を用いて製造した断片化コラーゲンを含む三次元組織体及び従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織体における、脂肪形成遺伝子の発現をリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)により確認した(図15)。
PureLink RNAマイクロキット(Invitrogen社製)を用いて、キットのプロトコルに従って、上記三次元組織体及び従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織体からトータルRNAを抽出した。抽出したRNAをNanodrop(登録商標)N1000(ThermoFisher Scientific社製)を用いて定量した。High Capacity RNA-to-cDNAキット(Applied Biosystems社製)を用いて、キットのプロトコルに従って、1μgのRNAをcDNAに変換した。PCRは、70ngのcDNAを0.3μMのForward及びReverseプライマーとともにiTaq(登録商標)Universal SYBR Green Supermix(BioRAD社製)を用いて増幅した。使用した各プライマーの配列、RT-PCRの最適増幅サイクル数及び温度条件は表1に示す。cDNA合成及びRT-qPCR反応は、StepOnePlus(登録商標)リアルタイムPCRシステム(ThermoFisher Scientific社製)を用いて行った。
脂肪形成は、前脂肪細胞が未成熟脂肪細胞となる際に最初の初期脂肪形成遺伝子(例えば、FABP4、PPARγ2)を発現し、その後脂肪小胞の脂質蓄積をしながら後期遺伝子(例えば、GLUT4)を発現するというように、増殖段階から分化段階へと切り替わる。初期マーカー及び後期マーカーの発現は、培養期間を通して徐々に増加していることが見いだされたが、三次元組織体と二次元培養により製造した人工脂肪組織体とでは、発現に違いが見られた。上記断片化コラーゲンを含む三次元組織体おけるmRNA量は、二次元培養により製造した人工脂肪組織体と比較して多い傾向にあり、7日目における初期遺伝子FABP4の発現は最大5.5倍であり、21日目における後期遺伝子GLUT4の発現は8.3倍であった(図15)。
PPARγ2遺伝子の発現は、二次元培養により製造した人工脂肪組織体においては増加し続けたが、上記三次元組織体においては、7日目から21日目にかけてわずかに増強した発現プロファイルを示したものの、ほぼ一定であった。三次元組織においては、すでにPPARγ2が一定に発現する段階あり、脂肪形成がより進行していると考えられる。もう一つの初期マーカーFABP4については、三次元組織体では7日目から21日目にかけて概ね一定であった。一方で、二次元培養により製造した人工脂肪組織体では、7日目から21日目にかけて発現の増加が見られた。後期マーカーであるインスリン刺激性GLUT-4の発現は、三次元組織体において14日目から急激に増加した一方で、二次元培養により製造した人工脂肪組織体におけるGLUT-4の発現は非常に弱く観察された。これらの結果より、上記三次元組織体は、二次元培養により製造した人工脂肪組織体と比較して、より分化状態に即した遺伝子発現を示すことが示された。
Claims (1)
- 脂肪細胞を含む細胞と、断片化された細胞外マトリックスとを含む三次元組織体からなる、人工脂肪組織。
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