KR101736544B1 - 3차원 세포배양 시스템 및 이를 이용한 약물 스크리닝 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 종횡 방향으로 각각 2개 이상 일정한 간격으로 이격되어 규칙적으로 배열된 소정의 단면 및 깊이를 갖는 홀을 포함하는 배양공간이 형성되어 있는 3차원 세포배양 시스템에 있어서, 상기 세포배양 시스템은 다공성 고분자로 형성된 것이 특징인 3차원 세포배양 시스템; 상기 3차원 세포배양 시스템 상에 형성된 배양공간에 홀을 포함하여 그 이상의 수위까지 배양배지에 세포를 현탁시킨 세포 현탁액(cell suspension)을 분주하는 제1단계; 및 세포가 홀 내에 트래핑되도록 여분의 배양액을 제거하는 제2단계를 포함하는, 3차원 세포배양 방법; 상기 3차원 세포배양 시스템을 구비하고, 상기 세포배양 시스템의 외각에 상기 세포배양 시스템의 종횡 방향으로 배열된 홀들과 평행하게 상기 홀들을 모두 포함하는 너비로 상기 홀들 보다 깊이 형성된 하나 이상의 약물 담지용 웰을 추가로 포함하는 약물 스크리닝 시스템; 및 약물 스크리닝 시스템에 형성된 배양공간에 홀을 포함하여 그 이상의 수위까지 배양배지에 세포를 현탁시킨 세포 현탁액을 분주하는 제1단계; 세포가 홀 내에 트래핑되도록 여분의 배양액을 제거하는 제2단계; 약물 담지용 웰에 약물을 투입하고 약물을 다공성 고분자의 공극을 통해 확산시켜 세포배양 홀에 전달시키는 제3단계; 및 세포배양 홀에 전달된 약물과 접촉된 세포의 반응을 검출하는 제4단계를 포함하는 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

3차원 세포배양 시스템 및 이를 이용한 약물 스크리닝 시스템{3D cell culture system and drug screening system using the same}

본 발명은 종횡 방향으로 각각 2개 이상 일정한 간격으로 이격되어 규칙적으로 배열된 소정의 단면 및 깊이를 갖는 홀을 포함하는 배양공간이 형성되어 있는 3차원 세포배양 시스템에 있어서, 상기 세포배양 시스템은 다공성 고분자로 형성된 것이 특징인 3차원 세포배양 시스템; 상기 3차원 세포배양 시스템 상에 형성된 배양공간에 홀을 포함하여 그 이상의 수위까지 배양배지에 세포를 현탁시킨 세포 현탁액(cell suspension)을 분주하는 제1단계; 및 세포가 홀 내에 트래핑되도록 여분의 배양액을 제거하는 제2단계를 포함하는, 3차원 세포배양 방법; 상기 3차원 세포배양 시스템을 구비하고, 상기 세포배양 시스템의 외각에 상기 세포배양 시스템의 종횡 방향으로 배열된 홀들과 평행하게, 상기 홀 전체에 액체가 확산될 수 있도록 상기 홀들보다 깊게 형성된 하나 이상의 약물 담지용 웰을 추가로 포함하는 약물 스크리닝 시스템; 및 약물 스크리닝 시스템에 형성된 배양공간에 홀을 포함하여 그 이상의 수위까지 배양배지에 세포를 현탁시킨 세포 현탁액을 분주하는 제1단계; 세포가 홀 내에 트래핑되도록 여분의 배양액을 제거하는 제2단계; 약물 담지용 웰에 약물을 투입하고 약물을 다공성 고분자의 공극을 통해 확산시켜 세포배양 홀에 전달시키는 제3단계; 및 세포배양 홀에 전달된 약물과 접촉된 세포의 반응을 검출하는 제4단계를 포함하는 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다.

세포 수준에서 분석은 대량 조건 스크리닝을 위한 가장 비용 효율적인 방법으로, 일반적으로 많은 생물학 연구자들에게는 필수적인 단계이다. 이와 같은 방법은 장기나 신체에 대해 직접 분석하는 것에 비해 적은 시간 및 노력을 요구하며, 분자 수준의 분석에 비해 보다 신뢰할 만한 결과를 제공할 수 있다. 그러나, 세포 수준에서의 조건 스크리닝 어세이를 수행하는 것은 생명과학 연구실에서는 여전히 힘든 작업이며, 분석을 필요로하는 대상이 되는 조건의 수가 방대함을 고려할 때 고가의 복잡한 과정이다. 또한, 표준 세포배양 플랫폼의 결여 및 세포 효과의 변수 의존성으로 인해, 동일하지 않을 수 있는 변수들로부터의 다른 보고된 결과와의 비교가 어려우며, 경우에 따라서는 상반되는 결과가 보고되기도 하였다.

세포를 기반으로 하는 고속 대량 스크리닝(high throughput screening; HTS)은 방대한 화합물 라이브러리로부터 바람직한 효율 및 안정성을 갖는 약물 후보군의 빠른 동정을 위한 강력한 수단임이 확인되었다. 이에 따라 종양학에 있어서 항암 약물 발굴을 포함한 광범위한 분야에서 약물 발굴을 현저히 가속화할 수 있다. 암의 질병률(morbidity) 및 사망률(mortality)이 증가함에 따라, 종양 세포를 기초로 한 HTS는 신규 항암제 발굴에 있어서 중요한 역할을 하게되었다. 통상적으로 HTS에서 항암제 스크리닝은 평면 고밀도 다중웰 플레이트 상에서 세포 분주 및 약물 투여를 위한 정교하고 값비싼 자동화된 액체-분주 시스템(liquid-dispensing systems)을 이용하여 수행된다. 뿐만 아니라 통상의 바이오메디컬 실험실에서는 사용하기 어려운 어세이 판독을 위한 현미경설비(microscopic facilities)를 필요로 한다.

예컨대, 종양세포는 원래 종양 성장 및 침습성에 필요한 신호를 제공하는 세포-세포 및 세포-기질 상호작용을 포함하는 고도로 상호작용을 하는 3차원(3D) 미세환경에서 존재한다. 그러나, 이러한 조건은 종래의 플라스틱이나 유리를 기반으로 한 2D 평면 배양 시스템에 의해서는 구현될 수 없다. 종양의 경우 3D 종양 미세환경은 종양발생 및 화학요법에 대한 암세포의 반응 모두에 영향을 미치는 것으로 확인되고 있다. 3D 미세환경에서 종양 세포는 악성상태로 부분적으로 분화하며 화학요법에 덜 민감하게 된다. 이 외에, 암 생물학에서 중요한 역할을 하는 성장인자들의 수용체(예컨대, β-인테그린, EGFR)가 3D 배양된 세포에서 발현되었다. 이제까지 전술한 모든 결과를 종합하면 3D 배양 시스템이 실험실 수준에서의 암 연구를 위한 보다 나은 모델로서 이용될 수 있다.

최근의 3D 암세포 배양 시스템은 2D 배양 시스템과 구별되는 세포거동 및 약물 반응을 나타내는 세포 스페로이드를 사용한다. 그러나, 3D 세포 기반 고속 대용량 약물 스크리닝을 위하여 스페로이드를 이동시키는 것은 어렵다. 일반적으로 종양 스페로이드는 행잉 드롭 배양에 의해 또는 조작된 저부착 마이크로웰 플랫폼 상에서 형성되므로, 자동화된 처리 시스템 및 추가적인 시간/시약을 소모하는 단계가 관여하는 후속 약물 테스트를 위해 스페로이드를 회수하여 다중웰 플레이트로 옮겨야 한다. 더욱이, 테스트의 정확도는 행잉 드롭 배양에 의해 형성되는 스페로이드의 불균일한 크기 및 작업에 의한 이동 과정동안 각 테스트를 위한 조절되지 않은 스페로이드의 수에 의해 영향을 받는다. 또한, 약물 테스트를 위한 배지 교환 과정에서 스페로이드가 쉽게 씻겨나갈 수 있으므로 불가피한 세포 손실이 존재한다.

이에 본 발명자들은, 균일한 수 및/또는 크기로 세포를 3D 배양하고 형성된 세포 스페로이드를 이동하지 않고 약물 스크리닝할 수 있는 3D 세포 배양 시스템 및 약물 스크리닝 시스템을 발굴하고자 연구 노력한 결과, 종횡으로 규칙적으로 배열된 소정의 단면 및 깊이를 갖는 복수의 홀을 포함하며, 다공성 고분자로 형성된 3차원 세포배양 시스템 및 그 외각에 약물을 담지할 수 있는 웰을 추가로 구비한 스크리닝 시스템을 제작하였고, 상기 홀에 세포를 3차원 배양하고 그 외각의 위치한 약물 담지용 웰에 약물을 투입함으로써, 약물 스크리닝을 위하여 배양된 세포를 옮기거나 할 필요 없이, 확산에 의해 약물을 담지한 웰로부터의 거리에 따라 다른 농도로 처리할 수 있고, 특히, 2종 이상의 약물을 서로 독립적인 농도 구배로 처리할 수 있으므로, 유효 약물 농도 또는 2종 이상의 약물 병용시 시너지적 효과를 나타낼 수 있는 유효 농도 조합을 간단히 결정할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

하나의 양태로서, 본 발명은 종횡 방향으로 각각 2개 이상 일정한 간격으로 이격되어 규칙적으로 배열된 소정의 단면 및 깊이를 갖는 홀을 포함하는 배양공간이 형성되어 있는 3차원 세포배양 시스템에 있어서, 상기 세포배양 시스템은 다공성 고분자로 형성된 것이 특징인 3차원 세포배양 시스템을 제공한다.

바람직하게, 상기 세포배양 시스템은 외부에 격벽을 추가로 포함하여 홀 표면 이상의 수위까지 배지를 수용하도록 할 수 있다.

바람직하게, 상기 다공성 고분자는 아가로스, 폴리아크릴아미드, 히알루론산, 폴리에틸렌글리콜, 키토산, 칼슘알지네이트 또는 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 보다 바람직하게, 상기 다공성 고분자는 아가로스일 수 있다. 상기 아가로스는 일반적인 3차원 세포배양에서 세포 성장을 위해 사용되는 물질이므로 상기 재질의 선택은 세포배양에 바람직한 효과를 나타낼 수 있다.

바람직하게, 본 발명의 3차원 세포배양 시스템은 1.5 내지 4 중량%의 다공성 고분자 용액으로 제조할 수 있다. 보다 바람직하게는 2.5 내지 3 중량%의 다공성 고분자 용액으로 제조할 수 있다. 고분자 용액의 농도가 1.5 중량% 미만인 경우 제조되는 세포배양 시스템은 형태를 유지할 수 있을 만큼의 경도를 가질 수 없다. 또는 고분자 네트워크가 엉성하게 형성되어 기공이 거대해져 미세구조를 유지하는데 어려움이 있다. 한편, 고분자 용액의 농도가 4 중량% 초과하는 경우 제조되는 세포배양 시스템의 기공이 조밀해져 물질의 확산이 원활하지 못할 수 있다.

구체적으로, 배양하고자 하는 세포의 종류, 테스트하고자 하는 후보 약물의 종류, 분자 크기 및 확산 속도 등을 고려하여 적합한 다공성 고분자의 종류 및 농도를 조합하여 결정할 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명은 상기 3차원 세포배양 시스템 상에 형성된 배양공간에 홀을 포함하여 그 이상의 수위까지 배양배지에 세포를 현탁시킨 세포 현탁액(cell suspension)을 분주하는 제1단계; 및 세포가 홀 내에 트래핑되도록 여분의 배양액을 제거하는 제2단계를 포함하는, 3차원 세포배양 방법을 제공한다.

바람직하게, 본 발명의 3차원 세포배양 시스템에서 세포는 스페로이드(spheroid) 형태로 배양될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 3차원 세포배양 시스템을 구비하고, 상기 세포배양 시스템의 외각에 상기 세포배양 시스템의 종횡 방향으로 배열된 홀들과 평행하게 상기 홀들을 모두 포함하는 너비로 상기 홀들 보다 깊이 형성된 하나 이상의 약물 담지용 웰을 추가로 포함하는 약물 스크리닝 시스템을 제공한다.

바람직하게, 본 발명의 약물 스크리닝 시스템은 2 내지 4개의 웰을 구비하여 2 내지 4개의 복수의 약물을 동시에 스크리닝할 수 있는 것이 특징이다.

따라서, 본 발명의 약물 스크리닝 시스템은 각각의 약물을 담지한 웰로부터의 거리에 따라 배양된 세포를 포함하는 동일한 홀 내에 각기 다른 농도의 2종 이상의 약물을 포함할 수 있으므로, 2종 이상의 병용하고자 하는 약물의 유효 조성비를 스크리닝하는 데에 유용하게 사용될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약물 스크리닝 시스템에 형성된 배양공간에 홀을 포함하여 그 이상의 수위까지 배양배지에 세포를 현탁시킨 세포 현탁액을 분주하는 제1단계; 세포가 홀 내에 트래핑되도록 여분의 배양액을 제거하는 제2단계; 약물 담지용 웰에 약물을 투입하고 약물을 다공성 고분자의 공극을 통해 확산시켜 세포배양 홀에 전달시키는 제3단계; 및 세포배양 홀에 전달된 약물과 접촉된 세포의 반응을 검출하는 제4단계를 포함하는 약물 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 배양공간을 포함하는 약물 스크리닝 시스템을 이용한 약물 스크리닝 방법은 상기 배양공간 내에서 3차원 배양된 세포를 약물 스크리닝을 위해 별도로 구비된 용기에 배양된 세포를 옮기는 단계를 필요로 하지 않으므로 이 과정에서 발생할 수 있는 세포의 손상이나 손실을 차단할 수 있다.

또한, 약물이 확산에 의해 이동하므로 농도 구배를 위해 별도로 희석하여 처리할 필요없이 단회 처리와 소정의 시간동안 인큐베이션하는 간단한 방법으로 다양한 농도로 약물을 다중웰에 동시에 처리할 수 있는 것이 특징이다.

바람직하게, 상기 세포의 반응은 세포 성장 또는 증식 억제, 또는 세포 사멸로서, 이를 모니터링함으로써 약리활성 및/또는 세포독성을 확인할 수 있다.

본 발명의 세포배양 시스템 또는 약물 스크리닝 시스템은 다공성 고분자로 제조되고 종횡으로 규칙적으로 배열된 소정의 단면 및 깊이를 갖는 복수의 홀을 포함하며, 그 외각에 배열된 홀과 평행하게 위치는 상기 홀보다 깊은 약물을 담지할 수 있는 웰을 구비하였으므로, 상기 홀에 세포를 3차원 배양하고 그 외각의 위치한 약물 담지용 웰에 약물을 투입함으로써, 약물 스크리닝을 위하여 배양된 세포를 옮기거나 할 필요 없이, 확산에 의해 약물을 담지한 웰로부터의 거리에 따라 다른 농도로 처리할 수 있고, 특히, 2종 이상의 약물을 서로 독립적인 농도 구배로 처리할 수 있으므로, 유효 약물 농도 또는 2종 이상의 약물 병용시 시너지적 효과를 나타낼 수 있는 유효 농도 조합을 간단히 결정할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 세포배양 시스템 및 이를 기반으로 하는 다중 약물 스크리닝 시스템 제조용 플라스틱 몰드의 구체적인 형태를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 아가로스를 이용하여 제조한 3차원 세포배양 시스템 및 이를 기반으로 하는 다중 약물 스크리닝 시스템, 및 상기 다중 약물 스크리닝 시스템으로부터 구현되는 약물의 농도 구배를 가시화하여 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 세포배양 시스템을 구성하는 개별 홀의 형태 및 규격을 예시하는 3차원 이미지를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 세포배양 시스템을 이용하여 세포를 3차원 배양하는 방법을 개략적으로 나타낸 도이다. 구체적으로 1) 균일하게 분산시킨 세포 현탁액을 세포배양 시스템의 홀을 완전히 커버할 수 있는 충분한 높이까지 고르게 채우고, 2) 모세관 현상에 의해 세포가 홀에 포집될 수 있도록 배지를 서서히 제거하였다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 세포배양 시스템의 각 홀 내에서 배양된 치수 줄기세포 스페로이드(dental pulp stem cells spheroid)를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 3% 아가로스를 이용하여 제조한 다중 약물 스크리닝 시스템에서의 약물 확산을 FITC를 이용하여 가시화하여 나타낸 도이다. 상단은 각각 흑백 및 컬러로 나타낸 FITC를 투입한 웰의 이미지를 나타낸 도이며, 하단은 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 상기 도면으로부터 각 웰의 회색값(grey value)을 측정한 후, FITC 표준곡선을 이용하여 회색값을 FITC 농도로 변환하여 정량적으로 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 아가로스를 이용한 다중 웰 3차원 세포 배양 시스템의 제조

본 발명의 세포배양 시스템 제조를 위하여 플라스틱 몰드를 사용하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 종횡 방향으로 각각 10줄씩 100개의 홈이 형성된 플라스틱 몰드로, 상기 몰드에 용융상태의 아가로스를 부어 사출한 후 세포배양 시스템을 제작하였다. 제작된 세포배양 시스템의 사진을 도 2에 나타내었다. 또한, 약물을 담지할 수 있는 2개의 서로 인접한 웰에 서로 다른 색(파란색 및 노란색)의 염료를 투입하고 12시간 동안 방치하여 2종의 약물이 각각 독립적으로 거리에 따라 확산되는 것을 육안으로 확인하였다. 이로부터, 각 웰에 서로 다른 약물을 투입할 경우, 세포가 배양되는 각 홀에 서로 독립적으로 거리에 따라 약물이 확산되어 각기 다른 농도로 처리될 수 있도록 할 수 있음을 확인하였다.

실시예 2: 다중 웰 3차원 세포 배양 시스템에서 세포의 배양

아가로스를 이용하여 제작된 3차원 세포 배양 시스템을 30분 동안 자외선으로 멸균하고, 세포 배양 배지에 담궈 12시간 동안 냉장 보관하였다. 세포 배양 접시에서 배양된 세포를 850 ~ 870 세포/ml 농도의 현탁액으로 준비하였다. 상기 시스템의 배양공간에 홀을 포함하여 그 이상의 수위까지 상기 준비한 세포 현탁액을 분주하고, 세포가 홀에 포집될 수 있도록 홀 이상 수위의 세포 현탁액을 제거하였다. 이와 같이 세포를 분주한 세포 배양 시스템을 37C° 5% CO₂인큐베이터에서 배양하였다.

실시예 3: 형광염료를 이용한 다중 웰 약물 스크리닝 시스템에서 약물의 확산 분석

3% 아가로스를 이용하여 상기 실시예 1의 방법으로 제조한, 외각에 약물을 담지할 수 있는 웰을 본 발명의 세포 배양 시스템의 상기 약물 담지 웰에 180 μg/ml 농도의 FITC를 투입하였다. 일반적인 세포배양 조건인 5% 인큐베이터에 12시간 동안 보관하였다. Multispectral InVivo 이미징 시스템을 이용하여 FITC의 형광을 측정하였다. ImageJ 프로그램을 사용하여 측정된 형광을 정량적으로 분석하였다. FITC 용액에 대한 표준곡선을 이용한 비색법으로 평균 회색값을 정량하였다. 웰 어레이에서 FITC의 농도를 플롯하였으며, 각 실험은 3회 반복하여 평균하였다. 측정된 결과는 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타난 바와 같이, 일정한 구간 내의 어레이에서 측정된 FITC의 농도는 거리에 선형적으로 비례하여 감소하였다.

Claims (11)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 약물이 통과될 수 있도록 1.5 내지 4중량% 아가로스 용액으로 제조된 구조물을 구비한 약물 스크리닝 시스템으로서,
   상기 구조물은
   (i) 종횡 방향으로 각각 2개 이상 일정한 간격으로 이격되어 규칙적으로 배열된 소정의 단면 및 깊이를 갖는 홀을 포함하는 배양공간이 형성되어 있는 3차원 세포배양 시스템;
   (ii) 상기 세포배양 시스템의 외각에 홀 간 제1격벽의 높이 보다 높게 형성되어, 제1격벽 보다 높은 수위까지 세포 현탁액을 세포배양 시스템에 수용할 수 있도록 형성된 제2격벽; 및
   (iii) 상기 제2격벽의 외각에, 상기 세포배양 시스템의 종 방향으로 배열된 홀들과 평행하게 상기 홀들을 모두 포함하는 너비로 상기 홀들 보다 깊이 형성된 1개 내지 2개의 약물 담지용 웰(a)과 상기 세포배양 시스템의 횡 방향으로 배열된 홀들과 평행하게 상기 홀들을 모두 포함하는 너비로 상기 홀들 보다 깊이 형성된 1개 내지 2개의 약물 담지용 웰(b)을 포함하여,
   2종 이상의 병용하고자 하는 약물의 유효 조성비를 스크리닝하는 것이 특징인 약물 스크리닝 시스템.
   
8. 삭제
9. 삭제
10. 제7항의 약물 스크리닝 시스템의 3차원 세포배양 시스템의 배양공간에 포함된 홀에, 홀의 깊이 이상의 수위까지 배양배지에 세포를 현탁시킨 세포 현탁액을 분주하는 제1단계;
    세포가 홀 내에 트래핑되도록 여분의 배양액을 제거하는 제2단계;
    약물 담지용 웰에 약물을 투입하고 약물을 다공성 고분자의 공극을 통해 확산시켜 세포배양 홀에 전달시키는 제3단계; 및
    세포배양 홀에 전달된 약물과 접촉된 세포의 반응을 검출하는 제4단계를 포함하는 약물 스크리닝 방법.
    
11. 제10항에 있어서,
    상기 세포의 반응은 세포 성장 또는 증식 억제, 또는 세포 사멸인 약물 스크리닝 방법.

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