JP2015529523A - 組織製造方法 - Google Patents

Abstract

表面上に細胞及び細胞外マトリクスを沈着することを含む、インビトロ又はエクスビボにおいて組織及び器官を作出する方法、更にはそのような組織及び器官の使用方法が、本明細書において提供される。一実施態様において、本明細書記載の組織（例えば3次元組織）及び器官を作出する方法に従い使用される細胞及びECMは、同じ組成物の一部として沈着される。別の実施態様において、本明細書記載の組織（例えば3次元組織）及び器官を作出する方法に従い使用される細胞及びECMは、異なる組成物の一部として沈着される。【選択図】図１

Description

本出願は、2012年9月4日に出願された米国特許仮出願第61/696,479号の優先権を主張するものであり、その出願の開示は、その全体が引用により本明細書中に組み込まれている。

（1. 緒言）
表面上に細胞及び／又は細胞外マトリクスを沈着することを含む、インビトロ又はエクスビボにおいて組織及び器官を作製する方法、並びにそのような組織及び器官を使用する方法が、本明細書において提供される。

（2. 背景）
バイオプリンティング（例えば、器官プリンティング）は、生体材料に沈着する、改変されたインクジェットプリンターなどの印刷装置が関与する、研究及び設計(engineering)の分野である。この技術は、細胞を含む液滴の迅速な作出及び放出、それに続く表面上へのそれらの正確な沈着に関与している。バイオプリンティングにより、基本的細胞材料を使用し設計された組織及び器官は、今日標準的な移植方策において使用されるドナー由来の組織及び器官の有望な代替品を表している。

（3. 概要）
一態様において、組織を形成するために、インビトロ又はエクスビボにおいて表面上に細胞及び／又は細胞外マトリクス(ECM)を沈着することを含む、組織（例えば3次元組織）又は器官を作製する方法が、本明細書において提供される。本明細書記載の組織（例えば3次元組織）及び器官を作製する方法に従い使用することができる細胞は、下記4.1.1項に説明されている。本明細書記載の組織（例えば3次元組織）及び器官を作製する方法に従い設計することができる組織及び器官は、下記4.1.2項に説明されている。本明細書記載の組織（例えば3次元組織）及び器官を作製する方法に従い使用することができるECMは、下記4.1.3項に説明されている。本明細書記載の組織（例えば3次元組織）及び器官を作製する方法に従いその上に細胞、ECM、及び／又は追加成分が沈着され得る表面は、下記4.1.4項に説明されている。

一実施態様において、本明細書記載の組織（例えば3次元組織）及び器官を作製する方法に従い使用される細胞及びECMは、同じ組成物の一部として沈着される。別の実施態様において、本明細書記載の組織（例えば3次元組織）及び器官を作製する方法に従い使用される細胞及びECMは、異なる組成物の一部として沈着される。具体的実施態様において、本明細書記載の組織（例えば3次元組織）及び器官を作製する方法に従い使用されるECMは、流動性ECMを含む。別の具体的実施態様において、本明細書記載の組織（例えば3次元組織）及び器官を作製する方法に従い使用される細胞及びECMは、異なる組成物の一部として沈着され、例えばここでECMは、例えば細胞の沈着前に、細胞とは別に沈着されるか、及び／又はここでECMは、細胞の沈着に先立ち脱水される。ECMが脱水される実施態様において、これは、後に所望の時点で、例えばECM及び細胞が沈着される表面上に細胞が沈着される時点で、再水和されてよい。

特定の実施態様において、本明細書記載のインビボにおいて3次元組織を形成する方法において使用される細胞及びECMは、例えば、増殖因子（類）、架橋剤（類）、重合可能なモノマー（類）、ポリマー、ヒドロゲル（類）などの1種以上の追加成分の沈着と同時に、その前に、又はその後に、表面上に沈着される。特定の実施態様において、その上に該細胞及びECMが沈着される表面は、本明細書記載の方法に従いバイオプリントされている表面である。

特定の実施態様において、本明細書記載の組織（例えば3次元組織）及び器官を作製する方法に従い使用される細胞及び流動性ECM（並びに追加成分）は、該表面上にプリントされ、例えば細胞及びECMはバイオプリントされる。特定の実施態様において、その上に該細胞及びECMがバイオプリントされる表面は、本明細書記載の方法に従いバイオプリントされている表面である。

特定の実施態様において、本明細書記載の組織（例えば3次元組織）及び器官を作製する方法に従い使用される細胞及び／又は流動性ECM（並びに追加成分）は、該表面上にプリントされず、例えば細胞及びECMは、バイオプリントされないが、むしろバイオプリンティングを含まない方法により該表面へ塗布される。特定の実施態様において、表面上にバイオプリントされない細胞及び／又は流動性ECM（並びに追加成分）は、バイオプリントされた表面に塗布され、例えば細胞及び／又は流動性ECM（並びに追加成分）は、足場、例えば合成マトリクスなどの合成足場へ、塗布される。具体的実施態様において、細胞及び／又は流動性ECM（並びに追加成分）は、足場（例えば表面）の一部のみ、例えば片側に塗布される。別の具体的実施態様において、細胞及び／又は流動性ECM（並びに追加成分）は、足場の全ての側に塗布され、すなわち、足場全体は、それに塗布された細胞及び／又は流動性ECMを有する。別の具体的実施態様において、足場は、ポリカプロラクトン(PCL)である。

特定の実施態様において、その上に細胞、ECM、及び／又は追加成分が本明細書記載の組織（例えば3次元組織）及び器官を作製する方法に従い沈着され得る表面は、人工表面、すなわち、人為的に製造された表面を含む。別の具体的実施態様において、その上に細胞、ECM、及び／又は追加成分が本明細書記載の組織（例えば3次元組織）及び器官を作製する方法に従い沈着され得る表面は、対象（例えばヒト対象）から摘出された組織又は器官（又はそれらの一部分）を含む。特定の実施態様において、対象から摘出された該組織又は器官の表面は、脱細胞化され、例えば組織又は器官の表面の全て又は一部から細胞を除去するように処理され得る。特定の実施態様において、その上に細胞、ECM、及び／又は追加成分が本明細書記載の組織（例えば3次元組織）及び器官を作製する方法に従い沈着され得る表面は、2次元である。特定の実施態様において、その上に細胞、ECM、及び／又は追加成分が本明細書記載の組織（例えば3次元組織）及び器官を作製する方法に従い沈着され得る表面は、3次元である。具体的実施態様において、その上に細胞、ECM、及び／又は追加成分が本明細書記載の組織（例えば3次元組織）及び器官を作製する方法に従い沈着され得る表面は、バイオプリントされた、例えば本明細書記載の方法に従いバイオプリントされた表面である。具体的実施態様において、表面は、ポリカプロラクトン(PCL)である。

別の態様において、本明細書記載の方法を使用し作製される組織及び器官、更にはそのような組織及び器官の使用方法が、本明細書において提供される。

特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い設計される組織（例えば3次元組織）及び器官は、植皮及び外科的移植手法を含む、移植手法に使用される。

特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い設計される組織（例えば3次元組織）及び器官は、実験的手法、例えば、薬物又は化合物の該組織又は器官に対する作用を評価するために使用される。

別の態様において、細胞及びECM（例えば流動性ECM）を含有する組成物が、本明細書において提供され、ここで該組成物は、本明細書記載の方法における使用に適している。同じく、1個以上の容器、該組成物、並びに本明細書記載の1以上の方法に従う該組成物の使用に関する指示書を含むキットも、本明細書において提供される。

（3.1. 図面の簡単な説明）
図1は、様々な角度でバイオプリントされたポリカプロラクトン(PCL)を含有する足場、及び様々な細孔サイズの足場が作製されたそのような方法を描いている。

図2は、その上に細胞外マトリクス(ECM)が、足場の両側に塗布され、引き続き脱水されたバイオプリントされた足場の複数の図を描いている。

図3は、細胞増殖アッセイの結果を描いている。バイオプリントされたPCL及び脱水されたECMを含むハイブリッド足場上で培養された胎盤幹細胞は、8日培養期間にわたり増殖する。

図4は、細胞生存能アッセイの結果を描いている。バイオプリントされたPCL及び脱水されたECMを含むハイブリッド足場上で培養された胎盤幹細胞は、8日培養期間にわたり、増殖して生存を維持する。

図5は、PCL、ECM、及び胎盤幹細胞を含み、それらのそれぞれは、層（PCL及びECM/細胞の層）としてバイオプリントされた、損傷がない3次元ハイブリッド足場を描いている。

図6は、胎盤幹細胞が、7日培養期間中、3次元バイオプリントされた足場内に分散することを明らかにしている。

図7は、細胞生存度アッセイの結果を描いている。ECM及びPCLにバイオプリントされて3次元ハイブリッド足場を形成する胎盤幹細胞は、7日培養期間中、増殖して生存を維持する。

図8は、ECM及びPCLと共にバイオプリントされて3次元ハイブリッド足場を形成する幹細胞が、7日培養期間中、ハイブリッド足場内のECM内に広がることを明らかにしている。

図9は、細胞増殖アッセイの結果を描いている。PCL、ECM、及び胎盤幹細胞のバイオプリンティングにより作製された3次元ハイブリッド足場内で培養された胎盤幹細胞は、7日培養期間中増殖する。

図10は、PCL、胎盤のECM、及びインスリン-産生細胞（β-TC-6細胞）を含有するバイオプリントされた足場を描いている。

図11は、細胞増殖アッセイの結果を描いている。PCL、胎盤のECM、及びインスリン-産生細胞を含有するバイオプリントされた足場内のインスリン-産生細胞（β-TC-6細胞）の数は、14日培養期間にわたって、一定であり続けた。

図12は、PCL、胎盤のECM、及びインスリン-産生細胞（β-TC-6細胞）を含有するバイオプリントされた足場からのインスリン生成レベルを描いている。

図13は、グルコースチャレンジへの曝露後(A)又は対照条件下(B、C)の、PCL、胎盤のECM、及びインスリン-産生細胞（β-TC-6細胞）を含有するバイオプリントされた足場からのインスリン生成レベルを描いている。

（4. 詳細な説明）
一態様において、組織を形成するために、インビトロ又はエクスビボにおいて表面上に細胞及び細胞外マトリクス(ECM)を沈着することを含む、組織（例えば3次元組織）又は器官を作製する方法が、本明細書において提供される。本明細書記載の組織（例えば3次元組織）及び器官を作製する方法に従い使用することができる細胞は、下記4.1.1項に説明されている。本明細書記載の組織（例えば3次元組織）及び器官を作製する方法に従い設計することができる組織及び器官は、下記4.1.2項に説明されている。本明細書記載の組織（例えば3次元組織）及び器官を作製する方法に従い使用することができるECMは、下記4.1.3項に説明されている。本明細書記載の組織（例えば3次元組織）及び器官を作製する方法に従いその上に細胞、ECM、及び／又は追加成分が沈着され得る表面は、下記4.1.4項に説明されている。

具体的実施態様において、該組織又は器官を形成するために、インビトロ又はエクスビボにおいて表面上に細胞及びECMを沈着することを含む、組織（例えば3次元組織）又は器官を作製する方法が、本明細書において提供される。

別の具体的実施態様において、該組織又は器官を形成するために、インビトロ又はエクスビボにおいて表面上に細胞及びECMを沈着することを含む、組織（例えば3次元組織）又は器官を作製する方法であって、ここで該ECMは、流動性ECMを含み、且つここで該細胞及び該流動性ECMは、同じ組成物の一部として配合される方法が、本明細書において提供される。具体的実施態様において、該細胞及び該ECMは、バイオプリンターを用いて沈着される。別の具体的実施態様において、該細胞は、単独の細胞型を含む。別の具体的実施態様において、該細胞は、2種以上の細胞型を含む。

別の具体的実施態様において、該組織又は器官を形成するために、インビトロ又はエクスビボにおいて表面上に細胞及びECMを沈着することを含む、組織（例えば3次元組織）又は器官を作製する方法であって、ここで該ECMは、流動性ECMを含み、且つここで該細胞及び該流動性ECMは、個別の組成物の一部として配合される方法が、本明細書において提供される。具体的実施態様において、該細胞及び該ECMは、バイオプリンターを用いて沈着される。別の具体的実施態様において、該細胞は、単独の細胞型を含む。別の具体的実施態様において、該細胞は、2種以上の細胞型を含む。

別の具体的実施態様において、該組織又は器官を形成するために、インビトロ又はエクスビボにおいて表面上に細胞及びECMを沈着することを含む、組織（例えば3次元組織）又は器官を作製する方法であって、ここで該ECMは、流動性ECMを含み、且つここで該細胞及び該流動性ECMは、個別の組成物の一部として配合される方法が、本明細書において提供される。具体的実施態様において、該細胞及び該ECMは、バイオプリンターを用いて沈着される。別の具体的実施態様において、該細胞は、単独の細胞型を含む。別の具体的実施態様において、該細胞は、2種以上の細胞型を含む。

別の具体的実施態様において、該組織又は器官を形成するために、インビトロ又はエクスビボにおいて表面上に細胞、ECM、及び1種以上の追加成分を沈着することを含む、組織（例えば3次元組織）又は器官を作製する方法が、本明細書において提供される。

別の具体的実施態様において、該組織又は器官を形成するために、インビトロ又はエクスビボにおいて表面上に細胞、ECM、及び1種以上の追加成分を沈着することを含む、組織（例えば3次元組織）又は器官を作製する方法が、本明細書において提供される。具体的実施態様において、該細胞、該ECM、及び該1種以上の追加成分は、バイオプリンターを用いて沈着される。別の具体的実施態様において、該細胞は、単独の細胞型を含む。別の具体的実施態様において、該細胞は、2種以上の細胞型を含む。別の具体的実施態様において、該細胞、該ECM、及び該1種以上の追加成分は、同じ組成物の一部として配合される。別の具体的実施態様において、該細胞、該ECM、及び該1種以上の追加成分は、個別の組成物の一部として配合される。別の具体的実施態様において、該1種以上の追加成分は、増殖因子、重合可能なモノマー、架橋剤、ポリマー、又はヒドロゲルである。

特定の実施態様において、その上に細胞、ECM、及び／又は追加成分が本明細書記載の組織（例えば3次元組織）及び器官を作製する方法に従い沈着され得る表面は、人工表面、すなわち、人為的に製造された表面を含む。別の具体的実施態様において、その上に細胞、ECM、及び／又は追加成分が本明細書記載の組織（例えば3次元組織）及び器官を作製する方法に従い沈着され得る表面は、対象（例えばヒト対象）から摘出された組織又は器官（又はそれらの一部分）を含む。特定の実施態様において、対象から摘出された該組織又は器官の表面は、脱細胞化され、例えば、組織又は器官の表面の全て又は一部から細胞を除去するように処理され得る。特定の実施態様において、その上に細胞、ECM、及び／又は追加成分が本明細書記載の組織（例えば3次元組織）及び器官を作製する方法に従い沈着され得る表面は、2次元である。特定の実施態様において、その上に細胞、ECM、及び／又は追加成分が本明細書記載の組織（例えば3次元組織）及び器官を作製する方法に従い沈着され得る表面は、3次元である。具体的実施態様において、その上に細胞、ECM、及び／又は追加成分が本明細書記載の組織（例えば3次元組織）及び器官を作製する方法に従い沈着され得る表面は、バイオプリントされた、例えば、本明細書記載の方法に従いバイオプリントされた表面である。具体的実施態様において、表面は、合成材料、例えば合成ポリマーを含む。別の具体的実施態様において、合成ポリマーは、PCLである。

特定の実施態様において、細胞及びECM（例えば流動性ECM）は、同時に印刷されないが、層で印刷される。具体的実施態様において、細胞の層が、表面上に印刷され、それにECM層の印刷が続く。別の具体的実施態様において、ECM層が、表面上に印刷され、それに細胞層の印刷が続く。特定の実施態様において、ECMの複数層が表面上に印刷され、それに細胞の複数層の印刷が続くことができ、その逆もまたあてはまる。同様に、細胞及び／又はECMの印刷と同時、前に又は後に印刷される追加成分は、本明細書記載の方法に従い細胞とECMの間に層化されることができる。

特定の実施態様において、細胞及びECM（例えば流動性ECM）は、その上に印刷される表面が、細胞及びECMの両方により全体が被覆されるように、印刷される。他の実施態様において、細胞及びECM（例えば流動性ECM）は、その上に印刷される表面が、細胞及びECMの両方により部分的に被覆されるように、印刷される。

特定の実施態様において、細胞及びECM（例えば流動性ECM）は、その上に印刷される表面が、特定の所望の領域が細胞により被覆され；並びに、特定の所望の領域がECMにより被覆されるように、印刷され、ここでそのような特定の領域は、重なってもよく、重ならなくともよい。

特定の実施態様において、細胞及びECM（例えば流動性ECM）は、3次元的に表面上に印刷されてよい。本明細書において使用される「3次元プリンティング」とは、バイオプリンターのプリントヘッドが、3次元表面の下側、上側、及び周りを移動するような、例えばプリンターヘッドが、特定された経路に沿って回転するように、機械的に制御されるプリンティングプロセスをいう。本明細書において使用される3次元プリンティングは、印刷が、平坦／平面／2次元の表面上に組織を構築するよう開始することにより実行される、当該技術分野において公知である標準バイオプリンティング方法とは対照的である。

一実施態様において、ECMは、インビトロ又はエクスビボにおいて表面（例えば人工装具又は骨）上に印刷され、且つ細胞は、標準の細胞培養方策を用い、ECMを含む該表面上に、遅れて播種される。その後そのような表面は、対象へ移植される。別の実施態様において、ECMは、インビトロ又はエクスビボにおいて表面（例えば人工装具又は骨）上に印刷され、且つECMを含む該表面は、対象へ移植され、ここで対象の細胞は、該表面に接着されるか及び／又は表面上で成長される。

具体的実施態様において、該組織を形成するために、インビトロ又はエクスビボにおいて表面上に細胞及びECMを沈着することを含む、組織を作製する方法であって、ここで該表面が、内面及び外面を有する骨を含み、並びにここで第一の細胞型を含む第一の細胞組成物が、該内面上に印刷され、且つ第二の細胞型を含む第二の細胞組成物が、該外面上に印刷される方法が、本明細書において提供される。本明細書において使用される骨の「内面」とは、間質又は筋肉組織に対して位置することが意図された骨の面を表し、並びに骨の「外面」とは、レシピエントの体の外部に曝されることが意図された骨の面を表す。この実施態様に従い、この内面は、例えば、間質細胞、脂肪組織、間葉系幹細胞、筋細胞、又はそれらの組合せにより、部分的に又は全体が被覆されてよく、並びにこの外面は、例えば真皮細胞により、部分的に又は全体が被覆されてよい。具体的実施態様において、該方法は、更に1種の追加成分（例えば架橋剤）の沈着を追加的に含む。別の具体的実施態様において、該印刷は、3次元的に実施される。

具体的実施態様において、肝臓を形成するために、インビトロ又はエクスビボにおいて表面上に細胞及びECMを沈着することを含み、ここで該表面は、肝臓組織を含む、該肝臓を作製する方法が、本明細書において提供される。具体的実施態様において、肝臓組織は、作製される肝臓が移植されることが意図されている対象から入手される。別の具体的実施態様において、肝臓組織は、作製される肝臓が移植されることが意図された対象からは入手されない（例えば肝臓組織は、生存ドナー又は死体ドナーから入手される）。別の具体的実施態様において、沈着される該細胞は、肝臓細胞（例えば肝細胞）である。具体的実施態様において、該方法は、更に1種の追加成分（例えば架橋剤）の沈着を追加的に含む。別の具体的実施態様において、該印刷は、3次元的に実行される。

具体的実施態様において、皮膚を形成するために、インビトロ又はエクスビボにおいて表面上に細胞及びECMを沈着することを含み、ここで該表面は、皮膚組織を含む、該皮膚を作製する方法が、本明細書において提供される。具体的実施態様において、皮膚組織は、作製される皮膚が移植されることが意図された対象から入手される。別の具体的実施態様において、皮膚組織は、作製される皮膚が移植されることが意図された対象からは入手されない（例えば皮膚組織は、生存ドナー又は死体ドナーから入手される）。別の具体的実施態様において、沈着される該細胞は、皮膚細胞（例えば上皮細胞）である。具体的実施態様において、該方法は、更に1種の追加成分（例えば架橋剤）の沈着を追加的に含む。別の具体的実施態様において、該印刷は、3次元的に実行される。

（4.1 バイオプリンティング）
本明細書において使用される「バイオプリンティング」は一般に、例えば、インクジェットプリンティング技術等の標準的又は改変された印刷技術を使用する、生細胞に加え、他の成分（例えば、流動性ECM；合成マトリクス）の表面上への沈着をいう。ヒドロゲルと組み合わせた細胞を含む、表面上への細胞沈着及び細胞バイオプリンティングの基本的方法は、Warrenらの米国特許第6,986,739号、Bolandらの米国特許第7,051,654号、Yooらの米国特許出願2009/0208466及びXuらの米国特許出願2009/0208577に記載されており、これら各文献の開示はそれらの全体が引用により本明細書中に組み込まれている。加えて、本明細書で提供される組織及び器官の製造に適したバイオプリンターは、例えばEnvisiontec社(Gladbeck、ドイツ国)製3D-Bioplotter(登録商標)、及びOrganovo社(San Diego、CA)製NovoGen MMXバイオプリンター(登録商標)等市販されている。

本明細書記載の方法において使用されるバイオプリンターは、例えば、プリンタードライバーソフトウェア及び／又はプリンターの物理的組成(makeup)の改変により、温度、湿度、剪断力、印刷速度、及び／又は吐出頻度(firing frequency)を制御することが可能である機構及び／又はソフトウェアを含むことができる。特定の実施態様において、バイオプリンターのソフトウェア及び／又はハードウェアは、好ましくは、印刷時、細胞温度を約37℃に維持するように構築及び／又は設定され得る。

特定の実施態様において、インクジェットプリンティング装置は、2次元又は3次元プリンターを含んでよい。特定の実施態様において、バイオプリンターは、DCソレノイドインクジェットバルブ、例えばインクジェットバルブに連結された、印刷前に例えば、流動性組成物中の細胞などの1種以上の細胞型、及び／又はECM（例えば流動性ECM）を含むための1個以上の貯留器を備える。バイオプリンターは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個又はそれよりも多い貯留器、例えば本明細書記載の組織及び器官の構築に使用される各細胞型又は各ECMについて1個を有することができる。これらの細胞は、空気圧、機械圧によるか、又は他の手段により、貯留器から、インクジェットバルブへ送達されることができる。典型的には、バイオプリンター、例えばバイオプリンター内のプリントヘッドは、1種以上の細胞型、及び該ECMが、予め決められたパターンで沈着されるように、コンピュータ-制御されている。予め決定された該パターンは、それから細胞が誘導されるか又は入手される器官又は組織内の該1以上の細胞型の天然の配置を再現又は反復するパターンであるか、あるいは該1種以上の細胞型の天然の配置とは異なるパターンであることができる。

特定の実施態様において、本明細書に提供される方法において使用されるバイオプリンターは、例えばNiklasenらの米国特許第6,537,567号を参照し、感熱式バブルインクジェットプリンターであるか、又は例えば周波数最大30kHz及び12〜100ワットの範囲の電源を使用する、圧電結晶発振式プリントヘッドであることができる。バイオプリンターのプリントヘッドノズルは、一部の実施態様においては、各々独立して直径0.05〜200μm、又は直径0.5〜100μm、又は直径10〜70μm、又は直径20〜60μmである。更なる実施態様において、ノズルは、各々独立して直径約40又は50μmである。同じ又は異なる直径の複数のノズルを使用することができる。一部の実施態様においては、ノズルは、円形開孔部を有し；他の実施態様においては、本発明の精神から逸脱しない、例えば楕円形、正方形、長方形などの、その他の好適な形状が使用される。

特定の実施態様において、バイオプリントされるべき組織又は器官の解剖学的画像は、ソフトウェア、例えばコンピュータ-支援設計(CAD)ソフトウェアプログラムを使用し、構築されることができる。そのような実施態様に従い、印刷されるべき組織又は器官の構造の代表である3次元表面上の3次元プリンティングを可能にするプログラムが作製されることができる。例えば、骨を印刷することが望ましい場合、骨の解剖学的画像が構築され、且つバイオプリンターのプリンターヘッドが、印刷時に3次元骨表面の周りを回転するように指示するプログラムが作製されてよい。

特定の実施態様において、本明細書に提供されるバイオプリンティングの方法は、細胞（例えば、単独の細胞を含有する組成物又は複数の細胞を含有する組成物）及び流動性細胞外マトリクス(ECM)の個別の液滴の、表面上への送達/沈着を含む。

特定の実施態様において、本明細書に提供されるバイオプリンティングの方法は、単独の細胞型及び流動性ECMの表面上への沈着を含む。そのような方法に従い使用することができる細胞型の例は、下記4.1.1項に提供される。流動性ECMを含むECMは、下記4.1.3項に説明される。

他の実施態様において、本明細書に提供されるバイオプリンティングの方法は、複数の（例えば、2、3、4、5種又はそれよりも多い）細胞型及び流動性ECMの、表面上への沈着を含む。具体的実施態様において、複数の細胞型は、同じ組成物の一部として沈着され、すなわち、細胞の給源は、複数の細胞型を含む単独の組成物である。別の具体的実施態様において、複数の細胞型は、異なる組成物の一部として沈着され、すなわち、細胞の給源は、複数の細胞型を含む個別の組成物である。別の具体的実施態様において、複数の細胞型の一部分は、一つの組成物（例えば、2種以上の細胞型が単独の組成物中にある）の一部として沈着され、並びに複数の型の別の一部分は、異なる組成物（例えば、1種以上の細胞型が単独の組成物中にある）として沈着される。そのような方法に従い使用することができる細胞型の例は、下記4.1.2項に提示される。

具体的実施態様において、沈着されるべき細胞及び流動性ECMは、同じ組成物の一部として一緒に（例えば、同時に）表面上に沈着される。別の具体的実施態様において、沈着されるべき細胞及び流動性ECMは、異なる組成物の一部として一緒に表面上に沈着される。別の具体的実施態様において、沈着されるべき細胞及び流動性ECMは、個別に（例えば異なる時点で）表面上に沈着される。

特定の実施態様において、細胞及び流動性ECMは、1種以上の追加成分と共に沈着される。一実施態様において、1種以上の追加成分は、これらの細胞と同じ組成物中に配合される。別の実施態様において、1種以上の追加成分は、ECMと同じ組成物中に配合される。別の実施態様において、1種以上の追加成分は、細胞及びECMと同じ組成物中に配合される（すなわち、単独の組成物が、細胞、流動性ECM、及び1種以上の追加成分を含む）。別の実施態様において、1種以上の追加成分は、細胞及び／又はECMを含有する組成物とは個別である組成物中に配合され、且つ細胞及び／又はECMの表面上への沈着と同時に、その前に、又はその後に沈着される。具体的実施態様において、1種以上の追加成分は、細胞（類）の生存、分化、増殖などを促進する。別の具体的実施態様において、1種以上の追加成分は、架橋剤（4.1.3.2項参照）を含む。別の具体的実施態様において、1種以上の追加成分は、ヒドロゲルを含む。別の具体的実施態様において、1種以上の追加成分は、合成ポリマーを含む。

当業者は、細胞及び流動性ECM、並びに本明細書記載の方法に従い使用される任意の追加成分は、形成される特定の組織又は器官に応じ、プリンターの個別のノズルから、又は共通の組成物中でプリンターの同じノズルを通して、印刷され得ることを認識するであろう。当業者により、本プリンティングは、同時に若しくは連続して、又はそれらの任意の組合せであることができ、且つ一部の成分（例えば、細胞、流動性ECM、又は架橋剤）は、第一のパターンの形状で印刷されることができ、並びに一部の成分は、第二のパターンの形状で印刷されることができるなどのことも、認識されるであろう。印刷の特定の組合せ及び様式は、印刷される特定の組織又は器官によって決まるであろう。

特定の実施態様において、細胞、ECM、及び／又は任意の他の材料（例えば、合成マトリクス、例えばPCL）は、所望の結果を得るために、特定されたパターンでバイオプリントされ得る。例えばバイオプリントされる材料（例えば細胞、ECM、マトリクス、及び本明細書記載の他の成分）は、特定の細孔サイズを有する3次元構造など、特定の望ましいパターンを作製するために、変動する角度で層状に、バイオプリントされるか、そうでなければ沈着される。具体的実施態様において、バイオプリントされる材料（例えば、細胞、ECM、マトリクス、及び本明細書記載の他の成分）は、箱様に見える所望のサイズの細孔を伴うバイオプリントされた構造を作製するために、十字交差様式で、印刷されるか、そうでなければ沈着される。別の具体的実施態様において、バイオプリントされる材料（例えば、細胞、ECM、マトリクス、及び本明細書記載の他の成分）は、三角形又は菱形様に見える所望のサイズの細孔を作製するために、角度をつけて、印刷されるか、そうでなければ沈着される。例えば、バイオプリントされる材料（例えば、細胞、ECM、マトリクス、及び本明細書記載の他の成分）は、所望のパターンを作製するために、特定の角度で、例えば角度30°、角度45°、角度60°で、印刷されるか、そうでなければ沈着される。そのような方法に従い、所望の品質を有する構造、例えば、細胞成長及び増殖を助長する能力を有する構造が、作製され得る。下記実施例1を参照されたい。具体的実施態様において、マトリクス、例えば合成マトリクスは、該バイオプリントされたマトリクス上の細胞の成長及び増殖の支援に貢献する特定のパターンで、バイオプリントされる。具体的実施態様において、合成マトリクスは、PCLである。

（4.1.1 細胞）
真核細胞を含む、当該技術分野において公知の任意の細胞の型を、本明細書記載の方法に従い使用することができる。

本明細書記載の方法に従い使用される細胞は、同系（すなわち、組織移植拒絶反応を最小化するために、レシピエント対象の細胞に関して遺伝的に同一であるか又は近い）、異系（すなわち、レシピエント対象と同じ種の遺伝的に同一でないメンバー）、又は異種（すなわち、レシピエント対象とは異なる種のメンバー由来）であることができる。同系細胞は、自家（すなわち、レシピエント対象由来）及び同質(isogeneic)（すなわち、遺伝的に同一であるが異なる対象に由来、例えば同じ双子に由来）である細胞を含む。細胞は、例えば、ドナー（生存又は死体のいずれか）から入手するか、又は樹立された細胞株若しくは細胞系統から誘導することができる。例えば、細胞は、当該技術分野において公知の標準の生検技術を使用し、ドナー（例えば、可能性のあるレシピエント）から収集することができる。

特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用される細胞は、流動性の生理的に許容し得る組成物、例えば、水、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、など）、液体培地（例えば、0.9N食塩水、クレブス液、改変クレブス液、イーグル培地、改変イーグル培地(MEM)、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)、ハンクス平衡塩溶液など）などの中に含まれる。

特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用される細胞は、1種以上の当該技術分野において公知のプロテアーゼ、例えば、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、トリプシン、LIBERASEなどを使用し、組織又は器官から単離されている初代細胞を含んでよい。器官組織は、組織をプロテアーゼで処理する前、その間、又はその後、例えば、さいの目に切る、浸解する(macerating)、ろ過する等により物理的に分散できる。細胞は、例えば、均一な又は実質的に均一な細胞集団を製造するため、特別な細胞型を選ぶため等に、本明細書記載の方法で細胞を使用する前に、標準的な当分野で公知の細胞培養技術を使用して培養できる。

一実施態様において、本明細書記載の方法において使用される細胞型（類）は、幹細胞を含む。本明細書記載の方法に従い使用することができる幹細胞の非限定的例は、以下を含む：胚性幹細胞、胚性生殖細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞(BM-MSC)、組織プラスチック接着性胎盤幹細胞(PDAC)、臍帯幹細胞、羊水幹細胞、羊膜由来接着性細胞(AMDAC)、骨形成性の胎盤接着性細胞(OPAC)、脂肪幹細胞、角膜上皮幹細胞、歯髄幹細胞、筋芽細胞、内皮前駆細胞、神経幹細胞、脱落歯由来幹細胞、毛嚢幹細胞、真皮幹細胞、単為生殖由来幹細胞、初期化された幹細胞、羊膜由来接着性細胞、又はサイドポピュレーション細胞。

具体的実施態様において、本明細書記載の方法は、胎盤幹細胞（例えば、米国特許第7,468,276号及び米国特許第8,057,788号に記載された胎盤幹細胞）の使用を含む。別の具体的実施態様において、該胎盤幹細胞は、PDAC(登録商標)である。一実施態様において、該PDACは、CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、及びCD200⁺である。別の実施態様において、該PDACは、CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、及びCD200⁺であり、並びに追加的にCD45^-、CD80^-、CD86^-、及び／又はCD90⁺である。

別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法は、AMDAC（例えば、国際公開公報第WO10/059828号に記載のAMDAC）の使用を含む。一実施態様において、該AMDACは、Oct4^-である。別の実施態様において、該AMDACは、CD49f⁺である。別の実施態様において、該AMDACは、Oct4^-及びCD49f⁺である。

別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法は、PDAC及びAMDACの使用を含む。

別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法は、BM-MSCの使用を含む。

別の実施態様において、本明細書記載の方法において使用される細胞型（類）は、分化した細胞を含む。別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用される分化した細胞（類）は、内皮細胞、上皮細胞、真皮細胞、内胚葉細胞、中胚葉細胞、線維芽細胞、骨細胞、軟骨細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、肝細胞、膵臓細胞、及び／又は間質細胞を含む。別の具体的実施態様において、細胞は、インスリン-産生細胞、例えば、膵臓細胞（例えば島細胞）、又はインスリン-産生細胞株、例えば、β-TC-6細胞である。

別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用される分化した細胞（類）は、唾液腺粘液性細胞、唾液腺漿液性細胞、フォンエブネル腺細胞、乳腺細胞、涙腺細胞、耳道腺細胞、エクリン汗腺暗調細胞、エクリン汗腺明調細胞、アポクリン汗腺細胞、モル腺細胞、脂腺細胞、ボウマン腺細胞、ブルンネル腺細胞、精嚢細胞、前立腺細胞、尿道球腺細胞、バルトリン腺細胞、リトレ腺細胞、子宮内膜細胞、単離された杯細胞、胃表層粘液細胞、胃腺酵素原細胞、胃腺酸分泌細胞、膵腺房細胞、パネート細胞、II型肺胞上皮細胞、及び／又はクララ細胞を含む。

別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用される分化した細胞（類）は、成長ホルモン産生細胞、乳腺刺激ホルモン産生細胞、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、性腺刺激ホルモン産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン産生細胞、下垂体中葉由来の細胞、巨大細胞神経分泌細胞、腸管細胞、気道細胞、甲状腺上皮細胞、傍濾胞細胞、副甲状腺細胞、副甲状腺主細胞、好酸性細胞、副腎腺細胞、クロム親和性細胞、ライディッヒ細胞、内卵胞膜細胞、黄体細胞、顆粒膜黄体細胞、莢膜黄体様細胞、傍糸球体細胞、緻密斑細胞、極周囲細胞、及び／又はメサンギウム細胞を含む。

別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用される分化した細胞（類）は、血管及びリンパ管内皮有孔細胞、血管及びリンパ管内皮連続型細胞、血管及びリンパ管内皮脾細胞、滑膜細胞、漿膜細胞（腹膜の、胸膜の、及び心膜腔の内壁）、扁平上皮細胞、円柱細胞、暗調細胞、前庭膜細胞（耳の内リンパ腔内壁）、血管条基底細胞、血管条周辺細胞（耳の内リンパ腔内壁）、クラウディウス細胞、ベッチェル細胞、脈絡叢細胞、軟膜クモ膜扁平上皮細胞、色素毛様体上皮細胞、非色素毛様体上皮細胞、角膜内皮細胞、栓細胞、気道線毛細胞、卵管線毛細胞、子宮内膜線毛細胞、精巣網線毛細胞、精巣輸出管線毛細胞、及び／又は線毛性上衣細胞を含む。

別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用される分化した細胞（類）は、表皮角化細胞、表皮基底細胞、手指爪及び足指爪の角化細胞、爪床基底細胞、毛幹の毛髄質細胞、毛幹の毛皮質細胞、毛幹の毛小皮細胞、毛根の毛小皮鞘細胞、毛根ハックスレー層の鞘細胞、毛根ヘンレ層の鞘細胞、外毛根鞘細胞、毛母細胞、重層扁平上皮の表面上皮細胞、上皮基底細胞、及び／又は泌尿器上皮細胞を含む。

別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用される分化した細胞（類）は、耳のコルチ器官の内有毛細胞、耳のコルチ器官の外有毛細胞、コルチ器官の内柱細胞、コルチ器官の外柱細胞、コルチ器官の内指骨細胞、コルチ器官の外指骨細胞、コルチ器官の境界細胞、コルチ器官のヘンゼン細胞、前庭器支持細胞、味蕾支持細胞、嗅上皮支持細胞、シュワン細胞、サテライト細胞、腸内グリア細胞、嗅上皮基底細胞、冷感受性一次感覚ニューロン、熱感受性一次感覚ニューロン、表皮のメルケル細胞、嗅覚受容体神経、痛み感受性一次感覚ニューロン、光受容体桿体細胞、光受容体青色感受性錐体細胞、光受容体緑色感受性錐体細胞、光受容体赤色感受性錐体細胞、固有受容性一次感覚ニューロン、触覚感受性一次感覚ニューロン、I型頸動脈小体細胞、II型頸動脈小体細胞（血液pHセンサ）、内耳前庭器官のI型有毛細胞（加速度及び重力）、内耳前庭器官のII型有毛細胞、I型味蕾細胞、コリン作動性神経細胞、アドレナリン作動性神経細胞、及び／又はペプチド作動性神経細胞を含む。

別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用される分化した細胞（類）は、星状細胞、ニューロン、希突起膠細胞、紡錘形ニューロン、前水晶体上皮細胞、クリスタリン含有水晶体線維細胞、肝細胞、脂肪細胞、白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞、肝臓脂肪細胞、腎臓糸球体壁細胞、腎臓糸球体有足細胞、腎臓近位尿細管刷子縁細胞、ヘンレ係蹄の細い部分の細胞、腎臓遠位尿細管細胞、腎臓集合管細胞、I型肺胞上皮細胞、膵管細胞、非線条導管細胞、導管細胞、腸管刷子縁細胞、外分泌腺線条導管細胞、胆嚢上皮細胞、精巣輸出管非線毛細胞、精巣上体主細胞、及び／又は精巣上体基底細胞を含む。

別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用される分化した細胞（類）は、エナメル芽細胞上皮細胞、半月面上皮細胞、コルチ器官歯間上皮細胞、疎性結合組織線維芽細胞、角膜実質細胞、腱線維芽細胞、骨髄網状組織線維芽細胞、非上皮性線維芽細胞、周細胞、髄核細胞、セメント芽細胞/セメント細胞、象牙芽細胞、オドントサイト(odontocyte)、ヒアリン軟骨細胞、線維軟骨細胞、弾性軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、骨前駆細胞、硝子体細胞、星細胞（耳）、肝星細胞（伊東細胞）、膵星細胞、赤色骨格筋細胞、白色骨格筋細胞、中間体骨格筋細胞、筋紡錘の核袋細胞、筋紡錘の核鎖細胞、サテライト細胞、固有心筋細胞、結節性心筋細胞、プルキンエ線維細胞、平滑筋細胞、虹彩の筋上皮細胞、及び／又は外分泌腺の筋上皮細胞を含む。

別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用される分化した細胞（類）は、網状赤血球、巨核球、単球、結合組織マクロファージ、表皮ランゲルハンス細胞、樹状細胞、小膠細胞、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞、細胞傷害性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、メラニン形成細胞、網膜色素上皮細胞、卵原細胞/卵母細胞、精子細胞、精母細胞、精原細胞、精子、卵胞細胞、セルトリ細胞、胸腺上皮細胞、及び／又は間質性腎臓細胞を含む。

本明細書記載の方法に従い使用される細胞は、組成物中に配合されることができる。特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用される細胞は、単独の細胞型のみを含む組成物中に配合され、すなわち、この組成物中の細胞の集団は、均一である。他の実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用される細胞は、2種以上の細胞型を含む組成物中に配合され、すなわち、この組成物中の細胞の集団は、不均一である。

特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用される細胞は、追加的に流動性ECMを含有する組成物中に配合される（4.1.3項参照）。あるいは、該流動性ECMは、本明細書記載の方法に従う個別の組成物の一部として、該細胞の沈着と同時に、その前に、又はその後に沈着されてよい。特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用される細胞は、追加的に1種以上の合成モノマー又はポリマーを含有する組成物中に配合される。あるいは、該合成モノマー又はポリマーは、本明細書記載の方法に従う個別の組成物の一部として、該細胞の沈着と同時に、その前に、又はその後に沈着されてよい。特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用される細胞は、流動性ECM及び1種以上の合成モノマー又はポリマーを追加的に含有する組成物中に配合される。特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用される細胞は、架橋剤を追加的に含有する組成物中に配合される。あるいは、該架橋剤は、本明細書記載の方法に従う個別の組成物の一部として、該細胞の沈着と同時に、その前に、又はその後に沈着されてよい。

特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用される細胞は、1種以上の追加成分、例えば細胞（類）の生存、分化、増殖などを促進する成分を追加的に含有する組成物中に配合される。そのような成分は、栄養素、塩類、糖類、生存因子、及び増殖因子を含むことができるが、これらに限定されるものではない。本明細書記載の方法に従い使用することができる増殖因子の例は、インスリン-様成長因子（例えばIGF-1）、トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)、骨形態形成タンパク質、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子(PDGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、結合組織増殖因子(CTGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子(FGF)（1、2及び3）、オステオポンチン、骨形態形成タンパク質-2、ソマトトロピンなどの成長ホルモン、細胞誘引物質及び付着物質など、並びにそれらの混合物を含むが、これらに限定されるものではない。あるいは、細胞（類）の生存、分化、増殖などを促進する1種以上の該追加成分は、本明細書記載の方法に従う個別の組成物の一部として、該細胞の沈着と同時に、その前に、又はその後に沈着されてよい。

特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用される細胞は、重合可能なモノマー（類）を追加的に含有する組成物中に配合される。あるいは、該重合可能なモノマーは、本明細書記載の方法に従う個別の組成物の一部として、該細胞の沈着と同時に、その前に、又はその後に沈着されてよい。そのような実施態様において、例えば、重合触媒が、バイオプリンティングの直前に添加されてよく、その結果一旦細胞が印刷されると、このモノマーは重合し、細胞を捕捉するか及び／又は物理的に支持するゲルを形成する。例えば、細胞を含有する組成物は、アクリルアミドモノマーを含むことができ、その際、TEMED及び過硫酸アンモニウム、又はリボフラビンが、バイオプリンティングの直前に、この組成物へ添加される。組成物中の細胞の表面上への沈着時に、アクリルアミドは重合し、細胞を隔離し支持する。

特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用される細胞は、接着剤を追加的に含有する組成物中に配合される。具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用される細胞は、非限定的に、シアノアクリレートエステル、フィブリンシーラント、及び／又はゼラチン-レゾルシノール-ホルムアルデヒド接着剤を含む、軟部組織付着剤を追加的に含有する組成物中に配合される。別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用される細胞は、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸(RGD)リガンド、細胞外タンパク質、及び／又は細胞外タンパク質類縁体を追加的に含有する組成物中に配合される。

特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用される細胞は、細胞が単独の細胞として表面上に沈着され得る（すなわち、細胞は、一度に1個の細胞が沈着される）ように、組成物中に配合される。

特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用される細胞は、細胞が複数の細胞を含む凝集体として、表面上に沈着され得るように、組成物中に配合される。そのような凝集体は、単独の型の細胞を含むことができるか、又は複数の細胞型、例えば、2、3、4、5種又はそれよりも多い細胞型を含むことができる。

特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用される細胞は、細胞が組成物の一部として組織を形成するように、組成物中に配合され、ここで該組織は、本明細書記載の方法を使用し、表面上に沈着され得る。そのような組織は、単独の型の細胞を含むことができるか、又は複数の細胞型、例えば、2、3、4、5種又はそれよりも多い細胞型を含むことができる。

特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用される細胞は、小さい容積、例えば、0.5〜500ピコリットル/液滴を有する細胞及び／又は組成物の個別の液滴として表面上に沈着される。様々な実施態様において、細胞又は細胞を含む組成物の容積は、約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、20、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95若しくは100ピコリットル、又は約1〜90ピコリットル、約5〜85ピコリットル、約10〜75ピコリットル、約15〜70ピコリットル、約20〜65ピコリットル、若しくは約25〜約60ピコリットルである。

（4.1.2 組織及び器官）
本明細書に提供される1以上の方法を用い、設計され／作製された組織及び器官が、本明細書において提供される。

当該技術分野において公知のいずれかの型の組織を、本明細書記載の方法を使用し作製することができる。特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製される組織は、単独の細胞型を含む。他の実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製される組織は、複数の細胞型を含む。特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製される組織は、2種以上の型の組織を含む。

特定の実施態様において、本明細書記載の方法は、表面上の細胞の沈着を含み、ここで該表面は、対象由来の組織を含み、例えば、組織は、ドナー、レシピエント対象、死体、又は別の給源に由来している。特定の実施態様において、本明細書記載の方法は、表面上の細胞の沈着を含み、ここで該表面は、対象に由来しない組織を含み、例えば組織は合成されている。

具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製される組織は、結合組織である。

別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製される組織は、筋肉組織である。本明細書記載の方法に従い作製された筋肉組織は、内臓筋（平滑筋）組織、骨格筋組織、又は心筋組織を含むことができる。

別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製される組織は、神経組織である。本明細書記載の方法に従い作製された神経組織は、中枢神経系組織（例えば、脳組織又は脊髄組織）又は末梢神経系組織（例えば、脳神経及び脊髄神経）を含むことができる。

別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製される組織は、内皮を含む、上皮組織である。

特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製される組織は、器官を設計するために使用することができる。特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製される組織は、器官の一部分を設計するために使用することができる。

本明細書記載の方法に従い設計される組織及び器官は、既知の哺乳動物の器官系のいずれか、すなわち、消化器系、循環器系、内分泌系、排泄系、免疫系、外皮系、筋肉系、神経系、生殖器系、呼吸器系、及び／又は骨格系に関連することができる。本明細書記載の方法に従い作製又は形成され得る器官の例は、肺、肝臓、心臓、脳、腎臓、皮膚、骨、胃、膵臓、膀胱、胆嚢、小腸、大腸、前立腺、睾丸、卵巣、脊髄、咽頭、喉頭、気管、気管支、横隔膜、尿管、尿道、食道、結腸、胸腺、及び脾臓を含むが、これらに限定されるものではない。具体的実施態様において、膵臓は、本明細書記載の方法に従い作製又は形成される。

具体的実施態様において、本明細書記載の方法は、骨を設計するために使用される。別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法は、皮膚を設計するために使用される。別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法は、肺組織、又は肺若しくはそれらの一部を設計するために使用される。別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法は、肝臓組織、又は肝臓若しくはそれらの一部を設計するために使用される。別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法は、神経組織、又は神経若しくはそれらの一部を設計するために使用される。

特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製される組織又は器官は、該組織又は器官の機能に有益な成分を追加的に含むことができる。特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製される組織又は器官は、人工神経導管(nerve guidance conduit)、すなわち、軸索再生を導く人工的手段を追加的に含むことができる。具体的実施態様において、人工神経導管は、ポリ無水物、例えばポリ(o-カルボキシフェノキシ)-p-キシレン)又はポリ(無水ラクチド)で作製される。特定の実施態様において、人工神経導管は、組織又は器官の印刷と同時に沈着される、すなわち、人工神経導管は、組織又は器官に沿って印刷されることができる。他の実施態様において、人工神経導管は、該組織又は器官の印刷前に調製され、且つ組織又は器官が印刷される際に、それらへ配置（例えば、手作業で配置）されてよい。他の実施態様において、人工神経導管は、該組織又は器官の印刷前に調製され、且つ組織又は器官が印刷された後に、それらへ配置（例えば、手作業で配置）されてよい。

特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製される組織又は器官は、血管、例えば、対象（例えば、ドナー、レシピエント対象、若しくは死体）から得られた血管又は本明細書記載の方法を使用し設計された血管を、追加的に含んでよい。

特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製される組織及び器官は、その天然の状態で、例えばヒト体内に現れる組織又は器官の形状である。例えば、本明細書記載の方法に従い作製された肺は、ヒト体内に現れるヒト肺に類似してよい。

特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製される組織及び器官は、その天然の状態で現れる組織又は器官の形状ではなくともよいが、その器官が機能するのと同じ様式又は類似の様式で機能する。例えば、本明細書記載の方法に従い作製される肺は、ヒト体内に現れるヒト肺に類似しなくともよいが、ヒト肺の機能の一部又は全てを保持することができる。そのような実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製される組織及び器官は、球形、円柱形、棒状、又は立方形状（すなわち、立方体）を含むが、これらに限定されるものではない、様々な形状であることができる。

（4.1.3 細胞外マトリクス(ECM)）
本明細書記載の方法は、表面上に細胞（例えば、単独の細胞を含有する組成物及び／又は複数の細胞を含有する組成物）及び流動性ECMを含む細胞外マトリクス(ECM)の沈着を含む。ECMは、任意の公知のECM給源から誘導されることができ、且つ当該技術分野において公知の任意の方法を用い流動性とされることができる。具体的実施態様において、ECMは、流動性ECMを含む。ECMは、例えば、下記4.1.3.1項に記載の方法を用い、流動性とされることができる。特定の実施態様において、ECMは、例えば、下記4.1.3.2項に記載の方法を用い、架橋されることができる。

本明細書記載の方法に従い使用されるECM（例えば流動性ECM）は、本明細書に提供される方法に従い使用するための組成物の一部として配合されることができる。

特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用されるECMは、哺乳動物ECM、植物ECM、軟体動物ECM、及び／又は魚類ECMを含む。

具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用されるECMは、哺乳動物ECMを含む。別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用されるECMは、哺乳動物ECMを含み、ここで該哺乳動物ECMは、胎盤（例えばヒト胎盤）から誘導される。別の具体的実施態様において、該胎盤由来のECMは、テロペプチドコラーゲンを含む。

別の具体的実施態様において、該胎盤由来のECMは、化学修飾されていないか又はプロテアーゼと接触されていない、塩基処理された及び／又は界面活性剤処理されたI型テロペプチド胎盤コラーゲンを含み、ここで該ECMは、フィブロネクチン5重量％未満又はラミニン5重量％未満；I型コラーゲン25重量％〜92重量％；及び、III型コラーゲン2重量％〜50重量％又はIV型コラーゲン2重量％〜50重量％を含む。

別の具体的実施態様において、該胎盤由来のECMは、化学修飾されていないか又はプロテアーゼと接触されていない、塩基処理され、界面活性剤処理されたI型テロペプチド胎盤コラーゲンを含み、ここで該ECMは、フィブロネクチン1重量％未満又はラミニン1重量％未満；I型コラーゲン74重量％〜92重量％；及び、III型コラーゲン4重量％〜6重量％又はIV型コラーゲン2重量％〜15重量％を含む。

本明細書記載の方法に従い使用される胎盤ECM、例えば、胎盤テロペプチドコラーゲンを含むECMは、当該技術分野において公知の方法を使用し調製されるか、又は下記のように調製されてよい。第一に、胎盤組織（胎盤全体又はそれらの一部のいずれか）は、例えば無菌的に、例えば帝王切開又は正常分娩の実施直後の収集など、常法により得られる。胎盤組織は、可溶性若しくは不溶性のいずれか又は両方の羊膜、絨毛膜、臍帯を含む胎盤の任意の部分に由来、あるいは全胎盤に由来することができる。特定の実施態様において、コラーゲン組成物は、臍帯を伴わないヒト胎盤全体から調製される。胎盤は、室温で、又は温度約2℃〜8℃で、更なる処理時まで貯蔵される。胎盤は、好ましくは放血され、すなわち、娩出後残存する胎盤及び臍帯血が完全に排出される。特定の実施態様において、妊婦は、例えば、HIV、HBV、HCV、HTLV、梅毒、CMV、及び胎盤組織に夾雑することがわかっている他のウイルス病原体について、出産前にスクリーニングされる。

胎盤組織は、ECMの製造前に脱細胞化されてよい。胎盤組織は、米国特許出願公開第20040048796号及び第20030187515号に詳述されているような、当業者に公知の任意の方法に従い脱細胞化されることができ、これらの出願の内容はそれらの全体が引用により本明細書中に組み込まれている。

胎盤組織は、浸透圧ショックに供されてよい。浸透圧ショックは、任意の透明化工程に追加され得るか、又は当業者の判断に従い単独の透明化工程であることができる。浸透圧ショックは、当業者に公知の任意の浸透圧ショック条件で実行され得る。そのような条件は、高浸透ポテンシャル溶液中、又は低浸透ポテンシャル溶液中、又は高及び低の交互の浸透ポテンシャル溶液中で、組織をインキュベーションすることを含む。高浸透ポテンシャル溶液は、NaCl（例えば、0.2〜1.0M又は0.2〜2.0M）、KCl（例えば、0.2〜1.0又は0.2〜2.0M）、硫酸アンモニウム、単糖、二糖（例えば20％ショ糖）、親水性ポリマー（例えばポリエチレングリコール）、グリセロールなどの1種以上を含有する溶液など、当業者に公知の任意の高浸透ポテンシャル溶液であることができる。特定の実施態様において、高浸透ポテンシャル溶液は、塩化ナトリウム溶液、例えば少なくとも0.25M、0.5M、0.75M、11.0M、1.25M、1.5M、1.75M、2M、又は2.5M NaClである。一部の実施態様において、塩化ナトリウム溶液は、約0.25〜5M、約0.5〜4M、約0.75〜3M、又は約1.0〜2.0M NaClである。低浸透ポテンシャル溶液は、水、例えば当業者に公知の任意の方法に従い脱イオンされた水など、当業者に公知の任意の低浸透ポテンシャル溶液であることができる。一部の実施態様において、浸透圧ショック溶液は、50mM NaCl未満の浸透圧ショックポテンシャルを有する水を含む。特定の実施態様において、浸透圧ショックは、塩化ナトリウム溶液と、それに続く水溶液である。特定の実施態様において、1又は2種のNaCl溶液処理に、水洗浄が続く。

この浸透圧ショックから生じる組成物は、次に、特定の実施態様において、界面活性剤と共にインキュベーションされてよい。界面活性剤は、細胞膜又はオルガネラ膜を破壊することが可能である、当業者に公知の任意の界面活性剤、例えば、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、デオキシコール酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、TritonX100、TWEENなどであることができる。界面活性剤処理は、約0℃〜約30℃、約5℃〜約25℃、約5℃〜約20℃、約5℃〜約15℃、約0℃、約5℃、約10℃、約15℃、約20℃、約25℃、又は30℃で実行することができる。界面活性剤処理は、例えば、約1〜24時間、約2〜20時間、約5〜15時間、約8〜12時間、又は約2〜5時間実行することができる。

この界面活性剤処理から生じる組成物は、次に、特定の実施態様において、塩基性条件下でインキュベーションされてよい。塩基性処理のための特定の塩基は、例えば濃度0.2〜1.0Mの、生体適合性塩基、揮発性塩基、又は任意の有機若しくは無機塩基を含む。特定の実施態様において、塩基は、NH₄OH、KOH及びNaOH、例えば、0.1M NaOH、0.25M NaOH、0.5M NaOH、又は1M NaOHからなる群から選択される。この塩基処理は、例えば、0℃〜30℃、5℃〜25℃、5℃〜20℃、5℃〜15℃、約0℃、約5℃、約10℃、約15℃、約20℃、約25℃、又は約30℃で、例えば、約1〜24時間、約2〜20時間、約5〜15時間、約8〜12時間、又は約2〜5時間実行することができる。

ECMは、塩基処理をせずに製造することができ；塩基処理工程の省略は、通常、塩基処理を含み製造されたECM組成物よりも、より多量のエラスチン、フィブロネクチン及び／又はラミニンを含有するECM組成物を生じる。

通常、ヒト胎盤組織に関する前述のプロセスは、化学修飾されていないか又はプロテアーゼと接触されていない、塩基処理された及び／又は界面活性剤処理されたI型テロペプチド胎盤コラーゲンを含有する、胎盤ECMの製造を生じ、ここで該ECMは、フィブロネクチン5重量％未満又はラミニン5重量％未満；I型コラーゲン25重量％〜92重量％；及び、III型コラーゲン2重量％〜50重量％；IV型コラーゲン2重量％〜50重量％；並びに、エラスチン40重量％未満を含む。より具体的実施態様において、本プロセスは、塩基処理され、界面活性剤処理されたI型テロペプチド胎盤コラーゲンの製造を生じ、ここで該コラーゲンは、化学修飾されていないか又はプロテアーゼと接触されておらず、並びにここで該組成物は、フィブロネクチン1重量％未満；ラミニン1重量％未満；I型コラーゲン74重量％〜92重量％；III型コラーゲン4重量％〜6重量％；IV型コラーゲン2重量％〜15重量％；及び／又は、エラスチン12重量％未満を含有する。

特定の実施態様において、流動性ECMを含有する本明細書において提供される組成物は、追加的に他の成分を含有してよい。特定の実施態様において、流動性ECMを含有する本明細書において提供される組成物は、追加的に、1種以上の細胞型、例えば上記4.1.1項において詳述された1種以上の細胞型を含有している。あるいは、該細胞は、該ECMの沈着と同時に、その前に、又はその後に、本明細書記載の方法に従い個別の組成物の一部として沈着されてよい。

特定の実施態様において、流動性ECMを含有する本明細書に提供される組成物は、追加的にヒドロゲル（例えば、感熱性ヒドロゲル及び／又は感光性ヒドロゲル）を含有する。あるいは、ヒドロゲルは、該ECMの沈着と同時に、その前に、又はその後に、本明細書記載の方法に従い個別の組成物の一部として沈着されてよい。

特定の実施態様において、流動性ECMを含有する本明細書において提供される組成物は、追加的に、1種以上の細胞型、例えば上記4.1.1項において詳述された1種以上の細胞型、及びヒドロゲルを含有している。具体的実施態様において、流動性ECM及びヒドロゲル（例えば、感熱性ヒドロゲル及び／又は感光性ヒドロゲル）を含有する本明細書に提供される組成物は、ECM：ヒドロゲルの比が、重量で約10：1〜約1：10であるように、配合される。

ヒドロゲルの例は、水分子を捕獲しゲルを形成する3次元開放-格子構造を作出するように、共有結合、イオン結合、又は水素結合を介して架橋されることができる、有機ポリマー（天然又は合成）を含むことができる。そのような組成物に好適なヒドロゲルは、RAD16などの自己集成ペプチドを含む。ヒドロゲル-形成材料は、イオン的に架橋されるアルギン酸塩及びそれらの塩などの多糖、ペプチド、ポリホスファジン、及びポリアクリレート、又は温度若しくはpHにより各々架橋されるポリエチレンオキシド-ポリプロピレングリコールブロック共重合体などのブロックポリマーを含む。一部の実施態様において、ヒドロゲル又はマトリクスは、生分解性であってよい。

特定の実施態様において、流動性ECMを含有する本明細書において提供される組成物は、追加的に合成ポリマーを含む。具体的実施態様において、合成ポリマーは、ポリアクリルアミド、ポリ塩化ビニリジン、ポリ(o-カルボキシフェノキシ)-p-キシレン)(ポリ(o-CPX))、ポリ(無水ラクチド)(PLAA)、n-イソプロピルアクリルアミド、ペントエリスリトールジアクリレート、ポリメチルアクリレート、カルボキシメチルセルロース、及び／又はポリ(乳酸-グリコール酸共重合体)(PLGA)である。別の具体的実施態様において、合成ポリマーは、熱可塑性物質、例えば、ポリカプロラクトン(PCL)、ポリ乳酸、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン、ポリエステル、ポリ酢酸ビニル、及び／又はポリ塩化ビニルを含む。あるいは、1種以上の合成ポリマーは、該ECMの沈着と同時に、その前に、又はその後に、本明細書記載の方法に従い個別の組成物の一部として沈着されてよい。具体的実施態様において、合成ポリマーは、PCLである。

特定の実施態様において、流動性ECMを含有する本明細書において提供される組成物は、追加的に、フィブロネクチンと相互作用することがわかっているヒトタンパク質であるテナシンC、又はその断片を含有する。あるいは、テナシンCは、該ECMの沈着と同時に、その前に、又はその後に、本明細書記載の方法に従い個別の組成物の一部として沈着されてよい。

特定の実施態様において、流動性ECMを含有する本明細書において提供される組成物は、追加的に、チタン-アルミニウム-バナジウム(Ti₆Al₄V)を含有する。あるいは、Ti₆Al₄Vは、該ECMの沈着と同時に、その前に、又はその後に、本明細書記載の方法に従い個別の組成物の一部として沈着されてよい。

特定の実施態様において、本明細書に提供される組成物中のECM及び／又は合成ポリマーなどの本組成物の追加成分は、誘導体化されてよい。ECM及び合成ポリマーの誘導体化の方法は、当該技術分野において公知であり、且つ非限定的に、細胞接着ペプチド（例えば、1以上のRGDモチーフを含むペプチド）を使用する誘導体化、細胞接着タンパク質を使用する誘導体化、サイトカイン（例えば、血管内皮増殖因子(VEGF)、又は骨形態形成タンパク質(BMP)）を使用する誘導体化、及びグリコサミノグリカンを使用する誘導体化を含む。

（4.1.3.1 流動性ECMの作製方法）
本明細書記載の方法に従い使用されるECMは、当該技術分野において公知の方法及び本明細書記載の方法を用いて、流動性とすることができる。

一実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用されるECMは、酸又は塩基と、例えば該ECMを可溶化するのに十分である量の該酸又は塩基を含有する酸性又は塩基性溶液と、ECMを接触させることにより、流動性とされる。一旦ECMが流動性とされたならば、望ましいならば、このECM含有組成物は、当該技術分野において公知の方法を用い、中性であるか、又は所望のpHとされることができる。

別の実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用されるECMは、例えば、プロテアーゼ、例としてトリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、及び／又はエラスターゼなどの酵素又は酵素の組合せと、ECMを接触させることにより、流動性とされることができる。一旦ECMが流動性とされたならば、望ましいならば、酵素は、当該技術分野において公知の方法を用い、失活されることができる。

別の実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用されるECMは、物理的方策を使用し、流動性とされる。具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用されるECMは、ECMの摩砕により、すなわち、内部結合力を克服するためのECMの研磨により、流動性とされる。別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用されるECMは、例えば、ブレンダー又は他の給源により、ECMを剪断することにより、流動性とされる。別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い使用されるECMは、ECMを切断することにより、流動性とされる。特定の実施態様において、物理的方策の使用によりECMがより流動性とされる場合、このECMは、凍結状態で操作されてよい（例えば、ECMは、凍結乾燥されるか、又は液体窒素中で凍結される）。

（4.1.3.2 ECMの架橋方法）
本明細書記載の方法に従い使用されるECMは、当該技術分野において公知の方法及び本明細書記載の方法を使用し、架橋されることができる。

特定の実施態様において、ECMは、表面へ塗布される前に架橋され、すなわち、ECMは、印刷前に架橋されてよい。そのような実施態様に従い、架橋剤は、ECMを含有する組成物中に含まれてよく、且つ必要ならばECM及び架橋剤を含有する組成物は、ECMの印刷前にECMの架橋を生じる条件下で処理されてよい。

他の実施態様において、ECMは、表面へ塗布された後に架橋され、すなわち、ECMは、印刷後に架橋されてよい。一実施態様において、ECMは、該表面へのECMの最初の印刷により表面に塗布された後に架橋され、引き続き該表面へ架橋剤が印刷される（すなわち、ECM及び架橋剤は、個別の組成物として印刷される）。この実施態様に従い、必要ならば、ECMの架橋を生じる条件下でのECM及び架橋剤の処理により、ECMは引き続き架橋され得る。

別の実施態様において、ECM及び架橋剤の両方を含有する組成物を表面上へ印刷し、且つ該印刷後、ECMの架橋を生じる条件下でECM及び架橋剤を処理することにより、ECMは表面へ塗布された後に架橋される。

具体的実施態様において、ECMは、ECM成分であるヒアルロン酸の化学架橋により、架橋される。ヒアルロン酸の化学架橋の手段の例は、ジビニルスルホン架橋、ビス-エポキシド架橋、ベンジルエステル架橋、ブタンジオールジグリシジルエーテル(BDDE)架橋、チオール修飾によるジスルフィド架橋、HAのハロアセテート修飾、HAのジヒドラジド修飾、HAのチラミン修飾、及びヒュスゲン環化付加の使用（すなわち、「クリック化学」）を含むが、これらに限定されるものではない。そのような方法は、当該技術分野において公知であり、且つ例えば、Burdick及びPrestwichの文献(2011, Adv. Mater. 23:H41-H56)に更に記載されている。

別の具体的実施態様において、ECMは、ECMタンパク質の化学架橋により、架橋される。ECMタンパク質を架橋することが可能である化学の例は、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアナート(HDMI)、ゲニピン、カルボジイミド、ポリエチレングリコール、過酸化ベンゾイル、BioGlue(グルタルアルデヒドベースの架橋剤；Cryolife社）、ポリホスホエステル、及び加水分解可能なポリロタキサンを含むが、これらに限定されるものではない。

別の具体的実施態様において、ECMは、例えば、メタクリル酸無水物及び／又はグリシジルメタクリレートなどを使用する、ヒアルロン酸の光重合により、架橋される（例えば、Burdick及びPrestwichの文献、2011, Adv. Mater. 23:H41-H56参照)。

別の具体的実施態様において、ECMは、酵素の使用により、架橋される。ECMの架橋に適した酵素は、リシルオキシダーゼ（例えば、Leventalらの文献、2009, Cell 139:891-906参照）及び組織型トランスグルタミナーゼ（例えば、Griffinらの文献、2002, J. Biochem. 368:377-96参照）を含むが、これらに限定されるものではない。

それらの当業者は、架橋剤は、バイオプリントされた製品の意図された使用を基に選択されなければならないことを認めるであろう。例えば、本明細書記載の方法が、対象へ投与されるべき組織又は器官を作製するために使用される場合、生体適合性である、すなわち、該対象に対し有害でない架橋剤を選択し使用するよう注意が払われるべきである。あるいは、対象へ投与されない組織又は器官、例えば診断アッセイに使用される組織又は器官を作製するために本明細書記載の方法が使用される場合、本方法の実践者は、架橋剤の選択に注意を払う必要はない。

（4.1.4 表面）
いずれか好適な表面を、本明細書記載の方法に従い作製される組織及び器官を得るために、その上に細胞、流動性ECM、及び／又は任意の追加成分が沈着（例えば、印刷）され得る表面として使用することができる。そのような表面は、2次元（例えば、平坦な、平面的な表面）であるか又は3次元であることができる。

一実施態様において、その上に細胞、流動性ECM、及び／又は任意の追加成分が沈着される表面は、人工表面、すなわち、人為的に製造された表面を含む。具体的実施態様において、該人工表面は、人工装具である。特定の実施態様において、人工表面は、対象、例えばヒト対象における投与及び／又は移植に関するその適性を基に選択される。例えば、免疫原性でないことがわかっている人工表面（すなわち宿主免疫応答を誘発しない表面）は、人工表面上に沈着されるべき組織又は器官が対象に移植されることを意図して作製される場合の使用のために選択されてよい。特定の実施態様において、人工表面は、対象、例えばヒト対象における投与及び／又は移植にそれが適した状態にするために、処理されてよい。

一実施態様において、その上に細胞、流動性ECM、及び／又は任意の追加成分が沈着される表面は、塑性表面を含む。その上に該細胞、ECM、及び／又は追加成分が沈着され得る塑性表面の例証的種類は、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアミド、ポリカーボネート、及びポリウレタンを含むが、これらに限定されるものではない。

一実施態様において、その上に細胞、流動性ECM、及び／又は任意の追加成分が沈着される表面は、金属表面を含む。その上に該細胞、ECM、及び／又は追加成分が沈着され得る塑性表面の例証的種類は、アルミニウム、クロム、コバルト、銅、金、鉄、鉛、マグネシウム、マンガン、水銀、ニッケル、白金、銀、錫、チタン、タングステン、及び亜鉛を含むが、これらに限定されるものではない。

特定の実施態様において、その上に細胞、流動性ECM、及び／又は任意の追加成分が沈着される人工表面は、それらが特定の形状を形成するように、設計される。例えば人工表面は、対象における移植に適している骨を作製するために、骨の形状（例えば、耳の骨）であるように設計され、並びに好適な細胞（例えば、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞及び他の骨-関連細胞）、流動性ECM、及び／又は任意の追加成分が、該表面の上及び／又は中に沈着されることができる。

別の実施態様において、該表面は、対象（例えばヒト対象）由来の組織若しくは器官、又は対象の細胞から誘導された組織若しくは器官を含む。特定の実施態様において、対象由来の該組織又は器官の表面は、脱細胞化、例えば、組織又は器官の表面の全て又は一部から細胞を除去するよう処理される。具体的実施態様において、それより表面組織又は表面器官が由来する対象は、本明細書記載の方法に従い作製されるべき組織又は器官の意図されたレシピエントである対象である。別の具体的実施態様において、それから表面組織又は表面器官が由来する対象は、本明細書記載の方法に従い作製されるべき組織又は器官の意図されたレシピエントである対象ではない（例えば、その上に印刷される表面組織又は表面器官を提供する対象は、ドナー又は死体対象である。）。

本明細書記載の方法に従い、細胞、流動性ECM、及び／又は任意の追加成分が、対象由来の好適な組織又は器官上に沈着（例えば、上に印刷）されてよい。具体的実施態様において、印刷表面を提供する組織は、結合組織（骨を含む）、筋肉組織（内臓筋（平滑筋）組織、骨格筋組織、及び心筋組織を含む）、神経組織（中枢神経系組織（例えば、脳組織又は脊髄組織）又は末梢神経系組織（例えば、脳神経及び脊髄神経）又は上皮組織（内皮を含む）である。別の具体的実施態様において、印刷表面を提供する器官は、消化器系、循環器系、内分泌系、排泄系、免疫系、外皮系、筋肉系、神経系、生殖器系、呼吸器系、及び／又は骨格系を含む、既知の哺乳動物の器官系のいずれかに由来している。別の具体的実施態様において、印刷表面を提供する器官は、肺、肝臓、心臓、脳、腎臓、皮膚、骨、胃、膵臓、膀胱、胆嚢、小腸、大腸、前立腺、睾丸、卵巣、脊髄、咽頭、喉頭、気管、気管支、横隔膜、尿管、尿道、食道、結腸、胸腺、及び脾臓の全て又は一部である。別の具体的実施態様において、印刷表面を提供する器官は、膵臓、又はそれらの一部である。

具体的実施態様において、細胞、流動性ECM、及び／又は追加成分は、骨を含むか又は骨からなる表面上に沈着される（例えば、上に印刷される）。その上に印刷され得る骨の例は、長骨、短骨、扁平骨、不規則形骨、及び種子(seismoid)骨を含む。その上に印刷することができる具体的な骨は、頭蓋骨、顔面骨、耳の骨、指の骨、腕の骨、脚の骨、肋骨、手指の骨、足及びつま先の骨、距骨、手根骨、胸の骨（例えば胸骨）などを含むが、これらに限定されるものではない。

特定の実施態様において、細胞、流動性ECM、及び／又は任意の追加成分の沈着（例えば、バイオプリンティングによるか又は他の手段による沈着）のための足場として働く本明細書記載の表面は、バイオプリントされていない表面である。特定の実施態様において、細胞、流動性ECM、及び／又は任意の追加成分の沈着（例えば、バイオプリンティングによるか又は他の手段による沈着）のための足場として働く本明細書記載の表面は、バイオプリントされている表面、例えば本明細書記載の方法に従いバイオプリントされている表面である。具体的実施態様において、バイオプリントされた表面は、合成材料を含む。具体的実施態様において、合成材料は、PCLである。

（4.2 組成物）
本明細書記載の方法に従い使用することができる組成物が、本明細書において提供される。一実施態様において、本明細書記載の方法に従う使用に適している細胞（例えば、上記4.1.1項に記載された細胞）を含有する組成物が、本明細書において提供される。別の実施態様において、本明細書記載の方法に従う使用に適している流動性ECM（例えば、上記4.1.3項に記載された流動性ECM）を含有する組成物が、本明細書において提供される。別の実施態様において、本明細書記載の方法に従う使用に適している1種以上の架橋剤（例えば、上記4.1.3.2項に記載された架橋剤）を含有する組成物が、本明細書において提供される。

一実施態様において、細胞（例えば、上記4.1.1項に記載された細胞）及び流動性ECM（例えば、上記4.1.3項に記載された流動性ECM）を含有する組成物が、本明細書において提供される。具体的実施態様において、細胞は、幹細胞、例えば骨髄由来間葉系幹細胞(BM-MSC)、組織プラスチック接着性胎盤幹細胞(PDAC)、及び／又は羊膜由来付着細胞(AMDAC)を含む。別の具体的実施態様において、流動性ECMは、胎盤（例えばヒト胎盤）から誘導される。

別の実施態様において、流動性ECM（例えば、上記4.1.3項に記載された流動性ECM）及び1種以上の架橋剤（例えば、上記4.1.3.2項に記載された架橋剤）を含有する組成物が、本明細書において提供される。

別の実施態様において、細胞（例えば、上記4.1.1項に記載された細胞）及び1種以上の架橋剤（例えば、上記4.1.3.2項に記載された架橋剤）を含有する組成物が、本明細書において提供される。

別の実施態様において、細胞（例えば、上記4.1.1項に記載された細胞）、流動性ECM（例えば、上記4.1.3項に記載された流動性ECM）及び1種以上の架橋剤（例えば、上記4.1.3.2項に記載された架橋剤）を含有する組成物が、本明細書において提供される。

具体的実施態様において、幹細胞及び流動性ECMを含有する組成物が、本明細書において提供され、ここで該幹細胞はPDACであり、並びにここで該流動性ECMは、胎盤から誘導される。別の具体的実施態様において、幹細胞及び架橋剤を含有する組成物が、本明細書において提供され、ここで該幹細胞はPDACである。別の具体的実施態様において、幹細胞、流動性ECM、及び架橋剤を含有する組成物が、本明細書において提供され、ここで該幹細胞はPDACであり、並びにここで該流動性ECMは、胎盤から誘導される。

別の具体的実施態様において、幹細胞及び流動性ECMを含有する組成物が、本明細書において提供され、ここで該幹細胞はAMDACであり、並びにここで該流動性ECMは、胎盤から誘導される。別の具体的実施態様において、幹細胞及び架橋剤を含有する組成物が、本明細書において提供され、ここで該幹細胞はAMDACである。別の具体的実施態様において、幹細胞、流動性ECM、及び架橋剤を含有する組成物が、本明細書において提供され、ここで該幹細胞はAMDACであり、並びにここで該流動性ECMは、胎盤から誘導される。

別の具体的実施態様において、幹細胞及び流動性ECMを含有する組成物が、本明細書において提供され、ここで該幹細胞はBM-MSCであり、並びにここで該流動性ECMは、胎盤から誘導される。別の具体的実施態様において、幹細胞及び架橋剤を含有する組成物が、本明細書において提供され、ここで該幹細胞はBM-MSCである。別の具体的実施態様において、幹細胞、流動性ECM、及び架橋剤を含有する組成物が、本明細書において提供され、ここで該幹細胞はBM-MSCであり、並びにここで該流動性ECMは、胎盤から誘導される。

本明細書において提供される組成物は、細胞（例えば、上記4.1.1項に記載された細胞）及び／又は流動性ECM（例えば、上記4.1.3項に記載された流動性ECM）及び／又は1種以上の架橋剤（例えば、上記4.1.3.2項に記載された架橋剤）を含有することに加え、他の成分を追加的に含有してよい。特定の実施態様において、本明細書において提供される組成物は、ヒドロゲル（例えば、感熱性ヒドロゲル及び／又は感光性ヒドロゲル）を追加的に含有する。あるいは、ヒドロゲルは、本明細書において提供される細胞及びECM含有組成物とは別の組成物中に配合されてよい。特定の実施態様において、本明細書において提供される組成物は、ポリアクリルアミド、ポリ塩化ビニリジン、ポリ(o-カルボキシフェノキシ)-p-キシレン)(ポリ(o-CPX))、ポリ(無水ラクチド)(PLAA)、n-イソプロピルアクリルアミド、ペントエリスリトールジアクリレート、ポリメチルアクリレート、カルボキシメチルセルロース、ポリ(乳酸-グリコール酸共重合体)(PLGA)、及び／又は熱可塑性物質（例えば、ポリカプロラクトン(PCL)、ポリ乳酸、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン、ポリエステル、ポリ酢酸ビニル、及び／又はポリ塩化ビニル)などの、合成ポリマーを、追加的に含有する。あるいは、合成ポリマーは、本明細書において提供される細胞及びECM含有組成物とは別の組成物中に配合されてよい。特定の実施態様において、本明細書において提供される組成物は、テナシンC又はそれらの断片を追加的に含有する。あるいは、テナシンC又はそれらの断片は、本明細書において提供される細胞及びECM含有組成物とは別の組成物中に配合されてよい。特定の実施態様において、チタン-アルミニウム-バナジウム(Ti₆Al₄V)を追加的に含有する組成物が、本明細書において提供される。あるいは、Ti₆Al₄Vは、本明細書において提供される細胞及びECM含有組成物とは別の組成物中に配合されてよい。特定の実施態様において、本明細書において提供される組成物は、薬物（例えば小型分子薬物）を追加的に含有する。あるいは、薬物は、本明細書において提供される細胞及びECM含有組成物とは別の組成物中に配合されてよい。特定の実施態様において、本明細書において提供される組成物は、抗体（例えば、治療用抗体）を追加的に含有する。あるいは、抗体は、本明細書において提供される細胞及びECM含有組成物とは別の組成物中に配合されてよい。

特定の実施態様において、本明細書において提供される組成物は、組成物中で使用される細胞（類）の生存、分化、増殖などを促進する1種以上の追加成分を追加的に含有する。そのような成分は、栄養素、塩類、糖類、生存因子、及び増殖因子を含むことができるが、これらに限定されるものではない。本明細書記載の方法に従い使用することができる増殖因子の例は、インスリン-様成長因子（例えばIGF-1）、トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)、骨形態形成タンパク質、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子(PDGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、結合組織増殖因子(CTGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子(FGF)（1、2及び3）、オステオポンチン、骨形態形成タンパク質-2、ソマトトロピンなどの成長ホルモン、細胞誘引物質及び付着物質など、並びにそれらの混合物を含むが、これらに限定されるものではない。あるいは、組成物中で使用される細胞（類）の生存、分化、増殖などを促進する1種以上の追加成分は、本明細書において提供される細胞及びECM含有組成物とは別の組成物中に配合されてよい。

（4.3 使用）
本明細書記載の方法に従い作製される組織及び器官は、いずれか好適な目的のために使用することができる。具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製される組織及び器官は、治療目的で使用され、例えばこれらの組織及び／又は器官は、移植において使用される。別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製された器官は、実験目的で使用され、例えば該組織又は器官に対する1種以上の化合物及び／又は外科的手法の効果を評価するために使用される。

（4.3.1 治療上の使用）
特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製される組織及び／又は器官は、そのような移植を必要とする対象へ移植される。個体へ移植され得る組織及び器官の例は、4.1.2項に記載されている。グラフティング（例えば植皮）及び外科的移植手法を含む移植方法は、当業者に周知である。

特定の実施態様において、それから移植される組織及び／又は器官が誘導される細胞及び／又はECMは、移植レシピエントに由来している。他の実施態様において、それから移植される組織及び／又は器官が誘導される細胞及び／又はECMは、移植レシピエントに由来しないが、別の対象、例えば、ドナー、死体などに由来する。

特定の実施態様において、それから移植される組織及び／又は器官が誘導される細胞は、移植レシピエントに由来し、且つそれから移植される組織及び／又は器官が誘導されるECMは、移植レシピエントに由来しないが、別の給源に由来する。具体的実施態様において、それから移植される組織及び／又は器官が誘導されるECMは、胎盤（例えばヒト胎盤）に由来している。

特定の実施態様において、それから移植される組織及び／又は器官が誘導されるECMは、移植レシピエントに由来し、且つそれから移植される組織及び／又は器官が誘導される細胞は、移植レシピエントに由来しないが、他の給源に由来する。

具体的実施態様において、本明細書記載の方法は、移植に適した皮膚を作製するために使用され、且つ該皮膚は、そのような移植を必要とする対象（例えば、火傷被害者）において移植される（すなわち植皮される）。具体的実施態様において、該対象はヒトである。

別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法は、移植に適した骨を作製するために使用され、且つ該骨は、そのような移植を必要とする対象（例えば、骨粗鬆症又は骨癌に罹患した者）において移植される（例えば、外科的に移植される）。具体的実施態様において、該対象はヒトである。

別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法は、移植に適した肝臓又はそれらの一部を作製するために使用され、且つ該肝臓又はそれらの一部は、そのような移植を必要とする対象（例えば、肝臓の硬変、肝炎、又は肝臓癌に罹患した者）において移植される(例えば、外科的に移植される）。具体的実施態様において、該対象はヒトである。

別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法は、移植に適した肺又はそれらの一部を作製するために使用され、且つ該肺又はそれらの一部は、そのような移植を必要とする対象（例えば、肺癌に罹患した者）において移植される（例えば、外科的に移植される）。具体的実施態様において、該対象はヒトである。

別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法は、移植に適した神経組織（例えば、脳組織又は脊髄組織）を作製するために使用され、且つ該神経組織は、そのような移植を必要とする対象において移植される（例えば、外科的に移植される）。具体的実施態様において、該対象は、神経疾患（すなわち、中枢又は末梢神経系の疾患）と診断されている。別の具体的実施態様において、該対象は、対象の中枢又は末梢神経系が損傷された外傷に罹患しており、例えば対象は、外傷性脳損傷(TBI)又は脊髄損傷(SCI)に罹患している。別の具体的実施態様において、該対象はヒトである。

別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法は、移植に適した循環系組織（例えば、心臓組織、動脈、又は静脈）を作製するために使用され、且つ該循環系組織は、そのような移植を必要とする対象において移植される（例えば、外科的に移植される）。具体的実施態様において、該対象はヒトである。

（4.3.1.1 患者集団）
本明細書記載の方法に従い作製される組織及び／又は器官は、様々な患者集団に恩恵があるように使用することができる。一実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製される組織及び／又は器官は、組織及び／又は器官の移植を必要とする対象において使用される。

具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製される組織（類）及び／又は器官（類）は、癌と診断された対象において、すなわち、癌に冒されている該対象の1種以上の器官/組織の全て又は一部を置き換えるために、移植される。具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製される組織（類）及び／又は器官（類）は、骨若しくは結合組織の肉腫、脳腫瘍、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、膵臓癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌(SCLC)、非小細胞肺癌(NSCLC)、咽喉癌、及び中皮腫）、及び／又は前立腺癌と診断された対象において移植される。

別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製された肺組織（類）及び／又は器官（類）は、呼吸器疾患と診断された対象、例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、気腫、肺炎、結核、肺癌及び／又は嚢胞性線維症と診断された対象において移植される。

別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製された肝臓組織（類）及び／又は器官（類）は、肝臓疾患と診断された対象、例えば、肝炎（例えば、A型、B型若しくはC型肝炎）、肝臓癌、ヘモクロマトーシス、又は肝臓の硬変と診断された対象において移植される。

別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製された骨組織（類）及び／又は器官（類）は、骨疾患と診断された対象、例えば、骨癌（例えば骨肉腫）、骨壊死、代謝性骨疾患、進行性骨化性線維形成異常、又は骨粗鬆症と診断された対象において移植される。

別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製された神経組織（類）及び／又は器官（類）は、神経疾患（すなわち、中枢又は末梢神経系の疾患）と診断された対象、例えば、脳腫瘍、脳炎、髄膜炎、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、又は多発性硬化症と診断された対象において移植される。

別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製された表皮（例えば皮膚）組織（類）は、皮膚疾患（すなわち、皮膚が冒される疾患）と診断された対象、例えば、皮膚癌、湿疹、座瘡、乾癬、帯状疱疹、角化症と診断された対象；又は、瘢痕を有する対象において移植される。

別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製された神経組織（類）及び／又は器官（類）は、対象の中枢又は末梢神経系が損傷された外傷を受けた対象、例えば、外傷性脳損傷(TBI)又は脊髄損傷(SCI)に罹患した対象において移植される。

別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製された循環系組織（類）及び／又は器官（類）は、循環系の疾患と診断された対象、例えば、冠動脈性心臓病、心筋症（例えば内因性又は外因性心筋症）、心臓麻痺、心臓発作、炎症性心疾患、高血圧性心疾患、又は心臓弁膜症と診断された対象において移植される。

一部の実施態様において、それに対し本明細書記載の方法に従い作製される組織又は器官が移植される対象は、動物である。特定の実施態様において、動物は鳥類である。特定の実施態様において、動物はイヌである。特定の実施態様において、動物はネコである。特定の実施態様において、動物はウマである。特定の実施態様において、動物はウシである。特定の実施態様において、動物は哺乳動物、例えばウマ、ブタ、マウス、又は霊長類、好ましくはヒトである。具体的実施態様において、それに対し本明細書記載の方法に従い作製される組織又は器官が移植される対象は、ヒトである。

特定の実施態様において、それに対し本明細書記載の方法に従い作製される組織又は器官が移植される対象は、成人である。特定の実施態様において、それに対し本明細書記載の方法に従い作製される組織又は器官が移植される対象は、乳児である。特定の実施態様において、それに対し本明細書記載の方法に従い作製される組織又は器官が移植される対象は、小児である。

（4.3.2 実験的使用）
特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製される組織及び／又は器官は、実験目的で使用される。

具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製される組織及び／又は器官は、該組織及び／又は器官に対する薬物効果のスクリーニングに使用される。そのような方法に従い、本明細書記載の方法に従い作製される組織又は器官は、所与の薬物（例えば、評価されるべき薬物）及び対照（例えば、該薬物を含有しない組成物）に曝露され、且つ組織又は器官に対する薬物の効果が、当業者に公知の方法を用い（例えば、対照と比較し薬物の毒性；対照と比較し、ある結果を引き起こす薬物の有効性などを評価することにより）評価されることができる。

特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製される組織及び／又は器官は、非ヒト動物へ移植されてよく、非ヒト動物における該組織又は器官に対する薬物の効果は、そのような移植を受けた第一の非ヒト動物へ薬物を投与し、及びそのような移植を受けた第二の非ヒト動物へ対照（例えば、該薬物を含有しない組成物）を投与し、それらの結果を比較することにより、評価することができる。

特定の実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製される組織及び／又は器官は、非ヒト動物に移植されてよく、且つ非ヒト動物における該組織又は器官に対する外科的手法の効果は、そのような移植を受けた第一の非ヒト動物へ移植された組織/器官に対し外科的手法を実行し、及びそのような移植を受けた第二の非ヒト動物に対し外科的手法を実行せずに、それらの結果を比較することにより、評価することができる。

具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い作製される組織及び／又は器官は、体外目的で使用される。例えば、本明細書記載の方法に従い作製される組織又は器官は、対象の体の外側に配置されるが、依然それから対象が恩恵を受ける機能を果たし、例えば、組織又は器官は、対象の体の内側に配置されている組織又は器官により通常果たされる機能を果たす。

（4.4 キット）
本明細書記載の組成物の1種以上の構成成分が充填された1個以上の容器を備える、医薬用パック又はキットが、本明細書において提供される。任意にそのような容器（類）に関連して、作製業者を規制する政府の規制機関により規定された形式での、医薬品又は生物学的製品の使用又は販売の注意書が存在することができ、その注意書は、製造、ヒト投与に関する使用又は販売の規制当局による承認を反映している。

具体的実施態様において、本明細書において提供されるキットは、本明細書記載の細胞及び本明細書記載の流動性ECMを含有する組成物を備える。そのようなキットは、1種以上の追加成分（例えば、架橋剤）を含有する組成物を任意に備えてよい。別の具体的実施態様において、本明細書に提供されるキットは、本明細書記載の細胞、本明細書記載の流動性ECM、及び本明細書記載の1種以上の架橋剤を含有する組成物を備える。本明細書に包含されるキットは、本明細書記載の方法に従い使用することができる。

（5. 実施例）
（5.1 実施例1：胎盤幹細胞の接着及び成長を支援するバイオプリントされた足場）
この実施例は、制御されたファイバー直径及び細孔サイズの足場を製造するために、合成材料を、バイオプリントすることができること、並びにそのような足場は、細胞外マトリクス(ECM)の塗布に適した基板を提供することを明らかにしている。この実施例は、バイオプリントされた合成材料及びECMを含む足場（ハイブリッド足場）は、胎盤幹細胞などの胎盤細胞を含む細胞の接着及び成長に適した基板を表していることを更に明らかにしている。

（5.1.1 方法）
合成材料及びECMを含有するハイブリッド足場を組み立てるために、ポリカプロラクトン(PCL)(Mn 45,000、Sigma社)を、バイオプリンター(EnvisionTEC、Gladbeck社、独国)を用い、足場(54×54×0.64mm)へ最初に印刷した。印刷条件は、下記であった：温度90℃、印刷圧力3〜5.5bar、印刷速度2〜6mm/秒、好適なサイズの針使用。ECMを、先に説明したようにヒト胎盤から単離した（例えば、Bhatia MBの文献、Wounds 20, 29, 2008参照）。単離されたECMを、バイオプリントされたPCL足場の両側に塗布し、且つ乾燥（脱水）させ、PCL及びECMを含有するハイブリッド足場を作製した。得られたハイブリッドPCL-ECM足場を、直径10mmの円盤に打ち抜き、培地により一晩予め湿潤させ、本明細書記載の方法に従い調製した胎盤幹細胞（例えば、4.1.1項参照）を12,500個細胞/cm²で播種した。細胞を、8日間培養した。カルセイン染色及びMTS増殖アッセイを、標準プロトコールに従い、異なる時点で行い（n＝3）、細胞生存能及び増殖を決定した。

（5.1.2 結果）
印刷条件を最適化することにより、異なるファイバーサイズ、細孔サイズ及び細孔構造のPCL足場を、作製した（図1）。印刷したファイバーは、PCL及びECMを含有するハイブリッド足場の作製のための安定した網状構造を形成した。更に、ファイバーサイズ及び細孔構造を変動する印刷は、様々な比率を含むハイブリッド足場を製造することを可能にした。

バイオプリントされたPCL足場の両側上のECMの脱水は、ハイブリッド足場の作製を生じた。PCLとECMの間に、良好な一体化が認められ；ハイブリッド足場が、再水和を含む足場の処理又は培養により操作された場合は、PCLとECMの間の分離は認められなかった（図2）。

胎盤幹細胞は、経時的にハイブリッド足場の表面上に拡散され、且つ培養6日目には、ハイブリッド足場の表面の大部分を被覆した。MTS細胞増殖アッセイは、細胞数は、経時的に有意に増加したことを明らかにした（図3）。加えてハイブリッド足場上に播種された胎盤幹細胞は、カルセイン染色により指摘されるように（図4）、8日の培養期間にわたり良好な生存能を明らかにした。まとめるとこれらのデータは、PCL-ECMハイブリッド足場は、細胞の接着、生存、及び成長を支援することを指摘している。

（5.1.3 結論）
この実験は、ECM及び合成材料(PCL)を含有するハイブリッド足場は、バイオプリンティングを含む方法により作製することができること、並びに細胞はそのような足場へ付着するのみではなく、そのような足場上で培養された場合、生存及び増殖することを明らかにしている。

（5.2 実施例2：胎盤幹細胞の接着及び成長を支援するバイオプリントされた足場）
合成材料、及び例えば胎盤幹細胞などの胎盤細胞のような細胞を含むECMは、同時にバイオプリントされ、ハイブリッド足場を製造することができることを明らかにしている。この実施例により明らかにされたように、このバイオプリントされた細胞は、バイオプリンティングプロセスを生き残るのみではなく、ハイブリッド足場との培養において経時的に増殖する。

（5.2.1 方法）
ECMを、実施例1に説明したように調製し、且つ100万個/mlの胎盤幹細胞を含有する0.5％アルギン酸ヒドロゲルと混合した。次にPCL及び細胞-含有ECMを、層状にバイオプリントし、PCL及びECMを含むハイブリッド足場を作製した。足場の各層内に、PCLを最初に印刷し、次にECM／細胞成分を、PCL線の間の間隙を充填するように印刷した。そのような層を2又は5個印刷し、CaCl₂溶液により架橋させ、ハイブリッド足場を作製した。バイオプリントされた細胞-含有足場（細胞／ECM／PCL）を、7日間培養し、且つ細胞増殖及び生存を、カルセイン染色及びMTS増殖アッセイにより様々な時点で評価した。

（5.2.2 結果）
このバイオプリントされた足場は、細胞培養期間を通じて、損傷がない構造を維持した（図5）。PCLは、ECMヒドロゲルについて良好な構造上の支持体を提供し、これは3次元構造体の作製を可能にした。バイオプリンティング及び最後までの培養後、細胞は、3次元構造体全体に良好に分布し；細胞は、培養時に足場の深さを通じて認められた（図6）。

カルセイン染色により証明されるように（図7）、胎盤幹細胞は、バイオプリンティングプロセスを生き残り、且つ培養を通して3次元バイオプリントされたハイブリッド足場において増殖し続けた。図8に示されたように、ほとんどの細胞は、ハイブリッド足場内のECMの全域に拡散されることが認められ、このことは、ECMは細胞接着及びECMヒドロゲル中の拡散を増強したことを指摘している。これは、アルギン酸単独中の細胞の配置と、本足場中の細胞の配置を比べることにより、確認された。加えて図9に示されるように、MTS細胞増殖アッセイは、2層及び5層の両方の足場について、細胞数の増加を明らかにし、このことは、これらのハイブリッド足場は細胞増殖を支援したことを示している。

（5.2.3 結論）
この実施例は、ECM及び合成材料(PCL)を含有するハイブリッド足場は、ECM及びPCLの同時バイオプリンティングを含む方法により、作製することができることを明らかにしている。また細胞は、ハイブリッド足場の成分(ECM及びPCL)に沿って、バイオプリントされ得るという事実、並びに細胞は、このバイオプリンティングプロセスで生き残るという事実が、この実施例により明らかにされる。更にハイブリッド足場の成分に沿ってバイオプリントされた細胞は、そのような足場の上で培養される場合に、増殖し、且つ細胞マトリクス（アルギン酸）単独中で培養される場合よりもより良く足場全体に点在する。

（5.3 実施例3：機能性バイオプリントされた足場）
この実施例は、合成材料及び細胞を含有するECMは、バイオプリントされ、機能性足場を製造することができることを明らかにしている。

インスリン産生細胞株であるβ-TC-6細胞は、ヒト胎盤から誘導された細胞外マトリクス(ECM)と共に、バイオプリントされた足場へバイオプリントされた。この足場は、寸法15×15×2.5mmであり、5層を含んだ。各層において、ポリカプロラクトン(PCL)を最初に印刷し、引き続きPCL線間に、アルギン酸-ECMヒドロゲル（1％アルギン酸及び12％ECM）中1500万個細胞/mlで混合したβ-TC-6細胞を印刷した。足場全体は、1％塩化カルシウム溶液中に浸漬させ、20分間架橋させた。その後足場を、6ウェルプレート（1個のウェルにつき培地3〜5ml）において、細胞培養インキュベーター内で、15％ウシ胎仔血清を含有するDMEM培地中で培養した。異なる時点で、足場を、カルセイン染色及びMTS増殖アッセイのために収集し、各々、細胞生存能及び細胞増殖を特徴付けた。図10は、バイオプリンティングされた足場の構造を示している。

カルセイン染色は、β-TC-6細胞は、プリンティングプロセスを生き残り、且つ培養時に生存し続けたことを明らかにした。足場の横断面図は、細胞は、足場全体に均等に分布されたこと、及び各層において生存し続けたことを示した（図10参照）。MTSアッセイは、インスリン産生β-TC-6細胞は、最大3週間生存し続け、生存細胞の総数は一定に維持された（図11参照）ことを確認した。

このβ-TC-6細胞が、バイオプリントされた足場において機能することができるかどうかを決定するために、これらの細胞によるインスリン生成を測定した。インスリン生成を測定するために、バイオプリンティングされた足場を、新鮮な成長培地（6-ウェルプレート中3ml/ウェル）に2時間に曝し、各足場からの上清のアリコートを、マウスインスリンELISAキット(Millipore社)を使用し、インスリン濃度について測定した。生成されたインスリンの最高レベルを、0日目に検出した（図12参照）。分泌されたインスリンのレベルは、その後の培養時に減少した（3日目及び6日目）が、この培養物中3日目から6日目までは、安定し続けた（図12参照）。従ってこのβ-TC-6細胞は、バイオプリントされた後、インスリンを生成し且つ分泌する能力を維持した。

膵臓におけるインスリン産生細胞の重要な機能は、血液中の上昇したグルコースレベルに反応してインスリンを生成することである。従ってPCL、ECM、及びβ-TC-6細胞を含むバイオプリントされた足場は、グルコース糖チャレンジに足場を曝すことにより、この機能を保持するかどうかを試験した（図13参照）。1個の足場（図13の“A”）を、グルコース飢餓条件（グルコース非含有IMDM培地、10％FCS）に2日間曝し、その後インスリン生成条件（50mMグルコース/1mM IBMX）によりチャレンジした。対照としてのバイオプリントされた足場は、安定したグルコースレベルで、通常の培養培地において維持した（図13の“B”及び“C”）。これらの対照においては、培地を、インスリン生成条件によるチャレンジを被験足場（すなわち、図13のA）について行うと同時に交換した。各培養物からの上清（A、B、及びC）を、30分毎に採取し、各上清からインスリン濃度をELISAにより測定した。図13は、異なる時点での各培養物からのインスリン生成のレベルを示し、且つグルコース飢餓条件に曝され、その後インスリン生成条件によりチャレンジされたバイオプリントされた足場（すなわち、図13のA）は、チャレンジ後0.5時間でのそのインスリン生成レベルと比較し、チャレンジ後3時間で、80倍より多くのインスリンを生成したのに対し、対照（すなわち、図13のB及びC）は、はるかに少ないインスリンを生成した（培地交換後0.5時間でのインスリン生成レベルと比べ、培地交換の3時間後にわずかに約2倍多いインスリン）ことを明らかにしている。

この実施例は、合成材料、細胞、及びECMを含有するバイオプリントされた足場が作製され得ること、並びにバイオプリントされた足場の細胞は、生存能及び機能の両方を維持していることを明らかにしている。

本明細書に明らかにされた組成物及び方法は、本明細書記載の具体的実施態様により範囲が限定されるものではない。実際、記載された組成物及び方法に加え、組成物及び方法の様々な改変が、前述の説明及び添付図面から、当業者には明らかになるであろう。そのような改変は、添付された特許請求の範囲内に収まることが意図されている。

様々な出版物、特許及び特許出願が本明細書に挙げられており、これら文献の開示はそれらの全体が引用により本明細書中に組み込まれている。

Claims (75)

1. 細胞及び細胞外マトリクス(ECM)を含む少なくとも1種の細胞組成物を表面上に沈着することを含む、3次元組織又は器官の形成方法。
2. 前記ECMが、流動性ECMを含む、請求項1記載の方法。
3. 前記細胞組成物及び前記ECMが、前記表面上に印刷される、請求項1又は2記載の方法。
4. 前記沈着が、インクジェットプリンティングにより達成される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
5. 前記表面が、人工表面である、請求項1〜4のいずれか記載の方法。
6. 前記表面が、脱細胞化された組織又は脱細胞化された器官である、請求項1〜4のいずれか記載の方法。
7. 前記ECMが、哺乳動物ECM、軟体動物ECM、魚類ECM、及び／又は植物ECMを含む、請求項1〜6のいずれか記載の方法。
8. 前記哺乳動物ECMが、胎盤ECMである、請求項7記載の方法。
9. 前記ECMが、テロペプチド胎盤コラーゲンを含む、請求項8記載の方法。
10. 前記テロペプチド胎盤コラーゲンが、塩基処理された、界面活性剤処理されたI型テロペプチド胎盤コラーゲンを含む、請求項9記載の方法。
11. 前記コラーゲンが、化学修飾されていないか又はプロテアーゼと接触されていない、請求項9又は10記載の方法。
12. 前記胎盤ECMが、化学修飾されていないか又はプロテアーゼと接触されていない、塩基処理された及び／又は界面活性剤処理されたI型テロペプチド胎盤コラーゲンを含み、ここで該ECMが、フィブロネクチン5重量％未満又はラミニン5重量％未満；I型コラーゲン25重量％〜92重量％；及び、III型コラーゲン2重量％〜50重量％又はIV型コラーゲン2重量％〜50重量％を含む、請求項8記載の方法。
13. 前記胎盤ECMが、化学修飾されていないか又はプロテアーゼと接触されていない、塩基処理され、界面活性剤処理されたI型テロペプチド胎盤コラーゲンを含み、ここで該ECMが、フィブロネクチン1重量％未満又はラミニン1重量％未満；I型コラーゲン74重量％〜92重量％；及び、III型コラーゲン4重量％〜6重量％又はIV型コラーゲン2重量％〜15重量％を含む、請求項8記載の方法。
14. 前記ECMが、前記沈着前に誘導体化されている、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
15. 前記ECMが、細胞付着ペプチド、細胞付着タンパク質、サイトカイン、又はグリコサミノグリカンの1種以上により誘導体化されている、請求項14記載の方法。
16. 細胞付着ペプチド、細胞付着タンパク質、サイトカイン、又はグリコサミノグリカンの沈着を更に含む、請求項1〜15のいずれか記載の方法。
17. 前記サイトカインが、血管内皮増殖因子(VEGF)、又は骨形態形成タンパク質(BMP)である、請求項16記載の方法。
18. 前記細胞接着ペプチドが、1以上のRGDモチーフを含むペプチドである、請求項16記載の方法。
19. 合成ポリマーの沈着を更に含む、請求項1〜18のいずれか記載の方法。
20. 前記合成ポリマーが、感熱性である、請求項19記載の方法。
21. 前記合成ポリマーが、感光性である、請求項19記載の方法。
22. 前記合成ポリマーが、熱可塑性物質を含む、請求項19記載の方法。
23. 前記合成ポリマーが、ポリ(L-ラクチド-コ-グリコリド)(PLGA)である、請求項22記載の方法。
24. 前記熱可塑性物質が、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン、ポリエステル、ポリ酢酸ビニル、又はポリ塩化ビニルである、請求項22記載の方法。
25. 前記合成ポリマーが、ポリアクリルアミド、ポリ塩化ビニリジン、ポリ(o-カルボキシフェノキシ)-p-キシレン)(ポリ(o-CPX))、ポリ(無水ラクチド)(PLAA)、n-イソプロピルアクリルアミド、ペントエリスリトールジアクリレート、ポリメチルアクリレート、カルボキシメチルセルロース、又はポリ(乳酸-グリコール酸共重合体)(PLGA)である、請求項19記載の方法。
26. テナシンC又はそれらの断片の沈着を更に含む、請求項1〜25のいずれか記載の方法。
27. チタン-アルミニウム-バナジウム(Ti₆Al₄V)組成物の沈着を更に含む、請求項1〜35のいずれか記載の方法。
28. 前記チタン-アルミニウム-バナジウム組成物が、ファイバーの相互連結された多孔質網の形態で沈着されている、請求項27記載の方法。
29. 前記組織又は器官が、前記細胞組成物の少なくとも1つの層及びECMの少なくとも1つの層を含む、請求項1記載の方法。
30. 前記組織又は器官の少なくとも一部が、交互層中に印刷された前記細胞組成物の少なくとも1つの層及び前記ECMの少なくとも1つの層を含む、請求項1記載の方法。
31. 前記組織又は器官の製造において、前記合成ポリマーの少なくとも一部が、互いに実質的に平行である複数のファイバーの形態で印刷される、請求項19記載の方法。
32. 前記複数のファイバーが、互いに実質的に平行に沈着され、互いに物理的に接触しないように印刷されている、請求項31記載の方法。
33. 前記合成ポリマーが、複数回沈着されている、請求項32記載の方法。
34. 前記ファイバーが、前記複数回沈着されている場合、該回数の少なくとも2回は異なる方向に印刷されている、請求項33記載の方法。
35. 前記ファイバーが、前記複数回沈着されている場合、該回数の各々が異なる方向に沈着されている、請求項33記載の方法。
36. 前記組織が、前記ECMの少なくとも2つの層を含む、請求項1〜35のいずれか記載の方法。
37. 前記基板の該少なくとも2つの層の少なくとも一部が、前記細胞組成物により互いに分離されている、請求項36記載の方法。
38. 前記プリンティングが、前記基板の2つの層間に接着剤を印刷することを含む、請求項3記載の方法。
39. 前記ECM及び前記細胞組成物が、前記表面上に個別に沈着されている、請求項1〜38のいずれか記載の方法。
40. 前記ECMの少なくとも一部が、前記細胞組成物の印刷前に、前記表面上に沈着される、請求項1〜38のいずれか記載の方法。
41. 前記細胞組成物及び前記ECMが、前記沈着の前に組み合せられる、請求項1〜38のいずれか記載の方法。
42. 前記細胞組成物が、前記印刷時に、前記ECM上に印刷される、請求項3記載の方法。
43. 前記細胞組成物が、前記ECMの前記印刷の完了後に、該ECM上に印刷される、請求項3記載の方法。
44. 前記ECMが、前記沈着時に、3次元構造へ形成される、請求項1〜43のいずれか記載の方法。
45. 代用骨の沈着を更に含む、請求項1〜44のいずれか記載の方法。
46. 前記表面が、骨であるか又は骨を含む、請求項1〜45記載の方法。
47. 前記代用骨が、前記組織の意図されたレシピエントにおける骨に対応するように印刷される、請求項45記載の方法。
48. 前記方法が、前記組織の意図されたレシピエントにおける骨の3次元マップを作製することを更に含み、ここで前記代用骨が、該3次元マップに対応するように印刷される、請求項47記載の方法。
49. 前記骨が、頭蓋骨又は顔面骨である、請求項47又は48記載の方法。
50. 前記骨が、耳の骨又は指趾骨である、請求項47又は48記載の方法。
51. 前記細胞組成物が、前記骨又は代用骨の表面を少なくとも部分的に被覆するように、該細胞組成物が、該骨又は代用骨上に印刷される、請求項47〜50のいずれか記載の方法。
52. 前記組織が、(a)内面及び外面を有する骨からなる表面、並びに(b)2種の細胞組成物を含み、ここで該第一の細胞組成物は、該内面上に印刷される第一の型の細胞、及び該外面上に印刷される第二の型の細胞を含む、請求項1記載の方法。
53. 前記沈着が、3次元的に行われる、請求項1〜52のいずれか記載の方法。
54. 前記組織が、3次元表面上に印刷される、請求項53記載の方法。
55. 前記インクジェットプリンティングが、複数のプリントヘッド又は複数のプリントジェットを備えるプリンターを用いて実行される、請求項4記載の方法。
56. 前記プリントヘッド又はプリントジェットの各々が、個別に制御可能である、請求項55記載の方法。
57. 前記プリントヘッド又はプリントジェットの各々が、残りのプリントヘッド又はプリントジェットから独立して作動する、請求項56記載の方法。
58. 前記複数のプリントヘッド又はプリントジェットの少なくとも1個が、前記細胞組成物を印刷し、並びにその他の該複数のプリントヘッド又はプリントジェットの少なくとも1個が、前記ECMを印刷する、請求項55〜57のいずれか記載の方法。
59. 前記細胞組成物及び前記ECMが、前記印刷前に組み合せられる、請求項1記載の方法。
60. 前記細胞組成物が、骨髄由来間葉系幹細胞(BM-MSC)を含む、請求項1〜59のいずれか記載の方法。
61. 前記細胞組成物が、組織培養プラスチック接着性CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、及びCD200⁺胎盤幹細胞を含む、請求項1〜59のいずれか記載の方法。
62. 前記胎盤幹細胞は更に、CD45^-、CD80^-、CD86^-、又はCD90⁺の1以上である、請求項61記載の方法。
63. 前記胎盤幹細胞が、前記レシピエント内で免疫応答を抑制する、請求項61又は62記載の方法。
64. 前記胎盤幹細胞が、前記レシピエント内で免疫応答を局所的に抑制する、請求項63記載の方法。
65. 前記細胞組成物が、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系間質細胞、組織プラスチック接着性胎盤幹細胞(PDAC)、臍帯幹細胞、羊水幹細胞、羊膜由来接着性細胞(AMDAC)、骨形成性の胎盤接着性細胞(OPAC)、脂肪幹細胞、角膜上皮幹細胞、歯髄幹細胞、筋芽細胞、内皮前駆細胞、神経幹細胞、脱落歯由来幹細胞、毛嚢幹細胞、真皮幹細胞、単為生殖由来幹細胞、初期化された幹細胞、羊膜由来接着性細胞、又はサイドポピュレーション幹細胞を含む、請求項1〜59のいずれか記載の方法。
66. 前記細胞組成物が、分化した細胞である、請求項1〜59のいずれか記載の方法。
67. 前記分化した細胞が、内皮細胞、上皮細胞、真皮細胞、内胚葉細胞、中胚葉細胞、線維芽細胞、骨細胞、軟骨細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、肝細胞、膵臓細胞、又は間質細胞を含む、請求項66記載の方法。
68. 前記分化した細胞が、
    唾液腺粘液性細胞、唾液腺漿液性細胞、フォンエブネル腺細胞、乳腺細胞、涙腺細胞、耳道腺細胞、エクリン汗腺暗調細胞、エクリン汗腺明調細胞、アポクリン汗腺細胞、モル腺細胞、脂腺細胞、ボウマン腺細胞、ブルンネル腺細胞、精嚢細胞、前立腺細胞、尿道球腺細胞、バルトリン腺細胞、リトレ腺細胞、子宮内膜細胞、単離された杯細胞、胃表層粘液細胞、胃腺酵素原細胞、胃腺酸分泌細胞、膵腺房細胞、パネート細胞、II型肺胞上皮細胞、クララ細胞、
    成長ホルモン産生細胞、乳腺刺激ホルモン産生細胞、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、性腺刺激ホルモン産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン産生細胞、下垂体中葉由来の細胞、巨大細胞神経分泌細胞、腸管細胞、気道細胞、甲状腺上皮細胞、傍濾胞細胞、副甲状腺細胞、副甲状腺主細胞、好酸性細胞、副腎腺細胞、クロム親和性細胞、ライディッヒ細胞、内卵胞膜細胞、黄体細胞、顆粒膜黄体細胞、莢膜黄体様細胞、傍糸球体細胞、緻密斑細胞、極周囲細胞、メサンギウム細胞、
    血管及びリンパ管内皮有孔細胞、血管及びリンパ管内皮連続型細胞、血管及びリンパ管内皮脾細胞、滑膜細胞、漿膜細胞(腹膜の、胸膜の、及び心膜腔の内壁）、扁平上皮細胞、円柱細胞、暗調細胞、前庭膜細胞（耳の内リンパ腔内壁）、血管条基底細胞、血管条周辺細胞（耳の内リンパ腔内壁）、クラウディウス細胞、ベッチェル細胞、脈絡叢細胞、軟膜クモ膜扁平上皮細胞、色素毛様体上皮細胞、非色素毛様体上皮細胞、角膜内皮細胞、栓細胞、
    気道線毛細胞、卵管線毛細胞、子宮内膜線毛細胞、精巣網線毛細胞、精巣輸出管線毛細胞、線毛性上衣細胞、
    表皮角化細胞、表皮基底細胞、手指爪及び足指爪の角化細胞、爪床基底細胞、毛幹の毛髄質細胞、毛幹の毛皮質細胞、毛幹の毛小皮細胞、毛根の毛小皮鞘細胞、毛根ハックスレー層の鞘細胞、毛根ヘンレ層の鞘細胞、外毛根鞘細胞、毛母細胞、
    重層扁平上皮の表面上皮細胞、上皮基底細胞、泌尿器上皮細胞、
    耳のコルチ器官の内有毛細胞、耳のコルチ器官の外有毛細胞、嗅上皮基底細胞、冷感受性一次感覚ニューロン、熱感受性一次感覚ニューロン、表皮のメルケル細胞、嗅覚受容体神経、痛み感受性一次感覚ニューロン、光受容体桿体細胞、光受容体青色感受性錐体細胞、光受容体緑色感受性錐体細胞、光受容体赤色感受性錐体細胞、固有受容性一次感覚ニューロン、触覚感受性一次感覚ニューロン、I型頸動脈小体細胞、II型頸動脈小体細胞（血液pHセンサ）、内耳前庭器官のI型有毛細胞（加速度及び重力）、内耳前庭器官のII型有毛細胞、I型味蕾細胞、
    コリン作動性神経細胞、アドレナリン作動性神経細胞、ペプチド作動性神経細胞、
    コルチ器官の内柱細胞、コルチ器官の外柱細胞、コルチ器官の内指骨細胞、コルチ器官の外指骨細胞、コルチ器官の境界細胞、コルチ器官のヘンゼン細胞、前庭器支持細胞、味蕾支持細胞、嗅上皮支持細胞、シュワン細胞、サテライト細胞、腸内グリア細胞、
    星状細胞、ニューロン、希突起膠細胞、紡錘形ニューロン、
    前水晶体上皮細胞、クリスタリン含有水晶体線維細胞、
    肝細胞、脂肪細胞、白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞、肝臓脂肪細胞、
    腎臓糸球体壁細胞、腎臓糸球体有足細胞、腎臓近位尿細管刷子縁細胞、ヘンレ係蹄の細い部分の細胞、腎臓遠位尿細管細胞、腎臓集合管細胞、I型肺胞上皮細胞、膵管細胞、非線条導管細胞、導管細胞、腸管刷子縁細胞、外分泌腺線条導管細胞、胆嚢上皮細胞、精巣輸出管非線毛細胞、精巣上体主細胞、精巣上体基底細胞、
    エナメル芽細胞上皮細胞、半月面上皮細胞、コルチ器官歯間上皮細胞、疎性結合組織線維芽細胞、角膜実質細胞、腱線維芽細胞、骨髄網状組織線維芽細胞、非上皮性線維芽細胞、周細胞、髄核細胞、セメント芽細胞/セメント細胞、象牙芽細胞、オドントサイト、ヒアリン軟骨細胞、線維軟骨細胞、弾性軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、骨前駆細胞、硝子体細胞、星細胞（耳）、肝星細胞（伊東細胞）、膵星細胞、
    赤色骨格筋細胞、白色骨格筋細胞、中間体骨格筋細胞、筋紡錘の核袋細胞、筋紡錘の核鎖細胞、サテライト細胞、固有心筋細胞、結節性心筋細胞、プルキンエ線維細胞、平滑筋細胞、虹彩の筋上皮細胞、外分泌腺の筋上皮細胞、
    網状赤血球、巨核球、単球、結合組織マクロファージ、表皮ランゲルハンス細胞、樹状細胞、小膠細胞、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞、細胞傷害性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、
    メラニン形成細胞、網膜色素上皮細胞、
    卵原細胞/卵母細胞、精子細胞、精母細胞、精原細胞、精子、卵胞細胞、セルトリ細胞、胸腺上皮細胞、及び／又は間質性腎臓細胞
    を含む、請求項66記載の方法。
69. 前記組織が、人工神経導管を含む、請求項1〜68のいずれか一項記載の方法。
70. 前記人工神経導管が、ポリ無水物で作製される、請求項69記載の方法。
71. 前記ポリ無水物が、ポリ(o-カルボキシフェノキシ)-p-キシレン)又はポリ(無水ラクチド)である、請求項70記載の方法。
72. 前記人工神経導管が、前記ポリ無水物を用い、前記組織へ、前記インクジェットプリンティングにより沈着される、請求項69〜71のいずれか記載の方法。
73. 前記人工神経導管が、前記プリンティング前に調製され、且つ前記組織のプリンティング時に、該組織へ配置される、請求項69〜71のいずれか記載の方法。
74. 前記人工神経導管を含む前記組織が、中枢神経系(CNS)の損傷領域への移植に適している、請求項72又は73記載の方法。
75. 前記CNSの領域が、脊髄である、請求項74記載の方法。

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