CN113940950A - 额骨间充质干细胞在治疗和/或预防动物创伤性脑损伤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了额骨间充质干细胞在治疗和/或预防动物创伤性脑损伤中的应用。本发明发现，额骨来源MSC可以改善损伤区神经炎症微环境，减少星形胶质细胞和小胶质细胞的活化，促进神经元突触重塑，促进TBI后的神经修复，从而减轻TBI引起的持续性损伤及由此引起的神经功能障碍，这为TBI的治疗提供了新的种子细胞，本发明具有很好的应用前景。

Description

额骨间充质干细胞在治疗和/或预防动物创伤性脑损伤中的 应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域中，额骨间充质干细胞在治疗和/或预防动物创伤性脑损伤中的应用。

背景技术

创伤性脑损伤(TBI)是一个全球性的公共健康问题，可供选择的治疗方法有限。创伤性脑损伤(TBI)是世界范围内死亡率和发病率的主要原因。幸存者可能患有认知和记忆缺陷、视力和听力损失、运动障碍和不同的心理问题。脑损伤的主要病理改变包括正常组织结构的丧失、神经元的破坏和内环境的紊乱，其中神经元损伤是最主要的病理改变之一。由于TBI的复杂性和异质性，尽管有深入的研究，但至今没有有效的治疗方法。

TBI在发病时引起原发性损伤，后续引起继发性损伤，包括缺氧、出血、血脑屏障破坏和神经毒性等。在TBI后的几个小时内，受损区域通过多种途径被激活，包括谷氨酸诱导的兴奋性中毒、血脑屏障，神经炎症、氧化应激以及脑脊液和血液成分的流入。原发性损伤导致神经元损伤，并激活星形胶质细胞和小胶质细胞，引发免疫反应，从而对大脑造成进一步伤害。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何治疗和/或预防动物创伤性脑损伤。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了下述任一应用：

1、额骨间充质干细胞在制备治疗和/或预防动物创伤性脑损伤产品中的应用；

2、额骨间充质干细胞在制备修复动物神经元轴突断裂产品中的应用；

3、额骨间充质干细胞在制备促进动物神经元重塑产品中的应用；

4、额骨间充质干细胞在制备改善动物神经元间突触连接产品中的应用；

5、额骨间充质干细胞在制备改善创伤性脑损伤动物学习和/或认知功能产品中的应用；

6、额骨间充质干细胞在制备抑制动物创伤性脑损伤神经炎症反应产品中的应用；

7、额骨间充质干细胞在制备抑制动物创伤性脑损伤小胶质细胞活化产品中的应用；

8、额骨间充质干细胞在制备抑制动物创伤性脑损伤星形胶质细胞活化产品中的应用。

上文中，所述神经炎症反应可通过IL-1β和/或TNF-α表现的炎症反应。

上文中，所述动物为哺乳动物(如人或小鼠)。

本发明还提供了一种具有如下任一功能的产品，所述产品含有(或其活性成分为)额骨间充质干细胞：

X1、治疗和/或预防动物创伤性脑损伤；

X2、修复动物神经元轴突断裂；

X3、促进动物神经元重塑；

X4、改善动物神经元间突触连接；

X5、改善创伤性脑损伤动物学习和/或认知功能；

X6、抑制动物创伤性脑损伤神经炎症反应；

X7、抑制动物创伤性脑损伤小胶质细胞活化；

X8、抑制动物创伤性脑损伤星形胶质细胞活化。

本发明发现，额骨来源的MSC可以改善损伤区神经炎症微环境，减少星形胶质细胞和小胶质细胞的活化，促进神经元突触重塑，促进TBI后的神经修复，从而减轻TBI引起的持续性损伤及由此引起的神经功能障碍。这为TBI的治疗提供了新的种子细胞，本发明具有很好的应用前景。

附图说明

图1额骨MSC与骨髓MSC基因芯片分析后的聚类热图、GO气泡图和KEGG通路图。聚类热图显示，额骨MSC高表达外胚层标记物Tfap2β和生长因子FGF1。额骨MSC与骨髓MSC基因芯片分析后的GO气泡图显示，额骨MSC与骨髓MSC在神经分化和炎症反应等生物学过程中有显著富集差异。额骨MSC与骨髓MSC基因芯片分析后的KEGG通路图显示，额骨MSC与骨髓MSC在神经配体-受体通路和TGF-β通路等有显著富集差异。

图2额骨MSC经β-巯基乙醇诱导后能够检测到EN-1+神经元。Before表示额骨MSC经β-巯基乙醇诱导之前的光镜照片；After表示额骨MSC经过β-巯基乙醇诱导之后的光镜照片；NeuN表示NeuN抗体的免疫荧光染色结果，是一种标记神经元细胞核的抗体；EN-1表示EN-1抗体的免疫荧光染色结果，是一种标记多巴胺能神经元的抗体。

图3额骨MSC能够在体外分化成vGlut2+谷氨酸能神经元和TH+多巴胺能神经元。“对照”表示额骨MSC，“诱导”为额骨MSC经过β-巯基乙醇诱导后的细胞。

图4额骨MSC移植能够降低损伤部位促炎因子的表达。

图5额骨MSC移植能够降低损伤部位即大脑皮层周围小胶质细胞活化。上图为荧光显微镜拍摄结果，下图为荧光强度定量结果。

图6额骨MSC移植能够降低损伤部位即大脑皮层周围星形胶质细胞活化。上图为荧光显微镜拍摄结果，下图为荧光强度定量结果。

图7额骨MSC移植能修复大脑皮层周围断裂的神经元。上图为荧光显微镜拍摄结果，下图为荧光强度定量结果。

图8额骨MSC治疗后TBI小鼠学习认知能力有明显改善。左图为小鼠在水迷宫实验第6天寻找平台的典型轨迹图像；中间图为水迷宫实验1-6天中小鼠首次穿过平台所用的时间(用时越少，小鼠的学习能力越强)；右图为水迷宫实验第6天，小鼠首次穿过平台所用时间的统计图。

图9水迷宫学习过程中各组小鼠运动能力没有差异。

注：ns表示无显著差异，*表示差异达到显著水平p＜0.05，**表示差异达到显著水平p＜0.01，***表示差异达到显著水平p＜0.001，****表示差异达到显著水平p＜0.0001。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、额骨MSC可以促进TBI后的神经修复

1.基因芯片

分别对小鼠来源的额骨MSC和骨髓MSC进行原代培养，收集足够量的细胞，送样给上海欧易科技生物有限公司进行后续提取分析。经基因芯片分析，得到额骨MSC与骨髓MSC在基因表达方面的显著差异。额骨MSC高表达外胚层标记Tfap2β和生长因子FGF1，说明额骨MSC与骨髓MSC来源不同，且外胚层治疗神经系统疾病有优势。额骨MSC与骨髓MSC在神经配体-受体通路和TNF-α通路也有显著性差异，在神经分化和炎症反应等生物学过程中也存在显著差异。图1。

2.动物

小鼠：为C57BL/6小鼠，维通利华，鼠龄为8-12周，体重20-25g。

动物饲养和实验符合国家标准和相关要求，小鼠饲养在通风的隔离笼中(4-5只/笼)，保持上午7：00-下午7：00的光照，温度保持在21-23℃。动物饲养员每天给动物提供标准食物和水，并密切监测它们的健康和福利。所有动物实验均按照军事医学研究院批准的“实验动物的护理和使用指南”进行。

3.额骨间充质干细胞(FbMSCs)的分离制备及诱导

使用C57BL/6新生24小时内乳鼠，制备了额骨来源的原代间充质干细胞(frontalbone mesenchymal stem cells，FbMSCs)。所用完全培养基为向MEM-α培养基中添加FBS、青霉素与链霉素得到的培养基，FBS、青霉素与链霉素在完全培养基中的浓度分别为10％(体积百分比)、100U/ml与100μg/ml，具体步骤如下：

剪开乳鼠头皮，暴露额骨与顶骨，将额骨与顶骨分开，保留额骨，剪成小块。随后加入0.25％胰蛋白酶(Gibco)，消化10分钟，加入血清终止消化，弃去液体。无菌PBS清洗2-3次，加入完全培养基，3天后换液，培养基每隔2-3天更换一次，直到细胞单层达到融合。对于额骨MSC诱导分化，将单层达到融合的细胞使用0.25％胰酶于孵箱消化3-5分钟，随后立即加入等体积的完全培养基终止消化。对消化后的细胞进行计数，然后种于24孔板，每孔5×10⁴个细胞，培养基为完全培养基，37℃下培养。待细胞贴壁后，弃去原来的培养液，向细胞中加入预诱导液(15ml完全培养基+1μlβ-巯基乙醇(SIGMA))，继续培养24小时后吸出旧的培养液，再加入诱导液(15ml MEM-α+5μlβ-巯基乙醇)继续培养2小时，得到诱导后的细胞。

将所得额骨MSC(FbMSCs)及诱导后的细胞进行免疫荧光染色，所用一抗为EN-1抗体(abcam，ab108598)；vGlut2抗体(abcam，ab79157)；TH抗体(abcam，ab137869)；NeuN抗体(abcam，ab177487)。结果显示，在体外实验中用β-巯基乙醇诱导额骨MSC分化，经免疫荧光染色发现额骨MSC可以在体外分化成神经元(图2和3)。

4.骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离和培养

使用C57BL/6乳鼠(新生4-5天)，制备了骨髓来源的原代间充质干细胞(Bonemesenchymal stem cells，BMSCs)。所用完全培养基为向MEM-α培养基中添加FBS、青霉素与链霉素得到的培养基，FBS、青霉素与链霉素在完全培养基中的浓度分别为10％(体积百分比)、100U/ml与100μg/ml，具体步骤如下：

将小鼠股骨和胫骨分离，剔除多余的组织，将骨头剔成小块，0.25％胰酶消化20min。用PBS冲洗两遍，换成完全培养基，3天后换液，往后2-3天换液一次，等细胞融合度60％-80％时进行传代。

5.额骨MSC移植

将C57BL/6小鼠随机分为四组，假手术组、TBI处理组(脑损伤组)、基质胶处理组和额骨MSC治疗组，各组处理方法如下：

对于假手术组，bregma点向后3mm、中缝左侧2mm处钻开4mm小孔，揭去头盖骨，如有出血则清理血迹后再进行小鼠头皮缝合。对于TBI处理组，使用控制性皮质撞击(Controlled Cortical Impact,CCI)制造脑损伤模型。冲击参数为：深度1mm，速度3.5m/s，时间400msec。对于基质胶处理组，小鼠撞击损伤(操作同TBI处理组)后，清理出血，将10μlMatrigel(Gibco)注射到损伤部位。对于额骨MSC治疗组，小鼠撞击损伤(操作同TBI处理组)后，清理出血，将Matrigel(Gibco)包裹的额骨MSC注射到损伤部位，每只小鼠注射5×10⁵个细胞。待凝胶凝固后，稳定2-3分钟，进行小鼠头皮缝合。Matrigel(Gibco)包裹的额骨MSC制备方法如下：将步骤2得到的额骨MSC(未诱导)按照每只老鼠5×10⁵分装至离心管，去掉多余上清，尽量吸除干净，每管加入10μl Matrigel混匀，但注意不要有气泡，即得到Matrigel包裹的额骨MSC，放置冰上，等待使用。

6.qRT-PCR

TBI损伤结束后第4天，每组取3只小鼠进行qRT-PCR，步骤如下：

取小鼠损伤处大脑皮层组织，加入裂解液Trizol提取RNA，并反转录为cDNA，以β-actin表达量为内参，qRT-PCR检测IL-6、IL-1β、TNF-α基因的表达变化，引物序列见下表。

引物	序列(5′-3′)
		β-actin-F	TCACTATTGGCAACGAGCGGTTC
β-actin-R	TCACTATTGGCAACGAGCGGTTC
		IL-6-F	CACTGGTCTTTTGGAGTTTGAG
IL-6-R	GGACTTTTGTACTCATCTGCAC
		IL-1β-F	TCGCAGCAGCACATCAACAAGAG
IL-1β-R	AGGTCCACGGGAAAGACACAGG
		TNF-α-F	GGACTAGCCAGGAGGGAGAACAG
TNF-α-R	GCCAGTGAGTGAAAGGGACAGAAC

结果显示，脑损伤介导炎症因子的表达以及损伤区域星形胶质细胞和小胶质细胞的募集，额骨MSC移植减轻了损伤区周围皮层和海马促炎因子(IL-1β、TNF-α)的水平，即额骨MSC移植能够降低神经炎症，防止进一步的神经损伤(图4)。

7.免疫荧光

TBI损伤结束后第4天，每组取3只小鼠进行免疫荧光检测，步骤如下：

小鼠用2,2,2-三溴乙醇(350mg/kg，Sigma-Aldrich，T48402)麻醉，经心脏灌注0.9％生理盐水50ml，取脑固定于4％多聚甲醛中24h，然后分别用15％和30％蔗糖于4℃冰箱脱水24h，利用冰冻切片机切片。小鼠脑切片(厚度30μm)用PBS洗涤三次，然后在室温下封闭1小时，在含有0.3％Triton X-100和5％正常山羊血清以及3％牛血清白蛋白的PBS中封闭。4℃下，一抗在封闭缓冲液中孵育过夜，一抗与封闭液比例为1：200。次日，PBS漂洗3次，每次10min，将二抗用封闭液以1：200的稀释比例配制并孵育1小时。然后用PBS清洗5次，每次10min，并用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)复染，在荧光显微镜下采集图像。用于免疫染色的一抗分别为：GFAP抗体(小鼠，1:200稀释；abcam，ab10062)、Iba1抗体(兔，1:200稀释；abcam，ab178847)、MAP2抗体(兔，1:200稀释；abcam，ab32454)、vGlut2抗体(鼠，1：200稀释；abcam，ab79157)、TH抗体(兔，1：200稀释；abcam，ab137869)、NeuN抗体(兔，1：200稀释；abcam，ab229590)、EN1抗体(兔，1：200稀释；abcam，ab108598)。二抗为：Cy3-conjugatedAffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG(Jackson ImmumoResearch，147259)，Alexa Fluor488-conjugated AffiniPure Donkey anti-Mouse IgG，150565)。DAPI(阳光英锐，C190401)。

星形胶质细胞和小胶质细胞的活化是神经炎症的标志。发明人证明额骨MSC移植能够显著降低小胶质细胞和星形胶质细胞的激活状态。与假手术组相比，脑损伤组Iba1+小胶质细胞数量(图5)和GFAP+星形胶质细胞数量均显著增加(图6)；与脑损伤处理组、基质胶处理组相比，额骨MSC治疗组Iba1+小胶质细胞数量(图5)和GFAP+星形胶质细胞数量均显著减少(图6)。说明，额骨MSC移植能够抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的活化，即额骨MSC移植能够抑制神经炎症反应。

额骨MSC移植修复神经元轴突的断裂，额骨MSC移植存在促进神经元重塑，改善神经元之间的突触连接的潜在功能。与假手术组相比，脑损伤组MAP2阳性细胞排列混乱，平均荧光强度显著降低(图7)；与脑损伤处理组、基质胶处理组相比，额骨MSC治疗组MAP2阳性细胞排列整齐有序，平均荧光强度显著增加(图7)。

8.水迷宫实验

TBI损伤结束后第6天开始水迷宫实验，完成水迷宫需要6天，每组取3只小鼠，步骤如下：

Morris水迷宫实验装置由圆形水池、平台、摄像系统以及动物行为轨迹分析系统组成。水池直径为100cm，高50cm。池壁上有N，E，S，W四个等距离点，将水池分为NE，SE，SW，NW四个象限。在其中一个象限中央的液面下隐藏着一个圆形平台，平台大小为10cm×10cm，距液面1cm。水池中放入无毒不透明的钛白粉透明剂等，从而和实验动物的毛色形成鲜明对比，液体温度多保持在20℃-22℃。

其目的是使动物在连续多日的训练中学会登上隐藏平台的实验规则。每次实验时把动物从其中一个区域面朝池壁放入水池中，由于动物的求生本能，动物将在水池内游泳直到找到隐藏在水面下的平台为止。每次训练时间一般为60s，找到平台后允许动物在平台上滞留10s。如果动物未在规定时间内找到平台，则实验者帮助其找到平台并在平台上滞留10s。每只动物四个象限每天各训练1次，实验连续进行6天。记录其到达到平台的时间作为衡量空间学习和记忆能力的标准。实验第6天，移除平台并进行测试，记录小鼠在四个象限中的时间、平均速度和总距离。

结果显示，TBI处理组首次穿过平台所用时间远高于假手术组和额骨MSC处理组的小鼠(图8、表1与2)，而各组小鼠之间运动能力没有差异(图9、表3)。这些数据表明，额骨MSC的移植改善了TBI小鼠的学习和认知水平。

表1、水迷宫实验1-6天小鼠首次穿过平台的时间(s)

试验天数	假手术组	脑损伤组	基质胶处理组	额骨MSC治疗组
					1	36.48±12.42	44.93±10.91	44.32±9.39	44.97±10.82
2	37.123±14.51	46.18±8.70	50.26±8.68	48.47±13.50
					3	34.455±13.42	46.13±11.40	42.05±9.02	37.46±9.17
4	30.198±9.18	42.35±7.42	40.74±10.38	29.62±13.65
					5	25.04±7.46	36.9±15.22	36.46±9.78	33.5±5.44
6	16.32±13.09	38.2±20.70	36.67±24.08	19.95±13.71

表2、水迷宫实验第6天小鼠首次穿过平台所用时间

	假手术组	脑损伤组	基质胶处理组	额骨MSC治疗组
					首次穿过平台时间(s)	12.34±8.90	40.98±19.37	36.48±24.03	16.1±6.84

表3、水迷宫实验第6天各组小鼠的平均速度

	假手术组	脑损伤组	基质胶处理组	额骨MSC治疗组
					平均速度(mm/s)	172.7±30.65	148.61±60.46	123.6±46.77	124.8±44.68

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.额骨间充质干细胞在制备治疗和/或预防动物创伤性脑损伤产品中的应用。

2.额骨间充质干细胞在制备修复动物神经元轴突断裂产品中的应用。

3.额骨间充质干细胞在制备促进动物神经元重塑产品中的应用。

4.额骨间充质干细胞在制备改善动物神经元间突触连接产品中的应用。

5.额骨间充质干细胞在制备改善创伤性脑损伤动物学习和/或认知功能产品中的应用。

6.额骨间充质干细胞在制备抑制动物创伤性脑损伤神经炎症反应产品中的应用。

7.额骨间充质干细胞在制备抑制动物创伤性脑损伤小胶质细胞活化产品中的应用。

8.额骨间充质干细胞在制备抑制动物创伤性脑损伤星形胶质细胞活化产品中的应用。

9.根据权利要求1-8中任一所述的应用，其特征在于：所述动物为哺乳动物。

10.一种具有如下任一功能的产品，含有额骨间充质干细胞：

X1、治疗和/或预防动物创伤性脑损伤；

X2、修复动物神经元轴突断裂；

X3、促进动物神经元重塑；

X4、改善动物神经元间突触连接；

X5、改善创伤性脑损伤动物学习和/或认知功能；

X6、抑制动物创伤性脑损伤神经炎症反应；

X7、抑制动物创伤性脑损伤小胶质细胞活化；

X8、抑制动物创伤性脑损伤星形胶质细胞活化。

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