TWI671398B - 去細胞角膜及其製備方法和用途 - Google Patents

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Abstract

在此揭示製備去細胞角膜的方法及其用途。所述方法包含對動物角膜施以去細胞處理步驟，且所述方法的特徵在於不使用蛋白酶、螯合劑、清潔劑、甘油或其組合處理角膜的步驟。在此亦揭示一種治療患有與角膜受損相關眼部疾病個體的方法，其能夠藉由使用本方法製成的去細胞角膜獲益。

Description

去細胞角膜及其製備方法和用途 引用參照
本申請案主張2016年1月8日提申之美國臨時案第62/276,238號的所有權利，其內文整體併入本申請案中。
本揭示內容是關於製備去細胞角膜方法的領域，所述去細胞角膜適合作為移植物使用，以及以所述去細胞角膜來治療患有與角膜受損相關眼部疾病之個體的方法。
有多種疾病或病症影響角膜的功能，情況嚴重時甚至需要藉由手術和角膜組織移植來進行修復。豬角膜已經被公認是最適合作為人類角膜的替代品，因豬角膜折射率及尺寸與人類角膜相當。然而，異種移植豬角膜往往會引發宿主嚴重的免疫反應(或移植排斥)，此係由於豬角膜去細胞處理過程中去除細胞不完全或所用的製劑殘留(例如，化學物質和酵素)所造成。
因此，本領域亟需一種經改良的角膜製備方法，其能保留天然角膜的結構和構型，並減少免疫原(即，任一種殘留的細胞物質)，使製備而成的角膜能夠作為三維支架，於移植後支撐宿主細胞於其上生長，且不會引起嚴重的免疫反應和誘發新生血管。
發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
本揭示內容之一第一態樣係有關於一種製備去細胞角膜的方法。所述方法包含對動物角膜施以超臨界流體(SCF)處理；其中，該方法的特徵在於不包括使用蛋白酶、螯合劑、清潔劑、甘油或其組合處理角膜的步驟。
依據某些實施方式，所述方法更包含在SCF處理前，以水或含0.5-4.0M NaCl溶液處理角膜至少24小時。
依據某些實施方式，在對角膜進行SCF處理時，更包含使用一輔溶劑並於壓力73-500巴以及溫度30-50℃下，處理20-120分鐘。
所述SCF是超臨界二氧化碳(supercritical carbon dioxide,ScCO2)、超臨界一氧化二氮(supercritical nitrous oxide,ScN2O)、超臨界烷類(supercritical alkane)、超臨界烯類(supercritical alkene)、超臨界醇類(supercritical alcohol)、超臨界丙酮(supercritical acetone)或其組合。在一實施例中，所述SCF是ScCO2。在另一實施例中，所述SCF是ScN2O。所述輔溶劑可以是C1-4醇，且選自於以下成員所組成的群組中：乙醇(ethanol)、丙醇(propanol)、異丙醇(isopropanol)、丁醇(butanol)、異丁醇(isobutanol)、仲丁醇(sec-butanol)、叔丁醇(t-butanol)和環丁醇(cyclobutanol)。在較佳的實施方式中，所述輔溶劑是30-100%(vol%)乙醇；在更佳的實施方式中，所述輔溶劑 是50-98%乙醇；以及，在最佳的實施方式中，所述輔溶劑是60-75%(vol%)乙醇。
依據一較佳實施方式，所述SCF處理的執行條件為連同60%(vol%)乙醇於壓力350巴和45℃下，處理80分鐘。
在最佳實施方式中，本方法不含以蛋白酶、螯合劑、清潔劑、甘油或其組合處理角膜的步驟。
依據某些實施方式，所述角膜是取自於動物，其係選自於以下成員所組成的群組中：豬、牛、綿羊、山羊、兔子、猴子或人類。在較佳的實施方式中，所述角膜是取自於豬。
因此，本揭示內容第二態樣是提供利用以所述方法製備而成的去細胞角膜。
依據較佳的實施方式，所述去細胞角膜是取自於豬角膜。
再者，本揭示內容第三態樣是關於以本揭示內容所製備的去細胞角膜，來治療患有與角膜受損相關眼部疾病之個體的方法。
在可任選的實施方式中，所述方法包含在移植前，先在去細胞角膜上培養細胞。適合培養於本發明去細胞角膜上的細胞可選自於以下成員所組成的群組中：角膜內皮細胞、角膜基質細胞、角膜上皮細胞、胚胎幹細胞和成體幹細胞。
依據本揭示內容某些實施方式，所述細胞是自體細胞。
依據本揭示內容其他實施方式，所述細胞是同種異體細胞。
依據本揭示內容某些實施方式，本方法所能治療的眼部疾病是選自於以下成員所組成的群組中：福斯式萎縮(Fuchs' dystrophy)、圓錐角膜 (keratoconus)、格狀角膜萎縮(lattice cornea dystrophy)、地圖-點-指紋狀萎縮(map-dot-fingerprint dystrophy)、虹膜角膜內皮症候群(iridocorneal endothelial syndrome)、虹膜痣症候群(柯根-立斯)(iris nevus(Cogan-Reese)syndrome)、錢得勒症候群(Chandler's syndrome)和自發性虹膜萎縮(essential iris atrophy)。
依據本揭示內容其他實施方式，所述眼部疾病是由單純泡疹病毒感染所致。
依據本揭示內容另一實施方式，所述眼部疾病是由沙眼披衣菌感染所致。
依據本揭示內容又一實施方式，所述眼部疾病是由化學性灼傷所導致的。
在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。
以下所附圖式係構成本說明書之一部分，其繪示出本發明多種態樣之各種例示性系統、方法以及其他實施方式。本案詳細說明之內容可依下列詳細之描述佐以圖式之說明，更清楚地理解其內容，其中，第1圖是依據本揭示內容一實施方式所示SDS PAGE分析從(A)正常角膜組織，和(B)經ScCO2處理的角膜組織萃取的可溶性角膜總蛋白之結果；第2A圖是依據本揭示內容一實施方式所示西方墨點法分析正常角膜組織和經ScCO2處理的角膜組織中第一型膠原蛋白的結果； 第2B圖是依據本揭示內容一實施方式所示西方墨點法分析正常角膜組織和經ScCO2處理的角膜組織中第二型膠原蛋白的結果；第3圖是實施例1.2去細胞角膜於放大倍率40 X(A)和100 X(B)下拍攝的組織染色的照片；以及第4圖是依據本揭示內容一實施方式所示實施例1.2去細胞角膜分別於接種hADCs前(A)和後(B)在放大倍率2,000 X下所拍攝的照片。
在此所提供的詳細敘述和所附的圖式係為本揭示內容的說明性的描述，但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。
在此所示之單數名詞「一(a,an)」包含複數型，除非另有定義。
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已儘可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。
本揭示內容是關於製備去細胞角膜的新穎方法、利用前述方法製備的去細胞角膜，以及利用所製成的去細胞角膜來治療眼部疾病和/或病徵並從中獲益的用途。
再者，本方法至少包含對動物角膜施以超臨界流體(SCF)處理的步驟，其中所述方法特徵在於不包含以蛋白酶、螯合劑、清潔劑、甘油或其組合處理角膜的步驟。
在執行本發明步驟前，從動物眼球中移除角膜和部分鞏膜組織。適用於本揭示內容的動物包含，但不限於，豬、牛、乳牛、綿羊、山羊、兔子、猴子和人類。在一較佳的實施方式中，將豬的眼球以組織固定環托持，接著利用環鋸將角膜和部分鞏膜組織切除，並立即執行本發明的方法。
對上述取得的角膜施以去細胞步驟處理。所述去細胞步驟執行的目的在於移除角膜的細胞物質，且保留角膜組織的物理和生物化學特性，使其能夠作為組織支架。再者，所述角膜以超臨界流體(SCF)處理的同時，使用一輔溶劑並於壓力73-500巴以及溫度30-50℃下，處理20-120分鐘。
所述SCF可以是臨界二氧化碳、超臨界一氧化二氮、超臨界烷類、超臨界烯類、超臨界醇類或超臨界丙酮。在一實施例中，所述SCF是ScCO2。在其他較佳的實施例中，所述SCF是ScN2O。所述輔溶劑可以是C1-4醇，其包含但不限於，乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、異丁醇、仲丁醇、叔丁醇和環丁醇。在某些較佳的實施例中，所述輔溶劑是30-100%(vol%)乙醇，例如，30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100%(vol%)乙醇。在較佳的實施例中，所述輔溶劑是40-98%乙醇，例如，40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97 或98%(vol%)乙醇。在又一較佳的實施方式中，所述輔溶劑是60-75%(vol%)乙醇，例如，60、65、70或75%(vol%)乙醇。在最佳的實施方式中，所述輔溶劑是60%(vol%)乙醇。
所述去細胞步驟是於以下條件執行，其中壓力約70-500巴，例如，70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500巴；較佳為約73-450巴，例如，73、74、75、76、77、78、79、80、90、100、110、120、130、140、150、160 170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440或450巴；較佳為約250-400巴，例如，250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390或400巴；溫度約30-50℃，例如，30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50℃，較佳為約35-48℃，例如，35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48℃；以及處理時間為約20-120分鐘，例如，20、30、40、50、60、70、80、90、100、110或120分鐘；較佳為約30-90分鐘，例如，30、40、50、60、70、80和90分鐘。在較佳的實施方式，在60%(vol%)乙醇存在下對以步驟(1)溶液處理的角膜施以ScCO2處理，處理條件為壓力約350巴，溫度約45℃，處理時間為約80分鐘。所述角膜於去細胞處理後，喪失其透明度或變混濁。
本方法特徵在於：不包括以酵素消化(即，蛋白酶或核酸酶)，和/或離子螯合作用處理(即，使用離子螯合劑)角膜的步驟，如先前技術所揭露的方法，例如，中國專利號104001215B和美國專利號8,313,893B2所揭露的方法。本發明的角膜也不使用清潔劑進行處理。在此所述的酵素消化是指使用蛋白酶處理角膜，其包含，但不限於，胃蛋白酶(pepsin)、胰蛋白酶(trypsin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、木瓜酶(papain)、木瓜凝乳蛋白酶(chymopapain)、鳳梨酶(bromelain)、奇異果酶(actinidain)、蛋白酶(proteinase A)、蛋白酶K(proteinase K)、胜肽酶(peptidase)、無花果蛋白酶(ficin)、鈣蛋白酶(calpain)、凋亡蛋白酶(caspase)及其組合；或一核酸酶，其可以是DNA核酸酶或RNA核酸酶。所述離子螯合作用處理是指以金屬離子螯合劑處理角膜，其包含，但不限於，乙二胺四醋酸(ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA)、1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四醋酸(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid,DOTA)、1,4,7,NNN10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四(1,4,7,NNN10-tetraazacyclododecane-1,4,7,1-0-tetrakis)(亞甲基磷酸(methylene phosphonic acid))(DOTP)、反式-1,2環己二胺四醋酸(trans-1,2-diaminocyclohexan-tetra-acetic acid,CDTA)、4,5-二羥基苯-1,3-二磺酸(4,5-dihydroxybenzene-1,3-disulphonic acid)(Tiron)、硫脲(thiourea)、8-羥基喹啉-5-磺酸(8-hydroxyquinoline-5-sulphonic acid)、3,6-二磺基-1,8-二羥基-萘(3,6-disulpho-1,8-dihydroxy-naphthalene)、Eriochromeschwarz T(1-(1-羥基-2-萘基偶氮)-2-羥基-5-硝基-4-萘磺酸(1-(1-hydroxy-2-naphthylazo)-2-hydroxy-5-nitro-4-naphthalene sulphonic acid)) 以及紫尿酸銨(ammonium purpurate)。所述清潔劑處理步驟是指使用清潔劑處理所述角膜，特別是指由兩性分子組成的液體清潔劑，例如，界面活性劑，其可以是陽離子(cationic)(即，四級銨化合物(quaternary ammonium compounds)、陰離子(anionic)(即，烷基苯磺酸鹽(alkylbenzesulfonates)、膽汁酸(bile acids)及其類似物)或非離子(即，Tween、Triton和/或Brij系列)。再者，本發明的角膜不需要如常規方法所示將角膜浸入至甘油溶液中。
依據可任選的實施方式，在SCF處理前，將角膜浸入至水或鹽溶液中，以從其上去除上皮層。依據本揭示內容某些實施方式，所述溶液含一價鹽(monovalent salts)，其包含，但不限於，氯化鋰(lithium chloride)、氯化鈉(sodium chloride)、氯化鉀(potassium chloride)、氯化銨(ammonium chloride)等。在較佳的實施方式中，所述鹽溶液是濃度為0.5-4M氯化鈉溶液，例如、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4.0M；較佳為約1.0-3.5M，例如，1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4或3.5M；以及最佳為約1.5M。在較佳的實施方式中，所述角膜是浸泡於1.5M NaCl溶液(未額外添加金屬螯合劑(即，EDTA))，於室溫下輕微震盪約24小時。在其他實施方式中，於SCF處理前，所述角膜是浸泡於純水中至少24小時。於鹽溶液或純水處理後，所述角膜將變得混濁或不透明狀且膨脹。在此，所屬技術領域中具有通常知識者，可基於每一角膜處理過程的狀況，在無須過度實驗下，輕易地調整水或 鹽溶液的處理條件(即，處理時間和/或鹽濃度)。在其他實施例中，所述角膜是以KCl溶液(0.5-4M)處理至少24小時。
因此，本揭示內容另一態樣是提供利用上述方法製備而成的去細胞角膜。以本發明方法製備而成的去細胞角膜，可保留天然角膜的膠原纖維完整性，且完全去除對於宿主而言具免疫原性的細胞物質，因此，對於宿主細胞(特別是取自於角膜的細胞)來說，是極佳的移植物，於移植後能夠支持宿主細胞在去細胞角膜上生長，且不會誘導宿主體內產生不希望發生的移植排斥反應。
再者，本揭示內容又一態樣是一種治療患有眼部疾病個體的方法，包括在亟需治療之個體眼部植入本發明的去細胞角膜移植物，其中，該去細胞角膜移植物可供細胞(即，取自於角膜的細胞)生長，且能夠修復眼部疾病造成的角膜受損，例如，疾病、感染或意外(即，化學性灼傷所導致的)，使個體能夠從去細胞角膜移植物中得到益處。
本方法包含將去細胞角膜移植至個體的眼睛上，以修復與眼部疾病相關的角膜缺損。
所述以本方法製備而成的去細胞角膜適合作為可供細胞生長的生物支架使用。再者，在可任選的實施方式中，本揭示內容的去細胞角膜於移植前，能夠在體外先進行細胞培養。可利用本領域任一種培養技術培養所述細胞。可以培養於去細胞角膜上的細胞，包含，但不限於，取自於角膜的細胞，例如，角膜內皮細胞、角膜基質細胞，以及角膜上皮細胞；胚胎幹細胞，以及成體幹細胞。再者，所述細胞可以是自體細胞(即，取自於接受去細胞角膜移植物的宿主)或同種異體細胞(即，取自於宿主以外的個體)。
本發明的去細胞角膜經培養合適的細胞後，可將其移植至患有角膜受損相關眼部疾病且需要角膜移植的宿主上。所述眼部疾病相關的角膜受損可以是疾病、感染或意外所導致的。
依據某些實施方式，所述眼部疾病是由疾病所導致的，其係選自於以下成員所組成的群組中：福斯式萎縮、圓錐角膜、格狀角膜萎縮、地圖-點-指紋狀萎縮、虹膜角膜內皮症候群、虹膜痣症候群(柯根-立斯)、錢得勒症候群和自發性虹膜萎縮。福斯式萎縮是肇因於內皮細胞死亡，導致從基質移除的液體不足，進而造成角膜膨脹和視覺扭曲；最終上皮層膨脹導致眼球異常彎曲，進一步造成視覺扭曲。圓錐角膜是由漸進式角膜增厚所導致的疾病，其主因是角膜逐漸向外凸出造成異常彎曲。其他可以本方法治療的疾病是格狀角膜萎縮，其造成澱粉樣沉積物或異常蛋白纖維堆積於基質內，導致混濁度上升進而降低視力。情況嚴重時，將導致外部上皮層侵蝕，在此狀況下則需要進行角膜移植。地圖-點-指紋狀萎縮亦稱為柯根氏營養不良(Cogan’s dystrophy)，此為影響角膜前部的退化性疾病，以裂隙燈觀察時可以發現視力降低和/或角膜侵蝕的狀況。虹膜角膜內皮症候群為婦女常見的疾病，其造成虹膜顏色改變、角膜腫脹以及青光眼的發生。所述症候群是具有相關症狀的三種症候群群組所定義，即，虹膜痣症候群、錢得勒症候群或自發性虹膜萎縮。然而，此疾病群組的共通特徵為內皮細胞從角膜遷移到虹膜上。角膜的內皮細胞死亡造成角膜腫脹和虹膜變形伴隨視覺扭曲。
在其他實施方式中，所述與角膜受損相關的眼部疾病是由多種病原體所造成的，例如，單純泡疹病毒所造成的病毒感染；或沙眼披衣菌所造成的細菌感染。
在又一實施方式，所述與角膜受損相關的眼部疾病是由意外所導致的，例如，酸性化學物質(如，電池中的鹽酸(muriatic acid)或硫酸(sulphuric acid))和/或鹼性化學物質(如，石灰(lime)、烤箱清潔劑(oven cleaners)、氨(ammonia))所導致的化學性灼傷。情況嚴重時，只能以角膜移植來改善角膜上的傷痕。
依據本揭示內容一較佳實施方式，以本方法製備的去細胞角膜是直接施用至動物(即，兔子)受傷的眼睛，其中所述眼睛受損的程度是指到達需要角膜移植的程度。在此實施方式中，所述去細胞角膜在移植前，並未接種上皮細胞。於移植後，所述動物個體(即，兔子)受傷的眼睛能夠完全恢復(即，恢復受傷角膜的完整性)。
下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。原則上所屬技術領域中具有通常知識者能夠以本領域其他已知的步驟、方法或技術取代。
實施例
實施例1 去細胞豬角膜的製備和特徵分析
1.1 製備去細胞豬角膜
將冷凍於-20℃的豬眼球，於室溫下解凍(少於3分鐘)，再以組織架夾持保持在適當位置。利用環鋸(18公釐)切除角膜和部分鞏膜。將切除的角膜浸泡在僅含1.5M NaCl或水(即，不添加任何鹽類、螯合劑或蛋白酶)的容器(7公分x 5公分x 4公分)中。接著於室溫下，以轉速100rpm輕微震盪 24小時，以移除上皮層(約50微米)。在此階段，經NaCl或水處理的角膜腫脹且混濁(即，不透明)。
接著，將所述經NaCl或水處理的角膜置於組織架上，並將其置入ScCO2系統(Helix SFE Version R3U,Applied Separations Inc(Allentown,PA,USA))的容器中，且容器內含10毫升乙醇(75%)。所述ScCO2系統進行去細胞的操作條件為：壓力120巴，38℃下，處理60分鐘(即，靜態和動態ScCO2處理)。再將去細胞角膜存放於無菌環境中備用。
1.2 製備去細胞豬角膜
在此實施例中，除了將ScCO2系統的操作條件改為壓力350巴，45℃下處理80分鐘(即，靜態和動態ScCO2處理)外，是利用與實施例1.1所述步驟類似的方法來製備去細胞豬角膜。
接著，將製備而成的去細胞角膜存放於無菌環境中備用。
1.3 實施例1.2之去細胞豬角膜的特徵分析
以下列標準流程利用蘇木精和伊紅染色(hematoxylin and eosin staining,H&E staining)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)染色和SDS-PAGE分析實施例1.2之去細胞角膜。
DAPI染色的定量結果顯示，正常角膜具有相對高量的DNA計數量，其中所測得DNA量為37.29±5.3(奈克/毫克)，而實施例1.2之去細胞角膜的DNA量僅為11.51±0.74(奈克/毫克)，由此結果可以得知，本發明以ScCO2進行去細胞處理，能夠有效移除角膜組織上的細胞物質。
SDS PAGE分析的結果確認實施例1.2經ScCO2處理之去細胞角膜上所保留的蛋白質是膠原蛋白(第1圖)，特別是第一型膠原蛋白，此一結果也經西方墨點法確認(第2B圖)。
第3圖是實施例1.2的角膜經H&E染色，分別於放大倍率40X(圖框A)和100X(圖框B)下所拍攝的照片。由此可以證實，實施例1.2的角膜具有相對完整的纖維結構，因此於移植後可作為生物支架供細胞生長於上。
實施例2 人類脂肪細胞(human adipose cells,hADCs)可生長於實施例1.2去細胞豬角膜上
2.1 分離hADCs
從進行抽脂手術的病人身上所取得的脂肪組織中分離人類脂肪細胞(hADCs)。簡言之，以大量的磷酸鹽緩衝液(phosphate-buffered slaine,PBS)沖洗脂肪組織(約50克)，以移除任一殘留的紅血球細胞。將徹底沖洗後的脂肪組織懸浮於PBS中，再進行離心，接著收集上層。再次離心，收集上層，接著將收集到的上層分成數個部分。將脂肪組織的每一部份移至另一乾淨試管，其中該試管含40毫升之杜氏改良培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium,DMEM))(含膠原蛋白酶(1毫克/毫升)、N-乙醯半胱氨酸(N-acetyl-cysteine,NAC)(2mM)和L-抗壞血酸2-磷酸(L-ascorbic acid 2-phosphate)(0.2mM))。將試管置於37℃，隔夜培養，接著進行離心，移除含有膠原蛋白酶的上層。收集每一試管中的沈澱物，再培養至DMEM(添加10%胎牛血清、NAC(2mM)和L-抗壞血酸2-磷酸(0.2mM))中，置於5% CO2的環境。隔天，以PBS將未貼附的細胞沖洗下來，再添加5毫升之K-NAC。 每兩天更換培養基直到細胞長滿(confluence)為止，約為一週的期間。利用胰蛋白酶消化收集細胞，並將其儲存於液態氮中備用。
2.2 實施例1.2去細胞豬角膜可支持hADCS於其上生長
於接種前，將實施例1.2去細胞豬角膜浸入含抗生素混合物(盤林西林(penicillin)、鏈黴素(streptomycin)和雙性黴素B(amphotericin B))之70%甘油溶液，浸泡3天，再以PBS(含抗生素混合物)充分清洗後，再將hADCs(1x104)接種在實施例2.1去細胞豬角膜上，接著培養14天。分別於第1、3、7和14天取下角膜小量樣本，再以H&E染色和SEM分析。將一代表性結果示於第4圖。
第4圖的SEM照片為實施例1.2之去細胞角膜分別在hADCs接種前(第4A圖)和接種後7天(第4B圖)下所拍攝的。結果顯示實施例1.2的去細胞豬角膜證實能作為支持hADCS生長的支架。
實施例3 在異種移植模型中使用實施例1.2之去細胞豬角膜
於角膜異種移植模型中，評估實施例1.2去細胞豬角膜對於需移植的眼部疾病修復之影響。
為達到上述目的，本實驗例採用紐西蘭白兔(行政院農業委員會畜產試驗所)，且嚴格遵守研究用動物使用規範進行試驗。實驗動物隨機接受單眼角膜移植。肌肉內注射囓齒動物雞尾酒藥物(100毫克/毫升5之氯胺酮(ketamine)、20毫克/毫升之甲苯噻嗪(xylazine)和10毫克/毫升之乙醯丙嗪(acepromazine))(0.5-0.7毫升/公斤)以進行兔子(體重為2.0和3.0公斤)麻醉。將鹽酸丙美卡因(proparacaine hydrochloride)局部麻醉滴劑(0.5% Ophthaine,Bristol-Myers Squibb)，連同鹽酸環戊苯胺酯滴劑(1%,Cyclogyl®,Alcon,Ft. Worth,Tex.)和去氫腎上腺素滴劑(10.0% CibaVision,Duluth,Ga.)滴入至實驗動物眼中，使瞳孔擴張最大化。所有操作步驟於顯微鏡下進行。利用深層前角膜層角膜移植術(DALK,deep anterior lamellar keratoplasty)於角膜上創造出5公釐的傷口。接著，將實施例1.2之去細胞角膜(直徑約為6公釐)覆蓋於傷口上，並以10-0號尼龍縫合線縫合至角膜上。施用局部眼藥水(含1%)至眼睛上，每日三次，且持續施用7-10天。於手術三週後，眼睛以螢光素染色評估角膜的完整性。分別於第1、5、11、14和21天拍攝眼部影像。於實驗結束時，犧牲動物以及染色，以觀察經移植的實施例1.2角膜上新生的上皮細胞。
實驗結果意外發現經DALK手術的兔子移植實施例1.2去細胞角膜，能夠恢復角膜的完整性，且經移植的角膜移植物上發現從鄰近區域(即，為受傷區域)新遷移至此的上皮細胞。
可以理解的是上述實施方式所揭露的具體實施例僅為例示，本技術領域具有通常知識者能夠對其進行各種修改。上述說明書、實施例和數據提供了本發明例示性實施方式整體完整的敘述和應用。雖然本發明於一定程度上具體揭示了多種實施方式，或是分別參照一或多個實施方式，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾。

Claims (7)

  1. 一種製備去細胞角膜的方法，包含：(1)以水或含0.5-4.0M NaCl溶液處理一動物之角膜至少24小時；以及(2)以超臨界流體(SCF)處理該角膜，在30-100%(vol%)乙醇存在下，於壓力73-500巴以及溫度30-50℃下，處理20-120分鐘；，其中該方法不包含以蛋白酶、螯合劑、清潔劑、甘油或其組合來處理該角膜的步驟。
  2. 如請求項1所述之方法，其中該SCF是超臨界二氧化碳(supercritical carbon dioxide,ScCO2)、超臨界一氧化二氮(supercritical nitrous oxide,ScN2O)、超臨界烷類(supercritical alkane)、超臨界烯類(supercritical alkene)、超臨界醇類(supercritical alcohol)、超臨界丙酮(supercritical acetone)或其組合。
  3. 如請求項1所述之方法，其中該SCF是ScCO2。
  4. 如請求項1所述之方法，其中該SCF是ScN2O。
  5. 如請求項1所述之方法，其中該角膜是以該SCF連同60%(vol%)乙醇，於壓力350巴和45℃下處理80分鐘。
  6. 如請求項1所述之方法，其中該動物是選自於以下成員所組成的群組：豬、牛、綿羊、山羊、兔子、猴子和人類。
  7. 如請求項6所述之方法，其中該動物為豬。
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