CN109072166A - 具有可调生长因子水平的活化血小板组合物 - Google Patents

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Abstract

用于产生可调或可定制的活化产物组合物的方法和系统。在某些实施方案中，改变电脉冲参数、流速或样本容器尺寸中的一者或多者以便产生所述活化产物组合物。可以基于特定的患者或程序来定制或优化所述活化产物组合物。

Description

具有可调生长因子水平的活化血小板组合物
背景技术
本说明书所公开的主题整体涉及用于各种医疗应用诸如外科手术或创伤(trauma)治疗中的血小板疗法(platelet therapy)。某些实施方案涉及血小板活化(platelet activation)和提供可由用户指定或“调节(tuned)”的生长因子水平(levelsof growth factor)。
使用血小板凝胶(也称为“活化富血小板血浆(activated platelet richplasma)”)是一种新兴的治疗方法，可用于临床或其他医疗保健机构中的各种应用，包括促进(诸如外科手术后)伤口愈合和止血。具体地讲，对于许多类型的损伤和病症，诸如神经损伤、肌腱炎、骨关节炎、心肌损伤以及骨修复和再生，人们对使用血小板疗法作为伤口愈合治疗存在兴趣。另外，用于患者的血小板凝胶的衍生可以是自体的，这意味着血小板衍生自患者自身的组织和/或流体。因此，取自患者的血样可用于获得用于治疗患者的血小板凝胶。
举例来说，医生可以从患者身上抽取血液。然后可以离心血液以产生富血小板血浆(PRP)。血小板活化后，血液中的血小板释放促进伤口愈合级联的生长因子和蛋白质。因此，临床工作流程可涉及从患者身上抽取血液、离心血液以分离血小板，并且诸如使用牛凝血酶执行离体血小板活化。然后可将活化的血小板或血小板凝胶施用到伤口或其他治疗区域。在替代地使用体内血小板活化的情况下，医生可以在不添加血小板活化剂的情况下将PRP施用到该部位。包括生长因子释放和凝聚的血小板活化通常是由结缔组织中的胶原诱导的。
对于其中凝血酶(例如，牛凝血酶)用于诱导血小板活化的此类离体应用，所得生长因子水平可以基于生物反应而固定。也就是说，不同生长因子的量和/或相应的比率或比例由凝血酶基活化的性质决定。因此，在此类反应中，临床医生无法调节或操纵不同生长因子的相应量或比例，并且相反地必须用常规的活化组合物来代替。
发明内容
在下文概述在范围方面与原始所要求发明相称的某些实施方案。这些实施方案并不希望限制所要求发明的范围，而是这些实施方案仅希望提供本发明的可能形式的简要概述。实际上，本发明可涵盖可类似于或不同于下文阐述的实施方案的多种形式。
在一个实施方案中，提供了一种释放生长因子(releasing growth)的方法。根据该方法，将样本相对于脉冲发生装置的电极定位。指定一组电脉冲参数。不同参数值在活化产物组合物中产生一种或多种生长因子的不同水平。将样本暴露于根据所述参数值产生的一个或多个电脉冲。样本在暴露于所述一个或多个电脉冲时，产生具有至少部分地由该组电脉冲参数确定的所述一种或多种生长因子的水平的活化产物组合物(activatedproduct composition)。
在另一个实施方案中，提供了一种释放生长因子(releasing growth factors)的方法。根据该方法，选择比色杯尺寸(cuvette size)。不同比色杯尺寸在活化产物组合物中产生一种或多种因子的不同水平。将样本置于所选尺寸的比色杯中。将比色杯放置在脉冲发生装置的样本保持器内。将样本暴露于一个或多个电脉冲。样本在暴露于所述一个或多个电脉冲时，产生具有至少部分地由该比色杯尺寸确定的所述一种或多种生长因子的水平的活化产物组合物。比色杯尺寸可以确定电场(因为电场是电压除以比色杯间距(cuvettespacing))和/或能量密度。
在又一个实施方案中，提供了一种用于定制活化的血液衍生细胞治疗的方法。根据该方法，确定用于基于伤口类型或伤口愈合级联(wound healing cascade)的相应过程中的一者或两者治疗患者的定制生长因子分布。选择对应于所确定的生长因子分布的一个或多个电脉冲参数和比色杯尺寸。可以针对伤口愈合级联的特定阶段或过程定制生长因子分布。例如，上皮形成阶段(epithelization phase)可能需要TGFb1(一种已知促进瘢痕(scarring)形成的生长因子)降低的生长因子分布。伤口的肉芽形成阶段(granulationphase)可能需要富含VEGF(一种已知促进血管新生(promote angiogenesis)即新血管形成的生长因子)的生长因子分布(growth factor profile)。将放置在选定尺寸的比色杯中的样本暴露于基于所选择的电脉冲参数产生的一个或多个电脉冲，以产生具有该生长因子分布的活化产物组合物。
在另外的实施方案中，提供了一种电脉冲发生系统。在一个实施方案中，该系统包括：样本保持器，其被配置成接纳至少两种不同尺寸的比色杯；脉冲发生电路，其被配置成当比色杯存在于样本保持器中时，产生一个或多个电脉冲到比色杯中；一个或多个用户输入设备，其被配置成接收用户输入；非暂态计算机可读存储器，其存储一个或多个处理器可执行例程；以及处理器，其被配置成访问和执行存储在计算机可读存储器中的一个或多个处理器可执行例程。所述处理器可执行例程当被执行时使得执行包括以下方面的动作：接收指定与规定的生长因子分布对应的一个或多个电脉冲参数的输入，其中不同电脉冲参数值在生长因子分布中产生一种或多种生长因子的不同水平；以及使用脉冲发生电路基于该输入产生一个或多个电脉冲，以产生具有规定的生长因子分布的活化产物组合物。
附图说明
当参考附图阅读以下详细描述时，本发明的这些和其他特征、方面以及优点将得到更好的理解，其中在整个附图中，相同的标号表示相同的部分，其中：
图1是根据本方法的各方面的脉冲发生系统的示意图；
图2是描绘根据本方法的各方面在多种场景下产生的血小板活化组合物中血小板衍生生长因子(PDGF)水平的图表；
图3是描绘根据本方法的各方面在多种场景下产生的血小板活化组合物中表皮生长因子(EGF)水平的图表；
图4是描绘根据本方法的各方面在多种场景下产生的血小板活化组合物中血管内皮生长因子(VEGF)水平的图表；
图5是描绘根据本方法的各方面在多种场景下产生的血小板活化组合物中转化生长因子β1(TGFb1)水平的图表；并且
图6描绘了使用根据某些本研究获得的生长因子的体外细胞增殖测定的上皮形成结果；
图7描绘了使用根据某些本研究获得的生长因子的体外细胞增殖测定的血管新生结果；
图8是根据本方法的各方面的描绘产生可定制或可调血小板活化组合物的步骤的工艺流程图。
具体实施方式
下文将描述本主题的一个或多个特定实施方案。已努力提供了关于这些实施方案的简明描述，但可能并非所有的实际实现方式的特征都在说明书中进行了描述。应了解，在如任何工程或设计项目的任何此类实际实现方式的开发过程中，众多针对实现方式的决定必须实现开发者的具体目标，例如遵守可能在各种实现方式之间变化的相关系统约束和相关商业约束。此外，应当理解的是，这种开发工作可能复杂且耗时，但是对于受益于本公开的普通技术人员来说，这仍是常规的设计、生产和制造工作。
当介绍本发明的各种实施方案的元件时，冠词“一个”、“一种”、“该”和“所述”意图表示这些元件中的一个或多个。术语“包括”和“具有”旨在为包括性的并且意味着可能存在除了所列元件之外的额外元件。
血小板活化和/或聚集(aggregation)可用于体内和/或离体(in vivo and/or exvivo)治疗伤口。对于体内血小板活化，在损伤部位施用或注射灭活的富血小板血浆(platelet rich plasma，PRP)，并且由体内天然存在的化合物诸如结缔组织(connectivetissue)中存在的胶原(collagen)进行活化。
在常规离体过程期间，将抽取并分离的血液中的血小板暴露于血小板活化化合物诸如凝血酶(thrombin)，其诱导生长因子(例如，血小板衍生生长因子(platelet-derivedgrowth factor，PDGF))的释放。例如，对于离体血小板活化(ex vivo plateletactivation)，医生可以从患者抽取血液并离心血样以产生富血小板血浆(platelet richplasma，PRP)样本。可将氯化钙(CaCl2)和血小板活化化合物诸如凝血酶添加到PRP样本中，以触发血小板活化并形成含有生长因子的凝胶，然后将其施用于伤口。然而，该过程不允许以任何方式定制或调节不同生长因子相对于彼此的各种水平。因此，临床医生只能简单地使用活化过程的结果，而不管所得生长因子混合物是否针对手头的任务进行了优化。
本说明书讨论的本发明实施方案涉及离体血小板(或其他细胞)活化以及响应于暴露于一种或多种可定制能量暴露方案(exposure protocols)的生长因子释放，所述暴露方案允许响应于活化参数释放不同水平或量的生长因子。除了生长因子的释放之外，本方法还可用于控制活化过程中其他因子的释放。例如，响应于本说明书讨论的方法，活化的血小板(或暴露的样本中的其他细胞)可以可调(tunable)或可调节的(adjustable)方式释放内源性抗氧化剂(endogenous antioxidants)、活性氧物质(reactive oxygen species)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和其他因子。也就是说，如本说明书所讨论的可调或可定制活化不仅可以涉及生长因子的定制释放(customized release)，还可以涉及可能与伤口愈合过程相关的其他因子(诸如上面列出的那些因子)的定制释放。因此，应当理解，尽管可以生长因子为背景(in the context of growth factors)提供本说明书的具体实例或讨论，但是此类实例和讨论还涵盖其他因子诸如上面列出的那些因子，这些因子也可以响应于不同、可定制的活化方案而差异性释放。
本方法可以相对于在活化时释放蛋白质、生长因子的各种类型的细胞使用，包括(但不限于)血小板、红细胞、白细胞等。这样，可以产生血小板凝胶(platelet gel)，其中调节血小板凝胶中不同生长因子的水平，以便优化所产生的某些因子的量；或者相对于彼此进行调节，以便获得某些因子相对于其他因子的期望比率或比例。这允许产生定制的或优化的血小板凝胶，其可具有不同的生长因子分布、不同的内源性抗氧化剂分布(differentendogenous antioxidants profiles)、不同的活性氧物质分布(different reactiveoxygen species profiles)等。这可能是有用的，因为愈合级联(the healing cascade)的不同阶段(stages)(例如，血管新生(angiogenesis)、上皮形成(epithelization)等)可受益于不同生长因子或其他因子，或者可以通过不同生长因子或其他因子来改善。因此，通过基于伤口愈合过程的特定阶段来调节生长因子水平，可以加速伤口愈合过程。
如本说明书所讨论的离体血小板活化可涉及将血样诸如PRP样本或任何含有血小板的悬浮液暴露于电脉冲(例如，暴露于脉冲电场)以触发血小板活化，但是也可以设想和涵盖暴露于其他类型的能量。离体生长因子释放的方法可以涉及或不涉及在电刺激之前向血样中添加化学物质。如本说明书所讨论的，活化可涉及或不涉及样本内细胞(例如，红细胞)的破坏(destruction)(例如，裂解(lysis))，具体取决于活化暴露的参数。可以根据活化暴露的参数调节细胞裂解(cell lysis)过程。在某些实施方案中，可以使用不同的电参数(例如，幅值、电压、电场、能量密度、电流、脉冲宽度、脉冲数等)施加电刺激或活化，其中不同的参数或参数组合产生不同的生长因子水平和/或生长因子相对于彼此的不同比例。相应地，暴露于其他类型的能量可包括调节通常与产生或暴露于该类型能量相关联的一个或多个参数。这种差异配制的活化组合物(differently formulated activatedcomposition)可用于实现不同的生物学或医学效果(例如，增强伤口愈合)，因此期望的效果可确定用于活化给定细胞组合物的电脉冲参数。
考虑到上述情况，图1示意性地示出了用于离体血小板(或其他细胞产物)活化和可定制或可调生长因子释放的脉冲发生系统10。系统10包括脉冲发生电路12和对置的电极(或电极阵列)14和16。在所描绘的实施方案中，电极14和16在比色杯18的相对侧上间隔开。也就是说，比色杯18设置在电极之间，并且电极14和16经由触点20耦合到脉冲发生电路。也就是说，在所描绘的实例中示出了电导耦合(conductive coupling)(即接触耦合)。然而，应该理解，提供该接触耦合实例仅仅是为了便于解释并提供用于解释本方法的有用背景，并且其不是将样本(如本说明书所讨论的)暴露于活化能量的唯一合适的机制。例如，在其他实现方式中，可以采用非接触耦合技术(诸如电容或电感耦合技术)来实现所讨论的能量耦合。因此，如本说明书所讨论的，与血小板悬浮液的能量耦合(energy coupling to theplatelet suspension)应理解为经由任何合适的机制发生，无论是涉及样本容器与导管和电极之间的接触(如本实例中所示)，还是使用感应或电容效应而无此类接触。
无论物理或结构实现方式如何，脉冲发生电路12在操作时均电刺激或活化比色杯18内的血液、血液组分或血小板悬浮液样本22，以便活化样本22内当被活化或刺激时释放蛋白质和/或生长因子的血小板或其他细胞类型。如本说明书所讨论的，这可以采取这样的形式：当脉冲发生电路12操作时，将脉冲电场施加到容纳在比色杯18内的样本，而不管电极14和16以及比色杯18物理整合或对接的方式如何。在某些实施方案中，系统10可以被构造成接纳或保持不同尺寸的比色杯，诸如不同直径或宽度的比色杯。
在某些实施方案中，比色杯18可以是一次性的(disposable)，和/或可从包含电极14和16的样本保持器24移除的(removable)。将比色杯18插入样本保持器24中并使电极14和16与触点20的接触将允许脉冲发生电路12产生跨越样本22的电脉冲。应当理解，比色杯18仅仅是合适的样本容器的一个示例，并且被配置成保持样本22、接触电极14和16以及传导电脉冲的其他类型的容器可以与系统10结合使用。如本说明书所讨论的，电极14与16之间的间距可以影响脉冲电场的强度，该强度被定义为施加的电压和比色杯间隙距离的比率。例如，将1cm宽的比色杯暴露于1kV脉冲将产生1kV/cm的场强。如本说明书所讨论的，场强、电极分隔距离和与产生的电脉冲相关的其他参数是可以改变或调节的因素，以在活化过程期间相对于彼此改变生长因子水平。
应当理解，所描绘的基于比色杯或容器的活化系统适用于间歇式处理环境(batch-type processing environment)。然而，也可以替代地采用流通式处理环境，其中导管替代地穿过电极14和16，这些电极可以位于导管的相对侧上或围绕导管。这种流通布置(flow through arrangement)允许样本连续地流过导管以暴露于脉冲电场以进行活化，其中活化的产物以连续或半连续方式收集。在这样的实施方案中，作为电极处的电参数和/或电极14和16之间的宽度的补充或作为其替代，还可以调节其他参数以便调节或定制活化产物。例如，通过导管的样本(例如，血小板悬浮液)的流速和/或导管的直径也可以作为活化过程的因素或参数而考虑或调整。也就是说，除了为电极指定的电参数之外，流速和电极间距中的一者或两者可以确定样本在活化期间经历的电场暴露(或场密度暴露)。
在某些实施方案中，该系统可以包括控制和输入电路，并且可以在专用外壳中实现，或者可以耦合到计算机或其他基于处理器的控制系统。例如，系统10可以包括控制脉冲发生电路12的处理器26或与之通信。系统10的附加部件可以包括存储由处理器26执行的指令的存储器28。此类指令可包括用于使用脉冲发生电路12产生电脉冲的方案和/或参数。处理器26可包括例如通用单芯片或多芯片微处理器。另外，处理器26可以是任何常规的专用处理器，诸如专用处理器或电路。存储器28可以是任何合适的非暂态计算机可读介质，诸如随机存取存储器、大容量存储设备、固态存储器设备或可移动存储器。另外，显示器30可以向操作员提供与系统10的操作有关的指示。系统10可包括用于激活脉冲发生电路12、选择或指定适当的脉冲参数或者从多个预先配置的脉冲轮廓中选择此类轮廓(诸如各自对应于伤口愈合的不同阶段的轮廓)的用户输入设备32(例如，键盘、鼠标、触摸屏、轨迹球、手持式设备诸如PDA或智能电话或其任何组合)。
如本说明书所讨论的脉冲发生系统10可实现为用于血小板或其他细胞类型活化的单用途设备，或者可实现为多用途设备，该多用途设备可用于其他电场暴露应用诸如电穿孔(electroporation)，通过除血小板(或其他细胞类型)活化之外还暴露于电刺激以加速细胞生长。此外，如本说明书所讨论的，系统10可以被配置成根据一个或多个定义的方案(protocols)，和/或使用可改变以产生不同水平或比例的生长因子的一个或多个参数来产生电脉冲。所述方案可以由用户输入而产生和/或可以存储在存储器28中以供用户选择，诸如形式列表或菜单。在一个实施方案中，脉冲发生电路12可以在处理器26的控制下操作，以实现使用指定电场强度、脉冲长度、总暴露时间、流速(针对流通式实现方式)或其他特性的方案，以便产生定制的活化细胞组合物(例如，定制用于促进伤口愈合的特定阶段的凝胶)，其中一种或多种生长因子水平由指定的脉冲参数值确定。这样的方案可以通过经验或理论研究(by empirical or theoretical studies)确定，以便对应于期望的生物学或医学效果(例如，伤口愈合阶段)，和/或对应于活化期间样本细胞的破坏或裂解。在其他实施方案中，系统10可以被配置成接收与电场强度、脉冲长度、流速和/或总暴露时间中的一者或多者相关的用户输入，即用户可以改变或指定这些操作参数中的一者或多者。此外，系统10可以被配置成根据用户输入和/或存储的方案设置来产生特定脉冲形状或产生可彼此不同的一系列脉冲。
举例来说，在一个实施方案中，系统10产生的脉冲可具有从约1纳秒至约100微秒的持续时间，以及从约0.1kV/cm至约350kV/cm的电场强度，具体取决于应用。如上所述，脉冲的电场强度是施加的电压除以电极14与16之间的距离。虽然系统10产生的脉冲通常具有0.1kV/cm或更高的电场强度，但该脉冲通常不会超过包含细胞的悬浮液的击穿场。
在一些实施方案中，脉冲发生系统10可包括感测功能。也就是说，脉冲发生系统10可被配置成将样本22暴露于感测信号，感测信号可以是电场强度低于用于细胞活化的电脉冲的电场强度的电脉冲。如图1所描绘，脉冲发生系统10可包括电流感测电路34，该电流感测电路可获取和/或处理感测信号以估计样本22的一些电特性，包括但不限于电导率(conductivity)和介电常数(permittivity)。电流感测电路34可以耦合至处理器26，处理器可以控制感测信号的产生和处理，并且在一些实施方案中，可以执行处理的一部分。在其他实施方案中，电流感测电路34可包括专用处理器以控制感测信号的处理，并且可以与处理器26通信以报告结果。或者，电流感测电路34可以与脉冲发生电路12集成，从而提供用于产生后续活化电脉冲的输入。在另外其他实施方案中，感测信号的处理可以由如上所述的专用处理器或由处理器26执行。
关于各种电脉冲因素或参数，这些因素包括但不限于：比色杯间距(即跨越其施加脉冲的比色杯18的宽度)、流速(流通式实施方案)、电压、电场(例如，强度或密度)、电流、脉冲宽度和施加的脉冲数。在一项研究中，将这些参数的组合与其他对照或活化场景(例如，未处理的富血小板血浆(PRP)、PRP+氯化钙(CaCl2)、PRP+凝血酶(例如，牛凝血酶活化的PRP)相结合进行测试。表1汇总了使用电刺激来活化血小板的研究中所用的电脉冲参数的各种组合。
另外，表1的最后一列指示当暴露于具有所列参数的脉冲时样本中是否发生溶血。可以调节电参数，以使得可以避免或不避免溶血，即红细胞裂解。在所描绘的实例中，在电场和电流最高的两种场景下观察样本内的溶血。因此，除了其他考虑因素之外，在选择活化方案的电参数或其他参数(例如，电极间距和流速)时，可考虑样本内细胞裂解或破坏的合意性(desirability)或不合意性(undesirability)。
表1
该研究的结果显示在图2至图5中，图2以图形方式描绘了测量的血小板衍生生长因子(PDGF)，图3以图形方式描绘了测量的表皮生长因子(EGF)，图4以图形方式描绘了测量的血管内皮生长因子(VEGF)，图5以图形方式描绘了测量的转化生长因子beta(β)1(TGFb1)。如这些结果所示，差异参数化的电脉冲不仅在电刺激与非电刺激结果之间产生不同水平的相应生长因子，而且还在差异参数化的电刺激场景之间产生不同水平的相应生长因子。在这些附图中，实验条件是：PRP＝富血小板血浆(未活化)；钙＝富血小板血浆加氯化钙；凝血酶＝富血小板血浆、氯化钙和牛凝血酶(血小板活化剂)；1、2、3、4、5＝富血小板血浆、氯化钙和经由表1中所示的电刺激条件1至5活化。
举例来说，关于PDGF并且如图2中所示，如表1的场景1所示而参数化的电脉冲和比色杯间距产生的PDGF水平(～3800pg PDGF/mL)不同于其他四种场景(～8000pg PDGF/mL)，也不同于三种非电刺激场景(PRP：～600pg PDGF/mL，钙：～6000pg PDGF/mL，凝血酶：～8000pg PDGF/mL)。因此，通过操纵电脉冲特性、比色杯间距或宽度和/或电学和空间因素(诸如在脉冲期间在样本观察到的能量密度)的一些组合，获得活化血小板组合物中不同的PDGF水平。
类似地，关于EGF并且如图3中所示，如表1的场景1至5所示而参数化的电脉冲和比色杯间距产生对于每个编号场景显著不同的EGF水平，范围从～100pg EGF/mL(场景1)到～3300pg EGF/mL(场景3)。此外，针对凝血酶活化的血小板测得的EGF水平仅为～500pg EGF/mL，这是针对非电活化样本观察到的最高水平。因此，通过操纵电脉冲特性、比色杯间距或宽度和/或电学和空间因素(诸如在脉冲期间在样本观察到的能量密度)的一些组合，获得活化血小板组合物中不同的EGF水平。
关于VEGF(图4)，可以看到类似的结果，如表1的场景1至5所示的不同电脉冲参数和比色杯间距对于每个编号场景产生不同的VEGF水平，其中场景1和2分别产生～800pgVEGF/mL和～1750pgVEGF/mL，而场景3至5产生在～2250与～2500pg VEGF/mL之间的VEGF。因此，如在前述实例中，通过操纵电脉冲特性、比色杯间距或宽度和/或电学和空间因素(诸如在脉冲期间在样本观察到的能量密度)的一些组合，获得活化血小板组合物中不同水平的VEGF。
最后，关于TGFb1，如图5所示，如表1的场景1至5所示而参数化的电脉冲和比色杯间距对于每个编号场景产生显著不同的TGFb1水平，范围从小于1000pg TGFb1/mL(场景2)到～65000pg TGFb1/mL(场景3)，其他场景介于这些值之间。因此，如在前述实例中，通过操纵电脉冲特性、比色杯间距或宽度和/或电学和空间因素(诸如在脉冲期间在样本观察到的能量密度)的一些组合，获得活化血小板组合物中不同的TGFb1水平。又如，与凝血酶活化相比，电学条件2产生较低的TGFb1水平(图5)，但是产生与凝血酶相同的PDGF-aa(图2)、VEGF(图4)和EGF(图3)水平。由于科学文献表明TGFb1与增加的瘢痕形成相关，因此与经由凝血酶活化产生的血小板凝胶相比，由此处描述的电刺激2产生的血小板凝胶可触发更低的瘢痕形成。
从前面的实例可以看出，响应于电脉冲和/或电极间距的变化的不同方面，差异地释放不同的生长因子。因此，应当理解，基于期望的生长因子分布，可以参数化电脉冲或脉冲序列，以便释放期望水平的期望生长因子。此外，可以在脉冲之间改变或调节脉冲参数，以便通过不同的脉冲靶向释放不同的生长因子。
同样值得注意的是，可归因于电极间距的空间变化似乎有时是差异生长因子释放中的一个因素。例如，场景2、3和4都是使用2mm比色杯间距执行的，然而，至少在EGF、VEGF和TGFb1释放的情况下，不同的电脉冲参数各自给出以下结果：场景4所释放的相应生长因子的量大于场景2，并且场景3大于场景4。也就是说，在这些场景中，由于比色杯间距保持恒定，差异化因素是电脉冲参数的差异。
相反，关于场景2和5，施加在电场、电流、脉冲宽度和施加的脉冲数方面大致相似的电脉冲参数，但是比色杯具有不同的间距(场景2中为2mm，场景5中为4mm)。在这种情况下，在这两种场景中释放了不同量的EGF、VEGF和(特别是)TGFb1，强烈表明比色杯间距或比色杯间距的某些衍生参数(诸如能量密度或电场)是差异化因素。因此，电脉冲参数和空间因素两者(分开地或以结合方式)可以在绝对意义上和/或相对于其他生长因子差异性地(例如，优先地)影响一种或多种生长因子的释放。
利用该知识，因此可以产生具有所需量的一种或多种特定生长(或其他)因子、具有一种或多种因子相对于其他因子的期望比率或比例、或具有绝对或相对意义上的特定因子分布的血小板活化组合物(例如，凝胶)。也就是说，可以使用电脉冲参数、电极间距和/或流速(流通式实现方式)的合适组合来调节或定制血小板活化组合物，从而允许临床医生产生或订购针对给定患者具有期望医学或生物学效果的血小板活化组合物，诸如特定于伤口愈合阶段的组合物(例如：对于需要血管新生、新血管等的伤口，VEGF较高)。在实践中，这可以使用编程到系统10中的预设选项来实现，诸如可选按钮或菜单项或图形界面列表，其中每个选项对应于不同的医学效果或处方，和/或对应于一组不同的预先配置的电脉冲参数，并因此对应于组合物的不同生长因子分布。然而，即使在这样的布置中，也可以向用户提供选项以输入定制的或用户指定的电脉冲参数。
又如，图6和图7呈现了使用来自未活化的PRP、用牛凝血酶以及表1中的电学条件2、3和5活化的PRP的生长因子(参见图2、3、4和5中的生长因子分布)进行的体外细胞增殖测定(in vitro cell proliferation assays)的结果。这些测定使用人表皮成纤维细胞作为上皮形成的替代物(图6)，并且使用人表皮微血管内皮细胞作为血管新生的替代物(图7)。图6示出了与凝血酶活化相比，电学条件2、3和5以更高的速率触发细胞增殖(更快的上皮形成)。但是图7示出与牛凝血酶活化相比，电学条件3触发更高的增殖率(更快的血管新生)，而与牛凝血酶相比，电学条件2和5显示出更慢的增殖(更慢的血管新生)。这些测定证明了允许临床医生使用富血小板血浆的适当电刺激来调节伤口愈合效果的可能性。
考虑到前述内容，图8描绘了可用于产生如本说明书所讨论的血小板活化组合物50的工艺流程40的实例。应当理解，方法40的某些步骤可以由操作员执行，而该方法的其他步骤可以由系统10执行，诸如执行控制电脉冲的配置和/或施加的一个或多个算法。
转到图8，在一种实现方式中，血样42(例如，全血样本)首先被处理(步骤44)以产生PRP样本46。在自体实现方式中(in an autologous implementation)，血样42可以在之前随访期间或在当前治疗疗程期间从患者自身获得。在其他实现方式中，血样可以从患者以外的其他人获取。此外，在一些情况下，可以不存在所描绘的处理步骤44，而后续步骤被理解为替代地在血样42上执行。当执行时，处理步骤44可以基于适合于血小板分离的一种或多种技术，诸如离心或过滤或用于从血样42产生PRP样本46的任何其他合适的方法。在某些实现方式中，在步骤52经由系统10暴露于一个或多个脉冲之前，可以将CaCl2添加到样本(无论是PRP还是全血)。
在所描绘的工艺流程中，描绘了步骤48，其中操作员选择用于在暴露于电脉冲期间放置样本(无论是PRP还是全血)的比色杯或导管的尺寸(例如，电极间距)。可以采用任何合适的电极间距(诸如2mm、4mm或其他合适的尺寸)，并且如上所述，无论在相对意义上(即与其他生长因子成比例)还是绝对意义上(即存在的总量或浓度，与其他生长因子水平无关)，比色杯尺寸的选择可以是影响活化血小板组合物中存在的一种或多种生长因子水平的因素。
在所选择的比色杯尺寸内的PRP或血样被放置在系统10内，并且准备好在步骤52暴露于一个或多个电脉冲。在脉冲产生之前，脉冲参数54可以由操作员选择或以其他方式指定。取决于实现方式，脉冲的任何电特性(包括但不限于电压、电场、电流等)以及脉冲宽度(即持续时间)和要施加的脉冲数可由操作员在步骤56直接指定，或者通过选择预定方案来指定(诸如从方案菜单或列表中选择)，所述预定方案对应于规定的活化血小板组合物50，诸如为了在使用时(步骤60)提供特定生物学或医学效果而定制或优化的组合物50。
尽管在本发明的某些实例中提及了血小板活化，但应当理解，也可以活化富血小板血浆中可能存在的其他细胞类型(例如，红细胞、白细胞等)，以便如本说明书所讨论的那样释放蛋白质和/或生长因子。也就是说，本方法通常可被理解为允许从多种细胞类型而不仅是血小板可定制地释放蛋白质和/或生长因子(当此类细胞被活化时)。此外，如上所述，尽管在上述讨论的某些部分中已经通过举例方式给出了生长因子，但在活化产物中可能存在其他因子(例如，内源性抗氧化剂、活性氧物质、基质金属蛋白酶-2(MMP-2))，这些因子可具有如本说明书所讨论的那样进行定制或调节的水平或比例。
单独的或以组合方式的本公开实施方案中的一个或多个可提供一种或多种技术效果，这些效果可用于离体活化血小板以及释放生长因子和其他因子的医学技术。用于离体血小板活化的本技术允许使用具有不同尺寸的比色杯或导管和/或具有不同电特性、持续时间的电脉冲和/或不同数量的此类脉冲，针对一种或多种生长因子或其他因子的量或浓度或者一种或多种因子相对于组合物中其他因子的相对比例来定制或调节活化血小板组合物。这样，便产生了活化血小板组合物，其具有不同于当通过其他方式实现活化时观察到的那些生长因子水平的水平，所述方式包括化学方式(例如，通过暴露于凝血酶、胶原、钙等)。在本说明书中描述的技术效果和技术问题仅作为示例提供，而并非是限制性的。应注意，本说明书中所描述的实施方案可具有其他技术效果且可解决其他技术问题。
虽然本说明书中仅展示和描述了本发明的某些特征，但所属领域的技术人员将想到许多修改和改变。因此，应理解，所附权利要求书旨在涵盖如属于本发明的真实精神内的所有此类修改和改变。一些实施方案可用于体内血小板活化工作流程。人们可以通过电刺激触发PRP中的生长因子释放而无凝结，并且在损伤部位注射该PRP。由此释放的生长因子可用于损伤部位的伤口愈合。此外，在某些实施方案中，血小板还可以被结缔组织内的胶原完全活化。

Claims (20)

1.一种释放生长因子的方法，包括：
将样本相对于脉冲发生装置的电极定位；
指定一组电脉冲参数，其中不同参数值在活化产物组合物中产生一种或多种生长因子的不同水平；以及
将所述样本暴露于根据所述参数值产生的一个或多个电脉冲，其中所述样本当暴露于所述一个或多个电脉冲时，产生具有至少部分地由所述一组电脉冲参数确定的所述一种或多种生长因子的水平的所述活化产物组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样本包括富血小板血浆样本、血小板悬浮液或全血样本中的一种。
3.根据权利要求1所述的方法，还包括：
从多个容器尺寸中选择容器或导管尺寸；以及
将所述样本放置在先前选择的尺寸的容器内，其中定位所述样本包括将容纳所述样本的所述容器放置在所述电极之间的样本保持器内，其中所述活化产物组合物具有至少部分地由所述容器尺寸确定的所述一种或多种因子的水平。
4.根据权利要求1所述的方法，其中将所述样本定位在所述电极之间包括使所述样本流动通过所述电极之间的导管，其中所述活化产物组合物具有至少部分地由所述导管直径或通过所述导管的所述样本的流速中的一者或两者确定的所述一种或多种因子的水平。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述一组电脉冲参数包括电压、电场、电流、脉冲宽度、能量密度、每个血小板的能量或脉冲数中的一者或多者。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种因子包括由血小板、红细胞或白细胞中的一种或多种释放的生长因子，所述生长因子包括血小板衍生生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子或转化生长因子β1中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述样本的细胞不响应于所述一个或多个电脉冲而裂解。
8.一种释放生长因子的方法，包括：
选择比色杯尺寸，其中不同比色杯尺寸在活化产物组合物中产生一种或多种因子的不同水平；
将样本放入所选尺寸的比色杯中；
将所述比色杯放入脉冲发生装置的样本保持器内；
将所述样本暴露于一个或多个电脉冲，其中所述样本当暴露于所述一个或多个电脉冲时，产生具有至少部分地由所述比色杯尺寸确定的所述一种或多种生长因子的水平的所述活化产物组合物。
9.根据权利要求8所述的方法，还包括：
指定一组电脉冲参数，其中不同参数值在所述活化产物组合物中产生一种或多种生长因子的不同水平，并且其中所述活化产物组合物具有至少部分地由所述一组电脉冲参数确定的所述一种或多种生长因子的水平。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述一组电脉冲参数包括电压、电场、电流、脉冲宽度、能量密度或脉冲数中的一者或多者。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述一种或多种生长因子包括血小板衍生生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子或转化生长因子β1中的一种或多种。
12.根据权利要求8所述的方法，其中所述样本的细胞不响应于所述一个或多个电脉冲而裂解。
13.一种用于定制活化的血液衍生细胞治疗的方法，包括：
确定用于基于伤口类型或伤口愈合级联的相应过程中的一者或两者治疗患者的定制生长因子分布；
选择对应于所确定的生长因子分布的一个或多个电脉冲参数和比色杯尺寸；
将放置在所选尺寸的比色杯中的样本暴露于基于所选电脉冲参数产生的一个或多个电脉冲，以产生具有所述生长因子分布的活化产物组合物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中确定生长因子分布包括确定从血小板、红细胞或白细胞中的一种或多种释放的生长因子的绝对量，所述生长因子包括将存在于所述活化血小板组合物中的血小板衍生生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子或转化生长因子β1中的一种或多种。
15.根据权利要求13所述的方法，其中确定生长因子分布包括确定将存在于所述活化产物组合物中的血小板衍生生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子或转化生长因子β1中的一种或多种相对于另一种生长因子的相对量。
16.根据权利要求13所述的方法，其中选择所述一个或多个电脉冲参数包括指定电压、电场、电流、脉冲宽度、能量密度或脉冲数中的一者或多者的值。
17.根据权利要求13所述的方法，其中选择所述一个或多个电脉冲参数包括从多个预先配置的脉冲轮廓中选择预先配置的脉冲轮廓。
18.一种电脉冲发生系统，包括：
样本保持器，其被配置成接纳至少两种不同尺寸的比色杯；
脉冲发生电路，其被配置成当比色杯存在于所述样本保持器中时，产生一个或多个电脉冲到所述比色杯中；
一个或多个用户输入设备，其被配置成接收用户输入；
非暂态计算机可读存储器，其存储一个或多个处理器可执行例程；以及
处理器，其被配置成访问和执行存储在所述计算机可读存储器中的所述一个或多个处理器可执行例程，其中所述处理器可执行例程当被执行时使得执行包括以下方面的动作：接收指定与规定的生长因子分布对应的一个或多个电脉冲参数的输入，其中不同电脉冲参数值在所述生长因子分布中产生一种或多种生长因子的不同水平；以及使用所述脉冲发生电路基于所述输入产生一个或多个电脉冲，以产生具有所述规定的生长因子分布的活化产物组合物。
19.根据权利要求18所述的系统，其中接收所述输入包括接收用户从多个生长因子分布中对所述生长因子分布的选择。
20.根据权利要求18所述的系统，其中所述一个或多个电脉冲参数包括电压、电场、电流、脉冲宽度、能量密度或脉冲数。
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