TWI398276B

TWI398276B - Method for producing bacterial cellulose with controlled pore size and its use in wound dressing

Info

Publication number: TWI398276B
Application number: TW99131887A
Authority: TW
Inventors: Jinn Tsyy Lai; Chiu Mei Kuo; Chin Chu Ho; Chiao Ying Huang; Hui Jung Yeh; Han Ken Chen
Original assignee: Food Industry Res & Dev Inst
Priority date: 2010-09-20
Filing date: 2010-09-20
Publication date: 2013-06-11
Also published as: TW201212955A

Description

製造具有調控的孔隙大小的細菌纖維素的方法及其於創傷敷材的用途

本發明是關於製造具有調控的孔隙大小的細菌纖維素的方法及其於創傷敷材的用途。

近年來，由於人體醫學發達，逐漸的取代塑膠製品的可替代性材料逐漸抬頭，尤其在生物性可分解性材料的開發，如親和性佳之膠原蛋白等天然來源材料，多被應用於創傷敷材之材料與組織培養等材料之基材。在一般的創傷敷材通常為創傷貼布，就大眾熟知的為OK繃，甚或高等級、高單價的創傷敷材，如：甲殼素、幾丁質、葡聚醣、海藻酸鹽和膠原蛋白等生物性材料(中華民國I263501係由甲殼素與海藻酸鹽所構成之一種多孔性創傷敷材，M274953係由聚甲殼醣經游離輻射或UV光照射法將丙烯酸或異丙基丙烯酸醯接枝共聚合於一基材表面之創傷敷材)。理想中的創傷敷材除了能快速的讓傷口癒合之外，也應該有足夠的彈性貼附於傷口、隔絕微生物的感染、可以吸收傷口的滲出液及減少換藥的痛苦。

創傷敷材主要在濕潤的環境下具有促進傷口癒合的效果。傷口癒合的越快復原並且沒有傷疤與後遺症，此創傷敷材的功效越佳。在科學家的研究中發覺傷口的體液內，發現存在著許多傷口癒合之生長因子(growth factor)，因此在創傷敷材內都會含有此些因子以促進傷口的癒合，特別是手術創傷、燒燙傷與潰瘍此類重大的皮膚損壞，經由這些生長因子與傷口上的體液擴散交流下，增加傷口上的癒合因子的濃度，癒合生長因子由生化代謝路徑促進皮膚傷口的癒合，產生新的皮膚組織。例如：中華民國專利I264306係為膠原蛋白及其衍生物與透明質酸所製成的一種創傷敷材。

傳統的創傷敷材都是利用不織布、塑膠膜和水膠(中華民國590763為一種多層的水凝膠創傷敷材)，此類創傷敷材基本上沒有特殊功效，僅利用少量的空氣對流與避免微生物感染來增進傷口癒合；葡聚醣、甲殼素、海藻酸鹽和膠原蛋白等生物性創傷敷材，依不同比例進行配方開發，而不同的組成造成不同的生物多樣性與傷口癒合機制皆不同，通常來說相較於傳統的創傷敷材效果更好，各種成分不但各有各的好處，更因為生物相容性而被大多數人所接受，不過其缺點便是價格昂貴，尤其是膠原蛋白類的創傷敷材，而生物性的材料也會造成容易脆裂、透氣性不佳、體液交換率差和生物相容、過敏性等缺點。

綜觀上述情況，創傷敷材的材料與特性會影響其物理特性與生物毒性，造成創傷敷材的好壞，特別是在傷口癒合能力上的表現。而生物性材料的創傷敷材可以降低人體生物性的排斥，促進傷口癒合，而生物性材料若沒有好的物理特性也無法取代原有的創傷敷材，因此在吸水性、通氣性、機械拉力與生物毒性，都會影響到創傷敷材對傷口癒合的功效；而在產品上也該考慮製作流程的簡易性，可減少操作程序與成本支出的製程。

醋酸菌(Gluconacetobacter xylinum )所生成的天然纖維，其纖維直徑小於0.1 μm，為天然界已知纖維最細者。醋酸菌纖維素保水性、保形性皆非常良好，具有高結晶度，且纖維中無植物纖維素中之木質素、半纖維素及果膠等伴生產物，目前在傷口包紮及創傷敷材的用途上受到廣大的重視。

美國專利5846213號揭示一種可作為創傷敷材的醋酸菌纖維素膜的製備方法，包括於攪拌容器中培養醋酸菌纖維素，將醋酸菌纖維素溶解於一含有氯化鋰及二甲基醋酸醯胺(dimethylacetamide)的溶劑系統中，澆鑄該溶液於一平坦表面上，及於一膠凝浴中凝結成一膜，接著藉由溶劑交換將一保水劑摻入該膜。該膜於去熱源、消毐後被包裝以長期儲存備用。此專利除了使用成本高氯化鋰外，亦使用對環境不利的有機溶劑，而其所製備的創傷敷材在保水性、水氣穿透率及吸濕倍數上仍有進一步被改善的空間。此專利的內容藉由參考方式被併入本案說明書。

本案發明人發現在靜止狀態下細菌培養液態媒體上若漂浮一種水包油微乳液或微膠囊，可使得所生產的細菌纖維素具有均勻且較大的孔隙。因此，本發明是關於一種細菌纖維素的孔隙大小的調控方法。

本發明亦包含一種具有調控的孔隙大小的細菌纖維素的製造方法，及其於創傷敷材的製備的用途。

本發明的較佳具體實施態樣包括(但不限於)以下項目：

1.　一種製造具有調控的孔隙大小的細菌纖維素的方法，包含下列步驟：

a)將具有油相粒子分散於水相中的一水包油微乳液或微膠囊添加於一細菌培養液態媒體，於是該油相粒子或微膠囊漂浮在該細菌培養液態媒體上；及

b)在實質上靜止及大氣狀態下該細菌培養液態媒體中的細菌在氣體及液體界面處形成片狀細菌纖維素，其中該片狀細菌纖維素內部分散有該油相粒子或微膠囊。

2.　如前述第1項的方法，其進一步包含：

c)從該細菌培養液態媒體上取出該片狀細菌纖維素；

d)以一鹼性水溶液清洗該片狀細菌纖維素；及

e)以水清洗該片狀細菌纖維素直到清洗後的液體呈現中性。

3.　如前述第2項的方法，於步驟e)之後其進一步包含：f)藉由溶劑交換將保水劑摻入該片狀細菌纖維素。

4.　如前述第2或3項的方法，於步驟e)或f)之後其進一步包含：

g)乾燥該片狀細菌纖維素。

5.　如前述第3項的方法，於步驟f)之後其進一步包含：

f')以UV光照射該摻有保水劑的片狀細菌纖維素；

f")將一癒合因子或生長因子添加於該UV照射過的片狀細菌纖維素。

6.　如前述第5項的方法，於步驟f")之後進一步包含：

g)乾燥該添加有癒合因子或生長因子的片狀細菌纖維素。

7.　如前述第1項的方法，其中該細菌為醋酸菌(Gluconacetobacter xylinus )。

8.　如前述第2項的方法，其中步驟a)使用該水包油微乳液而未使用微膠囊添加於該細菌培養液體媒體，其中該水包油微乳液含有粒徑為400-700 nm的油相粒子，而該步驟e)得到的片狀細菌纖維素有2-5 μm的孔隙大小。

9.　如前述第8項的方法，其中該油相粒子為一植物油，並且選擇性在其內部包埋有一機能性物質。

10.　如前述第9項的方法，其中該水包油微乳液係將該植物油及該機能性物質先行振盪混合，再加入一界面活性劑攪拌混合，最後再將所獲得的混合液加入於水中攪拌混合而製備，其中該界面活性劑具有7-16的HLB，及該混合液對水的體積比為1:10-1:100。

11.　如前述第9項的方法，其中該水包油微乳液係將該植物油與界面活性劑先行攪拌混合或一起加入於水中攪拌混合而製備，其中其中該界面活性劑具有7-16 HLB，及該混合液對水的體積比為1:10-1:100。

12.　如前述第8項的方法，其中步驟d)的該鹼性水溶液為鹼金屬或鹼土金屬氫氧化物或鹽，而步驟e)獲得的片狀細菌纖維素其內部仍然分散有該油相粒子。

13.　如前述第2項的方法，其中步驟a)使用該微膠囊而未使用該水包油微乳液添加於該細菌培養液態媒體，其中該微膠囊具有50-500 nm的粒徑，而該步驟e)得到的片狀細菌纖維素有10-25 μm的孔隙大小。

14.　如前述第13項的方法，其中該微膠囊為一水溶性高分子與藻酸鈣的摻合物。

15.　如前述第14項的方法，其中該微膠囊的製備包含將該水溶性高分子的水溶液與藻酸鈉的水溶液混合；再將該混合液均質；接著將均質化的混合物以一微噴頭噴入氯化鈣水溶液中，而得到漂浮於液面上的該水溶性高分子與藻酸鈣的摻合物的微膠囊。

16.　如前述第15項的方法，其中該微膠囊的製備進一步包含將一植物油加入於該混合液中再一起進行均質。

17.　如前述第15項的方法，其中水溶性高分子為聚乙烯醇，該聚乙烯醇對藻酸鈉的重量比為20：1至5：1。

18.　如前述第17項的方法，其中該聚乙烯醇具有10000-50000的數目平均分子量。

19.　如前述第15項的方法，其中步驟d)的該鹼性水溶液為鹼金屬或鹼土金屬氫氧化物或鹽，而且該微膠囊在步驟d)的清洗過程中由該片狀細菌纖維素的內部被洗出。

20.　如前述第3項的方法，其中該保水劑為甘油、乙二醇、聚乙烯醇或聚乙二醇(polyethylene glycol)、多元醇、山梨醣醇、甘露醣醇或其等的混合。

21.　如前述第20項的方法，其中該保水劑進一步含有NaCl水溶液。

22.　如前述第20或21項的方法，其中該保水劑為甘油和乙二醇體積比1:1的混合。

23.　如前述第5項的方法，其中該癒合因子為膠原蛋白、玻尿酸、果膠、蘆薈翠取液、海藻酸鹽、甲殼素、金奈米子、銀奈米子、葡聚醣、鈣鹽、或血管收縮素。

24.　如前述第23項的方法，其中該癒合因子為膠原蛋白。

25.　一種使用如前述任一項所述的方法所製備的片狀細菌纖維素於創傷敷材的製備的用途。

本發明的一個或多個具體實施例的細節被詳述如下。有關本發明之其餘特色、目的與優點在本說明書及申請專利範圍的敘述下可以明顯知悉。

微乳液是由水、油、和界面活性劑等至少三成份混合所形成的系統，宏觀上呈均勻相。在介紹『微乳液』之前，我們須先瞭解『界面活性劑』的特性。界面活性劑是喜歡滯留在固-液或氣-液界面上的分子，通常具有親水頭基與疏水尾鏈，所以又稱為『雙親分子』。在低濃度時，溶液內與界面上的界面活性劑分子達到熱力學平衡，如同一般溶質；由於表面上的界面活性劑可提供表面壓力而使該液體的『表面張力』降低。當界面活性劑濃度升高至某一狹小範圍，溶液的物理性質，如表面張力和電導度等，會產生顯著的變更。此一類似相變現象的發生乃肇因於溶液中許多『微胞』的形成。

在工業應用時，微乳液的液滴內可能含有某些溶質，例如鹽類離子、奈米粒子(蛋白質)、助界劑等。過去相關的研究指出鹽類離子和蛋白質等具有電荷的溶質可以顯著地改變電導穿透的臨界值。一般而言，穿透臨界溫度會隨鹽類濃度的增加而提高，而陽離子較陰離子的影響大。鹽類的效應可能緣自靜電作用改變微液滴表面界面活性劑單分子層的自然曲率和彎曲自由能。微液滴中包含奈米粒子會改變液滴的大小，進而影響其電導穿透臨界值，然而升高或降低則視粒子的特性而不同。加入作為助界劑的短鏈醇類也會影響電導穿透行為，某些理論研究指出較短的醇類可提高液滴間的引力，而長鏈的醇類則會使液滴表現如同硬球。在近年來微乳化常應用於化妝保養品的原料上，讓保養品於肌膚上更加容易穿透並吸收，在功效上大大的提升。

微粒膠囊乃將原料物質包藏起來，故具有保護作用，且因調製的條件不同，故可控制在一定時間內能將一定的藥量釋出。物質被微粒膠囊化後，原來所具有的性質諸如：顏色、形狀、重量、溶解性、持續性等，將會被改變。由於微粒膠囊具有與人體細胞膜相似的構造及半透膜性，故人工細胞、人工紅血球及固定化酵素。在醫療上的應用以及超微粒膠囊(nanocapsule)在注射劑上的應用等研究，將使微粒膠囊更被期待。微膠囊所用的材質較為廣泛，包含微脂體、高分子顆粒、膠體顆粒等，常用的殼材為甲殼素與環狀糊精較為熱門。

於以下的本發明的一較佳具體實施例中，將醋酸菌(Gluconacetobacter xylinus )利用靜置培養方式大量培養，並針對所產生之細菌纖維素之水含量、吸濕倍數、機械拉力、蛋白質吸附力、水氣穿透率及毒性試驗做探討，作為發展創傷敷材之開發。

將醋酸菌由甘油管取出活化於AC平板上三天，取單一菌落接菌於AC搖瓶(50 mL)中於150 rpm下培養2天，2天後將培養後之醋酸菌接於YE培養基(2L)中，於室溫下靜置培養。此時若要控制纖維素孔徑大小則另行加入本發明之微乳液或微膠囊於培養基使其漂浮於培養基表面上(詳見後續實施例說明)，生產出本發明之具有調控的孔隙大小的片狀細菌纖維素。細菌纖維素由氣體與培養基之間的界面開始生長，當利用微乳液與微膠囊形成之特殊培養基來培養菌體時，細菌纖維素將由原本無限制的孔隙大小下成為孔隙大小受到控制的成長，使得細菌纖維素生長時即為具有功能性的細菌纖維素，如細胞支架所需要的內部孔隙大小均勻之3D立體孔洞結構。

經由微乳液或微膠囊技術處理後所獲得之細菌纖維素可進一步添加保水劑，其可將細菌纖維素內的水分給鎖定住，維持一定的含水量。一合適的保水劑包含甘油、乙二醇及鹽類，其以塗布或混勻方式被加入細菌纖維素。例如將細菌纖維素與保水劑經由高速攪拌均質後，再澆鑄及乾燥形成片狀細菌纖維素(混勻方式)。或者將細菌纖維素以浸泡或塗佈方式與保水劑作用，經過一段時間，等待保水劑經擴散作用進入細菌纖維素之內，即可得到經保水劑改質後的細菌纖維素。加入保水劑改質後的細菌纖維素，其具有獨特的機械拉力與彈性，並可以得到敷材所需要的保濕性且不會失去高水氣穿透率的效果。保水劑中的鹽類可為氯化鈉，乙二醇尚可為多元醇、山梨醣醇與甘露醣醇。

針對經保水劑改質後的細菌纖維素，可進一步添加癒合因子(例如膠原蛋白、玻尿酸、果膠、蘆薈翠取液、海藻酸鹽、甲殼素、金奈米子、銀奈米子、葡聚醣、鈣鹽、血管收縮素等止血因子)或生長因子(EGF、PDGF、TGF、GH等)等加予功能化，其中，可透過高能UV照射處理，將表面物質激發成為高能激發態，在細菌纖維素上形成活躍自由基，與隨後添加的癒合因子或生長因子反應，使它們結合在細菌纖維素上。將上述經過保水劑和癒合因子或生長因子等改質後獲得之細菌纖維素進行冷凍乾燥處理以形成薄膜和海綿狀多層創傷敷材，或是以熱風(真空)乾燥來形成生物纖維素敷材，並在乾燥過程中以雙面塑膠片整平敷材表面並把水份以離心或擠壓方式排出來減少乾燥時間，並可固定生物纖維素在塑膠片中的位置，使乾燥處理時間減少。

最後再經過常溫滅菌與UV光照射滅菌即可得到最終之細菌纖維素創傷敷材。

實施例1：未添加保水劑及膠原蛋白

微乳液的製備：(以機能性成分Q10為例也可不包覆機能性成分)：

1.　試製微乳液，1000 mg機能性物質Q10(一種輔酵素)加入6 g椰子油，以超音波震盪方式先行震盪。

2.　加入24 g Tween 80並以磁石攪拌混合。

3.　待Tween 80與椰子油完全混合均勻後，緩慢加入70 mL純水並同時以磁石攪拌，待膠狀物質完全溶解即可得濃縮微乳液。

基礎(YE)培養基的準備：

以含下表所列成分及菌體濃度5%之液態媒體於無雜菌污染狀態下以120 rpm及於30℃環境下培養兩天所得到之充滿醋酸菌的液態媒體。

醋酸菌的培養：

將上述微乳液依適當比例混合基礎(YE)培養基進行醋酸菌培養，其比例可介於1:4~4:1(體積)之間，在本實施例中使用體積比1:1。經過在室溫下靜置培養4-6天，即可得到厚度0.5~1 cm之片狀細菌纖維素(含有機能性微乳化成分)，後續進行洗滌、保水劑添加與乾燥製程。

洗滌步驟：

1.　將前述生長完成之片狀細菌纖維素取出，再加入細菌纖維素二倍體積的超純水，在121℃、15分鐘下洗滌一次。

2.　將洗滌水排乾後，再加入細菌纖維素二倍體積的1% NaOH水溶液在121℃、15分鐘下洗滌一次。

3.　排乾NaOH水溶液後，再加入細菌纖維素二倍體積的超純水在121℃、15分鐘下洗滌數次，直到洗滌水之pH值為7。

乾燥步驟：

乾燥步驟以冷凍和熱風(真空)乾燥為主。冷凍乾燥處理可以形成多孔性薄膜和海綿狀多層創傷敷材。熱風(真空)乾燥可以形成扁平狀生物纖維素敷材。熱風乾燥過程之前或進行當中可用塑膠片整平片狀細菌纖維素表面並把其中部份水份以離心或擠壓方式排出來減少乾燥時間。於本實施例中使用下列兩種方式的任一種進行乾燥：冷凍乾燥：以冷凍乾燥機來完成，先於前一晚放置樣品於-80℃下過夜，當天先開機器熱機將冷凍乾燥機內棚板(-20℃)、腔體(-70℃)與真空壓力(200 mTorr以下)等條件預備完成，即可照機器內定之參數進行冷凍乾燥，二天後可得到乾燥產品。熱風(真空)乾燥：以熱風(真空)乾燥機來完成：1)將樣品於溫度30~50℃，真空度40 cmHg以下，時間為2-3天可得到乾燥產品；或者2)在沒有真空下把溫度提高為40-60℃，時間為1-1.5天，可得到乾燥產品。

實施例2:

重覆實施例的製程步驟，但在乾燥步驟之前，進行保水劑及膠原蛋白之添加步驟。

把pH為中性的細菌纖維素，以塗布或混勻方式加入保水劑。保水劑的主要功能在於可以加強細菌纖維素的拉伸長度。合適的保水劑為甘油、乙二醇及鹽類的混合。於本實施例中所使用的保水劑為甘油：乙二醇=1:1(體積)並添加濃度0.05%的氯化鈉(0.05%氯化鈉為100 mL的甘油/乙二醇保水劑添加0.05g氯化鈉)。

A：混勻方式

把洗好pH為中性的細菌纖維素以果汁機打碎，再添加保水劑攪勻，倒入培養皿中後照射UV光0.5~1小時，接著將不同濃度(1、5、10及20%(W/W))的膠原蛋白水溶液塗佈在其表面。最後經過前述之冷凍乾燥步驟，得到表面具有重組成膜狀之膠原蛋白的片狀細菌纖維素。

B：塗布方式

把洗好pH為中性的細菌纖維素，在沒有經過果汁機打碎的情況下塗佈保水劑1 mL/100 cm² ，接著照射UV 0.5~1小時後，再浸泡於不同濃度的膠原蛋白水溶液，取出後經過前述之冷凍乾燥步驟成膜，得到表面具有重組成膜狀之膠原蛋白的片狀細菌纖維素。

實施例3

微膠囊的製備：

準備2%海藻酸鈉(2 g海藻酸鈉+98 g水)及20% PVA水溶液(PVA：聚乙烯醇，購自Sigma公司，代號348406-500g，重量平均分子量13000-23000)。依下表1進行混合。再以均質機於轉速5000 rpm下均質10分鐘，接著以微噴頭(孔徑1 mm)將上述均質的混合液滴入5%氯化鈣水溶液使海藻酸鈉硬化形成微膠囊，再從其中撈出微膠囊使用。取部份微膠囊置入水中，觀察其漂浮情形，結果如表1。

將15 mL的2%海藻酸鈉與15 mL的20% PVA水溶液混合；將20 mL的2%海藻酸鈉與10 mL的20% PVA水溶液混合。對前述混合液分別加入體積1、3及5 mL的大豆油以均質機轉速5000 rpm均質10分鐘，再以本述微噴頭將上述均質的混合液滴入5%氯化鈣水溶液使海藻酸鈉硬化形成微膠囊，再從其中撈出微膠囊使用。取部份微膠囊置入水中，觀察其漂浮情形，結果如表2。

醋酸菌的培養：

取以上樣品8的微膠囊進行醋酸菌的培養，其中微膠囊被慢慢加入基礎(YE)培養基直到覆蓋其液面。經過在室溫下靜置培養4-6天，即可得到厚度0.5~1 cm之片狀細菌纖維素。取出該片狀細菌纖維素，依實施例1及2中所描述洗滌、保水劑添加與乾燥步驟接續進行，即可得到表面未具有或具有重組成膜狀之膠原蛋白的片狀細菌纖維素產品。

實施例4:

於本實施例中使用實施例1及3所製備的片狀細菌纖維素產品(不含保水劑及膠原蛋白)進行測試。機械拉力及位伸距離進一步使用實施例1(微乳液)所製備的片狀細菌纖維素產品進行測試。

性質測試

吸濕倍數(復水性)：將各種不同乾燥方式之細菌纖維素裁成2公分*5公分，浸泡於生理食鹽水中30分鐘，在不鏽鋼上離水，測得濕重。

吸濕倍數=[(濕重-乾重)/乾重]

機械拉力及位伸距離：將樣品裁成2.5公分*10公分，以INSTRON拉力試驗機測拉樣品，設定夾具間設定為5.0公分、移動速度為50 mm/min，厚度為0.25~0.75 mm，拉到細菌纖維素膜斷裂之力量即為拉張力。

水氣透過率：將樣品置於一恆溫恆濕箱內，並放飽和結晶水之氯化鎂，溫度為35℃、溼度為38%，利用抽氣過濾裝置測定水氣透過率。將樣品放置於濾杯與錐形瓶間，並在錐形瓶內置入20 mL水、測水減少量。

水氣透過率=(起始總重-隨時間的總重)/面積

SEM(掃瞄式電子顯微鏡):

分別將上述經洗滌完成之細菌纖維素以SEM確認孔洞大小。SEM步驟包括：分別為脫水、固定、電鍍膜與電子顯微鏡觀察。

固定

1.　將細菌纖維素以1~2%的固定液固定

2.　在4℃下擺放一個晚上。

3.　隔天把固定液用逆滲透(RO)水置換二次。

脫水

1.　將前述固定之細菌纖維素，以10%~95%酒精置換RO水，濃度由低至高依序置換，每種酒精濃度混合十五分鐘。

2.　以100%酒精置換二次，每次混合十五分鐘。

3.　取出1/3液體體積100%酒精加入等體積100%丙酮，混合十五分鐘。

4.　取出1/2液體體積上述3之混合液加入等體積100%丙酮，混合十五分鐘。

5.　取出上述4之混合液加入等體積100%丙酮，混合十五分鐘。

6.　重複上述5二次。

7.　取出樣品置入100%丙酮CPD容器，利用CPD(臨界點乾燥)。

毒性試驗：

1.　培養繼代NCTC選殖(clone) 929細胞，且需至少繼代兩次以上，待細胞恢復其正常之生長，方可進行試驗。

2.　將細胞培養液、D-PBS及胰蛋白脢(trypsin)-EDTA等回溫至37℃。

3.　將細胞自37℃培養箱中拿出，移去細胞培養基，用D-PBS洗滌細胞一次後移去D-PBS，加入胰蛋白脢-EDTA溶液，使其能潤溼所有細胞後，移去胰蛋白脢-EDTA，放在37℃作用數分鐘後，輕拍培養角瓶，使細胞自瓶壁脫落，加入新鮮培養基並均勻混合。

4.　以新鮮培養基將細胞稀釋至1.5×10⁵ 細胞/mL，取2 mL種植於6孔培養平盤，輕輕搖晃培養平盤，使細胞分佈均勻。

5.　將細胞放入37℃，5% CO₂ 培養箱中培養隔夜。

6.　隔天移除6孔培養平盤之培養液，將40℃、2 mL之1.0% Noble洋菜培基(agar medium)輕緩均勻加入6孔培養平盤中。

7.　待其凝固後，將0.8 cm無菌細菌纖維素與濾紙片，以鑷子輕輕放在孔盤的正中央。

8.　分別取50 μl的負控制組(Negative control)(無熱源水)與正控制組(Positive control)(苯酚)待測樣品加在直徑0.8 cm無菌濾紙片上，每種測試條件至少作三重複。

9.　將6孔培養平盤放入37℃，5% CO₂ 培養箱中培養24 hrs。

10.　將貼附於洋菜上之測試物質於細胞培養皿底部作上記號，然後以無菌鑷子移除含有測試物質及濾紙片。

11.　在6孔培養平盤中加入2 mL之100 μg/mL中性紅工作溶液(Neutral Red working Solution)(使用前配製)，於37℃，5% CO2培養箱中靜置3 hrs。

12.　將中性紅工作溶液移除後，把細胞培養皿置於顯微鏡下觀察。

細胞存活率：

1.　培養繼代NCTC選殖929細胞，且需至少繼代兩次以上，待細胞恢復其正常之生長，方可進行試驗。並將樣品內的毒性依標準作業程序在37℃下、24小時萃取，所需的材料依形態和材質的不同，以D-PBS採取不同萃取比例(10倍、100倍及1000倍)。

2.　培養一天後，進行MTT分析。

3.　於每一孔中加入20 μl的MTT溶液(5 mg/mL in D-PBS)，於37℃，5% CO₂ 培養箱中培養四小時。

4.　移除培養基。

5.　加入100 μl DMSO，搖晃5 min後，利用酵素免疫分析儀(ELISA reader)讀取540 nm之吸光值。相對百分存活率的計算是與負控制組(無熱源水)作吸光值比較得到的相對百分比。

LAL(Limulus Amebocyte Lssate)凝膠法內毒素試驗：(依據岑祥公司提供之SOP)

1.　取適當稀釋的標準內毒素或樣品100 μl+LAL試劑100 μl。

2.　於37±0.5℃培育60±1分鐘。

3.　判定結果：內容物呈凝膠狀則為凝集內容物呈凝膠狀但下滑，或呈濃稠狀、維持液態，則為不凝集。

結果

SEM觀察：

利用微乳液與醋酸菌共培養的情況下，微乳液的油相粒子的平均粒徑分佈為400-700 nm。經過5-7天的培養，利用電子顯微鏡不同的倍率下觀察細菌纖維素的孔隙大小。如圖1a至1d所示，培養基與微乳液不同比例下可得到不同效果的細菌纖維素孔隙小，在微乳液與培養基的體積比例為1:1的情況下，孔隙大小為2-5 μm，而且孔洞排列較對照組(圖2)整齊，並且鮮少有醋酸菌體的殘留。而在微乳液與培養基的比例為1:4的情況下，孔隙明顯較少，並且醋酸菌體的殘留較多，顯示微乳液的多寡會影響到細菌纖維素孔隙控制的情形。

一般未經本發明方法調控孔隙大小之細菌纖維素，其孔洞大小多為1-3 μm，而且醋酸菌體的殘留多。經由本發明微化液處理後，不但可使細菌纖維素之孔洞大小均一，也可使孔洞增大，因而使獲得之細菌纖維素具有可作為創傷敷材之較佳物理特性。而菌體殘留的多寡也會影響到熱源反應的變化，進而影響到人體的免疫反應。所以在微乳液系統中，微乳液和基礎培養基的最適體積比例為1：1。

利用微膠囊與醋酸菌共培養的情況下，在微膠囊粒徑分析上利用光學顯微鏡在血球計數器下來觀察其大小，微膠囊的大小在10 nm-1000 nm。利用前述微膠囊方式可獲得孔洞大小為10-25 μm的細菌纖維素，如圖3所示。

細胞毒性：

生物性多層創傷敷材應用在人類或動物的傷口治療上，因此根據ISO 10993需判定本創傷敷材是否具有生物毒性。根據ASTM F895-84規範，以BCRC 60091 NCTC Clone 929細胞來測試，如圖4所示，實驗組與正控制組(positive control)和負控制組(negative control)比較後，細微化細菌纖維素敷材之細胞增生數量與負對照組的數量相當，遠多於正對照組的數量，由此結果可判定細菌纖維素經過此實驗步驟的製程方式可達到此創傷敷材不具生物毒性，對於創傷性膚材的素材提供一個良好的選擇。

細胞存活率：

細胞相對百分存活率可以試驗出樣品是否有毒性並且定量相對毒性，主要是利用D-PBS來萃取樣品中的毒性物質，依照ISO的標準作業程序，細菌纖維素敷材樣品在37℃下浸泡於D-PBS一天可得到萃取液，將萃取液利用MTT分析來定量細胞相對毒性百分比。若是相對百分比低於一百，則細胞存活率較低，若是相對百分比高於一百，則樣品有促進細胞生長的效果，一般若是細胞百分比存活率高於85%則為無毒性。結果被示於圖5，其中1: 0.98摺代表0.98 g摺起來的樣品依0.1g/mL的比例添加D-PBS來萃取；2: 60 cm² /5 mL代表60 cm² 的樣品用5 mL的D-PBS萃取；3: 0.98散代主0.98 g打散的樣品依0.1g/mL的比例添加D-PBS來萃取；4: 1.2摺代表1.2 g的樣品依0.1g/mL的比例添加D-PBS來萃取。樣品分為摺跟打散，係因為細菌纖維素表面積比較大，恐怕萃取液沒辦法完全浸泡而影響萃取效果，所以試了不同的萃取方式。從圖5可以看出本發明樣品不論何種萃取方式，所有的細胞存活百分比皆在98%以上，顯示本發明的細菌纖維素不但沒有細胞毒性，尤其在稀釋倍數較高的情況下，不但達到85%的細胞毒性標準，更有促進細胞生長的效果。本發明細菌纖維素的製備方法對於傷口的瘉合能力有提升作用，在作為傷口敷材上將有所功效。

水氣穿透率：

本發明經過微乳液培養基來控制細菌纖維素的孔隙大小(亦可增進水氣穿透率)、保水劑的改質來增加機械拉力、氫氧化鈉的洗滌來去除內毒素的殘留與真空熱風乾燥並配合塑膠片的擠壓來完成乾燥平整製程。由表3顯示出在水氣穿透率上經過孔隙大小調控之本發明細菌纖維素敷材大大提升了原本的生物纖維敷材的水氣穿透率，也優於國外市售產品Xcell的水氣穿透率。

吸濕倍數：

經過微乳液培養基來調控孔隙大小之本發明細菌纖維素敷材在的吸濕倍數上也高於市售產品的2.26倍，可以達到4倍以上的吸濕倍數，如表4所示。

熱源試驗的結果：

而表5則是顯示有過敏反應之熱源試驗(LAL test)，本發明細菌纖維素敷材可以達到熱源標準(<3 EU/mL)。

對照組：未經過微乳液或微膠囊調控孔隙大小也未經過氫氧化鈉的洗滌

機械拉力及位伸距離的結果：

表6顯示出在保水劑及膠原蛋白的改質下本發明的細菌纖維素的最大機械拉力及拉伸距離均明顯地被提昇。

細菌纖維素經過含微乳液或微膠囊的培養基來控制細菌纖維素的孔隙大小，使得細菌纖維素具有更好的水含量、高倍吸濕倍數、高水氣穿透率，若進一步經過保水劑改質可以具有塑膠材料般的強機械拉力；以上都足以顯示本發明的細菌纖維素能夠當成良好的生物醫療材料。

圖式簡單說明

圖1a,1b,1c及1d分別為以掃描電子顯微鏡(SEM)觀察本發明微乳液細菌纖維素的結果，其中a)及b)分別為微乳液與培養基的體積比例為1:1放大倍數10000及5000的照片；c)及d)分別為微乳液與培養基的體積比例為1:4放大倍數10000及5000的照片。

圖2為未經本發明方法調控孔隙大小之細菌纖維素的SEM照片(放大倍數5000)。

圖3為本發明微膠囊細菌纖維素的SEM照片(放大倍數5000)。

圖4為本發明微乳液細菌纖維素與負控制組(Negative control)(無熱源水)與正控制組(Positive control)(苯酚)於顯微鏡下觀察細胞毐性的結果。

圖5為本發明微乳液細菌纖維素以MTT分析得到的細胞相對百分比存活率，其中1:0.98摺代表0.98 g摺起來的樣品依0.1g/mL的比例添加D-PBS來萃取；2: 60 cm² /5 mL代表60 cm² 的樣品用5 mL的D-PBS萃取；3: 0.98散代主0.98 g打散的樣品依0.1g/mL的比例添加D-PBS來萃取；4: 1.2摺代表1.2 g的樣品依0.1g/mL的比例添加D-PBS來萃取。

Claims

一種製造具有調控的孔隙大小的細菌纖維素的方法，包含下列步驟：a)將具有油相粒子分散於水相中的一水包油微乳液或微膠囊添加於一細菌培養液態媒體，於是該油相粒子或微膠囊漂浮在該細菌培養液態媒體上；及b)在實質上靜止及大氣狀態下該細菌培養液態媒體中的細菌在氣體及液體界面處形成片狀細菌纖維素，其中該片狀細菌纖維素內部分散有該油相粒子或微膠囊。
如申請專利範圍第1項的方法，其進一步包含：c)從該細菌培養液態媒體上取出該片狀細菌纖維素；d)以一鹼性水溶液清洗該片狀細菌纖維素；及e)以水清洗該片狀細菌纖維素直到清洗後的液體呈現中性。
如申請專利範圍第2項的方法，於步驟e)之後其進一步包含：f)藉由溶劑交換將保水劑摻入該片狀細菌纖維素。
如申請專利範圍第2或3項的方法，於步驟e)或f)之後其進一步包含：g)乾燥該片狀細菌纖維素。
如申請專利範圍第3項的方法，於步驟f)之後其進一步包含：f')以UV光照射該摻有保水劑的片狀細菌纖維素；f")將一癒合因子或生長因子添加於該UV照射過的片狀細菌纖維素。
如申請專利範圍第5項的方法，於步驟f")之後進一步包含：g)乾燥該添加有癒合因子或生長因子的片狀細菌纖維素。
如申請專利範圍第1項的方法，其中該細菌為醋酸菌(Gluconacetobacter xylinus )。
如申請專利範圍第2項的方法，其中步驟a)使用該水包油微乳液而未使用微膠囊添加於該細菌培養液體媒體，其中該水包油微乳液含有粒徑為400-700 nm的油相粒子，而該步驟e)得到的片狀細菌纖維素有2-5 μm的孔隙大小。
如申請專利範圍第8項的方法，其中該油相粒子為一植物油，並且選擇性在其內部包埋有一機能性物質。
如申請專利範圍第9項的方法，其中該水包油微乳液係將該植物油及該機能性物質先行振盪混合，再加入一界面活性劑攪拌混合，最後再將所獲得的混合液加入於水中攪拌混合而製備，其中該界面活性劑具有7-16的HLB，及該混合液對水的體積比為1:10-1:100。
如申請專利範圍第9項的方法，其中該水包油微乳液係將該植物油與界面活性劑先行攪拌混合或一起加入於水中攪拌混合而製備，其中其中該界面活性劑具有7-16 HLB，及該混合液對水的體積比為1:10-1:100。
如申請專利範圍第8項的方法，其中步驟d)的該鹼性水溶液為鹼金屬或鹼土金屬氫氧化物或鹽，而步驟e)獲得的片狀細菌纖維素其內部仍然分散有該油相粒子。
如申請專利範圍第2項的方法，其中步驟a)使用該微膠囊而未使用該水包油微乳液添加於該細菌培養液態媒體，其中該微膠囊具有50-500 nm的粒徑，而該步驟e)得到的片狀細菌纖維素有10-25 μm的孔隙大小。
如申請專利範圍第13項的方法，其中該微膠囊為一水溶性高分子與藻酸鈣的摻合物。
如申請專利範圍第14項的方法，其中該微膠囊的製備包含將該水溶性高分子的水溶液與藻酸鈉的水溶液混合；再將該混合液均質；接著將均質化的混合物以一微噴頭噴入氯化鈣水溶液中，而得到漂浮於液面上的該水溶性高分子與藻酸鈣的摻合物的微膠囊。
如申請專利範圍第15項的方法，其中該微膠囊的製備進一步包含將一植物油加入於該混合液中再一起進行均質。
如申請專利範圍第15項的方法，其中水溶性高分子為聚乙烯醇，該聚乙烯醇對藻酸鈉的重量比為20：1至5：1。
如申請專利範圍第17項的方法，其中該聚乙烯醇具有10000-50000的數目平均分子量。
如申請專利範圍第15項的方法，其中步驟d)的該鹼性水溶液為鹼金屬或鹼土金屬氫氧化物或鹽，而且該微膠囊在步驟d)的清洗過程中由該片狀細菌纖維素的內部被洗出。
如申請專利範圍第3項的方法，其中該保水劑為甘油、乙二醇、聚乙烯醇或聚乙二醇(polyethylene glycol)、多元醇、山梨醣醇、甘露醣醇或其等的混合。
如申請專利範圍第20項的方法，其中該保水劑進一步含有NaCl水溶液。
如申請專利範圍第20或21項的方法，其中該保水劑為甘油和乙二醇體積比1:1的混合。
如申請專利範圍第5項的方法，其中該癒合因子為膠原蛋白、玻尿酸、果膠、蘆薈翠取液、海藻酸鹽、甲殼素、金奈米子、銀奈米子、葡聚醣、鈣鹽、或血管收縮素。
如申請專利範圍第23項的方法，其中該癒合因子為膠原蛋白。
一種使用如前述申請專利範圍中任一項所述的方法所製備的片狀細菌纖維素於創傷敷材的製備的用途。