JP5008284B2 - 組織再生用基材 - Google Patents

Description

本発明は、組織再生用基材に関する。具体的には、熱傷、外傷などの急性皮膚欠損創ならびに褥瘡、潰瘍などの慢性皮膚欠損創に皮膚組織を再生させる為の人工真皮基材等に関する。

皮膚の欠損が広範囲にわたる場合、早期に皮膚欠損部を閉鎖する必要がある。欠損した皮膚の再生方法としては、細胞を使わずに鋳型としてのコラーゲンスポンジを生体に移植して生体内で疑似真皮組織を再生させる方法（人工真皮）がある。人工真皮の場合には、真皮様組織が再生した後に薄い分層植皮を行うか培養表皮を移植する必要があるが、できるだけ早く真皮成分を再生させることが必要である。

人工真皮の製造方法としては、コラーゲンスポンジを凍結乾燥する方法が一般的であり、生体内での分解吸収速度を制御する目的で架橋を行うことが多い。

皮膚組織の再生を促進させる方法としては、ある種の成長因子、例えば塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を、皮膚表面に塗布することがあげられる。皮膚から吸収されることにより効果はあるが、その効果を維持するためには毎日塗布する必要がある。そこで、成長因子を徐放させることにより、一度の投与で効果を持続させる方法が試みられている。

例えば河合らは、ｂＦＧＦ含浸ゼラチンマイクロスフェアーを人工真皮に注入することにより、ｂＦＧＦの徐放効果と皮膚組織の生体内での構築が促進されることを明らかにしている（非特許文献１）。また、細胞組込型の培養皮膚を作製するにあたっても、ｂＦＧＦ含浸ゼラチンマイクロスフェアーを添加することにより組織の構築が促進されることが明らかになっている（非特許文献２）。

しかし、この方法だと一度マイクロスフェアーにｂＦＧＦを含浸させる必要があり、さらにそのｂＦＧＦ含浸ゼラチンマイクロスフェアーを臨床の現場で人工真皮に注入する作業が必要となり繁雑である。

そこで、人工真皮自体に成長因子徐放能をもたせることができれば、臨床現場で成長因子を人工真皮に塗布するだけで使用することが可能になり、簡便な方法となりうる。

現在、臨床で最も多く使用されている細胞成長因子は塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）である。ｂＦＧＦは等電点が９．６であり、例えば等電点が５．０のゼラチンと電気的相互作用により吸着する。この特性を利用して、酸性ゼラチン（等電点５．０）でできたマイクロスフェアーにｂＦＧＦを吸着させ、ｂＦＧＦの吸着したマイクロスフェアーを用いることによって生体内でｂＦＧＦを経時的に徐放させることが可能である（特許文献１、非特許文献３）。

しかしながら、この方法では微粒子であるマイクロスフェアーに一端ｂＦＧＦを吸着させた後に、ｂＦＧＦを吸着させたマイクロスフェアーを基材に注入させるなどの手技が必要となり、臨床現場で利用するには煩雑で使いにくい一面があった。

一方、ｂＦＧＦが吸着しやすい酸性ゼラチンで人工真皮材料を作製し、そこにｂＦＧＦを吸着させれば徐放能をもつ基材になると考えられるが、生体内においてゼラチンはコラーゲンと比較すると細胞の侵入などで劣るために、組織の再生には適していない。ｂＦＧＦを適量吸着させることが可能であり、一方で周囲の細胞が侵入しやすい基材が望まれる。

なお、特許文献２には、ゼラチンとコラーゲンとを必須基材構成成分とし、紫外線が照射されて架橋されている医用基材が、細胞培養担体、培養皮膚などに用いられることが記載されている。
特開２００３−３２５６５２号公報 特開平１１−４７２５８号公報 K.Kawaiら、Biomaterials, Vol.21, p.489-499 (2000) 佐生ら、日本熱傷学会誌、第２９巻、p.24-30 Y.Tabataら、J. Controlled Release, Vol.31, p.189-199 (1994)

本発明は、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）等の細胞成長因子の徐放能を有し、かつ、細胞が侵入しやすく組織の再生に適した組織再生用基材を提供することを目的とする。

本発明者は、上記の課題を解決するため鋭意研究を行った結果、コラーゲンとゼラチンとを含む生体吸収性多孔質基材にｂＦＧＦを含有させて得られる基材が、ｂＦＧＦの良好な徐放性を有しかつ細胞が侵入しやすく、皮膚組織を再生させるための組織再生用基材として好適であることを見出した。この知見に基づき、さらに研究を重ねて本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、以下の組織再生用基材及びその製造方法を提供する。

項１．コラーゲン及びゼラチンを含む生体吸収性多孔質基材に細胞成長因子を含有してなる組織再生用基材。

項２．生体吸収性多孔質基材のゼラチンの含有量が１〜７０重量％である項１に記載の組織再生用基材。

項３．細胞成長因子が塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）である項１又は２に記載の組織再生用基材。

項４．３７℃のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に３日間浸漬させた後の該ＰＢＳ中への細胞成長因子の放出量が組織再生用基材中に含侵させた初期の細胞成長因子の総量に対し７重量％以下である項１〜３のいずれかに記載の組織再生用基材。

項５．３７℃のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に７日間浸漬させた後の該ＰＢＳ中への細胞成長因子の放出量が組織再生用基材中に含侵させた初期の細胞成長因子の総量に対し１５重量％以下である項１〜４のいずれかに記載の組織再生用基材。

項６．平均孔径１０〜５００μｍの連続孔を有する項１〜５のいずれかに記載の組織再生用基材。

項７．生体内で３週間以内に分解吸収される項１〜６のいずれかに記載の組織再生用基材。

項８．コラーゲン及びゼラチンを含む水性混合物を凍結乾燥する工程、得られる乾燥体を架橋処理する工程、及び得られる架橋体に細胞成長因子を含有させる工程を含む組織再生用基材の製造方法。

以下、本発明を詳述する。
Ｉ．組織再生用基材
本発明の組織再生用基材は、コラーゲン及びゼラチンを含む生体吸収性の多孔質基材に細胞成長因子を含有してなる。本発明の組織再生用基材とは、広く再生医療に用いられる基材を意味し、例えば、皮膚、骨、軟骨、心筋、脂肪などの再生医療に用いられる基材である。特に、皮膚（真皮）の組織再生用基材、つまり人工真皮基材として好適に用いられる。

本発明の組織再生用基材に使用される生体吸収性多孔質基材は、コラーゲン及びゼラチンを必須成分として含有する。

上記ゼラチンとしては特に限定はなく、例えば、牛、豚、鶏、鮭等の骨、腱、皮等に由来するものを用いることができる。上記ゼラチンは、酸処理又はアルカリ処理されていることが好ましい。酸処理されたゼラチンは正電荷に、アルカリ処理されたゼラチンは負電荷に帯電することから、この電荷を利用すれば、正あるいは負の電荷を有するゼラチンを含む生体吸収性多孔質基材に、静電結合により各種の細胞成長因子を変性させることなく結合させることが可能となる。そのため、細胞成長因子（例えば、ｂＦＧＦ）の良好な徐放が可能になる。

上記コラーゲンとしては特に限定はなく、牛、豚等の皮膚や腱等に由来するものを用いることができる。抗原性を排除してより安全性を高める観点から、コラーゲンをプロテアーゼやペプシン等の酵素で処理して、テロペプチドをできる限り除去したアテロコラーゲンが好ましい。アテロコラーゲンには、Ｉ〜ＩＶ型があるが、基材の用途に応じて選択することができる。培養皮膚や創傷被覆材として用いる場合、真皮の構成成分に近い、Ｉ又はIII型を用いることが好ましい。生体吸収性多孔質基材にコラーゲンを含有させることにより、該基材への細胞の侵入が容易となる。

生体吸収性多孔質基材に含まれるゼラチンの含有量は、１〜７０重量％程度、好ましくは２０〜６０重量％程度、より好ましくは３０〜５０重量％程度である。ゼラチンの含有量が多くなりすぎると、生体吸収性多孔質基材に周囲の組織が入りにくくなり、一方、ゼラチンの含有量が少なすぎると、ゼラチンと細胞成長因子が静電的相互作用による吸着が弱くなり徐放性能が低下する。従って、上記した含有量の範囲であると、ゼラチン及びコラーゲンの効果が有効に発揮され高い治療効果を得ることができる。

生体吸収性多孔質基材は、三次元的に組織を再生する基材となるため、多孔質構造を有していることが好ましい。特に、多数の連続孔（連続した微細小孔）を有していることが好ましい。かかる構造であることにより、本発明の組織再生用基材に細胞を播種したときには、細胞が微細小孔内に浸入して接着し三次元的に伸展することが可能となり、また、細胞を播種することなく移植した場合にも、周辺の細胞が容易に侵入することができる。更に、接着した細胞へ充分な栄養を供給することが可能となり、細胞を正常に増殖及び分化させることができる。

生体吸収性多孔質基材の微細小孔の平均孔径としては、再生しようとする組織又は器官により最適な値を選択することができるが、好ましくは１０〜５００μｍ程度、より好ましくは５０〜３００μｍ程度である。１０μｍ未満であると、生体吸収性多孔質基材の内部に細胞が侵入できず細胞接着性が極端に劣ったり、接着した細胞が三次元的に伸展できなかったりすることがあり、５００μｍを超えると、細胞の密度が低くなり組織又は器官を再生できないことがある。

本発明の組織再生用基材は、上記の生体吸収性多孔質基材の多孔質構造がそのまま反映される。

本発明の組織再生用基材は、コラーゲン及びゼラチンを含む生体吸収性多孔質基材に、細胞成長因子を含有してなる。細胞成長因子としては血管新生を促進し、細胞の活性を高めるものであれば特に限定されず、例えば血管新生作用をもつような細胞成長因子、具体的には塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血漿版由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、アンジオポエチン、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）が挙げられる。本発明の特に好ましい実施形態としては、ｂＦＧＦである。

本発明の組織再生用基材における細胞成長因子の含有量は、その再生する対象組織等に応じて適宜選択することができ特に限定はない。好ましくは、１ｃｍ^２に対して0.1μｇ〜100μg程度、好ましくは1μg〜50μg程度含有していればよい。

本発明の組織再生用基材は、長時間に渡り細胞成長因子を安定して徐放できるという優れた徐放性能を有している。例えば、ｂＦＧＦは血管新生を促進し細胞の活性を高める作用を有するが、生体内で不安定な物質でありかつ水溶液状態で使用しても期待される生物効果はほとんど認められない。しかし、上記の生体吸収性多孔質基材に所定量のｂＦＧＦを含浸させることにより、ｂＦＧＦを徐放させてｂＦＧＦの作用を安定的に持続させることができる。

本発明の組織再生用基材は、例えば、３７℃のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に３日間浸漬させた後の該ＰＢＳ中への細胞成長因子の放出量が、組織再生用基材中に含侵させた初期の細胞成長因子の総量に対し７重量％以下（好ましくは６重量％以下）という特徴がある。また、３７℃のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に７日間浸漬させた後の該ＰＢＳ中への細胞成長因子の放出量が、該基材中に含侵させた初期の細胞成長因子の総量に対し１５重量％以下（好ましくは１３重量％以下）という特徴がある。特に、細胞成長因子がｂＦＧＦの場合に上記の徐放性能が再現性よく発揮される。

さらに、本発明の組織再生用基材は、コラーゲン及びゼラチンを含む生体吸収性基材からなるため、生体内で３週間以内に分解吸収される。

組織再生用基材の含水率の好ましい下限は９０％、好ましい上限は９９．８％である。生体吸収性多孔質基材の含水率は、該生多孔質基材の架橋度に対応しており、架橋度が高いほど含水率は低くなる。含水率が９０％未満であると、得られる組織再生用基材が移植に適する柔軟性を有しないことがあり、９９．８％を超えると、得られる組織再生用基材が培養液やバッファー中で強度を保つことができないことがある。より好ましい下限は９５％、より好ましい上限は９８％である。なお、含水率は以下の計算式による。

含水率（％）＝［（Ｗｓ−Ｗｄ）／Ｗｓ］×１００（％）
式中、Ｗｓは、組織再生用基材を２５℃においてリン酸緩衝生理食塩水中に１時間浸漬したときの重量（湿潤重量）を表し、Ｗｄは、癒着防止材を真空乾燥機を用いて完全に乾燥したときの重量（乾燥重量）を表す。
II．組織再生用基材の製法
本発明の組織再生用基材は、コラーゲン及びゼラチンを含む水性混合物を凍結乾燥する工程、得られる乾燥体を架橋処理する工程、及び得られる架橋体に細胞成長因子を含有させる工程を含む製造方法により製造される。

まず、上記のゼラチン及びコラーゲンを混合して水溶液とし、これを適当な型枠の中に流延し、−４０〜−８０℃で３０分〜２時間程度凍結する。この凍結物を凍結乾燥することによりスポンジ状の生体吸収性多孔質基材を作製する。

次に、得られた凍結乾燥物を架橋処理して生体吸収性多孔質基材を作製する。凍結乾燥物の架橋の方法としては特に限定されず、例えば、熱架橋法、γ線照射法、紫外線照射法、電子線照射法、Ｘ線照射法、架橋剤を用いる化学架橋法等が挙げられる。そのうち、基材の全体が均一の架橋度となるように架橋できることから架橋剤を用いる化学架橋法が好適である。

化学架橋法として、例えば、グルタルアルデヒド等の架橋剤を含む水溶液に、凍結乾燥物を浸漬し化学架橋を行うことができる。水洗にて余剰のグルタルアルデヒドを除去し、必要に応じ再度凍結乾燥することにより架橋された生体吸収性多孔質基材を得る。

次に、得られる架橋された基材に細胞成長因子を含有させるが、その方法としては特に限定はなく、例えば、細胞成長因子を含有する水溶液を該架橋体に滴下する、細胞成長因子を含有する水溶液を該架橋体に含浸させるなどが例示される。その後、さらに、必要に応じて乾燥工程を設けてもよい。

本発明の組織再生用基材（特に、人工真皮基材）は、細胞成長因子を安定的に徐放することができ、かつ、細胞が侵入しやすいため、創傷治癒が促進され、治癒期間の大幅な短縮を図ることができる。

以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限られるものではない。
［実施例１］
（１）コラーゲンとゼラチンの混合スポンジの作製
豚腱由来タイプIコラーゲンと豚皮膚由来ゼラチンとを混合して水溶液とした。水溶液を型枠に入れて−４０℃で１時間凍結し、その後凍結乾燥することによりスポンジを作製した。

このスポンジを真空下１１０℃で処理することにより熱架橋を行った。さらに、熱架橋後、０．２％グルタルアルデヒド、０．０５Ｎ酢酸水溶液に浸漬し化学架橋を行った。水洗にて余剰のグルタルアルデヒドを除去し、再度凍結乾燥することにより架橋コラーゲン−ゼラチンスポンジを得た。この架橋スポンジを次のin vitro徐放試験に用いた。
（２）in vitro徐放試験
実験に使用したスポンジは、ゼラチン含量が０、１０、３０、５０重量％のものを用いた。

１２ｍｍΦ厚さ３ｍｍのスポンジに、ｂＦＧＦが４０μｇ含浸するようｂＦＧＦ水溶液１００μｌをスポンジに滴下した。

徐放試験は３７℃のＰＢＳ中にスポンジを浸漬させ、１，３，５，７，９日後にＰＢＳ中に放出されたｂＦＧＦを、ＥＬＩＳＡ法により定量して行った。

含浸させたｂＦＧＦを１００とした時のｂＦＧＦ放出量を表１及び図１示す。

（３）埋植試験
ゼラチン含量０、１０、３０、５０、１００重量％のスポンジを、モルモット背部全層皮膚欠損層に埋植したときの組織切片像を図２〜６に示す。ゼラチン１００重量％のスポンジでは、周囲組織の細胞の侵入が少なく、またスポンジの下に細胞が潜り込むダウングロースの像が観察された。一方で、コラーゲン含量が高くなるにつれて、細胞の侵入が多く、組織の再生も良好であったが、コラーゲン１００重量％の場合、細胞成長因子の徐放性能が低下するため、周囲組織の侵入を妨げることなく、かつ細胞成長因子の徐放機能を発揮させるためには、ゼラチンを最適な混合割合で混合させることが必要となる。

実施例１におけるin vitroにおけるｂＦＧＦの徐放試験の結果を示すグラフである。 実施例１におけるスポンジのゼラチン含量を0重量％とした場合の組織切片像である。 実施例１におけるスポンジのゼラチン含量を10重量％とした場合の組織切片像である。 実施例１におけるスポンジのゼラチン含量を30重量％とした場合の組織切片像である。 実施例１におけるスポンジのゼラチン含量を50重量％とした場合の組織切片像である。 実施例１におけるスポンジのゼラチン含量を100重量％とした場合の組織切片像である。

Claims (5)

1. コラーゲン及びゼラチンを含む生体吸収性多孔質基材に塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含有してなる組織再生用基材であって、該生体吸収性多孔質基材のゼラチンの含有量が１０重量％であり、該生体吸収性多孔質基材がコラーゲン及びゼラチンを含む水性混合物を凍結乾燥して得られたものであり、該生体吸収性多孔質基材が化学架橋されており、該生体吸収性多孔質基材が平均孔径１０〜５００μｍの連続孔を有する組織再生用基材。
2. ３７℃のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に３日間浸漬させた後の該ＰＢＳ中への細胞成長因子の放出量が組織再生用基材中に含侵させた初期の細胞成長因子の総量に対し７重量％以下である請求項１に記載の組織再生用基材。
3. ３７℃のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に７日間浸漬させた後の該ＰＢＳ中への細胞成長因子の放出量が組織再生用基材中に含侵させた初期の細胞成長因子の総量に対し１５重量％以下である請求項１又は２に記載の組織再生用基材。
4. 皮膚の組織再生用である請求項１〜３のいずれかに記載の組織再生用基材。
5. 組織再生用基材の製造方法であって、（１）コラーゲン及びゼラチンを含む水性混合物を凍結乾燥して、ゼラチンの含有量が１０重量％であり、平均孔径１０〜５００μｍの連続孔を有する生体吸収性多孔質基材を製造する工程、（２）得られる生体吸収性多孔質基材を化学架橋処理する工程、及び（３）得られる架橋体に塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含有させる工程を含む製造方法。

Images