CN1252251C - 皮肤干细胞胶原海绵膜人工活性皮肤的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种皮肤干细胞胶原海绵膜人工活性皮肤的制备方法，它是用包皮分离纯化的皮肤干细胞种植在自制胶原海绵膜上下两面，体外诱导上面的皮肤干细胞分化表皮各层，下面的皮肤干细胞分化为真皮组织，形成具有皮肤和真皮组织结构的活性人工复合皮肤，经Balb/C裸鼠动物实验证明可以促进创面表皮生长及组织修复，是一种接近人类皮肤组织学和功能特性的“表-真皮复合皮肤”类型的组织工程化皮肤，它具有采用人类皮肤干细胞作为种子细胞来制造人工活性皮肤从而用于修复、维持和改善皮肤组织功能，制备方法简单、成本低廉的优点，因此本发明的皮肤干细胞胶原海绵膜人工活性皮肤是一种较佳的人工皮肤替代物。

Description

皮肤干细胞胶原海绵膜人工活性皮肤的制备方法

技术领域

本发明涉及人造皮肤，尤其是涉及一种皮肤干细胞胶原海绵膜人工活性皮肤的制备方法。

背景技术

组织工程化人工皮肤是最先进入商业性应用开发的较为成熟的组织工程产品。目前，其代表产品有Biobrane^TM、Integra^TM、Dermagraft^TM和Apligraft^TM等，它们在烧伤、慢性静脉溃疡及先天性皮肤畸形等疾病的治疗中发挥了一定的效果。但是，迄今为止，尚无一种产品是用人类皮肤干细胞作为种子细胞来构建的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用人类皮肤干细胞作为种子细胞来制造人工活性皮肤从而用于修复、维持和改善皮肤组织功能、制备方法简单、成本低廉的皮肤干细胞胶原海绵膜人工活性皮肤的制备方法。

本发明的目的是这样实现的：其制备方法为：

1、皮肤干细胞的分离、纯化和培养：

1.1、表皮细胞的体外分离：将无菌条件下经环切术后的儿童包皮用0.05％醋酸洗必泰浸泡消毒10分钟后，生理盐水冲洗，剔除皮下组织，剪成2mm×2mm大小，置于37℃温度下1∶1浓度的0.25％胰蛋白酶/乙二胺四乙酸液中30分钟至1小时；或置于4℃下的0.25％离散酶II中24小时消化，分离表皮和真皮；将表皮置200目网筛上研磨，收集过滤后的细胞；

1.2、纯化：富集皮肤干细胞，用50μg/ml的胶原IV溶液铺培养皿底部，待干，将收获之表皮细胞以1×10⁵/cm²密度种植于胶原IV之上，在37℃温度下、10分钟后吸去未黏附细胞，收集黏附于培养皿底部的细胞；

1.3、皮肤干细胞的培养与传代：用50μg/ml的胶原IV溶液预铺培养皿底部，将经快速黏附10分钟、黏附于培养皿底部的细胞种植于胶原IV，加入含10％螯合钙离子的干细胞专用血清、表皮生长因子10μg/L、CaCl₂0.05mmol/L、氢化可的松10^-6mol/L，在37℃温度、5％CO₂、饱和湿度下培养，每隔5天换液半量；待细胞70-80％融合时，用0.25％胰蛋白酶/0.02％乙二胺四乙酸液消化传代；

1.4、皮肤干细胞的鉴定：胶原IV黏附前皮肤干细胞的比例为整合素α₆ ^briCD₇₁ ^dim细胞2.21％±0.11％和细胞角蛋白19阳性细胞6.21％±0.52％；而胶原IV黏附后分别为48.15％±4.01％和52.15％±4.41％；证明胶原IV快速黏附可富集皮肤干细胞；

2、胶原海绵膜的制备：

2.1、胶原的制备：Spraque-Dawley(SD)大鼠鼠尾用75％的酒精浸泡后切成1.5cm小段，剔除皮毛，抽出尾腱；取1.5g剪碎之尾腱浸入150ml、0.05mol/L乙酸中，高温振荡培养箱中振荡，48小时后移入离心管中，4000转/分离心30分钟，吸取上清液，按100ml上清液加5gNaCl的比例加入NaCl晶体，1000转/分离心10分钟，弃上清，所得沉淀即为胶原，冷冻干燥后称重，4℃冰箱备用；

2.2、胶原海绵膜的制备：将提取的胶原重溶于0.05mol/L乙酸中，得0.25％胶原溶液，将6-硫酸软骨素C溶液滴加于胶原溶液中，搅拌混匀，使终溶度为8％，倾于培养皿中，厚2-3mm，置-30℃冰箱内预冻4小时以上，真空冷冻干燥36小时；先室温下复温，然后逐步加热至105℃，恒温24小时即成为胶原海绵膜；

2.3、交联型胶原海绵膜的制备：将胶原海绵膜浸入0.2％戊二醛溶液10分钟，过滤自来水漂洗2小时，换双蒸馏水置4℃冰箱24小时，去除未结合的残余戊二醛，制得交联型胶原海绵膜，贮存于75％乙醇中备用；

2.4、胶原海绵膜的检测：

物理性状：微黄有弹性，吸水性强；

扫描电镜：胶原纤维相互连接成多孔网状结构，网孔大小一致，约50-100μm，孔隙率84.9±2.4％；

2.5、胶原海绵膜Balb/c裸鼠皮下埋置实验：

大体观察：埋入后3天即与创基黏附较紧密，不易揭起，第7天渐转红色，5-6周降解；

组织学观察：埋入第1周在海绵膜间隙内有了细胞生长，第3周有血管生成，生长的细胞增多，第5、6周海绵膜基本降解；

3、胶原海绵膜活性真皮的制备：将交联型胶原海绵膜置于培养皿中，用伊氏科夫刀比科氏培养基浸泡48小时，将皮肤干细胞诱导传代培养第三代的人成纤维细胞以1×10⁵/cm²密度种植于胶原海绵膜上，加10％小牛血清，在37℃、5％CO₂、饱和湿度下培养，隔天换液；倒置显微镜下观察，种植后可见胶原海绵膜周边及网孔中成纤维细胞贴壁，14天可见网孔内被成纤维细胞及其分泌的基质填充；

4、皮肤干细胞胶原海绵膜人工活性皮肤的制备：将70％融合后的第二代皮肤干细胞接种在已接种成纤维细胞的基质网另一面，接种密度为3×10⁵/cm²；培养体系为：无钙低糖刀比科氏培养基，添加10％螯合钙的干细胞专用小牛血清，表皮生长因子10μg/L、CaCl₂ 0.05mmol/L、氢化可的松10^-6mol/L；1周后转移到不锈纲网架上行气-液界面培养，继续培养12天左右；倒置显微镜形态学观察皮肤干细胞增多并分化，免疫组化检查细胞角蛋白阳性，透射电镜观察表皮含3-5层细胞，形成基底层、棘层、颗粒层和角化层，即制得皮肤干细胞胶原海绵膜人工活性皮肤；

5、复合皮修复裸鼠创面：用氯胺酮加安定麻醉后，于背部尾侧正中作1.5cm×1.5cm的全层皮肤缺损创面，移植含人皮肤干细胞和人成纤维细胞的复合皮肤替代物；术后3天去除包扎敷料，皮肤与创面贴合较紧，成活，第3周创面已愈合，愈合后皮肤光滑，韧性及质地均较对照组好，第4、5周创面仅有轻微收缩；组织学观察第1周复合皮已成活，表皮细胞3-4层；第2周上皮完全上皮化，新生上皮4-6层，有基底层、棘层、颗粒层形成，角质层较薄；第4周新生上皮6-9层，第5周移植的皮肤形态结构与正常皮肤相似；电镜观察第1周发现桥粒及半桥粒，第2周基底膜清晰连续，第3周表皮出现6-7层细胞，核仁较多，出现有脂肪滴的细胞；免疫荧光检查人类白细胞抗原I阳性，表明新生皮为人源细胞。

本发明是用包皮分离纯化的皮肤干细胞种植在自制胶原海绵膜上下两面，体外诱导上面的皮肤干细胞分化表皮各层，下面的皮肤干细胞分化为真皮组织，形成具有皮肤和真皮组织结构的活性人工复合皮肤，经Balb/C裸鼠动物实验证明可以促进创面表皮生长及组织修复，是一种接近人类皮肤组织学和功能特性的“表一真皮复合皮肤”类型的组织工程化皮肤，它具有采用人类皮肤干细胞作为种子细胞来制造人工活性皮肤从而用于修复、维持和改善皮肤组织功能、制备方法简单、成本低廉的优点，因此本发明的皮肤干细胞胶原海绵膜人工活性皮肤是一种较佳的人工皮肤替代物。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。

1、皮肤干细胞的分离、纯化和培养：

1.1、表皮细胞的体外分离：将无菌条件下经环切术后的儿童包皮用0.05％醋酸洗必泰浸泡消毒10分钟后，生理盐水冲洗，剔除皮下组织，剪成2mm×2mm大小，置于37℃温度下1∶1浓度的0.25％胰蛋白酶/乙二胺四乙酸液中30分钟至1小时；或置于4℃下的0.25％离散酶II中24小时消化，分离表皮和真皮；将表皮置200目网筛上研磨，收集过滤后的细胞；

1.2、纯化：富集皮肤干细胞，用50μg/ml的胶原IV溶液铺培养皿底部，待干，将收获之表皮细胞以1×10⁵/cm²密度种植于胶原IV之上，在37℃温度下、10分钟后吸去未黏附细胞，收集黏附于培养皿底部的细胞；

1.3、皮肤干细胞的培养与传代：用50μg/ml的胶原IV溶液预铺培养皿底部，将经快速黏附10分钟、黏附于培养皿底部的细胞种植于胶原IV，加入含10％螯合钙离子的干细胞专用血清、表皮生长因子10μg/L、CaCl₂0.05mmol/L、氢化可的松10^-6mol/L，在37℃温度、5％CO₂、饱和湿度下培养，每隔5天换液半量；待细胞70-80％融合时，用0.25％胰蛋白酶/0.02％乙二胺四乙酸液消化传代；

1.4、皮肤干细胞的鉴定：胶原IV黏附前皮肤干细胞的比例为整合素α₆ ^briCD₇₁ ^dim细胞2.21％±0.11％和细胞角蛋白19阳性细胞6.21％±0.52％；而胶原IV黏附后分别为48.15％±4.01％和52.15％±4.41％；证明胶原IV快速黏附可富集皮肤干细胞；

2、胶原海绵膜的制备：

2.1、胶原的制备：SD大鼠鼠尾用75％的酒精浸泡后切成1.5cm小段，剔除皮毛，抽出尾腱；取1.5g剪碎之尾腱浸入150ml、0.05mol/L乙酸中，高温振荡培养箱中振荡，48小时后移入离心管中，4000转/分离心30分钟，吸取上清液，按100ml上清液加5gNaCl的比例加入NaCl晶体，1000转/分离心10分钟，弃上清，所得沉淀即为胶原，冷冻干燥后称重，4℃冰箱备用；

2.2、胶原海绵膜的制备：将提取的胶原重溶于0.05mol/L乙酸中，得0.25％胶原溶液，将6-硫酸软骨素C溶液滴加于胶原溶液中，搅拌混匀，使终溶度为8％，倾于培养皿中，厚2-3mm，置-30℃冰箱内预冻4小时以上，真空冷冻干燥36小时；先室温下复温，然后逐步加热至105℃，恒温24小时即成为胶原海绵膜；

2.3、交联型胶原海绵膜的制备：将胶原海绵膜浸入0.2％戊二醛溶液10分钟，过滤自来水漂洗2小时，换双蒸馏水置4℃冰箱24小时，去除未结合的残余戊二醛，制得交联型胶原海绵膜，贮存于75％乙醇中备用；

2.4、胶原海绵膜的检测：

物理性状：微黄有弹性，吸水性强；

扫描电镜：胶原纤维相互连接成多孔网状结构，网孔大小一致，约50-100μm，孔隙率84.9±2.4％；

2.5、胶原海绵膜Balb/c裸鼠皮下埋置实验：

大体观察：埋入后3天即与创基黏附较紧密，不易揭起，第7天渐转红色，5-6周降解；

组织学观察：埋入第1周在海绵膜间隙内有了细胞生长，第3周有血管生成，生长的细胞增多，第5、6周海绵膜基本降解；

3、胶原海绵膜活性真皮的制备：将交联型胶原海绵膜置于培养皿中，用伊氏科夫刀比科氏培养基浸泡48小时，将皮肤干细胞诱导传代培养第三代的人成纤维细胞以1×10⁵/cm²密度种植于胶原海绵膜上，加10％小牛血清，在37℃、5％CO₂、饱和湿度下培养，隔天换液；倒置显微镜下观察，种植后可见胶原海绵膜周边及网孔中成纤维细胞贴壁，14天可见网孔内被成纤维细胞及其分泌的基质填充；

4、皮肤干细胞胶原海绵膜人工活性皮肤的制备：将70％融合后的第二代皮肤干细胞接种在已接种成纤维细胞的基质网另一面，接种密度为3×10⁵/cm²；培养体系为：无钙低糖刀比科氏培养基，添加10％螯合钙的干细胞专用小牛血清，表皮生长因子10μg/L、CaCl₂ 0.05mmol/L、氢化可的松10^{- 6}mol/L；1周后转移到不锈钢网架上行气-液界面培养，继续培养12天左右；倒置显微镜形态学观察皮肤干细胞增多并分化，免疫组化检查细胞角蛋白阳性，透射电镜观察表皮含3-5层细胞，形成基底层、棘层、颗粒层和角化层，即制得皮肤干细胞胶原海绵膜人工活性皮肤；

5、复合皮修复裸鼠创面：用氯胺酮加安定麻醉后，于背部尾侧正中作1.5cm×1.5cm的全层皮肤缺损创面，移植含人皮肤干细胞和人成纤维细胞的复合皮肤替代物；术后3天去除包扎敷料，皮肤与创面贴合较紧，成活，第3周创面已愈合，愈合后皮肤光滑，韧性及质地均较对照组好，第4、5周创面仅有轻微收缩；组织学观察第1周复合皮已成活，表皮细胞3-4层；第2周上皮完全上皮化，新生上皮4-6层，有基底层、棘层、颗粒层形成，角质层较薄；第4周新生上皮6-9层，第5周移植的皮肤形态结构与正常皮肤相似；电镜观察第1周发现桥粒及半桥粒，第2周基底膜清晰连续，第3周表皮出现6-7层细胞，核仁较多，出现有脂肪滴的细胞；免疫荧光检查人类白细胞抗原I阳性，表明新生皮为人源细胞。

Claims (1)

1、一种皮肤干细胞胶原海绵膜人工活性皮肤的制备方法，其特征在于：

(1)、皮肤干细胞的分离、纯化和培养：

1.1、表皮细胞的体外分离：将无菌条件下经环切术后的儿童包皮用0.05％醋酸洗必泰浸泡消毒10分钟后，生理盐水冲洗，剔除皮下组织，剪成2mm×2mm大小，置于37℃温度下1∶1浓度的0.25％胰蛋白酶/乙二胺四乙酸液中30分钟至1小时；或置于4℃下的0.25％离散酶II中24小时消化，分离表皮和真皮；将表皮置200目网筛上研磨，收集过滤后的细胞；

1.2、纯化：富集皮肤干细胞，用50μg/ml的胶原IV溶液铺培养皿底部，待干，将收获之表皮细胞以1×10⁵/cm²密度种植于胶原IV之上，在37℃温度下、10分钟后吸去未黏附细胞，收集黏附于培养皿底部的细胞；

1.3、皮肤干细胞的培养与传代：用50μg/ml的胶原IV溶液预铺培养皿底部，将经快速黏附10分钟、黏附于培养皿底部的细胞种植于胶原IV，加入含10％螯合钙离子的干细胞专用血清、表皮生长因子10μg/L、CaCl₂0.05mmol/L、氢化可的松10^-6mol/L，在37℃温度、5％CO₂、饱和湿度下培养，每隔5天换液半量；待细胞70-80％融合时，用0.25％胰蛋白酶/0.02％乙二胺四乙酸液消化传代；

1.4、皮肤干细胞的鉴定：胶原IV黏附前皮肤干细胞的比例为整合素α₆ ^briCD₇₁ ^dim细胞2.21％±0.11％和细胞角蛋白19阳性细胞6.21％±0.52％；而胶原IV黏附后分别为48.15％±4.01％和52.15％±4.41％；证明胶原IV快速黏附可富集皮肤干细胞；

(2)、胶原海绵膜的制备：

2.1、胶原的制备：SD大鼠鼠尾用75％的酒精浸泡后切成1.5cm小段，剔除皮毛，抽出尾腱；取1.5g剪碎之尾腱浸入150ml、0.05mol/L乙酸中，高温振荡培养箱中振荡，48小时后移入离心管中，4000转/分离心30分钟，吸取上清液，按100ml上清液加5gNaCl的比例加入NaCl晶体，1000转/分离心10分钟，弃上清，所得沉淀即为胶原，冷冻干燥后称重，4℃冰箱备用；

2.2、胶原海绵膜的制备：将提取的胶原重溶于0.05mol/L乙酸中，得0.25％胶原溶液，将6-硫酸软骨素C溶液滴加于胶原溶液中，搅拌混匀，使终溶度为8％，倾于培养皿中，厚2-3mm，置-30℃冰箱内预冻4小时以上，真空冷冻干燥36小时；先室温下复温，然后逐步加热至105℃，恒温24小时即成为胶原海绵膜；

2.3、交联型胶原海绵膜的制备：将胶原海绵膜浸入0.2％戊二醛溶液10分钟，过滤自来水漂洗2小时，换双蒸馏水置4℃冰箱24小时，去除未结合的残余戊二醛，制得交联型胶原海绵膜，贮存于75％乙醇中备用；

1.4、胶原海绵膜的检测：

物理性状：微黄有弹性，吸水性强；

扫描电镜：胶原纤维相互连接成多孔网状结构，网孔大小一致，约50-100μm，孔隙率84.9±2.4％；

1.5、胶原海绵膜Balb/c裸鼠皮下埋置实验：

大体观察：埋入后3天即与创基黏附较紧密，不易揭起，第7天渐转红色，5-6周降解；

组织学观察：埋入第1周在海绵膜间隙内有了细胞生长，第3周有血管生成，生长的细胞增多，第5、6周海绵膜基本降解；

(3)、胶原海绵膜活性真皮的制备：将交联型胶原海绵膜置于培养皿中，用伊氏科夫刀比科氏培养基浸泡48小时，将传代培养第三代的人皮肤成纤维细胞以1×10⁵/cm²密度种植于胶原海绵膜上，加10％小牛血清，在37℃、5％CO₂饱和湿度下培养，隔天换液；倒置显微镜下观察，种植后可见胶原海绵膜周边及网孔中成纤维细胞贴壁，14天可见网孔内被成纤维细胞及其分泌的基质填充；

(4)、皮肤干细胞胶原海绵膜人工活性皮肤的制备：将70％融合后的第二代皮肤干细胞接种在已接种成纤维细胞的基质网另一面，接种密度为3×10⁵/cm²；培养体系为：无钙低糖刀比科氏培养基，添加10％螯合钙的干细胞专用小牛血清，表皮生长因子10μg/L、CaCl₂ 0.05mmol/L、氢化可的松10^-6mol/L；1周后转移到不锈钢网架上行气-液界面培养，继续培养12天左右；倒置显微镜形态学观察皮肤干细胞增多并分化，免疫组化检查细胞角蛋白阳性，透射电镜观察表皮含3-5层细胞，形成基底层、棘层、颗粒层和角化层，即制得皮肤干细胞胶原海绵膜人工活性皮肤；

(5)、复合皮修复裸鼠创面：用氯胺酮加安定麻醉后，于背部尾侧正中作1.5cm×1.5cm的全层皮肤缺损创面，移植含人皮肤干细胞和人成纤维细胞的复合皮肤替代物；术后3天去除包扎敷料，复合皮与创面贴合较紧，第3周创面已愈合，愈合后皮肤光滑，韧性及质地均较对照组好，第4、5周创面仅有轻微收缩；组织学观察第1周复合皮已成活，表皮细胞3-4层；第2周上皮完全上皮化，新生上皮4-6层，有基底层、棘层、颗粒层形成，角质层较薄；第4周新生上皮6-9层，第5周移植的皮肤形态结构与正常皮肤相似；电镜观察第1周发现桥粒及半桥粒，第2周基底膜清晰连续，第3周表皮出现6-7层细胞，核仁较多，出现有脂肪滴的细胞；免疫荧光检查人类白细胞抗原I阳性，表明新生皮为人源细胞。