CN107233610B - 一种丝胶蛋白创伤敷料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种丝胶蛋白创伤敷料及其制备方法和应用，采用丝素缺失突变型家蚕品种结合家蚕育种技术通过改变家蚕的吐丝生理习性获得可用于创伤修复的丝胶蛋白创伤敷料，该创伤敷料具有丝胶蛋白的天然结构和活性，保持了丝胶蛋白的“原生态”特性；本发明所述的丝胶蛋白创伤敷料具有多孔结构，透气性好；具有很好的机械强度，便于手术缝合；具有高生物相容性；能有效促进皮肤创伤愈合，可作为皮肤组织创伤修复；所述丝胶蛋白创伤敷料具有良好的生物相容性和细胞粘附性，可长期支持细胞的存活、增殖与迁移；该敷料也是一种三维多孔的丝胶蛋白生物支架，可用于细胞外基质支持细胞生长和促进营养物质交换，可应用于多种组织损伤的修复和疾病的治疗。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，涉及一种丝胶蛋白，具体为一种丝胶蛋白创伤敷料及其制备方法和应用。
背景技术
丝胶蛋白是由家蚕分泌的一种天然动物蛋白，含有18种氨基酸，不仅具有可降解、抗菌、抗癌、抗氧化、抗凝血、亲水、保湿、无免疫原性以及促进细胞粘附和增殖等生物活性，而且富有氨基、羟基、羧基等利于修饰或改造的活性基团，如今丝胶蛋白已成为一种备受关注的新型组织工程材料。
近年来，人们基于丝胶开发了不同类型的组织工程材料，如水凝胶，丝胶蛋白膜，丝胶海绵样材料，丝胶纳米纤维和纳米粒等。然而到目前为止，基于丝胶蛋白材料的研发，所用的丝胶蛋白均是经过分离纯化和后续一系列的理化处理加工而成，在这些过程中，均难以避免地造成丝胶蛋白天然结构的破坏(分子量和天然构象)和天然生物活性的改变。同时目前有关丝胶蛋白创伤敷料的制备工艺也较为复杂，成本较高且机械性能不佳。因此，如何开发具有天然结构和活性的丝胶蛋白新型材料无疑具有十分重要的意义。
发明内容
解决的技术问题：为了克服现有技术的缺陷，本发明通过调控家蚕的吐丝平台，改变家蚕吐丝习性，从而选育适用于生产天然丝胶蛋白创伤敷料的家蚕品种同时直接生产可用于创伤修复的丝胶蛋白创伤敷料；此外，本发明提供了由上述方法制得的丝胶蛋白创伤敷料，以及该敷料在生物医用材料等领域中的应用。
技术方案：一种丝胶蛋白创伤敷料的制备方法，包含以下步骤：
(1)构建家蚕吐丝平台，选用平整的台基，首先在台基上覆盖吸水纸或吸水布，再覆盖一层2～30目的尼龙网或棉纱网；
(2)将丝素缺失突变型家蚕饲养至5龄熟蚕期，待家蚕体内排泄干净后，将其转移至步骤(1)构建的平台上，每批次家蚕的投放密度为250头/平方米以下；
(3)家蚕完成吐丝并化蛹后，选取健康的家蚕蛹用于化蛾、制种传代；
(4)将步骤(3)留种的家蚕按步骤(2)的方式饲养，并重复步骤(3)；
(5)重复传代10～15代后，按照步骤(2)的方式饲养，待家蚕吐丝完成，将网与下层纸或布分开，再从网上分离丝胶蛋白，即可获得丝胶蛋白创伤敷料。丝胶蛋白创伤敷料的厚度可以通过控制单位面积吐丝家蚕的数量和上蚕的次数来实现。
优选的，所述丝素缺失突变型家蚕的品种为185Nd-s,140Nd-s,139Nd-s,Nd。以上品种均由中国农业科学院蚕业研究所保存。
由所述方法制备获得的丝胶蛋白创伤敷料。
优选的，所述丝胶蛋白创伤敷料为丝胶蛋白支架。
所述丝胶蛋白创伤敷料在生物医用材料中的应用。
所述丝胶蛋白支架在细胞载体中的应用。
有益效果：(1)本发明首次采用丝素缺失突变型家蚕品种结合家蚕育种技术通过改变家蚕的吐丝生理习性获得可用于创伤修复的丝胶蛋白创伤敷料，该创伤敷料具有丝胶蛋白的天然结构和活性，保持了丝胶蛋白的“原生态”特性；同时本方案获得的丝胶蛋白生产工艺简单，成本低廉，具有可推广性；(2)通过本发明所述方法制得的丝胶蛋白创伤敷料具有多孔结构，透气性好；具有很好的机械强度，便于手术缝合；具有高生物相容性；能有效促进皮肤创伤愈合，可用于皮肤组织创伤修复；(3)本发明所述丝胶蛋白创伤敷料具有良好的生物相容性和细胞粘附性，可长期支持细胞的存活、增殖与迁移；(4)该敷料也是一种三维多孔的丝胶蛋白生物支架，可用于细胞外基质支持细胞生长和促进营养物质交换，可应用于多种组织损伤的修复和疾病的治疗。
附图说明
图1是家蚕吐丝平台结构示意图；
图2是丝胶蛋白创伤敷料结构图；
其中A为宏观结构图，B为微观结构图；
图3是丝胶蛋白创伤敷料孔隙率统计图；
图4是丝胶蛋白创伤敷料水平衡图；
图5是丝胶蛋白创伤敷料在不同pH环境中的降解曲线图；
图6是丝胶蛋白创伤敷料的傅里叶红外光谱图；
图7是丝胶蛋白创伤敷料的机械性能测试图；
图8是丝胶蛋白创伤敷料的热稳定性图；
图9是丝胶蛋白创伤敷料的X衍射图；
图10是丝胶蛋白创伤敷料对凝血时间的影响图；
图11是小鼠皮肤成纤维细胞NIH3T3细胞活力检测图；
图12是人皮肤角质细胞Hacat细胞活力检测图；
图13是丝胶蛋白创伤敷料中细胞迁移图；
图14是丝胶蛋白创伤敷料3D细胞培养图；
图15是丝胶蛋白创伤敷料促进皮肤创伤愈合图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1制备家蚕丝胶蛋白创伤敷料
(一)选择家蚕品种
选用丝素缺失型突变品种家蚕品种(由中国农业科学院蚕业研究所保存并向外商业化提供)，该类家蚕品种所吐的丝蛋白中只含有丝胶蛋白而不含丝素蛋白。
(二)制备家蚕吐丝平台
选用6块厚度为1cm、长和宽均为50cm的纸板，制作一个表面积为1.5m2的立方体纸箱。将纸箱放于一个平整的台面上，在其向上的一面覆盖3层厚度为0.4mm的经高温灭菌的新闻纸。然后再在纸上覆盖一层棉纱网(10目)，并将棉纱网的四边绷紧。
(三)选育家蚕品种
选取家蚕丝素缺失突变型品种(185Nds或140Nds)，在标准环境下(1-2龄28℃，3-5龄25℃)，选用新鲜桑叶饲喂，采用一天三回育。待家蚕5龄成熟时，将蚕放置在一个铺有报纸的蚕匾中，等家蚕粪便排泄干净后，再将家蚕转移到步骤二制作的家蚕吐丝平台上。让家蚕在平台上吐丝，人员在旁边观察，如发现有家蚕在平台上掉下，即将掉下来的蚕再放回平台。家蚕吐完丝后即在平台上化蛹。待化蛹结束，挑选化蛹较为正常的个体化蛾后交配留种，其余淘汰。按此种方法选育15代，即可获得适应于在平台上吐丝的丝素缺失型家蚕新品种。
(四)制备丝胶蛋白创伤敷料
选取由步骤(三)选育后的家蚕品种进行饲养，饲养方法同步骤(三)所述。待家蚕5龄成熟后，将家蚕转移到铺有报纸的蚕匾中，当它们体内粪便排泄干净后，再将蚕放在步骤(二)制作的吐丝平台上，每平方米放置100头蚕。24小时后，此时，家蚕已吐丝完毕，将该批家蚕转移走。然后再重新放置100头即将吐丝的家蚕，同样24小时后，待家蚕吐丝完毕，然后转移，再重新放100头即将吐丝的家蚕。24小时后，将家蚕移去。将附有丝胶蛋白的网轻轻取下，然后将网慢慢揭除，则即可获得一定厚度的丝胶蛋白创伤敷料。
如图1所示，家蚕吐丝平台由三部分构成，下层台基为一个平整的平台。中间一层为吸水纸或布，最上层为尼龙网或棉纱网。
对上述方法制备获得的家蚕丝胶蛋白创伤敷料进行性能测试，结果如下：
如图2所示，其中A为家蚕丝胶蛋白创伤敷料的宏观图，由普通数码相机拍摄；B为家蚕丝胶蛋白创伤敷料的微观结构图，为电子扫描电镜照片。从B图可见，丝胶蛋白创伤敷料为纤维状的丝胶蛋白交织构成的多孔结构，具有良好的透气性。
丝胶蛋白创伤敷料的孔隙率的测定采用超纯水作为替代溶液。将干重质量为w1的样品浸没在超纯水中，1小时后取出，去除样品表面多余的水后称得样品的重量为w2，则样品的孔隙率即为(w2-w1)/w2×100％。结果如图3所示。
将干燥的丝胶蛋白创伤敷料(质量为Wd)置于超纯水中，24h后去除表面多余的水，取出其质量为Ws。则创伤敷料的水平衡为：
结果如图4所示。
对于测试丝胶蛋白创伤敷料在不同pH环境中的降解，将丝胶蛋白创伤敷料浸泡于不同pH值(pH 3.0、pH 7.4、pH 11.0)的PBS溶液中，置于37℃恒温培养箱中，每日更换一次PBS溶液，在预设的时间点，取出、干燥、称重。结果如图5所示：丝胶蛋白创伤敷料降解具有pH响应性，其中在pH 11.0的碱性条件下降解速率最快，8周的降解率为69％，而在中性(pH7.4)和酸性(pH 3.0)环境中的降解率分别仅为38％和23％。另外，在碱性(pH 11.0)条件下，丝胶蛋白创伤敷料在前4周内降解速度较快，第4周降解率已达67％，此后降解速度变缓。
利用傅里叶变换红外光谱仪(Nexus,Thermal Nicolet,USA)测定丝胶蛋白创伤敷料在4000–400cm-1的特征峰。后采用软件进行分析，结果见图6。β折叠所占比例高达44.16％，比所报道的丝胶蛋白材料的β折叠含量均高。表明，本发明获得的丝胶蛋白创伤敷料稳定性更高。另一方面也在一定程度上反映了我们获得的丝胶蛋白创伤敷料保持丝胶蛋白的天然结构与性质。
丝胶蛋白创伤敷料的拉伸强度由万能材料测试机(Instron 5848MicroTester,USA)测得，结果如图7所示，其拉伸强度高达2.5MPa。表明该创伤敷料具有良好的拉伸强度，能够满足手术缝合的需要且不易破损。
采用同步热分析仪(NETZSCH STA 449F3,Germany)检测丝胶蛋白创伤敷料热重变化和在相变时熔点的变化。程序升温范围为40～800℃，每分钟升温10℃。如图8所示：丝胶蛋白创伤敷料的分解温度为313.4℃和423.6℃。
丝胶蛋白创伤敷料的X衍射分析，将丝胶蛋白创伤敷料剪成圆形片状，采用转靶X射线衍射仪(型号：D/MAX-RB,日本RIGAKU公司)测试。结果如图9所示，丝胶蛋白创伤敷料的2θ角为20.56°和28.6°，显著高于前期报道的经过分离纯化的非降解丝胶蛋白的2θ角(19.08°和22.86°)，见文献Scientific Reports,4:7064,DOI:10.1038/srep 07064)。结果表明，本发明获得的丝胶蛋白创伤敷料由于保持了丝胶蛋白的天然构象，具有较高的结晶度。
丝胶蛋白创伤敷料对凝血时间的影响测定方法如下：首先将丝胶蛋白创伤敷料剪成小片状，然后在室温下，浸入到血液里，同时未加丝胶蛋白创伤敷料的小鼠新鲜血液作为对照。从样品放入血液时开始计时，记录血液的凝血时间。统计结果见图10，含有丝胶蛋白创伤敷料的血液和对照组在凝血时间上没有显著性差异。结果表明丝胶蛋白创伤敷料对血液的凝血时间没有影响。前期人们研究发现丝胶蛋白具有抗凝血的现象，和我们的结果不同，他们所采用的均是降解性的丝胶蛋白。而我们制备的丝胶蛋白创伤敷料蛋白结构是天然的，其活性也是未被破坏的，这也可能是我们获得的丝胶蛋白创伤敷料和前期人们在丝胶蛋白抗凝血的结果有所不同的原因。
实施例2家蚕丝胶蛋白创伤敷料用作细胞载体
(一)小鼠成皮肤成纤维细胞(NIH3T3)和人皮肤角质细胞(Hacat)丝胶蛋白创伤敷料细胞活力检测
(1)首先将丝胶蛋白创伤敷料剪片状，然后用灭菌PBS洗3次，再用75％乙醇浸泡1小时，最后用已灭菌PBS洗1次，置于室温备用。
(2)将从细胞培养瓶收集的细胞经悬浮，吹散，种植于96孔细胞培养板中，待细胞贴壁后将步骤(1)中预处理的丝胶蛋白创伤敷料转入到含有细胞的培养板中，每孔放置一片丝胶蛋白创伤敷料。未放置丝胶蛋白创伤敷料的细胞培养孔作为对照。细胞培养所用培养基为DMEM高糖培养基，细胞置于细胞培养箱(37℃，CO2浓度为5％，湿度为100％)中培养。
如图11和图12所示，采用CCK8方法检测细胞在种植后2天和3天后细胞的活力。结果显示：小鼠皮肤成纤维细胞(NIH3T3)丝胶蛋白创伤敷料组与人皮肤角质细胞(Hacat)丝胶蛋白创伤敷料组和对照组相比，在细胞活力方面没有显著性差异，结果表明，丝胶蛋白创伤敷料具有良好的细胞相容性。
(二)丝胶蛋白创伤敷料的细胞迁移检测
所用细胞系为小鼠皮肤成纤维细胞(NIH3T3)。
(1)首先将丝胶蛋白创伤敷料剪圆形片状，然后用灭菌PBS洗3次，再用75％乙醇浸泡1小时，最后用已灭菌PBS洗1次，置于24孔细胞培养板中。
(2)将从细胞培养瓶收集的细胞经悬浮，吹散，种植于步骤(1)含有丝胶蛋白创伤敷料的细胞培养板中，初始种植细胞数进行计数。待细胞贴壁后，将丝胶蛋白创伤敷料转移到新的24孔细胞培养板中。再统计原培养板中各孔剩余的细胞数量，则得知丝胶蛋白创伤敷料上初始种植细胞数量。
此后，每隔一天将丝胶蛋白创伤敷料转移到新的细胞培养板中一次，同时统计原培养板中相对应的孔中剩余的细胞数并作好记录。最后进行统计分析。细胞培养所用培养基为DMEM高糖培养基，细胞放于细胞培养箱(37℃，CO2浓度为5％，湿度为100％)中培养。
结果如图13所示，在统计的24天内细胞从丝胶蛋白创伤敷料中迁移出的细胞呈现持续增长的现象。表明丝胶蛋白创伤敷料具有良好的细胞相容性，能够长期支持细胞的存活、增殖与迁移。
(三)丝胶蛋白创伤敷料的3D细胞培养
所用细胞系为GFP稳转的人神经母细胞瘤细胞系SHSY5Y。
首先将丝胶蛋白创伤敷料剪成圆形片状，然后用灭菌PBS洗3次，再用75％乙醇浸泡1小时，最后用已灭菌PBS洗1次，置于24孔细胞培养板中。接下来将从细胞培养瓶收集的细胞经悬浮、吹散，再种植于含有丝胶蛋白创伤敷料的细胞培养板中。2天后将含有丝胶蛋白创伤敷料的样品取出用激光共聚焦进行观察和拍照。如图14所示，丝胶蛋白创伤敷料中的细胞生长状态良好。结果表明丝胶蛋白创伤敷料具有良好的细胞相容性，可以作为细胞的载体。
实施例3家蚕丝胶蛋白创伤敷料用于小鼠皮肤损伤修复
(1)首先将丝胶蛋白创伤敷料剪成直径为1cm的圆形片状，然后用灭菌PBS洗3次，再用75％乙醇浸泡1小时，最后用已灭菌PBS洗1次，干燥后置于室温备用。
(2)制备小鼠烫伤模型，选用的动物为6周龄的昆明鼠。首选将小鼠麻醉和脱毛处理；然后采用温度为100℃金属棒(直径为1cm的圆柱体)紧贴小鼠后背部烫5秒钟。然后将烫伤后的皮肤剪去，将步骤(1)预处理的丝胶蛋白创伤敷料在创伤面上，未用创伤敷料处理的小鼠作为对照。
实验结果如图15所示，2天后丝胶蛋白创伤敷料组较对照组的小鼠创面面积缩小显著，表明丝胶蛋白创伤敷料可以有效促进皮肤创伤修复，可用于皮肤组织损伤修复。
Claims (6)
1.一种丝胶蛋白创伤敷料的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
（1）构建家蚕吐丝平台，选用平整的台基，首先在台基上覆盖吸水纸或吸水布，再覆盖一层2～30目的尼龙网或棉纱网；
（2）将丝素缺失突变型家蚕饲养至5龄熟蚕期，待家蚕体内排泄干净后，将其转移至步骤（1）构建的平台上，每批次家蚕的投放密度为250头/平方米以下；
（3）家蚕完成吐丝并化蛹后，选取健康家蚕蛹用于化蛾、制种传代；
（4）将步骤（3）留种的家蚕按步骤（2）的方式饲养，并重复步骤（3）；
（5）重复传代10～15代后，按照步骤（2）的方式饲养，待家蚕吐丝完成，将网与下层纸或布分开，再从网上分离丝胶蛋白，即可获得丝胶蛋白创伤敷料。
2.根据权利要求1所述的一种丝胶蛋白创伤敷料的制备方法，其特征在于，所述丝素缺失突变型家蚕的品种为185Nd-s, 140Nd-s,139Nd-s,Nd。
3.权利要求1或2所述方法制备获得的丝胶蛋白创伤敷料。
4.根据权利要求3所述的一种丝胶蛋白创伤敷料，其特征在于，所述丝胶蛋白创伤敷料为丝胶蛋白支架。
5.权利要求3所述丝胶蛋白创伤敷料在制备生物医用材料中的应用。
6.权利要求4所述丝胶蛋白支架在制备细胞载体中的应用。
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