CN101595211B - 皮肤替代物及其制备方法与用途 - Google Patents

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Abstract

在此提供可于活体上修复受损组织的皮肤替代物、其制造方法与用途。所提供者为一种生物复合物膜，其包含聚(ε-己内酯)(PCL)及至少一种选自胶原蛋白及明胶的材料。在一实施例中，该生物复合物膜为一种由PCL及明胶两种成分组成的膜层；在另一实施例中，该生物复合物膜则为一种由PCL、胶原蛋白及明胶三种成分组成的膜。该生物复合物膜可直接使用在活体上作为一种伤口敷料，或是当做一种支架来支持细胞于其每一表面上生长，以制备出适合活体外或活体内使用的人工皮肤。

Description

皮肤替代物及其制备方法与用途
发明领域
本发明涉及可于活体上修复受损组织的皮肤替代物(skin substitutes)、其制造方法与用途。更具体而言，本发明提供一种生物复合物膜，其包含聚(ε-己内酯)[poly(ε-caprolactone)，PCL]及至少一种选自胶原蛋白(collagen)及明胶(gelatin)的材料；一种利用此生物复合物膜所制成的人工皮肤；此人工皮肤的制备方法及用途，其中该人工皮肤是利用生物复合物膜的至少一表面来支持细胞于其上生长所制备而成的。
发明背景
生物个体的皮肤表面经常会因各种原因而出现伤口，一般来说，健康个体皮肤表面上的伤口会在一段可预期的时间内自行痊愈。但是，对于烧烫伤、重伤、行动不便(包括卧床)和/或患有疾病(例如，糖尿病)的个体来说，皮肤表面上的伤口很容易转变成慢性伤口(chronic wounds)。慢性伤口被定义为依据患者的年龄、伤口位置、伤口大小或病因而无法在一段预定时间范围内自行痊愈的伤口。慢性伤口通常会让患者处于受感染、需住院治疗、因肢体感染而须截肢等等的风险下，且已经成为一项亟需关注的公共卫生议题。慢性伤口的发病率和死亡率都很高，造成患者的生活质量低落和极高的医疗照护支出。理想情况是通过传统的伤口治疗及护理来使伤口痊愈，避免出现慢性伤口而需要进一步治疗。但是，对于无法自行痊愈的伤口来说，必需使用更积极的治疗方式以促使伤口愈合，例如，使用生物合成性敷料(biosynthetic dressings)、皮肤替代物或给予生长因子等。
目前已有多种以组织工程方式所研发出来的皮肤替代物(即，相当于人类皮肤的等效物)，这类产品是使用一种天然、生物可分解或人工合成的基质(matrix)作为可支持活细胞(例如，角质细胞及纤维母细胞)于其上生长的支架，藉以促进伤口愈合，其中的支架系作为一种可导引组织细胞聚集及发育的稳定框架，其上会被蛋白质及聚醣类等细胞外基质所覆盖，进而能诱导细胞的迁移和黏附。又称为人工皮肤或是细胞性伤口敷料(cellular wound dressings)的皮肤替代物，可作为暂时性的或永久性的伤口覆盖物，或是和传统的伤口治疗方法合并使用。某些种类的皮肤替代物表层具有一层最终可被撕下或是被新生的健康皮肤所取代的人工合成层，至于其底层则是由一可支持并促进新生皮肤细胞生长的支架或基质所构成。随着健康的皮肤、血管、纤维母细胞和神经纤维跨入该支架或基质中生长，最后会造成该支架或基质被分解。异基因细胞大部分市售的皮肤替代物是由多层具有或着不具有异基因细胞(allogeniccells)在内的生物材料基质所构成，且该些异基因细胞通常来自新生儿的包皮细胞。这类产品包括(但不限于)，例如Alloderm
Figure G2006800562290D00021
(Life Cell Inc.，Branchburg，NJ)、Integra
Figure G2006800562290D00022
(Integra LifeSciences corp.，Plainsboro，NJ)、EZ DermTM(Brennen Medical，Inc.，St.Paul，MN)、Dermagraft
Figure G2006800562290D00023
(Smith&Nephew，Inc.，Largo，FL)、Oasis
Figure G2006800562290D00024
(Cook Biotech Inc.，West Lafayette，IN)，Apligraft
Figure G2006800562290D00025
(Organogenessis，Inc.，Canton，MA)、及OrCelTM(Ortec International，Inc.，New York，NY)。
适合作为细胞生长支架且同时可在活体中表现出生物可吸收性的已知传统材料，包括天然及合成的聚合物，例如胶原蛋白、明胶、玻糖醛酸(即，玻尿酸)、果胶及纤维素衍生物。但是，由这类材料所做成的支架也有许多缺点，例如组织排斥性相当高、机械强度不足和/或不易控制其分解后的性质。以下简单介绍由各国研发团队以这些材料所研发出来的改良材料和/或皮肤替代物及其的制造方法。
美国专利No.6,599,323 B2中揭示了一种生物可兼容的组织植入物，以及制造和使用这类植入物的方法。此组织植入物包含一或多层生物可吸收的聚合物泡棉，其含有许多具开放细胞架构的孔隙。此泡棉成分又可以一种密度在12-80％间的网状材料来加以强化。该泡棉成分是由一种选自下列的弹性共聚物所构成，包括ε-己内酯-共-乙交酯、ε-己内酯-共-乳酸交酯、对-二氧环己酮(1，4-二氧己烷-2-酮)-共-乳酸交酯(p-dioxanone(1，4-dioxan-2-one)-co-lactide)、ε-己内酯-共-对-二氧环己酮、对-二氧环己酮-共-三亚甲基碳酸酯(trimethylenecarbonate)、三亚甲基碳酸酯-共-乙交酯、三亚甲基碳酸酯-共-乳酸交酯及其组合。该网状材料则由一种选自由聚乳酸、聚羟乙酸、聚己内酯、聚二氧环己酮、戊内酯、聚乙烯醇、其共聚物和其组合所组成的材料的纤维所制成。
美国专利No.6,733,530涉及一种移植到人类患者的新生真皮上的皮肤材料，该材料包含一种由以下成分所构成的复合材料：由酯化的玻尿酸所组成的生物合成子层、位在该生物合成子层上表面上的一层活的人类真皮纤维母细胞、及位在该真皮纤维母细胞层上的一层活的人类角质细胞，该角质细胞获取自该人类患者身上。
美国专利No.6,974,679 B2涉及一种用来形成胶原蛋白支持物的复合物产品，包含至少一层多孔的胶原蛋白层，覆盖在一紧实胶原膜的至少一面上，该紧实胶原膜系由在空气或气流中干燥的一胶原蛋白凝胶所制成的胶原蛋白膜或是一高度压缩的胶原蛋白泡棉所构成。
美国专利NO.6,946,143 B2揭示一种组织工程用的生物可兼容的医疗材料及多孔性支架，其系由一种分子量在10,000道尔顿或更高的生物可分解的乙交酯/ε-己内酯共聚物所构成，且在共聚物中乙交酯∶ε-己内酯的摩尔比为约4.0∶6.0至6.0∶4.0。该生物可分解的聚合物具有低免疫性、优异的机械性质及几近无毒等特性，且适合用于诸如皮肤及血管等类软组织的再生，及作为医疗母体及伤口覆盖物等类的医疗材料。
美国专利No.6,991,652 B2涉及一种活体用的复合材料，包含一种生物可相容的三维建构物和分散在该生物可兼容的三维建构物上的许多细胞，其中该生物可兼容的三维建构物包括一种选自以下的材料：藻酸盐、胶原蛋白、聚乳酸交酯、聚乙二醇、聚己内酯、聚乙交酯、聚二氧环己酮及其衍生物和其共聚物，且具有直径大于1.5毫米的孔隙分散在一载体中；该载体包含一凝胶基质或黏性流体，该凝胶基质或黏性流体选自生物可分解材料及非生物可分解材料，每一种材料的黏性都在10到1000cps；和位于所述生物可兼容的三维建构物中的细胞；其中该生物可兼容的三维建构物可容许位于其中的细胞进行生长，并可容许该活体周围组织细胞往该建构物内生长及黏附在该建构物内。
美国专利No.6,846,675 B2涉及一种具有提高的阻隔功能的活体外培养的皮肤替代物，在某些情况下，该些功能是改良的培养条件所造成的结果，然而在其它情况下，则是经过基因修饰的角质细胞所造成的结果。因而制备的皮肤替代物对刺激试验相当有用。
本案发明人之前也曾发现过一种包含胶原蛋白和聚己内酯(PCL)在内的生物复合物，其可作为支持皮肤细胞生长的基架(Dai等人，Biomaterials 25(2004)4263-4271；和Dai等人，Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 329(2005)905-908)。多年来，研究人员一直视胶原蛋白为制造包含活细胞在内的人工皮肤替代物时一种无可替代的材料，但是，酶包含胶原蛋白类的基质极易受到细菌和酶的攻击，因此当将这类包含胶原蛋白类的基质用在充满细菌的慢性伤口上作为皮肤覆盖物时，治疗效果往往不佳。因此，仍然需要研发出一种较目前使用的任何一种生物材料价格更便宜、同时具有良好机械强度的生物材料，其具有适合细胞发育、代谢的生物性质，且不易受到细菌侵袭和酶降解的影响。
发明概述
本发明目的在于提供可于活体上修复受损组织的皮肤替代物、其制造方法与用途。
因此，一方面，本发明提供一种生物复合物膜，其包含聚(ε-己内酯)及至少一种选自胶原蛋白及明胶的材料，且其重量比在4∶1到20∶1间。在一较佳实施例中，该生物复合物膜包含聚(ε-己内酯)和明胶。在另一较佳实施例中，该生物复合物膜包含聚(ε-己内酯)、胶原蛋白和明胶，其中胶原蛋白和聚(ε-己内酯)的重量比或是明胶/胶原蛋白和聚(ε-己内酯)的重量比在1∶4到1∶20间。该生物复合物膜可作为一种伤口敷料或是活体器官覆盖物，以促进伤口愈合和/或组织再生。更特别的是，其可用来治疗耳鼓损伤，肌腱/神经破裂，和/或包括烧烫伤、溃疡、色素沉降受损、切除外伤或其它表皮状况在内的各种皮肤伤害。
另一方面，本发明提供一种生物复合物产品，其包含该生物复合物膜，及至少一层生长在该膜层的至少一表面上的细胞。该生物复合物产品可包含一层生长在该生物复合物膜的一表面上的细胞。或者，该生物复合物产品可包含两层细胞，每一层细胞系分别生长在该生物复合物膜的两个表面中的一相对应表面上。在一较佳实施例中，提供了一种生物复合物产品，其包含该生物复合物、生长在该膜一表面上的一第一层细胞、及生长在该膜另一表面上的一第二层细胞。该些细胞可选自纤维母细胞、角质细胞、黑色素细胞、源自毛囊和/或汗腺的细胞、源自血管的内皮细胞、血细胞、软骨细胞、骨细胞、成骨细胞与源自脐带血和/或骨髓的干细胞，且这些细胞可以是正常细胞、经过基因修饰的细胞或恶性细胞。在一较佳实施例中，该生物复合物产品是一种人工皮肤，包含一生物复合物膜，其具有一层角质细胞生长在该生物复合物膜的一面上及一层纤维母细胞生长在该生物复合物膜的另一面上。
再一方面，本发明提供一种用来培养一人工皮肤的方法，该人工皮肤适合用来移植到一亟需皮肤治疗和/或伤口覆盖的个体上，该方法包含将一层角质细胞培养在一生物复合物膜的一表面上，及将一层纤维母细胞培养在该生物复合物膜的另一表面上。上述培养一层角质细胞的步骤可在该培养一层纤维母细胞的步骤之前或然后进行。
另一方面，本发明提供一种治疗一亟需皮肤治疗和/或伤口覆盖的个体的方法，包含在一具有耳鼓损伤，肌腱/神经破裂，和/或包括烧烫伤、溃疡、色素沉降受损、切除外伤或其它表皮状况在内的各种皮肤伤害的患者上施用一以本发明发法所制备的人工皮肤。
通过以下详细说明、实施例及附图，将可更了解本发明上述目的和优点。应理解，上述一般性说明及以下详细说明均为例示，而非用以限制本发明范畴。
附图简述
本申请含有至少一幅彩色附图。具彩色附图之申请将在提出要求并缴纳必要费用后由美国专商局提供。
为让本发明的上述和其它目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，附图的详细说明如下：
图1绘示出依据本发明一较佳实施例，于37℃、PBS溶液中自(A)实施例1.2及(B)实施例1.3的复合生物膜中累积释出的明胶含量；
图2为(A)1∶4(重量/重量)的实施例1.2的明胶/PCL复合生物膜，(B)1∶8(重量/重量，w/w)的实施例1.2的明胶/PCL复合生物膜，及(C)1∶20(重量/重量)的实施例1.2的明胶/PCL复合生物膜的扫描式电子显微镜(SEM)照片；
图3为(A)1∶8(重量/重量)的实施例1.3的明胶/10％胶原蛋白:PCL复合生物膜，(B)1∶20(重量/重量)的实施例1.3的明胶/10％胶原蛋白:PCL复合生物膜，(C)1∶8(重量/重量)的实施例1.3的明胶/25％胶原蛋白:PCL复合生物膜，及(D)1∶20(重量/重量)的实施例1.3的明胶/25％胶原蛋白:PCL复合生物膜的扫描式电子显微镜(SEM)照片；
图4A及4B为分别培养在1∶8(重量/重量)的实施例1.2的明胶/PCL复合生物膜上1天及3天后的PHEK细胞的SEM照片；
图4C及4D为分别培养在1∶20(重量/重量)的实施例1.2的明胶/PCL复合生物膜上1天及3天后的PHEK细胞的SEM照片；
图5A及5B为分别培养在1∶8(重量/重量)的实施例1.2的明胶/PCL复合生物膜上1天及4天后的PHDF细胞的SEM照片；
图5C及5D为分别培养在1∶20(重量/重量)的实施例1.2的明胶/PCL复合生物膜上1天及4天后的PHDF细胞的SEM照片；
图6A及6B为分别培养在1∶8或1∶20(重量/重量)的实施例1.2的明胶/PCL复合生物膜上6天后的PHEK细胞的免疫染色照片(100倍，标尺：100μm)，其中用来标记套膜蛋白(involucrin)的一抗为单克隆鼠抗-人套膜蛋白抗体(1∶100)，而二抗为与罗丹明-结合的山羊抗-鼠IgG(1∶100)；
图6C及6D为分别培养在1∶8(重量/重量)的实施例1.2的明胶/PCL复合生物膜上7天及10天后的PHDF细胞的免疫染色照片(100倍，标尺：100μm)，其中用来标记α-微管蛋白(tubulin)的一抗为单克隆鼠抗-人α-微管蛋白抗体(1∶100)，而二抗为与荧光素(FITC)-结合的山羊抗-鼠IgG(1∶100)；
图6E及6F为分别培养在1∶20(重量/重量)的实施例1.2的明胶/PCL复合生物膜上7天及10天后的PHDF细胞的免疫染色照片(100倍，标尺：100μm)，其中用来标记α-微管蛋白的一抗为单克隆鼠抗-人类α-微管蛋白抗体(1∶100)，而二抗为与荧光素(FITC)-结合的山羊抗-鼠IgG(1∶100)；
图7绘示出明胶/PCL(实施例1.2)生物复合物、胶原蛋白/PCL(实施例1.1)生物复合物及TCP上的PHEK生长的比较，其中以培养在TCP上达9天的细胞作为对照组，并分别在第1、3、6及9天计算细胞数目(n＝4+SE；ANOVA：p＜0.05；Newman-Keuls：*P＜0.05)；
图8绘示出在明胶/PCL(实施例1.2)生物复合物、胶原蛋白/PCL(实施例1.1)生物复合物及TCP上的PHDF细胞生长的比较，其中PHDF细胞细以浸泡方式培养10天，并分别在第1、4、7及10天计算细胞数目(n＝4+SE；ANOVA：除第4天P＝0.344外，其余p＜0.05；Newman-Keuls：除第4天外，*P＜0.05)；
图9绘示出生长在明胶/10％胶原蛋白:PCL生物复合物、明胶/25％胶原蛋白:PCL(实施例1.3)生物复合物及TCP上的PHEK细胞的比较，其中PHEK细胞细以浸泡方式培养10天，并以培养在TCP上达9天的细胞作为对照组，并分别在第1、3、6及9天计算细胞数目(n＝4+SE；ANOVA：p＜0.05；Newman-Keuls：*P＜0.05)；
图10绘示出生长在明胶/10％胶原蛋白:PCL生物复合物、明胶/25％胶原蛋白:PCL(实施例1.3)生物复合物及TCP上的PHDF细胞的比较，其中PHDF细胞细以浸泡方式培养10天，并分别在第1、4、7及10天计算细胞数目(n＝4+SE；ANOVA：除第4天P＝0.344外，其余p＜0.05；Newman-Keuls：除第4天外，*P＜0.05)；
图11是生长在1∶20(重量/重量)的胶原蛋白/PCL生物复合物(实施例1.1)的上表面达35天的PHEK细胞的SEM照片；
图12是生长图11预覆盖有PHEK细胞的生物复合物的下表面达35天的PHDF细胞的SEM照片；
图13是生长在1∶20(重量/重量)的胶原蛋白/PCL生物复合物(实施例1.1)的上表面达35天的PHEK细胞的免疫染色照片(100倍，标尺为100μm)；
图14是生长图11预覆盖有PHEK细胞的生物复合物的下表面达35天的PHDF细胞的免疫染色照片(100倍，标尺为
Figure G2006800562290D00071
μm)；
图15显示在有(B、D、F组)或无(A、C、E组)IL-1刺激下，自人类纤维母细胞中释出的KGF量，其中人类纤维母细胞分别培养在TCP盘(A及B组)、实施例1.1的生物复合物(C及D组)及与角质形成细胞共培养的实施例1.1的生物复合物膜上(即，实施例2的人工皮肤)(E及F组)；
图16显示将实施例2的人工皮肤移植到一无胸腺小鼠背上以手术方式制作出来的伤口皮肤上的过程，(A)以1∶20(重量/重量)的胶原蛋白/PCL生物复合物在共同培养装置中制作出来的人工皮肤，(B)将该人工皮肤移转到皮肤伤口；
图17显示接续图16的处理而在(A)以4号手术线环绕伤口周围将实施例2的人工皮肤缝在皮肤伤口时所拍摄的照片，(B)接续在第0天，于伤口上覆盖一层由Tagaderm透明膜包覆的内含DMEM/明胶/琼脂/10％FCS的凝胶状基质时所拍摄的照片，(C)接续在第7天；及(D)第28天时所拍摄的照片；
图18显示在(A)在第0天以4号手术线环绕伤口周围将实施例1.1的生物复合物膜缝在无胸腺小鼠皮肤伤口时所拍摄的照片，(B)接续在第7天，(C)第10天，(D)第19天时所拍摄的照片；
图19显示当伤口未经任何处理而使其自行痊愈的情况下，分别在(A)第0天，(B)第7天，(C)第10天，及(D)第19天时所拍摄的照片；
图20显示自移植有实施例2的人工皮肤达43天的无胸腺小鼠移植物附近皮肤所取下的样本内，其中PHEK细胞的免疫染色照片，其中用来标记套膜蛋白(involucrin)的一抗为单克隆鼠抗-人套膜蛋白抗体(1∶20)，而二抗为与罗丹明-结合的山羊抗-鼠IgG(1∶100)，以箭头显示代表PHEK细胞所在处的强烈红荧光(100倍，标尺为100μm)；
图21显示自移植有实施例2的人工皮肤达225天的无胸腺小鼠移植物附近皮肤所取下的样本内，以H&E染色的组织免疫染色照片，其中示出伤口完全愈合，并在小鼠正常皮肤(●→)间移植有皮肤替代物处的皮肤上看到具有已分化的表皮细胞(◆→)、新生成的毛囊(→)、及平行排列的ECM结构(40倍，标尺为100μm)；
图22显示自移植有实施例2的人工皮肤达225天的无胸腺小鼠移植物附近皮肤所取下的样本内，以Gomori三原色染色法染色的组织免疫染色照片，其中示出伤口完全愈合，并在小鼠正常皮肤(●→)间移植有皮肤替代物处的皮肤上看到具有已分化的表皮细胞(◆→)及丰富的胶原蛋白/ECM沉积(→；绿色)(40倍，标尺为100μm)；
图23显示自移植有实施例2的人工皮肤达225天的无胸腺小鼠移植物附近皮肤所取下的样本内，残存的人类纤维母细胞/表皮细胞的免疫组织染色照片，其中PHEK细胞和PHDF细胞系分别以不会和小鼠或大鼠产生交叉反应的单克隆鼠抗人D7-F1B抗体(1∶200)及与罗丹明-结合的山羊抗-鼠IgG(1∶100)加以标记，以箭头(→)指出皮肤替代物真皮层中PHEK和PHDF细胞所在处的强烈红荧光(100倍，标尺为100μm)；
图24显示自未经任何移植物处理达34天的无胸腺小鼠皮肤伤口附近所取下的样本，以H&E染色的组织免疫染色照片，其中示出伤口完全愈合，并在无胸腺小鼠正常皮肤(●→)间的皮肤上看到具有已分化的表皮细胞(◆→)、及松散排列的ECM结构(→)(40倍，标尺为
Figure G2006800562290D00091
μm)；
图25显示自未经任何移植物处理达34天的无胸腺小鼠皮肤伤口附近所取下的样本，以Gomori三原色染色法染色的组织免疫染色照片，其中示出伤口完全愈合，并在无胸腺小鼠正常皮肤(●→)间的皮肤上看到具有已分化的表皮细胞(◆→)及松散的胶原蛋白沉积(→；绿色)(40倍，标尺为100μm)；
图26显示自未经任何移植物处理达34天的无胸腺小鼠皮肤伤口附近所取下的样本，残存的人类纤维母细胞/表皮细胞的免疫组织染色照片，其中PHEK细胞和PHDF细胞系分别以不会和小鼠或大鼠产生交叉反应的单克隆鼠抗人D7-F1B抗体(1∶200)及与罗丹明-结合的山羊抗-鼠IgG(1∶100)加以标记，以箭头(→)指出皮肤替代物真皮层中PHEK和PHDF细胞所在处的强烈红荧光(100倍，标尺为100μm)；
图27显示自移植有实施例1.1的空白生物复合物膜达34天的无胸腺小鼠组织样本，以H&E染色的照片，其中示出伤口完全愈合，并在无胸腺小鼠正常皮肤(●→)间移植有皮肤替代物处的皮肤上看到具有已分化的表皮细胞(◆→)及松散排列的ECM结构(40倍，标尺为100μm)；
图28显示自移植有实施例1.1的空白生物复合物膜达34天的无胸腺小鼠组织样本，以Gomori三原色染色法染色的照片，其中示出伤口完全愈合，并在无胸腺小鼠正常皮肤(●→)间移植有皮肤替代物处的皮肤上具有已分化的表皮细胞(◆→)及丰富的胶原蛋白/ECM沉积(→；绿色)(100倍，标尺为100μm)；
图29显示自移植有实施例1.1的空白生物复合物膜达34天后，残存的人类纤维母细胞/表皮细胞的免疫组织染色照片，其中PHEK细胞和PHDF细胞系分别以不会和小鼠或大鼠产生交叉反应的单克隆鼠抗人D7-F1B抗体(1∶200)及与罗丹明-结合的山羊抗-鼠IgG(1∶100)加以标记，以箭头(→)指出手术位置处真皮层中没有红荧光(100倍，标尺为
Figure G2006800562290D00092
μm)。
发明说明
以下，将藉由详细实施说明及实施例来阐述本发明之其它特点、目的及优点。所揭示实施例及所使用的技术名词均系为了阐述本发明而用，非用以限制本发明之范畴。本发明范畴也涵盖未揭示于此、但对的任一参阅过本说明书然后的习知技艺人士来说显而易见的实施例。
除非另作说明，否则单数名词(a，an，the)在此均涵盖其复数形式。
除了在操作实施例中或另有定义之外，所有在此用来表示一成分数量、反应条件的数值大小，均为一约略范围。因此，除非代表相反意涵，否则所有的数值均可根据想要的性质来加以变化。
本发明涉及皮肤替代物的活体外(in vitro)制备；以及其活体外(in vitro)或活体内(in vivo)的用途。这些活体外培养的皮肤替代物可用来修复受损组织，特别是，皮肤组织。在某些实施例中，该些活体外培养的皮肤替代物是一种不含活细胞的生物复合物膜，其包含聚(ε-己内酯)及至少一种选自胶原蛋白及明胶的材料。但在某些实施例中，该些活体外培养的皮肤替代物是一种包含有活细胞的生物复合物膜，该些活细胞系在该生物复合物膜的至少一表面上培养。在另外一些实施例中，本发明提供该些活体外培养的皮肤替代物(包括不含活细胞的生物复合物膜或是含有活细胞的人工皮肤)的活体内应用，用以移植到具有耳鼓损伤，肌腱/神经破裂，和/或包括烧烫伤、溃疡、色素沉降受损、切除外伤或其它表皮状况在内的各种皮肤伤害的个体身上。
术语“生物复合物(biocomposite)”在此指一种具有生物可兼容性且适用于本发明的材料，其不会实质负面影响培养在该生物复合物表面上的细胞的各种想要的特性或是对皮肤表面上移植有包含此生物复合物在内的人工皮肤的活体周围组织或细胞造成不良影响。
因此，在一实施例中，本发明提供一种生物复合物膜，其包含PCL及至少一种选自胶原蛋白及明胶的材料，且其重量比在4∶1到20∶1间，更优选在8∶1到20∶1间。在一较佳实施例中，该生物复合物膜包含PCL和明胶。在另一更佳实施例中，该生物复合物膜包含PCL、胶原蛋白和明胶，其中胶原蛋白和PCL的重量比或是明胶/胶原蛋白和PCL的重量比在1∶4到1∶20间，更优选在8∶1到20∶1间。
该生物复合物膜的制造方法如下：依据实施例1所述的步骤，将冷冻干燥的胶原蛋白垫(collagen mats)或明胶垫或是胶原蛋白/明胶垫缓缓地与PCL溶液混合，接着将溶剂挥发，以形成一种二-成分或三-成分的膜层。该二-成分的生物复合物膜可包含胶原蛋白和PCL共两种成份，或是明胶和PCL共两种成份；而该三-成分的生物复合物膜则包含胶原蛋白、明胶及PCL，共三种成份。
在一较佳实施例中，依据上述方法制备而成的生物复合物膜可被直接用在活体上，即直接当作一种伤口敷料或活器官覆盖物而用在一活的个体上，藉以促进伤口愈合和/或组织再生。特别是，用来修复耳鼓损伤，肌腱/神经破裂，和/或包括烧烫伤、溃疡、色素沉降受损、切除外伤或其它表皮状况在内的各种皮肤伤害。此种新颖的敷料使用非常容易，施用时不需要复杂的手术且浅伤口(shallow wounds)及深度伤口(deep cavity wound)均适用。当作为敷料使用时，因为这些生物复合物膜并不包含任何活细胞或是任何可能被快速降解的成份，因此储存上较容易且可保存在无菌环境下长达一年。由于敷料本身不需要活细胞，并可使用较便宜的材料(例如，明胶)来代替胶原蛋白，因此制造上也相当简单、快速，并可大幅降低成本。
上述的生物复合物膜也可被当作一种可支持活细胞于其至少一表面上生长的支架。该生物复合物膜可包含一层活细胞，其生长在该生物复合物膜之一表面上。或者，该生物复合物膜也可包含两层活细胞，每一层细胞各自生长在该生物复合物膜的两个表面中的一相对应表面上。在一较佳实施例中，该生物复合物膜包含两层活细胞，每一层细胞各自生长在该生物复合物膜的两个表面中的一相对应表面上，藉以形成一种包含有活细胞的人工皮肤。可依据本发明实施例2所述方法，在该生物复合物膜的一表面上培养第一层细胞，接着，在该生物复合物膜的另一表面上培养一第二层细胞。分离和/或培养细胞的技术，已是本领域中熟练技术人员所公知的，在此将不再赘述。所选择的细胞必须能够适合在该生物复合物膜表面上生长，这些细胞包括但不限于，纤维母细胞、角质细胞、黑色素细胞、源自毛囊和/或汗腺的细胞、源自血管的内皮细胞、血细胞、软骨细胞、骨细胞、成骨细胞与源自脐带血和/或骨髓的干细胞，且这些细胞可以是原代分离出来的细胞或是永久细胞株，且其可为正常细胞、经过基因修饰的细胞或恶性细胞。在一较佳实施例中，将依据本发明方法所制备而成的生物复合物膜架设在一种共-培养装置中的无菌滤膜架上，然后将角质细胞种植到该生物复合物膜的一个表面上，培养该些细胞直到接近全满程度；然后，以无菌的镊子将该生物复合物膜翻面，再将纤维母细胞接续种植到该生物复合物膜的另一不含细胞的表面上，并培养3天使该些纤维母细胞可黏附在该生物复合物膜上并生长。接着，再将此含有不同细胞于各表面的生物复合物膜再次翻面，并抬高至可接触空气的高度以促使角质细胞分化。然后或者，也可先培养纤维母细胞，然后再接续培养角质细胞。
上述包含有活细胞在其之一或两个表面上的该些活体外培养的生物复合物膜，即人工皮肤(artificial skin)，其可根据想要的用途而被施用在活体外或活体内。由于此包含有活细胞的人工皮肤具有类似皮肤的三维架构，因此适合作为一种可供药物筛检的活体外皮肤模型，以用来决定测试药物的毒性和/或药动学应用等等。另外，也可将此人工皮肤施用在活的个体上，以修复耳鼓损伤，肌腱/神经破裂，和/或包括烧烫伤、溃疡、色素沉降受损、切除外伤或其它表皮状况在内的各种皮肤伤害。所制备而成的人工皮肤由于包含有易被破坏的活细胞，因此必须储存在可避免活细胞受损且能维持活细胞生长的活体外环境中，储存时间一般为至少2个月。在一较佳实施例中，此活体外制备而成的人工皮肤包含一层位于该生物复合物膜一表面上的已长满且分化的角质细胞，以及一层位于该生物复合物膜另一表面上的纤维母细胞，将此人工皮肤移植到一测试个体背上以手术方式所作出的皮肤伤口上，然后在不给予其它传统伤口治疗的情况下令其自行痊愈。经过7到9天后，伤口已完全愈合，等到28天后，患处皮肤已看不出来任何手术伤口的痕迹，宛如完全未受过伤一样。
以下实施例中系用来阐述本发明概念，并帮助此领域中具有通常知识者来使用并实施本发明，而非用以限制本发明范畴。
实施例
统计分析
所有在此呈现的数据均经过ANOVA双因子分析并重复测试，其中的变量并进一步以Student Newman-Keuls进行分析。当样品数不小于3时，数据即以平均值±SE(SE：标准偏差)方式表示。当P值小于0.05时(P＜0.05)，即表示结果属于统计上显着。
实施例1生物复合物的制备
1.1制备胶原蛋白:PCL生物复合物
依据Dai等人(Biomaterials 2004；25：4263-4271)先前所揭示的方法，分别制备出1∶4、1∶8及1∶20(重量/重量)的胶原蛋白:PCL生物复合物膜。简言之，将胶原蛋白溶液(0.25％(w/v)溶于1％的醋酸中)加到4毫升的玻璃小瓶中并在-20℃下冷冻约45-50分钟。然后，将样品转移到-70℃的冰箱并置于其中约35分钟。最后，将冷冻样品放在-44℃的冷冻干燥机(EdwardsModulyo)中，抽真空至42毫巴的压力下，并维持24小时。分别取少量(0.5毫升)之0.5％、1％、2.5％(重量/体积)的PCL/二氯甲烷(dichloromethane，DCM)溶液，并将其小心地加到冷冻干燥的胶原蛋白垫内，以分别制备出1∶4、1∶8及1∶20(重量/重量)的胶原蛋白:PCL生物复合物膜。在将盖子打开以让溶剂得以挥发过夜之前，需保持该些小瓶在密封状态下30分钟。
1.2制备明胶:PCL生物复合物
除了使用明胶(B型)溶液来取代胶原蛋白溶液外，依据实施例1.1所述方法来制备1∶4、1∶8及1∶20(重量/重量)的明胶:PCL生物复合物膜。
1.3制备明胶:胶原蛋白/PCL生物复合物
除了使用明胶/10％胶原蛋白溶液或明胶/25％胶原蛋白溶液来取代胶原蛋白溶液外，依据实施例1.1所述方法来制备明胶/胶原蛋白/PCL生物复合物膜层。将0.2％(重量/体积)的明胶溶解在0.2毫升的双蒸水中，接着再分别混入0.025毫升或0.062毫升的0.25％(重量/体积)的胶原蛋白溶液，以分别制备出明胶/10％胶原蛋白溶液或明胶/25％胶原蛋白溶液。如此，可分别获得1∶8及1∶20(重量/重量)的明胶/10％胶原蛋白/PCL的生物复合物膜或明胶/25％胶原蛋白/PCL的生物复合物膜。
1.4实施例1.1、1.2及1.3的生物复合物膜的特性分析
以如下试验来分析实施例1.1、1.2及1.3所制备的生物复合物膜，这些测试包括1)BCA总蛋白质分析，用以测量从生物复合物膜中释出的胶原蛋白和/或明胶的量；2)热示差扫描分析(differential scanning calorimetry，DSC)；3)扫描式电子显微镜分析(scanning electron microscopy，SEM)；4)细胞在该生物复合物膜上的生长情形；及5)免疫组化分析。
1.4.1 BCA分析
依据制造商(Sigma)所提供的操作方法来执行BCA总蛋白质分析，以估算出自实施例1.1、1.2或1.3的生物复合物膜中所释出的胶原蛋白和/或明胶的量。简言之，分别将实施例1.1、1.2或1.3的生物复合物膜样品放到内含1毫升PBS溶液的7毫升玻璃管中，并在37℃的水浴中培养一段时间。定期以新鲜的PBS溶液完全置换所释出的物质，并以BCA总蛋白质分析试验来进行蛋白质(即，胶原蛋白和/或明胶)含量分析。在执行BCA总蛋白质分析之前，先配制好一些校正用的蛋白质溶液，包括配制浓度为1毫克/毫升的胶原蛋白和/或明胶溶液，然后再进行一系列稀释来获得各种浓度的校准溶液。依据制造商提供的指示配制BCA操作溶液。在BCA分析中，使用96孔的培养盘，并在每一培养孔中混入200μg的BCA操作溶液与25μg的蛋白质样品，同时每一测试均进行三重复。然后，将测试样品及校准样品放在37℃的水浴中40分钟。分别在562nm的光线下测量样品的吸收度，从校准样品所制得的校准曲线来计算出每一测试样品中的胶原蛋白和/或明胶的浓度。
1.4.2热差扫描分析(DSC)
以Perkin-Elmer公司所出品的热差扫描仪(Perkin-Elmer Pyris DiamondDifferential Scanning Calorimeter)来记录实施例1.1、1.2或1.3的生物复合物膜(2-10毫克)的热性质。将每一样品轻压至靠近盘底，以确保每一样品都有良好的热接触。在本试验中使用密封的DSC盘，且每一样品都进行三重复。将其分别以10℃/分钟的加热速度，从10℃逐渐升温至100℃。经由DSC仪器附设软件计算出各材料中PCL成分的峰值熔解温度(Tm)和熔融热量。然后，以所得熔融热量的数据来估算生物复合物中所含PCL结晶的百分比，其与已报导的PCL完整结晶熔融热量139.5焦耳/克相比较后所得数据，其中并使用铟作为标准物。
1.4.3扫描式电子显微镜分析(SEM)
以扫描式电子显微镜来评估实施例1.1、1.2或1.3的生物复合物膜的表面形状，以及在该些生物复合物膜表面上生长的细胞之黏附性、生长情况及分布情形。
简言之，以碳片将样品(有或无细胞于其表面上生长的实施例1.1、1.2或1.3的生物复合物膜)黏附在铝制的SEM短棒上，在以HITACHI
Figure G2006800562290D00141
S-3000N扫描式电子显微镜进行扫描之前，先在上述样品上电镀上金。
1.4.4细胞在生物复合物膜上的生长情形
PHEK细胞在实施例1.1、1.2或1.3的生物复合物膜上的生长情形原代分离的人类表皮角质细胞(primary human epidermal keratinocytes，PHEK)是自实施包皮环状切除术患者所捐赠的人类包皮样品中分离而得的，并以EpiLife
Figure G2006800562290D00142
角质细胞培养液(Cascade Biologics
Figure G2006800562290D00151
，Inc.，USA)进行培养。皮肤样品的处理方法、放大细胞量的方法及计算细胞数目的方法都是相关领域公知的方法。简言之，将分离自儿童包皮细胞的第4代PHEK(P4)细胞，以1.7×105细胞/cm2的密度分别种植在实施例1.1、1.2或1.3的生物复合物膜表面上，并培养9天。以胰蛋白酶-EDTA溶液分离细胞，此后使用Weber血球计数器分别在第1、3、6及9天计算细胞数目。
PHDF细胞在实施例1.1、1.2或1.3法人生物复合物膜上的生长情形原代分离的人类真皮纤维母细胞(primary human dermal fibroblasts，PHDF)是自实施包皮环状切除术患者所捐赠的人类包皮样品中分离而得的，并以DMEM纤维母细胞培养液(Cat No.12430，GIBCOBRL Company，USA)进行培养。皮肤样品的处理方法、放大细胞量的方法及计算细胞数目的方法都是相关领域公知的方法。简言之，将分离自儿童包皮细胞的第3-4代PHDF(P3-4)细胞，以2.0×104细胞/cm2的密度分别种植在实施例1.1、1.2或1.3的生物复合物膜表面及24孔的TCP组织培养盘上，并培养10天。以胰蛋白酶-EDTA溶液分离细胞，此后使用Weber血球计数器分别在第1、4、7及10天计算细胞数目。
1.4.5免疫组织染色分析
PHEK的免疫组织染色分析将衍生自儿童包皮的第4代PHEK细胞，以1.7×105细胞/cm2的密度分别种植在实施例1.1、1.2或1.3的生物复合物膜表面(1∶8及1∶20)及24孔的TCP组织培养盘上，并培养9天。在第1及6天将种植在生物复合物膜(1∶8及1∶20)表面上的PHEK细胞，分别以单克隆鼠抗-人套膜蛋白抗体(一抗，1∶200，United States Biological，Inc.)，和与罗丹明-结合的多克隆山羊抗-鼠IgG(二抗，1∶100，United States Biological，Inc.)标记，并放在荧光显微镜下观察细胞的生长情形。
PHDF的免疫组织染色分析将衍生自成人包皮的第3代PHDFK细胞，以2.0×104细胞/cm2的密度分别种植在实施例1.1、1.2或1.3的生物复合物膜(1∶8及1∶20)表面及24孔的TCP组织培养盘上，并培养10天。在第1、7及10天将种植在生物复合物膜(1∶8及1∶20)表面上的PHEK细胞，分别以单克隆鼠抗-人α-微管蛋白(tubulin)抗体(一抗，1∶200，Santa CruzBiological，Inc.)和与荧光素(FITC)-结合的多克隆山羊抗-鼠IgG(二抗，1∶100；Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.)标记，并放在荧光显微镜下观察细胞的生长情形。
1.4.6结果
图1示出从实施例1.2(图1A)及1.3(图1B)的生物复合物膜中所释出的蛋白质(即，明胶和/或明胶/胶原蛋白)含量结果。已知从一开始(即，24小时内)，无论是明胶或是胶原蛋白，都会快速地从生物复合物膜中释出，一直到培养后的第3天才会到达一稳定的平台期。此外，明胶的价格比胶原蛋白便宜许多且不易于受到细菌和酶的攻击，因此是一种可用来取代胶原蛋白并和PCL形成生物复合物膜的良好替代材料。同时，DSC热差分析也表明实施例1.2或1.3的生物复合物的熔点与PCL类似(表1)。
分别以SEM和免疫组织染色法来观察有或无细胞生长于其表面的上述合成的生物复合物膜的外形。SEM照片显示该些合成的生物复合物膜本身含有许多不规则的孔和纤维状结构，因此适合作为一种可供细胞于其上生长的支架(图2及3)。此外，也透过SEM照片(图4及5)、免疫染色(图6)及计算生长在该些生物复合物膜表面上的细胞数目(图7、8、9及10)等方法，来确认PHEK或PHDF细胞在依据本发明方法所制备而成之生物复合物膜表面上的生长情形。图7提供了PHEK细胞分别在实施例1.1及1.2之生物复合物上的生长情形的比较，至于PHDF细胞的生长情形比较结果则示于图8。从结果可发现，细胞在明胶/PCL生物复合物膜(实施例1.2)上的生长情形与在胶原蛋白/PCL生物复合物膜(实施例1.1)上的生长情形一样好，而在某些情况下，例如第9天的PHEK细胞或是第10天的PHDF细胞，细胞在明胶/PCL生物复合物膜(实施例1.2)上的生长情形甚至比在胶原蛋白/PCL生物复合物膜(实施例1.2)上的生长情形来得好，表示以明胶来取代胶原蛋白并不会对细胞生长造成不良的影响。类似的细胞生长结果也可在实施例1.3的生物复合物膜中看到。结果分别示于图9及10。
表1实施例1.2及1.3的生物复合物的热性质分析
Figure G2006800562290D00171
实施例2人工皮肤的制备
2.1藉由在实施例1的生物复合物膜上共同培养角质细胞和纤维母细胞来制备人工皮肤
藉由将角质细胞和纤维母细胞分别培养在实施例1的生物复合物膜的表面上，来制备出人工皮肤。简言之，将经过UV光照射灭菌后的生物复合物材料，固持在一种具有直径13毫米的无菌滤膜架(Swinnex)的共-培养装置的两个开放式的腔室中，其可容许细胞培养基质接触生物复合物材料膜的两个表面。接着，将PHEK细胞(1.7×105细胞/cm2第4代；源自儿童包皮组织)种植到该生物复合物膜的一个表面上，培养6天直到所培养细胞接近80％～90％全满程度(相较于培养在TCP培养盘上的PHEK细胞而言)。然后，以无菌的镍子将该含有生长至接近全满之PHEK细胞的生物复合物膜翻面，再将PHDF细胞(2.0×104细胞/cm2；第4代；源自儿童包皮组织)接续种植到该生物复合物膜的另一不含细胞的顶表面上，并再培养3天使该些纤维母细胞可黏附在该生物复合物膜上并生长。接着，再将此含有不同细胞于各表面的生物复合物膜再次翻面，并保持其在可浸泡于培养液的情况下继续培养6天，然后，将其抬高至可接触空气的高度继续培养10天以促使角质细胞分化。
以SEM(图11及12)，或是以可标记纤维母细胞或是角质细胞的特定抗体染色的免疫组化法(图13及14)，来观察生长在上述复合材料膜各表面上的细胞形态。图11的SEM照片示出生长在实施例1.1的生物复合材料膜上表面达35天的一层长满且分化之PHEK细胞，至于其之免疫染色照片则示于图13中。图12的SEM照片示出生长在实施例1.1的生物复合材料膜下表面达35天的一层PHDF细胞，至于其免疫染色照片则示于图14中。类似的结果也可在以实施例1.2或1.3的生物复合材料膜作为细胞生长支架而制成的人工皮肤中。
2.2PHEK及PHDF细胞在实施例2.1的人工皮肤中的交互作用
已知诸如口腔黏膜及皮肤之类的成人组织，其皮下纤维母细胞会藉由分泌各种蛋白质/多肽(例如，角质细胞生长因子(KGF)及肝细胞生长因子)来影响表皮的正常生长及伤口愈合期间表皮的再生过程。因此，为了探讨皮肤角质细胞与纤维母细胞两者在实施例2.1的人工皮肤中的相互作用，分别测量了在纤维母细胞与角质细胞共同培养然后，以及经过前-炎性细胞因子(IL-1β)(10ng/ml，R&D System，Oxford，UK)刺激后，由所培养的纤维母细胞中分泌出来的KGF含量。
将试验组及控制组分成A到F组，其中(A)为生长在TCP盘上的人类纤维母细胞；(B)为生长在有添加IL-1β的TCP盘上的人类纤维母细胞；(C)为生长在1∶20的实施例1.1生物复合物膜上的人类纤维母细胞；(D)为生长在有添加IL-1β及1∶20的实施例1.1生物复合物膜上的人类纤维母细胞；(E)与角质细胞在共同培养系统中(即，实施例2的人工皮肤)一同培养的人类纤维母细胞；(F)添加有IL-1β、且与角质细胞在共同培养系统中一同培养的人类纤维母细胞。
每一组的培养基在实验过程中保持不变，并于24至48小时后收集各组使用的培养基，储存在-80℃下。以ELISA来决定自各组细胞收集来的上清液中KGF蛋白质含量。
KGFELISA依据制造商所提供的操作手册来执行标准及相符细胞因子抗体对(R&D System)的人类KGF夹心ELISA试验。此试验识别天然及合成的KGF蛋白质，没有明显的交叉反应且不受其它细胞因子影响。简言之，在微滴定板上包被抗-KGF单克隆抗体(5μg/ml，溶于PBS溶液中)，静置隔夜，再以内含5％蔗糖、1％BSA及0.05％NaN3的PBS溶液封闭约1小时。所有培养均在室温下执行。在每一所述步骤间，皆以内含0.5％Tween 20的PBS溶液(pH 7.4)清洗3次。将稀释在内含0.1％BSA及0.05％Tween 20的Tris缓冲液(pH 7.3)中的标准物及测试样品分别加到微滴定板上的小孔中，并培养2小时。将生物素化的多克隆山羊抗人抗体(μg/ml)加到培养孔中，继续培养2小时。然后，在与链霉亲和素(streptavidin)HRP溶液一起培养20分钟后，加入四甲基联苯胺(tetramethylbenzidin，TMB)的颜色反应剂并培养30分钟，待其产生颜色。以1M的H2SO4将反应终止。在450nm下以自动平板读取器读其吸收值，参考波长则为570nm。
结果图15显示24小时后，相较于未添加IL-1β、但培养在相同条件下的细胞(A组)来说，IL-1β可以明显促进培养在TCP盘上的纤维母细胞(B组)分泌KGF(n＝3+SE；p＝0.01)。但是，在其它组细胞中则无此效果。细胞因子IL-1β的效果已在此试验中获得证实，即细胞因子IL-1β可于24小时内诱发生长在TCP盘上的PHDF细胞分泌KGF。但是，此效应可能肇因于将皮肤角质细胞与纤维母细胞一起培养而产生的细胞-细胞间的变化和/或细胞-基质间的交互作用，因此可排除前-炎性细胞因子刺激、和/或特定的细胞培养环境(即，该胶原蛋白/PCL生物复合物膜)的影响。
实施例3以实施例2的人工皮肤进行活体内动物试验
3.1活体内动物试验
本实验中所使用的动物为已切除胸腺的小鼠。所有动物的取得、饲养与研究均系依照国防医学院动物饲养中心及动物使用委员会所订定的操作准则来进行。
将本试验中所使用的小鼠随机分成3组，并在每一组小鼠背上皮肤以手术方式创造出一深达脂膜肌且直径为1.2公分的圆形伤口。然后，分别将实施例2的人工皮肤(n＝3)或是实施例1.1的生物复合物膜(空白不含细胞的生物复合物膜组，n＝3)，以手术方式移植到该些圆形的皮肤伤口上；其中控制组小鼠(n＝3)皮肤上的伤口则是不进行任何移植处理。将移植物(实施例2的人工皮肤或是实施例1.1的生物复合物膜)以4号缝线环绕着伤口缝合，然后再覆盖上内含DMEM/明胶/琼脂/10％FCS的胶状基质(其上覆有Tagaderm
Figure G2006800562290D00201
透明膜)，然后再以弹性的Omnifix不织布胶带(Hartmann Inc.，Spain)加以密封及固定。在本试验中，不使用纱布敷料也不给予受术后治疗。手术1周后，拆除所有的敷料及缝线，纪录数据后，让伤口接触空气并自行痊愈。经由(1)在活体实验期间定期对伤口区域照相；(2)由主要研究员对伤口大小及外观进行评估；及(3)组织染色分析，来对移植物及含有该移植物之皮肤表面区域进行临床评估。
图16的照片显示将实施例2的人工皮肤移植到一已切除胸腺的小鼠皮肤上的过程。图17的照片是同一只小鼠分别在以下时间点所拍摄的照片，包括(A)移植了实施例2之人工皮肤并以手术缝线加以固定后；(B)实验第0天在伤口上覆盖了胶状基质后；及后续在(C)第7天及(D)第28天时所拍摄的照片。在成功移植了人工皮肤的第7到9天时，已可观察到伤口完全愈合。到了第28天时，皮肤已经恢复光滑，而且看不出手术后的刀痕。
图18及19为小鼠皮肤伤口经过实施例1.1的生物复合物膜处理或是未接受任何移植物处理(控制组)的照片。无论是以不含有细胞的生物复合物膜处理的伤口或是未经任何移植物处理之控制组的伤口，其均可在第7天完全愈合，同时在此两组实验动物中还可看到自发性的皮肤再生以及后续的伤口体积缩小现象，并在第19天时看到伤口完全封闭(图18(D))。
3.2组织学研究及免疫组织染色
将实施例3.1中的小鼠牺牲后，切下其身上包括有该生物复合物膜及其相邻组织在内的组织样品，制成冷冻切片及石腊包埋的组织片，分别以H&E和Gomori三原色染色法及免疫组织染色来进行组织学研究。
3.2.1免疫组织染色
以免疫组织分析来确认PHEK或PHDF细胞在任何一已移植到实验小鼠(已切除胸腺)背上的人工皮肤的任一表面上的生长情形。以单克隆鼠抗-人套膜蛋白抗体(1∶200，United States Biological，Inc.)来标记PHEK细胞。用来检测套膜蛋白的二抗则是与罗丹明-结合的山羊抗-鼠IgG抗体(1∶100，United States Biological，Inc.)。
此外，也可使用不会和小鼠或大鼠交叉反应的单克隆鼠抗-人D7-F18抗体(1∶200，Novus
Figure G2006800562290D00211
Biological，Inc.)以及与罗丹明-结合的山羊抗-鼠IgG的二抗(1∶100，United States Biological，Inc.)来标记PHEK或PHDF细胞。因此，在活体人工皮肤中，源自人类的纤维母细胞/表皮细胞可单独呈现红色荧光的染色。
3.2.2以石腊包埋的苏木素(Hematoxylin)及曙红-Y(Eoxin-Y)(H&E)染色法所进行的组织学研究
以H&E染色法来对石腊包埋的组织片染色，藉以区分出不同细胞状态下的细胞核(蓝黑色)和细胞质(粉红色)，该些状态包括细胞黏附、生长及分布在皮肤替代物(体内已移植到实施例3.1活体小鼠的背上伤口)表面上等不同状态。
简言之，以10％的福尔马林溶液将所获得的老鼠组织加以固定，然后再将其包埋在石腊中并保存在-20℃的冰箱内。以切片机(MicromHM 400)将组织样品横切成厚度10μm的薄片。将样品薄片放在30℃的漂浮浴(Fisher
Figure G2006800562290D00213
Tissue PrepTM Flotation Bath Model 134)中，然后在25℃的水浴中冷却后再转移到载玻片上。将含有组织样品的载玻片放在56℃的烤箱中烘烤15到20分钟以去除腊，然后再浸泡在对二甲苯的溶液中5分钟两次，接着以99％的酒精清洗1到3分钟。以自来水冲洗载玻片底面约30秒，将载玻片浸泡在苏木素溶液(Harris hematoxylin)中约1到5分钟。再次以自来水冲洗载玻片底面约30秒，然后，分别以50％和70％的酒精清洗1分钟。将这些载玻片浸泡在1％的曙红-Y中约5至10分钟，接着分别以75％、80％、90％、95％的酒精清洗1分钟。再次将载玻片浸泡在99％的乙醇/二甲苯(1∶1)溶液中约1分钟。接着浸泡在二甲苯溶液中5分钟，两次。以封片溶液(mounting solution)对该些载玻片进行封片，然后置于抽风柜内干燥约4小时。以一光学显微镜来检视制作完成的载玻片。
3.2.3以冷冻切片及Gomori三原色染色法(Gomori’s trichrome staining)所进行的组织学研究
Gomori三原色染色法是在添加有冰醋酸之磷酸钨的酸性溶液中合并血浆染色(铬变素2R)及结缔纤维染色(淡绿SF)的一种标准染色程序。挑选此种染色法系为了区分细胞黏附、生长及分布在含有共同培养之细胞的人工皮肤表面上时，其细胞核(蓝黑色)、细胞质(红色)及胶原蛋白(绿色)等的分布情形。以葛莫里三色染色法来评估在此含有共同培养之细胞的人工皮肤表面上的组织学变化情形。首先，先从已切除胸腺的小鼠身上取得其组织样品的冷冻切片；接着，将其以甲醇/丙酮(1∶1)溶液在4℃下固定约30分钟；然后，于浓度递减的乙醇溶液(100％、2次；90％、80％及70％)中进行含水再湿润处理约5分钟，每次都接续以自来水进行清洗。然后，将样品浸泡在苏木素溶液(Harris hematoxylin)中约5分钟，并接续以自来水进行清洗直到水没有颜色为止。然后，将样品置于葛莫里三色染色溶液中(A溶液)约25分钟，并迅速以蒸馏水及清洗溶液(B溶液)清洗约5分钟。最后，在浓度递增的乙醇溶液(95％×2次；100％×2次)中将样品脱水，每次5分钟，然后放在载玻片上以光学显微镜观察。因为在染色过程中，二甲苯会对胶原蛋白:PCL生物复合物膜的结构造成不良影响，因此，在此研究中并未使用二甲苯。
3.2.4结果
图20显示PHEK细胞在移植了实施例2的人工皮肤的无胸腺小鼠背上，经过43天后的免疫染色情形，其中以箭头示出表现出强烈红色荧光的PHEK细胞。可看到快速的伤口覆盖及伤口愈合现象，包括生成已分化的表皮细胞层，真皮层出现丰富、规则的平行排列的胶原蛋白以及在皮肤替代物周围区域新生的毛囊组织(图21-23)。此外，可经由抗人类D7-F18抗体的小鼠单株抗体(其不会与小鼠或大鼠产生交叉反应)及上述与罗丹明结合之山羊抗小鼠IgG的二抗来对纤维母细胞染色，确认在移植物中残存高达225天的人类纤维母细胞/表皮细胞，表示实施例的人工皮肤被成功地移植到活体内，其中以箭头指出人工皮肤真皮层中的强烈红荧光(图23)。
但是，对未接受任何移植处理的小鼠来说，亦即，保留有开放性伤口的小鼠，则显示出相对来说较缓慢的伤口愈合过程，其中所形成之已分化的表皮层较薄，真皮层中沉积的胶原蛋白/ECM结构较为松散，且找不到新生的毛囊细胞(图24-26)。此外，在任一小鼠背上手术位置处的皮肤中也没有源自人类的纤维母细胞/表皮细胞(图26)。相反的，对于接受实施例1.1不含细胞的生物复合物(空白生物复合物(blank biocomposite))移植的小鼠来说，其表现出相对来说较快速的愈合过程，生成已分化的表皮层，真皮层中沉积有较高量的胶原蛋白/ECM，且在皮肤替代物周围可找到少量新生的毛囊组织(图27-29)。此外，在任一实验动物背上手术位置处的皮肤中也没有源自人类的纤维母细胞/表皮细胞(图29)，此结果和具有开放性伤口的实验动物组的结果一致。
产业利用性
本发明优点在于可提供一种皮肤替代物，其可以是一种没有活细胞的生物复合物膜，包含PCL及至少一种选自胶原蛋白及明胶的材料；或是提供一种人工皮肤，其包含有培养在该生物复合物膜至少一表面上的活细胞。在一较佳实例中，该不含活细胞的生物复合物膜系由PCL和一种较便宜、可取代胶原蛋白的材料(即，明胶)所制成的。明胶的成本约只有胶原蛋白的十分之一，但其可表现出与胶原蛋白相同的效果，也使得白明胶成为一种可用来制造人工皮肤之相当具有竞争力的生物材料。本发明不含活细胞的生物复合物膜制造简单且使用方便，可长期保存并可直接当作敷料施用在皮肤伤口上。至于包含有活细胞(生长在该生物复合物膜的至少一表面上)的人工皮肤也可直接用于活体，来修补皮肤伤口。在一较佳实例中，该人工皮肤包含有角质细胞，其培养在该生物复合物膜的一表面上；及纤维母细胞，其系培养在该生物复合物膜的另一表面上。
虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种改变及修改，因此本发明的保护范围当以后附权利要求所界定者为准。

Claims (3)

1.一种用以促进伤口愈合和/或组织再生的生物复合物膜，其特征在于，所述生物复合物膜为由聚（ε-己内酯）及明胶所组成，且所述聚（ε-己内酯）及所述明胶的重量比在4：1到20：1间。
2.一种用以促进伤口愈合和/或组织再生的生物复合物膜，其特征在于，所述生物复合物膜为由明胶、胶原蛋白及聚（ε-己内酯）所组成，其中所述明胶与所述胶原蛋白的混合溶液和所述聚（ε-己内酯）在所述生物复合物膜中的重量比在1：8到1：20间，且基于所述混合溶液的总重为100重量百分比，所述混合溶液的所述胶原蛋白为10重量百分比至25重量百分比。
3.一种用以促进伤口愈合和/或组织再生的生物复合物膜，其特征在于，所述生物复合物膜为由胶原蛋白及聚（ε-己内酯）所组成，且所述聚（ε-己内酯）及所述胶原蛋白的重量比在4：1到20：1间。
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