CN107296981B - 一种蚕丝蛋白生物支架及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蚕丝蛋白生物支架及其制备方法和应用，采用野生型家蚕品种通过家蚕育种技术改变家蚕的吐丝生理习性获得可用于创伤修复的蚕丝蛋白生物支架，该生物支架保持蚕丝蛋白的天然结构和活性，具有蚕丝蛋白的“原生态”特性；本发明所述的蚕丝蛋白生物支架具有多孔的结构，透气性好；具有很强的机械强度；具有高生物相容性。所述蚕丝蛋白生物支架具有良好的生物相容性和细胞粘附性，可长期支持细胞的存活、增殖与迁移；该蚕丝蛋白生物支架，可用于细胞外基质支持细胞生长和促进营养物质交换，可作为一种医学填充材料，可应用于多种组织损伤的修复和疾病的治疗。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，涉及一种蚕丝蛋白，具体为一种蚕丝蛋白生物支架及其制备方法和应用。
背景技术
蚕丝蛋白(含丝素蛋白和丝胶蛋白)是由家蚕分泌的一种天然动物蛋白，含有18种氨基酸，不仅具有可降解、抗菌、抗癌、抗氧化、抗凝血、亲水、保湿、低免疫原性以及促进细胞粘附和增殖等生物活性，而且富有氨基、羟基、羧基等利于修饰或改造的活性基团，如今蚕丝蛋白作为一种重要的组织工程材料在医药领域具有广泛的用途。
近年来，人们基于蚕丝蛋白开发了不同类型的组织工程材料，如丝蛋白水凝胶，蚕丝蛋白膜，蚕丝蛋白海绵样材料，丝蛋白纳米纤维，纳米粒和丝蛋白与其他材料制备的各种复合材料等。然而到目前为止，基于蚕丝蛋白医用材料的研发，主要基于单独的丝素或丝胶，这是由于相当长一段时间内，人们怀疑丝胶蛋白是导致丝胶蛋白产生免疫原性的元凶。近年来研究表明，单独的丝素或丝胶并不会产生免疫原性。尽管有个别报道丝胶与丝素在一起会产生免疫原性，但是，他们采用的丝素与丝胶蛋白均是经过后续处理，丝蛋白的天然结构和生物活性已遭受严重破坏，这也很可能是有关蚕丝蛋白具有免疫原性的原因所在。另外，目前有关蚕丝蛋白生物支架的制备工艺也较为复杂，成本较高且机械性能不佳。天然的丝蛋白(含丝素和丝胶)具有良好的机械性能，优异的稳定性和“原生态”的生物活性。因此，如何开发具有天然结构和活性的蚕丝蛋白新型材料具有十分重要的意义。另一方面，蚕蛹已成为人们餐桌上的美食，我们知道蚕是在蚕茧中化蛹的，即蚕蛹是包裹于蚕茧中的，当前蚕蛹生产主要采用人工刀削的方式从蚕茧中取出蚕蛹，费力费时，生产成本高，另外切割蚕茧取蛹过程中也破坏了丝蛋白，不能再用于缫丝，丝蛋白的经济价值显著下降。因此，通过改变家蚕的生理特性，让家蚕吐出的丝形成一个平面而非形成茧状蚕丝蛋白支架，让蚕蛹与蚕茧自然分离，不仅获得了高经济价值的蚕丝蛋白生物支架，同时也为蚕蛹生产提供了便捷。
发明内容
解决的技术问题：为了克服现有技术的缺陷，本发明通过调控家蚕的吐丝平台，改变家蚕吐丝习性，从而选育适用于生产天然蚕丝蛋白生物支架的家蚕品种同时直接生产可用于创伤修复的蚕丝蛋白生物支架；此外，本发明提供了由上述方法制得的蚕丝蛋白生物支架，以及该敷料在生物医用材料等领域中的应用。再则，本发明为获得无创蚕蛹提供了便利，蚕蛹与丝蛋白是分离开的，省时省力，可以显著提高蚕业生产的价值。
技术方案：一种蚕丝蛋白生物支架，所述生物支架的成分为丝胶蛋白和丝素蛋白。
优选的，所述丝胶蛋白和丝素蛋白来源于非丝素缺失型家蚕品种。
进一步的，所述家蚕品种为菁松A或白玉。以上品种均由中国农业科学院蚕业研究所保存。
一种蚕丝蛋白生物支架的制备方法，包含以下步骤：
(1)构建家蚕吐丝平台，选用平整的台基，首先在台基上覆盖吸水纸或吸水布，再覆盖一层2～30目的尼龙网或棉布网；
(2)将野生型家蚕饲养至5龄熟蚕期，待家蚕体内排泄干净后，将其转移至步骤(1)构建的平台上，每批次家蚕的投放密度为250头/平方米以下；
(3)家蚕完成吐丝并化蛹后，选取健康的家蚕蛹用于化蛾、制种传代；
(4)将步骤(3)留种的家蚕按步骤(2)的方式饲养，并重复步骤(3)；
(5)重复传代10～15代后，按照步骤(2)的方式饲养，待家蚕吐丝完成，将网与下层纸或布分开，再从网上分离蚕丝蛋白，即可获得蚕丝蛋白生物支架。蚕丝蛋白生物支架的厚度可以通过控制单位面积吐丝家蚕的数量和上蚕的批次来实现。
所述蚕丝蛋白生物支架在生物医用材料中的应用。
所述蚕丝蛋白生物支架在细胞载体中的应用。
有益效果：(1)本发明首次采用野生型家蚕品种结合家蚕育种技术通过改变家蚕的吐丝生理习性获得可用于创伤修复的蚕丝蛋白生物支架，该生物支架具有丝胶蛋白的天然结构和活性，保持了蚕丝蛋白的“原生态”特性；同时本方案获得的丝蛋白生物支架生产工艺简单，成本低廉，具有可推广性；(2)通过本发明所述方法制得的蚕丝蛋白生物支架具有多孔结构，透气性好，可降解性和优异的机械强度；(3)本发明所述家蚕丝蛋白生物支架具有良好的生物相容性和细胞粘附性，可长期支持细胞的存活、增殖与迁移；(4)该生物支架可用于细胞外基质支持细胞生长和促进营养物质交换，可作为一种医用填充材料，可应用于多种组织损伤的修复和疾病的治疗。
附图说明
图1是家蚕吐丝平台结构示意图；
图2是蚕丝蛋白生物支架结构图；
其中A为宏观结构图，B为微观结构图；
图3是蚕丝蛋白生物支架孔隙率统计图；
图4是蚕丝蛋白生物支架水平衡图；
图5是蚕丝蛋白生物支架在不同pH环境中的降解曲线图；
图6是蚕丝蛋白生物支架的机械性能测试图；
图7是蚕丝蛋白生物支架的热稳定性图；
图8是蚕丝蛋白生物支架的X衍射图；
图9是小鼠成皮肤成纤维细胞NIH3T3细胞活力检测图；
图10是蚕丝蛋白生物支架中细胞迁移图；
图11是蚕丝蛋白生物支架3D细胞培养图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1制备家蚕蚕丝蛋白生物支架
(一)选择家蚕品种
选用野生型家蚕品种(由中国农业科学院蚕业研究所保存并向外商业化提供)，该类家蚕品种所吐的丝蛋白中包含丝胶蛋白和丝素蛋白。
(二)制备家蚕吐丝平台
选用厚度为2cm的干燥木材或纸板制作一个直径和高度均为50cm的圆柱体(基座)。将基座放在一个平整的台面上，在其向上的一面覆盖4层厚度为0.5mm的经高温灭菌的新闻纸。然后再在纸上覆盖一层棉纱网(10目)，并将棉纱网的边缘固定。
(三)选育家蚕品种
选取家蚕野生型品种(菁松A或白玉)，在标准环境下(1-2龄28℃，3-5龄25℃)，选用新鲜桑叶饲喂，采用一日三回育。待家蚕5龄不再食桑时，将蚕放置在一个铺有吸水纸的蚕匾中，等家蚕体粪便排泄干净后，再将家蚕转移到步骤(二)制作的家蚕吐丝平台上。让家蚕在平台上吐丝，人员在旁边观察，如发现有家蚕在平台上掉下，立即将其放回平台。待家蚕吐完丝后即在平台上化蛹。待化蛹结束，挑选化蛹正常的个体化蛾后交配留种，其余淘汰。按此种方法选育20代以上，即可获得适应于在平台上吐丝的丝素缺失型家蚕新品种。
(四)制备蚕丝蛋白生物支架
选取由步骤(三)选育后的家蚕品种进行饲养，饲养方法同步骤(三)所述。待家蚕5龄止桑后，将家蚕转移到铺有吸水纸的蚕匾中，当它们体内粪便排泄干净后，再将蚕放在步骤(二)制作的吐丝平台上，每平方米放置50头蚕。24小时后，此时，家蚕已吐丝完毕，将该批家蚕转移走。然后再重新放置50头即将吐丝的家蚕，同样24小时后，待家蚕吐丝完毕，然后转移，再重新放50头即将吐丝的家蚕。24小时后，将家蚕移去。将附有蚕丝蛋白的网轻轻取下，然后将网慢慢揭除，则即可获得一定厚度的蚕丝蛋白生物支架。
如图1所示，家蚕吐丝平台由三部分构成，下层基座为一个平整的平台。中间一层为吸水层(具有吸水和透气性强的纸或布)，最上层为网(尼龙网或棉纱网)。
对上述方法制备获得的蚕丝蛋白生物支架进行性能测试，结果如下：
如图2所示，其中A为家蚕蚕丝蛋白生物支架的宏观图，由普通数码相机拍摄；B为家蚕蚕丝蛋白生物支架的微观结构图，为电子扫描电镜照片。从B图可见，蚕丝蛋白生物支架为纤维状的丝胶蛋白交织构成的多孔的结构。具有良好的透气性。
蚕丝蛋白生物支架的孔隙率的测定采用超纯水作为替代溶液。将干重质量为w1的样品置于超纯水中，1小时后取出并去除样品表面多余的水后称得样品的重量为w2，则样品的孔隙率即为(w2-w1)/w2×100％。结果如图3所示。
将干燥的蚕丝蛋白生物支架(质量为Wd)置于超纯水中，24h后去除表面多余的水，取出其质量为Ws。则创伤敷料的水平衡为：结果如图4所示。
对于测试蚕丝蛋白生物支架在不同pH环境中的降解，将蚕丝蛋白生物支架浸泡于不同pH值(pH 3.0、pH 7.4、pH 11.0)的PBS溶液中，置于37℃恒温培养箱中，每日更换一次PBS溶液，在预设的时间点，取出、干燥、称重。结果如图5所示：蚕丝蛋白生物支架降解具有pH响应性，其中在pH 11.0的碱性条件下降解速率最快，8周的降解率为22％，而在中性(pH7.4)和酸性(pH 3.0)环境中的降解率分别仅为11％和13％。另外，无论在碱性(pH 11.0)，中性(pH 7.4)和酸性(pH 3.0)环境中条件下，蚕丝蛋白生物支架在不同pH环境下在第一天内降解速度都较快，达6％左右，此后降解速度变慢。
蚕丝蛋白生物支架的拉伸强度由万能材料测试机(Instron 5848MicroTester,USA)测得，结果如图6所示，其拉伸强度高达9.6MPa。表明该创伤敷料具有良好的拉伸强度，能够满足手术缝合的需要且不易破损。
采用同步热分析仪(NETZSCH STA 449F3,Germany)检测蚕丝蛋白生物支架热重变化和在相变时熔点的变化。程序升温范围为40～800℃，每分钟升温10℃。如图7所示：蚕丝蛋白生物支架的分解温度为215.7℃、321.7℃和414.2℃。
蚕丝蛋白生物支架的X衍射分析，将丝胶蛋白创伤敷料剪成圆形片状，采用转靶X射线衍射仪(型号：D/MAX-RB,日本RIGAKU公司)测试。结果如图8所示，蚕丝蛋白生物支架的2θ角为21.58°。
实施例2家蚕蚕丝蛋白生物支架用作细胞载体
(一)小鼠成皮肤成纤维细胞(NIH3T3)蚕丝蛋白生物支架细胞活力检测
(1)首先将蚕丝蛋白生物支架剪片状，然后用灭菌PBS洗3次，再用75％乙醇浸泡1小时，最后用已灭菌PBS洗1次，置于室温备用。
(2)将从细胞培养瓶收集的细胞经悬浮，吹散，种植于96孔细胞培养板中，待细胞贴壁后将步骤(1)中预处理的蚕丝蛋白生物支架转入到含有细胞的培养板中，每孔放置一片蚕丝蛋白生物支架。未放置蚕丝蛋白生物支架的细胞培养孔作为对照。细胞培养所用培养基为DMEM高糖培养基，细胞置于细胞培养箱(37℃，CO2浓度为5％，湿度为100％)中培养。
如图9所示，采用CCK8方法检测细胞在种植后2天和3天后细胞的活力。结果显示：蛋白创伤敷料对小鼠皮肤成纤维细胞(NIH3T3)蚕丝蛋白生物支架和对照组在细胞活力方面没有显著性差异，结果表明，蚕丝蛋白生物支架具有良好的细胞相容性。
(二)蚕丝蛋白生物支架的细胞迁移检测
所用细胞系为小鼠皮肤成纤维细胞(NIH3T3)。
(1)首先将蚕丝蛋白生物支架剪圆形片状，然后用灭菌PBS洗3次，再用75％乙醇浸泡1小时，最后用已灭菌PBS清洗1次，置于24孔细胞培养板中。
(2)将从细胞培养瓶收集的细胞经悬浮、吹散、种植于步骤(1)含有蚕丝蛋白生物支架的细胞培养板中，初始种植细胞数进行计数。待细胞贴壁后，将蚕丝蛋白生物支架转移到新的24孔细胞培养板中。再统计培养板中各孔剩余的细胞数量，则得知蚕丝蛋白生物支架上初始种植细胞数量。
此后，每隔一天将蚕丝蛋白生物支架转移到新的细胞培养板中一次，同时统计原培养板中相对应的孔中剩余的细胞数并作好记录。最后进行统计分析。细胞培养所用培养基为DMEM高糖培养基，细胞放于细胞培养箱(37℃，CO2浓度为5％，湿度为100％)中培养。
结果如图10所示，在统计的24天内细胞从蚕丝蛋白生物支架中迁移出的细胞呈现持续增长的现象。表明蚕丝蛋白生物支架具有良好的细胞相容性，能够长期支持细胞的存活、增殖与迁移。
(三)蚕丝蛋白生物支架的3D细胞培养
所用细胞系为GFP稳转的人神经母细胞瘤细胞系SHSY5Y。
首先将蚕丝蛋白生物支架剪圆形片状，然后用灭菌PBS洗3次，再用75％乙醇浸泡1小时，最后用已灭菌PBS洗1次，置于24孔细胞培养板中。接下来将从细胞培养瓶收集的细胞经悬浮，吹散，种植于含有蚕丝蛋白生物支架的细胞培养板中。2天后将含有蚕丝蛋白生物支架的样品取出用激光共聚焦进行观察和拍照。如图11所示，蚕丝蛋白生物支架中的细胞生长状态良好。结果表明蚕丝蛋白生物支架具有良好的细胞相容性，可以作为细胞的载体。
Claims (5)
1.一种蚕丝蛋白生物支架，其特征在于，所述生物支架的成分为丝胶蛋白和丝素蛋白；所述生物支架由以下方法制得：（1）构建家蚕吐丝平台，选用平整的台基，首先在台基上覆盖吸水纸或吸水布，再覆盖一层2～30目的尼龙网或棉布网；（2）将野生型家蚕饲养至5龄熟蚕期，待家蚕体内排泄干净后，将其转移至步骤（1）构建的平台上，每批次家蚕的投放密度为250头/平方米以下；（3）家蚕完成吐丝并化蛹后，选取健康的家蚕蛹用于化蛾、制种传代；（4）将步骤（3）留种的家蚕按步骤（2）的方式饲养，并重复步骤（3）；（5）重复传代10～15代后，按照步骤（2）的方式饲养，待家蚕吐丝完成，将网与下层纸或布分开，再从网上分离蚕丝蛋白，即可获得蚕丝蛋白生物支架。
2.根据权利要求1所述的一种蚕丝蛋白生物支架，其特征在于，所述丝胶蛋白和丝素蛋白来源于非丝素缺失型家蚕品种。
3.根据权利要求2所述的一种蚕丝蛋白生物支架，其特征在于，所述家蚕品种为菁松A或白玉。
4.权利要求1～2任一所述蚕丝蛋白生物支架在制备生物医用材料中的应用。
5.权利要求1～2任一所述蚕丝蛋白生物支架在制备细胞载体中的应用。
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