CN104721889B - 一种复合聚丙烯网片及其制备方法 - Google Patents
一种复合聚丙烯网片及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种复合聚丙烯网片，由聚丙烯网片和成纤维细胞生长因子通过聚多巴胺键合而成。本发明在不改变原有聚丙烯网片力学强度及表面结构的前提条件下，在聚丙烯网片表面接枝聚多巴胺后，再在聚多巴胺表面接枝成纤维细胞生长因子，不会产生复合网片分离的现象。同时，成纤维细胞生长因子在体内不易降解，并且可以诱导成纤维细胞生长，从而诱导筋膜重建。
Description
技术领域
本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种复合聚丙烯网片及其制备方法。
背景技术
女性盆底功能障碍性疾病是50岁以上中老年妇女的常见病、多发病，给中老年妇女的生活和健康造成严重的影响。目前的治疗方法是用一些医用聚丙烯类合成材料的网带或片，通过外科手术进行盆底功能重建。
强生公司设计的盆底功能重建聚丙烯网片，干重约50g/m2，研究人员对网片的编织工艺加以改进，使网片的每条纤维更细，孔径更大，重量更轻，以期减轻副反应。虽然编织工艺改进了，但单纯的聚丙烯网片还是具有组织侵蚀性的缺点，其生物相容性差，较难与植入后的组织发生融合，再加上在体内老化变硬变脆、摩擦、位移、蚀穿等作用，常发生刺穿膀胱、阴道等不良并发症。
针对上述问题，市场上出现了采用可吸收材料制作的网片。申请号为201110203098.7的中国专利公开了一种用于女性盆底的生物复合补片，该复合补片是在聚丙烯网片的表面包裹有动物供体的膀胱脱细胞基质，但是，上述生物复合补片降解速度太快，容易导致术后薄弱区域复发，而且动物来源的脱细胞基质可能携带有病毒、细菌等，存在免疫抗原性等问题，需抗原灭活等。同时，附件膜贴附在网片表面，存在多层结构，不利于手术中操作使用等制约了临床推广。
申请号为201110270972.9的中国专利公开了一种壳聚糖挂膜聚丙烯网片及其制备方法。该网片是在所述聚丙烯网片上涂覆有一层壳聚糖膜，具体方法为：将洁净的聚丙烯网片浸泡于铸膜液中，直至在所述聚丙烯网片上涂覆一层壳聚糖膜，制得壳聚糖挂膜聚丙烯网片。但上述聚丙烯网片中壳聚糖的降解速度快，并且壳聚糖挂膜与聚丙烯网片结合不紧密，易分离，不利于临床使用。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种复合聚丙烯网片及其制备方法，本发明提供的复合聚丙烯网片不易降解，不会产生复合网片分离的现象。
本发明提供了一种复合聚丙烯网片，由聚丙烯网片和成纤维细胞生长因子通过聚多巴胺键合而成。
本发明还提供了一种复合聚丙烯网片的制备方法，包括以下步骤：
A)将聚丙烯网片置于多巴胺水溶液中进行反应，得到聚多巴胺-聚丙烯网片；
B)将所述聚多巴胺-聚丙烯网片置于成纤维细胞生长因子溶液中进行反应，得到复合聚丙烯网片。
优选的，所述多巴胺水溶液的浓度为0.1～3mg/ml。
优选的，所述多巴胺水溶液的pH值为7.2～10。
优选的，步骤A)中所述反应的温度为5～40℃。
优选的，步骤A)中所述反应的时间为0.1～48h。
优选的，成纤维细胞生长因子溶液的浓度为5～200μg/ml。
优选的，步骤B)中所述反应的温度为0～40℃。
优选的，步骤B)中所述反应的时间为0.1～96h。
优选的，在步骤A)之前，还包括将聚丙烯网片置于体积分数为75％～95％的乙醇溶液中进行表面处理。
与现有技术相比，本发明提供了一种复合聚丙烯网片，由聚丙烯网片和成纤维细胞生长因子通过聚多巴胺键合而成。本发明在不改变原有聚丙烯网片力学强度及表面结构的前提条件下，在聚丙烯网片表面接枝聚多巴胺后，再在聚多巴胺表面接枝成纤维细胞生长因子，不会产生复合网片分离的现象。同时，成纤维细胞生长因子在体内不易降解，并且可以诱导成纤维细胞生长，从而诱导筋膜重建。
结果表明，将复合聚丙烯网片植入体内后，该网片可以促进组织的再生和减少组织的异物反应。
附图说明
图1为实施例1提供的聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片的光镜切片图；
图2为实施例1提供的聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片的表面分析图；
图3为实施例1提供的聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片的成纤维细胞粘附和生长荧光图片；
图4为实施例1提供的聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片的植入体内后组织切片的HE染色图。
具体实施方式
本发明提供了一种复合聚丙烯网片，所述复合聚丙烯网片由聚丙烯网片和成纤维细胞生长因子通过聚多巴胺键合而成。
本发明提供的复合聚丙烯网片以聚多巴胺为桥连介质，其中，多巴胺是一种神经传导物质，来源于生物体，安全可靠。通过所述聚多巴胺，将聚丙烯网片与成纤维细胞生长因子键合。所述成纤维细胞生长因子(bFGF)在体内不易降解，并且可以诱导成纤维细胞生长，从而诱导筋膜重建。
本发明在不改变原有聚丙烯网片力学强度及表面结构的前提条件下，在聚丙烯网片表面接枝聚多巴胺后，再在聚多巴胺表面接枝成纤维细胞生长因子，不会产生复合网片分离的现象。同时，成纤维细胞生长因子在体内不易降解，并且可以诱导成纤维细胞生长，从而诱导筋膜重建。将上述复合聚丙烯网片植入体内后，该网片可以促进组织的再生，并可以减少组织的异物反应。
本发明还提供了一种复合聚丙烯网片的制备方法，包括以下步骤：
A)将聚丙烯网片置于多巴胺水溶液中进行反应，得到聚多巴胺-聚丙烯网片；
B)将所述聚多巴胺-聚丙烯网片置于成纤维细胞生长因子溶液中进行反应，复合聚丙烯网片。
在聚丙烯网片与多巴胺水溶液进行反应之前，本发明首先将聚丙烯网片进行预处理，即，将所述聚丙烯网片置于体积分数为75％～95％的乙醇溶液中进行表面处理，以去除杂质，并且可以达到灭菌的目的。
本发明将预处理的聚丙烯网片置于多巴胺水溶液中进行反应，得到聚多巴胺-聚丙烯网片。
本发明所述的多巴胺水溶液按照如下方法进行配置：将所述成纤维细胞生长因子溶解于10mM的Tris-HCl缓冲液中，再调节pH值至7.2～10，得到多巴胺水溶液。所述多巴胺水溶液的浓度为0.1～3mg/ml，优选为0.5～2.5mg/ml。所述pH值优选为8～9。
将得到的多巴胺水溶液进行过滤除菌，本发明对所述过滤除菌的方法并没有特殊限制，本领域技术人员公职的过滤除菌方法即可。在本发明中，优选采用规格为0.22μm的滤膜进行过滤除菌。
将上述经过预处理的聚丙烯网片置于过滤除菌的多巴胺水溶液中进行反应，得到聚多巴胺-聚丙烯网片。所述反应为聚多巴胺接枝到聚丙烯网片表面；所述反应的温度优选为5～40℃，更优选为10～30℃；所述反应的时间优选为0.1～48h，更优选为10～30h。反应结束后，将上述网片用去离子水清洗，再用氩气流吹干，得到洁净的聚多巴胺-聚丙烯网片。
将所述聚多巴胺-聚丙烯网片置于成纤维细胞生长因子溶液中进行反应，得到复合聚丙烯网片。
本发明所述成纤维细胞生长因子溶液按照下述方法进行配置：将所述成纤维细胞生长因子溶解于10mM的Tris-HCl缓冲液中，在调节pH值至7.2～10，离心分离后得到成纤维细胞生长因子溶液。其中，所述成纤维细胞生长因子溶液中成纤维细胞生长因子的浓度为5～200μg/ml，优选为10～100μg/ml。所述pH值优选为8～9。
将得到的成纤维细胞生长因子溶液进行过滤除菌，本发明对所述过滤除菌的方法并没有特殊限制，本领域技术人员公职的过滤除菌方法即可。在本发明中，优选采用规格为0.22μm的滤膜进行过滤除菌。
将所述聚多巴胺-聚丙烯网片置于经过过滤除菌的成纤维细胞生长因子溶液中进行反应，得到复合聚丙烯网片。所述反应为将成纤维细胞生长因子接枝到聚多巴胺-聚丙烯网片表面，得到成纤维细胞生长因子-聚多巴胺-聚丙烯网片，即复合聚丙烯网片。所述反应的温度优选为0～40℃，更优选为10～30℃；所述反应的时间优选为0.1～96h，更优选为10～30h。反应结束后，将上述网片用去离子水清洗，再用氩气流吹干，得到洁净的聚多巴胺-聚丙烯网片。
本发明制备得到的复合聚丙烯网片无需改变原有聚丙烯网片的力学强度和表面结构，并且无需改变原有聚丙烯网片的裁剪和形状特点以及手术方法。本发明接枝过程简单，反应条件温和，在无菌水溶液中即可完成纤维细胞生长因子的接枝，既保证了生长因子的活性又避免了二次污染，聚多巴胺作为桥连介质，来源于生物体，安全可靠；同时，在聚多巴胺表面接枝的成纤维细胞生长因子具有诱导成纤维细胞生长，从而诱导筋膜重建的功效。制备的复合聚丙烯网片具有器官功能恢复、手术防治、诱导新组织再生和功能重建的功能。
本发明在不改变原有聚丙烯网片力学强度及表面结构的前提条件下，在聚丙烯网片表面接枝聚多巴胺后，再在聚多巴胺表面接枝成纤维细胞生长因子，不会产生复合网片分离的现象。同时，成纤维细胞生长因子在体内不易降解，并且可以诱导成纤维细胞生长，从而诱导筋膜重建。
结果表明，将复合聚丙烯网片植入体内后，该网片可以促进组织的再生和减少组织的异物反应。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的复合聚丙烯网片及其制备方法进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1
将聚丙烯网片置于体积分数为75％的乙醇溶液中进行表面处理，得到预处理的聚丙烯网片。
配制多巴胺溶液：用10mM的Tris-HCl缓冲液配制成浓度为2mg/ml的、pH值为8.5的多巴胺溶液。所述多巴胺水溶液经过0.22μm的滤膜过滤除菌。
将上述预处理的聚丙烯网片浸泡于多巴胺溶液中，在25℃的条件下反应12h后，用去离子水漂洗5次，得到聚多巴胺-聚丙烯网片。
将上述聚多巴胺-聚丙烯网片取出，浸泡于浓度为10μg/ml、pH值为8.5的纤维细胞生长因子缓冲溶液中，所述缓冲溶液为10mM的Tris-HCl缓冲液，在25℃的条件下反应12h后取出，再用去离子水漂洗5次，最后用氩气流进行干燥，得到复合聚丙烯网片。
将聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片进行性能测定，具体方法及结果如下：
1、光镜切片分析
采用德国Leica公司生产的型号为DM3000的生物显微镜对聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片进行光镜切片分析，结果见图1，图1为实施例1提供的聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片的光镜切片图。图1中，a为聚丙烯网片的光镜切片图，b为聚多巴胺-聚丙烯网片的光镜切片图，c为复合聚丙烯网片的光镜切片图。
结果表明，相对聚丙烯纤维表面，表面接枝聚多巴胺后的纤维表面有一些粗糙和高分子沉积；进一步接枝纤维细胞生长因子后，表面显得更加粗糙，说明聚丙烯和纤维细胞生长因子分别成功接枝了。
2、表面元素分析
使用X射线光电子能谱分析设备对聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片进行表面元素分析，结果见图2，图2为实施例1提供的聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片的表面分析图。其中，图2中，(a)为聚丙烯网片的表面分析曲线，(b)为聚多巴胺-聚丙烯网片的表面分析曲线，(c)为复合聚丙烯网片的表面分析曲线。
结果表明，相对聚丙烯网片纤维表面，主要就是C峰；聚丙烯网片表面接枝聚多巴胺后，出现N的峰，这是由于聚多巴胺中有N元素的存在，说明聚多巴胺成功接枝聚丙烯网片纤维表面，在接枝聚多巴胺的基础上，接枝后成纤维细胞生长因子，N的峰又升高和增加，这是由于成纤维细胞生长因子中又含有N的元素峰，说明成纤维细胞生长因子成功接枝。
3、接枝率的测定
分别测定制备得到的聚多巴胺-聚丙烯网片中聚多巴胺的接枝率以及复合聚丙烯网片中成纤维细胞生长因子的接枝率，结果见表1，表1为实施例1～4接枝率测定结果。
表1 实施例1～4接枝率测定结果
4、成纤维细胞粘附和生长
(1)细胞培养
从脐带提出成纤维细胞，细胞用含有10％FBS，100单位/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素DMEM的培养液，放入含有5％CO2的37℃的加湿培养箱中进行培养。培养基每3天替换一次。当HDFs长到培养皿的70％以上时，按1:3的比例进行传代，本实验中使用2至4代的成纤维细胞。
使用成纤维细胞来检测细胞在实施例1提供的聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片上的粘附和生长行为。
(11)成纤维细胞在聚丙烯网片上的粘附和生长
将消过毒的聚丙烯网片切成直径5mm的小块，然后在细胞培养液中预处理1小时。将50μl的HDFs悬液(1×103个细胞/ml)种植到聚丙烯网片的表面，并放置到96孔板中。然后，将96孔板放到培养箱中4小时，再在每孔加入100μl的培养液。培养液每3天更换一次。
(12)成纤维细胞在聚多巴胺-聚丙烯网片上的粘附和生长
成纤维细胞在聚多巴胺-聚丙烯网片上的粘附和生长与步骤(11)成纤维细胞在聚丙烯网片上的粘附和生长的步骤相同，仅是将步骤(11)中的聚丙烯网片替换为聚多巴胺-聚丙烯网片。
(13)成纤维细胞在复合聚丙烯网片上的粘附和生长
成纤维细胞在复合聚丙烯网片上的粘附和生长与步骤(11)成纤维细胞在聚丙烯网片上的粘附和生长的步骤相同，仅是将步骤(11)中的聚丙烯网片替换为复合聚丙烯网片。
(2)细胞形态学观察
接种细胞6天以后，用PBS溶液分别冲洗三次步骤(11)得到的生长有成纤维细胞的聚丙烯网片、步骤(12)得到的生长有成纤维细胞的聚多巴胺-聚丙烯网片以及步骤(13)得到的生长有成纤维细胞的复合聚丙烯网片，然后进行扫描电子显微镜观察，步骤如下：
21)前固定：4wt％戊二醛固定液4℃下固定标本2h；
22)漂洗：PBS缓冲液洗涤3次，每次10min；
23)后固定：1wt％锇酸固定液4℃下固定标本2h；
24)漂洗：PBS缓冲液洗涤3次，每次10min；
25)脱水：质量分数为30％、50％、70％、80％、95％和100％的梯度酒精进行脱水，每次10min；再用醋酸异戊脂脱水2次，每次进行10min；
26)干燥：临界点干燥机内干燥；
27)样品经表面喷金后通过扫描电子显微镜进行观察。
观察结果见图3，图3为实施例1提供的聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片的成纤维细胞粘附和生长荧光图片。图3中，a为聚丙烯网片的表面成纤维细胞粘附和生长荧光图，b为聚多巴胺-聚丙烯网片的表面成纤维细胞粘附和生长荧光图，c为复合聚丙烯网片的表面成纤维细胞粘附和生长荧光图。
结果表明，聚丙烯网片纤维表面有很少量的细胞生长；相对聚丙烯网片纤维表面，表面接枝聚多巴胺后，有稍微多量的细胞生长和铺展，由于聚多巴胺接枝，因此细胞粘附和生长更多，在接枝聚多巴胺基础上，成纤维细胞生长因子接枝后，细胞的粘附和生长量更多，说明成纤维细胞生长因子成功接枝，并且可以促进细胞更好的生长和增殖。
(3)细胞增殖
分别在培育细胞的第3天、6天和9天的聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片使用CCK-8来检测HDFs的增殖情况。具体过程为概括为：去除培养液，用PBS清洗复合聚丙烯网片2次。接着向每个样本中加入100μl培养基和10μlCCK-8试剂，放入孵育箱中2.5h。然后将100μl的孵育介质转移到另一个96孔板。最后用酶标仪读出吸光值在450nm波长下的数值。所有试验进行3遍。结果见表2，表2为实施例1提供的聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片细胞增殖结果。
表2 实施例1提供的聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片细胞增殖结果
从表2的吸光度值可以看出，相对聚丙烯网片纤维表面，表面接枝聚多巴胺后，有稍微多量的细胞生长，由于聚多巴胺接枝，因此细胞粘附和生长更多，在接枝聚多巴胺基础上，成纤维细胞生长因子接枝后，细胞的粘附和生长量更多，说明成纤维细胞生长因子成功接枝，并且可以促进细胞更好的生长和增殖。
5、组织切片染色
将实施例1提供的聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片分别移植于兔子，进行盆底修复手术。
手术后，每天一次认真观察和记录每个伤口的愈合情况，术后第14天用空气栓塞法处死上述实验兔子。
切取标本时要留有边缘5mm未损伤的正常组织，然后从伤口的中线一切为二。将这些标本在多聚甲醛中固定24个小时，常规石蜡包埋，沿组织横切面进行切片，对切片HE染色进行常规的组织学分析。
HE染色的常规步骤如下：
501)烤片：将切片置于70℃恒温箱中30min；
502)脱蜡及水化：将切片置于二甲苯中脱腊三次，每步10min，再依次放到体积分数为100％、95％、85％、70％的乙醇溶液中进行梯度酒精水化，每步3min；
503)入水清洗5min；
504)浸入苏木素染液5min；
505)自来水冲洗多余的苏木素；
506)放入质量浓度为75％盐酸乙醇分化3s；
507)放入自来水中冲洗30min至棕蓝色；
508)放入95％乙醇脱水1min；
509)酸化伊红乙醇染液染色90s；
510)放入体积分数分别为70％、85％、95％、100％的梯度酒精中脱水各5min；
511)再放入二甲苯浸泡3次，每步3min，脱去酒精；
512)用中性树胶封片。
试验结果见图4，图4为实施例1提供的聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片的植入体内后组织切片的HE染色图。图4中，a为聚丙烯网片植入体内后组织切片的HE染色图，b为聚多巴胺-聚丙烯网片植入体内后组织切片的HE染色图，c为复合聚丙烯网片的植入体内后组织切片的HE染色图。
结果表明，聚丙烯网片植入体内后没有出现新生组织包围网片的结构；表面接枝聚多巴胺后，有一些新生组织包围网片，并形成网片和组织的一体，说明接枝聚多巴胺后，可以在一定程度上提高组织的诱导性能和生物相容性；在接枝聚多巴胺基础上，成纤维细胞生长因子接枝后，更多的新生组织生长和包裹在网片周围，说明成纤维细胞生长因子可以更好的促进组织的再生和减少组织的异物反应，有望进行组织重建。
实施例2
将聚丙烯网片置于体积分数为75％的乙醇溶液中进行表面处理，得到预处理的聚丙烯网片。
配制多巴胺溶液：用10mM的Tris-HCl缓冲液配制成浓度为1mg/ml的、pH值为9.0的多巴胺溶液。所述多巴胺水溶液经过0.22μm的滤膜过滤除菌。
将上述预处理的聚丙烯网片浸泡于多巴胺溶液中，在25℃的条件下反应12h后，用去离子水漂洗5次，得到聚多巴胺-聚丙烯网片。
将上述聚多巴胺-聚丙烯网片取出，浸泡于浓度为15μg/ml、pH值为9.0的纤维细胞生长因子缓冲溶液中，所述缓冲溶液为10mM的Tris-HCl缓冲液，在25℃的条件下反应12h后取出，再用去离子水漂洗5次，最后用氩气流进行干燥，得到复合聚丙烯网片。
将聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片进行性能测定，具体方法及结果如下：
1、接枝率的测定
分别测定制备得到的聚多巴胺-聚丙烯网片中聚多巴胺的接枝率以及复合聚丙烯网片中成纤维细胞生长因子的接枝率，结果见表1，表1为实施例1～4接枝率测定结果。
2、成纤维细胞粘附和生长
(1)细胞培养
从脐带提出成纤维细胞，细胞用含有10％FBS，100单位/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素DMEM的培养液，放入含有5％CO2的37℃的加湿培养箱中进行培养。培养基每3天替换一次。当HDFs长到培养皿的70％以上时，按1:3的比例进行传代，本实验中使用2至4代的成纤维细胞。
使用成纤维细胞来检测细胞在实施例2提供的聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片上的粘附和生长行为。
(11)成纤维细胞在聚丙烯网片上的粘附和生长
将消过毒的聚丙烯网片切成直径5mm的小块，然后在细胞培养液中预处理1小时。将50μl的HDFs悬液(1×103个细胞/ml)种植到聚丙烯网片的表面，并放置到96孔板中。然后，将96孔板放到培养箱中4小时，再在每孔加入100μl的培养液。培养液每3天更换一次。
(12)成纤维细胞在聚多巴胺-聚丙烯网片上的粘附和生长
成纤维细胞在聚多巴胺-聚丙烯网片上的粘附和生长与步骤(11)成纤维细胞在聚丙烯网片上的粘附和生长的步骤相同，仅是将步骤(11)中的聚丙烯网片替换为聚多巴胺-聚丙烯网片。
(13)成纤维细胞在复合聚丙烯网片上的粘附和生长
成纤维细胞在复合聚丙烯网片上的粘附和生长与步骤(11)成纤维细胞在聚丙烯网片上的粘附和生长的步骤相同，仅是将步骤(11)中的聚丙烯网片替换为复合聚丙烯网片。
(2)细胞增殖
分别在培育细胞的第3天、6天和9天的聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片使用CCK-8来检测HDFs的增殖情况。具体过程为概括为：去除培养液，用PBS清洗复合聚丙烯网片2次。接着向每个样本中加入100μl培养基和10μlCCK-8试剂，放入孵育箱中2.5h。然后将100μl的孵育介质转移到另一个96孔板。最后用酶标仪读出吸光值在450nm波长下的数值。所有试验进行3遍。结果见表3，表3为实施例2提供的聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片细胞增殖结果。
表3 实施例2提供的聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片细胞增殖结果
从表3的吸光度值可以看出，相对聚丙烯网片纤维表面，表面接枝聚多巴胺后，有稍微多量的细胞生长，由于聚多巴胺接枝，因此细胞粘附和生长更多，在接枝聚多巴胺基础上，成纤维细胞生长因子接枝后，细胞的粘附和生长量更多，说明成纤维细胞生长因子成功接枝，并且可以促进细胞更好的生长和增殖。
实施例3
将聚丙烯网片置于体积分数为75％的乙醇溶液中进行表面处理，得到预处理的聚丙烯网片。
配制多巴胺溶液：用10mM的Tris-HCl缓冲液配制成浓度为0.5mg/ml的、pH值为9.5的多巴胺溶液。所述多巴胺水溶液经过0.22μm的滤膜过滤除菌。
将上述预处理的聚丙烯网片浸泡于多巴胺溶液中，在25℃的条件下反应24h后，用去离子水漂洗5次，得到聚多巴胺-聚丙烯网片。
将上述聚多巴胺-聚丙烯网片取出，浸泡于浓度为20μg/ml、pH值为9.5的纤维细胞生长因子缓冲溶液中，所述缓冲溶液为10mM的Tris-HCl缓冲液，在25℃的条件下反应24h后取出，再用去离子水漂洗5次，最后用氩气流进行干燥，得到复合聚丙烯网片。
将聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片进行性能测定，具体方法及结果如下：
1、接枝率的测定
分别测定制备得到的聚多巴胺-聚丙烯网片中聚多巴胺的接枝率以及复合聚丙烯网片中成纤维细胞生长因子的接枝率，结果见表1，表1为实施例1～4接枝率测定结果。
2、成纤维细胞粘附和生长
(1)细胞培养
从脐带提出成纤维细胞，细胞用含有10％FBS，100单位/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素DMEM的培养液，放入含有5％CO2的37℃的加湿培养箱中进行培养。培养基每3天替换一次。当HDFs长到培养皿的70％以上时，按1:3的比例进行传代，本实验中使用2至4代的成纤维细胞。
使用成纤维细胞来检测细胞在实施例3提供的聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片上的粘附和生长行为。
(11)成纤维细胞在聚丙烯网片上的粘附和生长
将消过毒的聚丙烯网片切成直径5mm的小块，然后在细胞培养液中预处理1小时。将50μl的HDFs悬液(1×103个细胞/ml)种植到聚丙烯网片的表面，并放置到96孔板中。然后，将96孔板放到培养箱中4小时，再在每孔加入100μl的培养液。培养液每3天更换一次。
(12)成纤维细胞在聚多巴胺-聚丙烯网片上的粘附和生长
成纤维细胞在聚多巴胺-聚丙烯网片上的粘附和生长与步骤(11)成纤维细胞在聚丙烯网片上的粘附和生长的步骤相同，仅是将步骤(11)中的聚丙烯网片替换为聚多巴胺-聚丙烯网片。
(13)成纤维细胞在复合聚丙烯网片上的粘附和生长
成纤维细胞在复合聚丙烯网片上的粘附和生长与步骤(11)成纤维细胞在聚丙烯网片上的粘附和生长的步骤相同，仅是将步骤(11)中的聚丙烯网片替换为复合聚丙烯网片。
(2)细胞增殖
分别在培育细胞的第3天、6天和9天的聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片使用CCK-8来检测HDFs的增殖情况。具体过程为概括为：去除培养液，用PBS清洗复合聚丙烯网片2次。接着向每个样本中加入100μl培养基和10μlCCK-8试剂，放入孵育箱中2.5h。然后将100μl的孵育介质转移到另一个96孔板。最后用酶标仪读出吸光值在450nm波长下的数值。所有试验进行3遍。结果见表4，表4为实施例3提供的聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片细胞增殖结果。
表4 实施例3提供的聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片细胞增殖结果
从表4的吸光度值可以看出，相对聚丙烯网片纤维表面，表面接枝聚多巴胺后，有稍微多量的细胞生长，由于聚多巴胺接枝，因此细胞粘附和生长更多，在接枝聚多巴胺基础上，成纤维细胞生长因子接枝后，细胞的粘附和生长量更多，说明成纤维细胞生长因子成功接枝，并且可以促进细胞更好的生长和增殖。
实施例4
将聚丙烯网片置于体积分数为85％的乙醇溶液中进行表面处理，得到预处理的聚丙烯网片。
配制多巴胺溶液：用10mM的Tris-HCl缓冲液配制成浓度为1.5mg/ml的、pH值为8.0的多巴胺溶液。所述多巴胺水溶液经过0.22μm的滤膜过滤除菌。
将上述预处理的聚丙烯网片浸泡于多巴胺溶液中，在25℃的条件下反应24h后，用去离子水漂洗5次，得到聚多巴胺-聚丙烯网片。
将上述聚多巴胺-聚丙烯网片取出，浸泡于浓度为15μg/ml、pH值为8.0的纤维细胞生长因子缓冲溶液中，所述缓冲溶液为10mM的Tris-HCl缓冲液，在25℃的条件下反应24h后取出，再用去离子水漂洗5次，最后用氩气流进行干燥，得到复合聚丙烯网片。
将聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片进行性能测定，具体方法及结果如下：
1、接枝率的测定
分别测定制备得到的聚多巴胺-聚丙烯网片中聚多巴胺的接枝率以及复合聚丙烯网片中成纤维细胞生长因子的接枝率，结果见表1，表1为实施例1～4接枝率测定结果。
2、成纤维细胞粘附和生长
(1)细胞培养
从脐带提出成纤维细胞，细胞用含有10％FBS，100单位/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素DMEM的培养液，放入含有5％CO2的37℃的加湿培养箱中进行培养。培养基每3天替换一次。当HDFs长到培养皿的70％以上时，按1:3的比例进行传代，本实验中使用2至4代的成纤维细胞。
使用成纤维细胞来检测细胞在实施例4提供的聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片上的粘附和生长行为。
(11)成纤维细胞在聚丙烯网片上的粘附和生长
将消过毒的聚丙烯网片切成直径5mm的小块，然后在细胞培养液中预处理1小时。将50μl的HDFs悬液(1×103个细胞/ml)种植到聚丙烯网片的表面，并放置到96孔板中。然后，将96孔板放到培养箱中4小时，再在每孔加入100μl的培养液。培养液每3天更换一次。
(12)成纤维细胞在聚多巴胺-聚丙烯网片上的粘附和生长
成纤维细胞在聚多巴胺-聚丙烯网片上的粘附和生长与步骤(11)成纤维细胞在聚丙烯网片上的粘附和生长的步骤相同，仅是将步骤(11)中的聚丙烯网片替换为聚多巴胺-聚丙烯网片。
(13)成纤维细胞在复合聚丙烯网片上的粘附和生长
成纤维细胞在复合聚丙烯网片上的粘附和生长与步骤(11)成纤维细胞在聚丙烯网片上的粘附和生长的步骤相同，仅是将步骤(11)中的聚丙烯网片替换为复合聚丙烯网片。
(2)细胞增殖
分别在培育细胞的第3天、6天和9天的聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片使用CCK-8来检测HDFs的增殖情况。具体过程为概括为：去除培养液，用PBS清洗复合聚丙烯网片2次。接着向每个样本中加入100μl培养基和10μlCCK-8试剂，放入孵育箱中2.5h。然后将100μl的孵育介质转移到另一个96孔板。最后用酶标仪读出吸光值在450nm波长下的数值。所有试验进行3遍。结果见表5，表5为实施例4提供的聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片细胞增殖结果。
表5 实施例4提供的聚丙烯网片、聚多巴胺-聚丙烯网片以及复合聚丙烯网片细胞增殖结果
从表5的吸光度值可以看出，相对聚丙烯网片纤维表面，表面接枝聚多巴胺后，有稍微多量的细胞生长，由于聚多巴胺接枝，因此细胞粘附和生长更多，在接枝聚多巴胺基础上，成纤维细胞生长因子接枝后，细胞的粘附和生长量更多，说明成纤维细胞生长因子成功接枝，并且可以促进细胞更好的生长和增殖。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种复合聚丙烯网片的制备方法，其特征在于，所述复合聚丙烯网片由以下步骤制备而成：
A)将聚丙烯网片置于多巴胺水溶液中进行反应，得到聚多巴胺-聚丙烯网片；
B)将所述聚多巴胺-聚丙烯网片置于成纤维细胞生长因子溶液中进行反应，得到复合聚丙烯网片；
所述成纤维细胞生长因子溶液按照下述方法进行配置：将所述成纤维细胞生长因子溶解于10mM的Tris-HCl缓冲液中，再调节pH值至7.2～10，离心分离后得到成纤维细胞生长因子溶液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述多巴胺水溶液的浓度为0.1～3mg/ml。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述多巴胺水溶液的pH值为7.2～10。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤A)中所述反应的温度为5～40℃。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤A)中所述反应的时间为0.1～48h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，成纤维细胞生长因子溶液的浓度为5～200μg/ml。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤B)中所述反应的温度为0～40℃。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤B)中所述反应的时间为0.1～96h。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤A)之前，还包括将聚丙烯网片置于体积分数为75％～95％的乙醇溶液中进行表面处理。
10.一种如权利要求1～9任意一项所述的制备方法制备得到的复合聚丙烯网片，其特征在于，由聚丙烯网片和成纤维细胞生长因子通过聚多巴胺键合而成。
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