CN1201825C - 一种制备人工子宫内膜的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属组织工程学领域，具体涉及一种制备人工子宫内膜的方法。本发明应用新型生物可降解材料做立体支架，用实验动物子宫内膜细胞做种子细胞，通过特殊的培养方法，在体外构建人工子宫内膜，能形成三维结构，并具备与在体子宫内膜形似的结构和形态，能分泌细胞外基质成分，模拟在体子宫内膜的形态与功能。克服了现有的体外模型的缺陷，为进一步研究胚胎着床的机理提供理想的平台，为人流，结核等所造成的子宫内膜损伤导致不孕提供治疗途径。

Description

一种制备人工子宫内膜的方法

技术领域

本发明属组织工程学领域，具体涉及一种制备人工子宫内膜的方法。

背景技术

胚胎着床及胚胎在母体内生长发育的机理及过程尚不清楚，其受到激素、细胞因子、蛋白、酶等多种信息物质的调节，是一个复杂而精密的过程，直接在体研究极其困难。目前，已有有关体外模型建立的研究。在众多的胚胎着床模型中，大多只能实现胚胎成分与母体成分相粘附及滋养细胞外延生长，很少有胚胎或滋养细胞能真正侵入母体成分，其原因主要是体外培养条件与在体情况不完全相同，使培养的胚胎及母体成分的生长、发育及分化过程发生改变，不能完全再现在体时的形态、结构及功能。另一方面，子宫内膜损伤是造成女性不孕及流产的重要原因，此现象已受到人们的普遍重视。再造子宫内膜，使损伤的子宫内膜得到修复，从而治疗因子宫内膜损伤造成的不孕及流产，成为研究热点。因此，建立人工合成的子宫内膜组织，更好地模拟在体子宫内膜的形态及生物学特性，同时又能人工控制、监测各项指标，为研究着床机理提供理想的体外模型，为子宫内膜损伤修复提供治疗方法，为临床和研究者所重视。

近年来组织工程技术的发展为解决上述难题，建立理想的“模型”提供了可能。组织工程(tissue engineering)是生物医学工程领域中的新方向，应用生命科学与工程学的原理和技术，研究、开发用于修复、维护、促进人体，各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。其技术核心是在可降解三维支架上通过细胞种植实现组织重建。支架材料和种子细胞是组织工程研究的重要内容。其中生物可降解的三维高分子聚合物多孔支架在组织构建中越来越受到重视。目前应用较广泛的可降解材料主要为聚酯类(polyesteralpha)如聚羟基乙酸(polyglycolic acid PGA)、聚乳酸(polylactic acid PLA)、以及两种单体的共聚物多聚乳酸-羟基乙酸复合体(poly DL-lactic-co-glycolic acid PLGA等。

胶原及聚乳酸羟基乙酸共聚物的交联聚合网(Collegen-PLGApolymer mesh)是由日本东京大学工程学院发明的多孔生物可降解聚合物支架，已被用于人造皮肤的构建。

发明内容：

本发明的目的是提供一种人工子宫内膜及其制备方法，为胚胎着床的研究提供新的理想的平台，为最终解决不孕及流产提供新的途径。

本发明应用新型生物可降解材料一胶原及聚乳酸羟基乙酸共聚物的交联聚合网做立体支架，用分离的子宫内膜上皮细胞及基质细胞做种子细胞，通过特殊的培养方法，在体外构建人造子宫内膜。

本发明所采用的新型生物可降解材料PGLA具有良好的表面特性和适宜的孔隙率，表面包被胶原后可提高细胞的粘附及种植密度，使其具有更好的细胞相容性，使种子细胞可以进入多孔聚合物支架内部并在其上贴附和生长，同时细胞自身还可分泌细胞外基质(extracellular matrics ECM)代替生物可降解支架成为自然组织。

本发明的技术方案通过下述方法和步骤实现。

一、应用酶消化法分离及纯化BALB/c小鼠子宫内膜细胞取妊娠小鼠处死，剪取双侧子宫角，放入盛有PBS的培养皿内，加入2.5％Pacreatin和0.5％Trypsin，4℃ 1.5h后，置20℃ 0.5h，旋转，静置，吸取下2/3细胞悬液于含有胎牛血清的离心管内，PBS冲洗子宫，吸取上清液，离心，弃上清，加入PBS漂洗，离心后得子宫内膜上皮细胞。再将子宫置于含0.05％Trypsin-0.02％EDTA离心管中，旋转，吸取细胞悬液于含FCS离心管中，PBS冲洗子宫，吸取上清，离心，再用PBS漂洗细胞，离心后得子宫内膜基质细胞。

二、构建子宫内膜三维模型

取上述对数生长期的子宫内膜上皮细胞及基质细胞，胰酶消化，制备细胞悬液。将胶原及聚乳酸羟基乙酸共聚物的交联聚合网固定，置于培养板孔内，加入含10％胎牛血清的DMEM∶F12(1∶1)培养液，接种子宫内膜基质细胞，静止，补加上述培养液，放入培养箱培养，然后，以同样密度接种上皮细胞于聚合网的另一面，加培养液孵箱内培养。数日后取出支架，PBS清洗，2.5％戊二醛固定，酒精梯度脱水，乙酸异戊酯置换，临界点干燥，喷金，扫描电镜观察人工子宫内膜的超微形态。

本发明将子宫内膜细胞种植于上述生物材料后，间质细胞首先附着在聚合网上，并进入聚合网孔间生长，占据网孔，并向网的另一面生长，上皮细胞接种后，24h细胞能在聚合网上粘附生长并与间质细胞混合；培养第5天细胞大量铺展生长，并进入聚合网网孔间，形成多层结构，有些区域，可见融合生长；培养第14天后，细胞融合，原聚合网上包被的胶原大部分被子宫内膜细胞分泌的细胞外基质代替，形成三维结构。

结果表明，子宫内膜细胞能形成三维结构，并具备与在体子宫内膜形似的结构和形态，能分泌细胞外基质成分，模拟在体子宫内膜的形态与功能。为最终克服现有的体外模型的缺陷，构建人组织工程子宫提供新方法。

本发明人工子宫内膜克服了现有体外模型的缺陷，为最终通过组织工程学方法构建子宫提供新方法，为进一步研究胚胎着床的机理提供理想的平台，为人流，结核等所造成的子宫内膜损伤导致不孕提供可能的治疗途径。

附图说明：

图一为子宫内膜细胞在三维支架上的生长形态

其中

(a)为胶原及聚乳酸羟基乙酸共聚物的交联聚合网扫描电镜图，其中可见为交织状态，呈网状结构，上附胶原物质，

(b)为子宫内膜细胞种植于聚合网材料培养第5天的扫描电镜图，放大500倍，其中细胞大量铺展生长，深入网孔，有些区域可见融合生长。

图二为细胞培养第14后扫描电镜图，

其中图(a)放大倍数为50倍，图(b)的放大倍数为200，可见细胞融合生长，原生物材料上包被的胶原大部分已被子宫内膜细胞分泌的细胞外基质代替，呈多层生长，形成三维结构。

具体实施方式

实施例

1、分离及纯化子宫内膜细胞：

采用清洁级实验动物BALB/c小鼠，周龄8-12周，体重18g-20g，雌∶雄＝1∶1合笼交配，次晨检查阴栓，发现阴栓为孕d1天

分离子宫内膜细胞：应用酶消化法。取10只妊娠d4小鼠脱颈处死，剪取双侧子宫角，纵向切开放入盛有PBS的培养皿内，加入2.5％Pacreatin和0.5％Trypsin，4℃ 1.5h后，置20℃ 0.5h，涡流旋转器旋转10sec，静置5min，弃上1/3悬液，吸取下2/3细胞悬液于含有胎牛血清的离心管内，5ml PBS冲洗子宫2次，吸取上清液，1000rpm离心5min，弃上清，加入10ml PBS漂洗细胞两次，每次离心1000rpm×5min。，离心后得子宫内膜上皮细胞。再将子宫置于含0.05％Trypsin-0.02％EDTA离心管中，37℃ 20min，涡流旋转器旋转10sec，吸取细胞悬液于含FCS离心管中，将5ml PBS冲洗子宫2次，吸取上清液，离心，再用10ml PBS漂洗细胞2次，离心后得子宫内膜基质细胞。所分离的子宫内膜上皮细胞及间质细胞经抗cytokeratin-18及抗desmin抗体免疫组织化学分析，分离的子宫内膜细胞纯度占90％以上。

2、构建子宫内膜三维模型

将分离的子宫内膜上皮细胞及基质细胞种植于培养瓶，取对数生长期的细胞，0.5％胰酶消化37℃ 5min，制备细胞悬液用于接种。将胶原及聚乳酸羟基乙酸共聚物的交联聚合网用自制支架固定，固定后的聚合网置于24孔培养板的培养孔内，加入含10％胎牛血清的DMEM∶F12(1∶1)培养液100ul，首先按2×10⁵/cm²的密度接种子宫内膜基质细胞，在细胞培养箱静止3h后，补加含10％胎牛血清的DMEM∶F12(1∶1)培养液1ml，放入培养箱培养，间质细胞在聚合网上粘附、生长。间质细胞培养72h后，再将上皮细胞以同样密度接种于聚合网的另一面，加入培养液1ml，置5％CO₂，37℃孵箱内培养，每2天更换一次培养液。

接种上皮细胞后第5天及第14天，取出支架，PBS清洗，2.5％戊二醛固定，酒精梯度脱水，乙酸异戊酯置换，临界点干燥，喷金，扫描电镜观察人工子宫内膜的超微形态。

Claims (4)

1、一种制备人工子宫内膜的方法，其特征是应用生物可降解材料做支架，用动物子宫内膜细胞做种子细胞种植于生物可降解材料，体外构建人工子宫内膜，所述的生物可降解材料是胶原及聚乳酸羟基乙酸共聚物的交联聚合网，所述的种子细胞为动物子宫内膜上皮和基质细胞。

2、按权利要求1所述的制备人工子宫内膜的方法，其特征是所述的种子细胞细胞培养过程为将基质细胞和上皮细胞依次接种，多层培养。

3、按权利要求1所述的制备人工子宫内膜的方法，其特征是所述的种子细胞接种密度为2×10⁵/cm²。

4、按权利要求1所述的制备人工子宫内膜的方法，其特征是按下述方法和步骤进行，

1)用酶消化法分离及纯化动物小鼠子宫内膜细胞，得子宫内膜上皮和基质细胞，

2)将上述子宫内膜细胞依次种植于生物可降解材料支架不同层面，体外构建人工子宫内膜。

Images