CN102517247B - 一种晶格状三维细胞培养支架及其制作方法和一种应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种晶格状三维细胞培养支架及其制作方法和一种应用方法。细胞培养支架包括微孔石英光学模板,它由有膜层石英光学模板制成,微孔为斜柱子阵列。制作方法步骤包括:在制作有膜层石英光学模板后再制作斜柱子阵列微孔,然后去掉高分子材料膜层。应用方法步骤包括:三维细胞培养支架高温灭菌、表面修饰、细胞植入和培养、细胞固定和细胞透化及封闭、细胞孵化和细胞清洗。本发明优点是:能调整三维细胞培养支架的孔径大小、分布以及晶格的层数,能有效的为组织工程研究提供更为科学和完整的实验数据、提高细胞培养的效率、减少动物实验的次数;同时,三维细胞培养支架能大批量生产,且成本低,能适应再生医学的广泛需求。
Description
技术领域
本发明涉及一种晶格状三维细胞培养支架及其制作方法和一种应用方法,晶格状三维细胞支架广泛用于细胞培养、干细胞增殖及分化、细胞组织工程、药物筛选、再生医学、微流控及纳米技术等的应用和研究,属于生物技术领域。
背景技术
细胞是生命的基本单元,人和动物体内组织结构的细胞均处于复杂的环境中,受包括可溶性细胞因子、细胞外基质和细胞间相互作用在内的微环境调控。因此,动物细胞的体外培养不仅应考虑细胞培养液的化学组成,也因考虑细胞外基质的物理和化学特性。事实上,细胞在体内的黏附、繁殖、迁移和分化等行为与机体的三维组织结构密切相关。但是,细胞体外培养通常是在培养皿和类似的培养体系中完成的。越来越多的研究表明:用这种简单的二维细胞培养技术来实现细胞扩增和研究细胞与药物间的相互作用是不合适的。因此,有必要发展三维细胞培养支架,以其产生对细胞培养、增殖或分化有利的环境,满足未来组织工程的需要。近几年,人工多孔三维材料被大量用于细胞培养,并在组织工程的研究和临床得到广泛应用。然而,现有多孔三维材料的孔径大小和分布都是不规则的,用其作为细胞培养支架很难进行精确地分析细胞培养所需的微环境,从而影响相关的研究和临床应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种晶格状三维细胞支架及其制作方法和应用方法,通过孔径大小和分布精确可控的三维细胞培养支架,有效地为组织工程研究提供更为科学和完整的实验数据、提高细胞培养的效率、减少动物实验的次数;同时,能大批量、低成本地生产三维细胞培养支架,从而能适应再生医学的广泛需求。
本发明的一种晶格状三维细胞培养支架的技术方案是:它包括微孔石英光学模板;所述微孔石英光学模板由有膜层石英光学模板制成,微孔为斜柱子阵列;所述有膜层石英光学模板是在石英光学模板表面上沉积用作牺牲层的高分子材料膜层后再附着一层感光胶层3的光学模板;斜柱子阵列微孔4是通过背曝光7和斜向旋转曝光6制得的微孔。
在上述的晶格状三维细胞培养支架技术方案的基础上更进一步的技术方案是:
所述的晶格状三维细胞培养支架,斜柱子阵列微孔其深度与直经比大于等于5,小于等于20。
所述的晶格状三维细胞培养支架,所述牺牲层的高分子材料膜层其材料为水溶性高分子材料。
所述的晶格状三维细胞培养支架,所述的感光胶层厚度大于等于50微米,小于等于200微米。
所述的晶格状三维细胞培养支架,所述的感光胶层是具有感光性和生物兼容性及生物可降解性的高分子聚合物,选自于光功能高分子材料,或生物医用高分子材料,或仿生高分子材料。
本发明的一种晶格状三维细胞培养支架的制作方法的技术方案是:
三维细胞培养支架包括微孔石英光学模板;制作方法包括如下步骤:
A、制作有膜层石英光学模板;
a、制作高分子材料膜层:在石英光学模板的表面沉积高分子材料膜层作为牺牲层;
b、制作感光胶层:在高分子材料膜层上附着感光胶,形成感光胶层;
B、制作斜柱子阵列微孔:对A步骤的有膜层石英光学模板用背曝光和斜向旋转曝光制作斜柱子阵列微孔;
C、去掉高分子材料膜层:使斜柱子阵列交叉形成的高分子材料膜层剥离。
在上述的晶格状三维细胞培养支架的制作方法技术方案的基础上更进一步的技术方案是:
所述的晶格状三维细胞培养支架的制作方法,其斜向旋转曝光的倾斜角β为0-90度。
所述的晶格状三维细胞培养支架的制作方法,其斜向旋转曝光的倾斜角β为30度。
所述的晶格状三维细胞培养支架的制作方法,其斜向旋转曝光的曝光次数至少为2次,每次旋转角θ小于等于180度。
所述的晶格状三维细胞培养支架的制作方法,其斜向旋转曝光的曝光次数为3次,每次旋转角θ为120度。
本发明的一种晶格状三维细胞培养支架在培养细胞中的应用方法,包括下述步骤:
a步骤、高温灭菌:将制作好的三维细胞培养支架用灭菌锅进行高温蒸汽灭菌;
b步骤、表面修饰:对灭菌后的三维细胞培养支架用细胞外基质蛋白,或多肽,或多糖进行表面修饰;
c步骤、细胞植入和培养:将一定浓度细胞植于三维细胞培养支架表面,然后置于培养液中培养;
d步骤、细胞固定:待细胞在三维细胞培养支架中培养若干天后,用一定浓度的多聚甲醛溶液将每个细胞培养单元中的细胞固定一定时间;
e步骤、细胞染色:在上述d步骤完成后,对细胞进行染色;所述染色为细胞化学染色,或苏木精—伊红染色,或免疫荧光染色。
在上述的晶格状三维细胞培养支架在培养细胞中的应用方法技术方案的基础上更进一步的技术方案是:
方案之一:所述步骤中:
b步骤:对灭菌后的三维细胞培养支架用30~80微克/毫升的纤维连接蛋白水溶液进行表面修饰约15~60分钟;
c步骤:将1毫升浓度为104个/毫升的NIH3T3细胞植于三维细胞培养支架表面,然后置于含1~10%胎牛血清的DMEM培养液中培养;
d步骤:待细胞在三维细胞培养支架中培养4~8天后,用4%多聚甲醛溶液将每个细胞培养单元中的细胞固定10~20分钟;
e步骤:在d步骤完成后,按下列苏木精—伊红染色方法染色:二甲苯-I 15分钟,二甲苯-II 15分钟,100%乙醇-I 5分钟,100%乙醇-II 5分钟,80%乙醇5分钟,蒸馏水洗5分钟,苏木素染色5分钟,用流水冲洗,1%盐酸乙醇3秒,蒸馏水浸泡15分钟,伊红染色2分钟,蒸馏水洗1分钟,80%乙醇洗1分钟,80%乙醇1分钟,95%乙醇-I 3秒,95%乙醇-II 5秒,100%乙醇10分钟,石炭酸二甲苯10分钟,二甲苯-I 2分钟,二甲苯-II 2分钟,二甲苯-III 2分钟,中性树胶封固。
方案之二:所述步骤中:
b步骤:对灭菌后的三维细胞培养支架用50微克/毫升的纤维连接蛋白溶液进行表面修饰约15分钟;
c步骤:将1毫升浓度为104个/毫升NIH3T3细胞植于三维细胞培养支架表面,然后置于含1%含胎牛血清的DMEM培养液中培养;
d步骤:待细胞在三维细胞培养支架中培养5天后,用4%甲醛/磷酸盐缓冲溶液将每个细胞培养单元中的细胞固定10分钟;
然后分别用0.5%聚乙二醇辛基苯基醚/磷酸盐缓冲溶液透化和用3% 牛血清蛋白溶液封闭30分钟;
e步骤:固定好的细胞在1微克/毫升异硫氰酸荧光素鬼笔环肽溶液溶液中染色20分钟;
细胞染色好后,用磷酸盐缓冲溶液清洗3次,用共聚焦显微镜观察不同高度的位置细胞骨架。
结合本发明结构、原理对本发明效果说明如下:
本发明所提供的一种晶格状三维细胞培养支架及其制作方法是结合背曝光和斜向旋转曝光的技术,能在石英光学模板上得到深宽比和相互交叉的斜柱子规则阵列微孔,从而形成晶格状三维支架。改变光学模板的设计和改变斜向曝光的角度,可调整支架的孔径大小、分布以及晶格的层数;所得到的晶格状三维支架可用于细胞黏附、迁移、繁殖、繁殖和分化的研究,也可以通过去掉事先在石英光学模板上沉积的牺牲层将三维支架层剥离并将其转移到其它细胞培养体系中去。对比常用的二维细胞培养体系,晶格状三维细胞支架一方面可以模拟细胞体内的生长环境、诱导细胞的快速扩增活化,另一方面,对比现有其它类型的人工多孔材料,晶格状三维细胞支架的孔径大小和分布以及晶格的层数可控可调,从而为细胞生物学和组织工程的研究提供更为科学和完整的实验数据、提高细胞培养的效率、减少动物实验的次数。同时,这种三维细胞培养支架能大批量生产,且成本低;不仅如此,这种新型细胞支架结构也适用于药物筛选、临床诊断和再生医学的研究和应用。
附图说明
图1 为用背曝光和斜向旋转曝光的技术制作晶格状三维细胞培养支架示意图。
图2、图3为不同晶格层数、孔径大小的三维细胞培养支架的扫描电镜图。
图 4 是在三维细胞培养支架中不同层面NIH3T3细胞的荧光图。
图5 是在培养皿和晶格状三维细胞培养支架中NIH3T3细胞的扩增情况对比。
图中的附图标记的名称为:
1-石英光学模板; 2-高分子材料膜层;3-感光胶层;4-斜柱子阵列微孔;5-有膜层石英光学模板;6-斜向旋转曝光;β-倾斜角;θ-旋转角;7-背曝光。
具体实施方式
结合附图和实施例对本发明作进一步说明如下:
实施例1:
如图1所示,是本发明的一种晶格状三维细胞培养支架的实施例。它包括微孔石英光学模板;所述微孔石英光学模板由有膜层石英光学模板5制成,微孔为斜柱子阵列;所述有膜层石英光学模板5是在石英光学模板1表面上沉积用作牺牲层的高分子材料膜层2后再附着一层感光胶层3的光学模板;斜柱子阵列微孔4是通过背曝光7和斜向旋转曝光6制得的微孔。所述的斜柱子阵列微孔4其深度与直经比大于等于5,小于等于20,本实施例选为10。所述牺牲层的高分子材料膜层2其材料为水溶性高分子材料。所述的感光胶层3厚度大于等于50微米,小于等于200微米,本实施例选为100微米。所述的感光胶层3是具有感光性和生物兼容性及生物可降解性的高分子聚合物,选自于光功能高分子材料,或生物医用高分子材料,或仿生高分子材料,更具体说,所述的感光胶层3的感光胶材料为SU8感光胶,也可是AZ感光胶,或PMMA感光胶,本实施例选为SU8感光胶。
实施例2:
与上述实施例1不同的是,所述的斜柱子阵列微孔4其深度与直经比为5。所述的感光胶层3厚度为50微米。所述的感光胶层3的感光胶材料为AZ感光胶。
实施例3:
与上述实施例1不同的是,所述的斜柱子阵列微孔4其深度与直经比为20。所述的感光胶层3厚度为20微米。所述的感光胶层3的感光胶材料为PMMA感光胶。
实施例4:
本实施例为本发明的一种晶格状三维细胞培养支架制作方法的基本实施例,包括如下步骤:
A、制作有膜层石英光学模板5;
a、制作高分子材料膜层2:在石英光学模板1的表面沉积高分子材料膜层2作为牺牲层,高分子材料膜层2材料为水溶性高分子;
b、制作感光胶层3:在高分子材料膜层2上附着感光胶,形成感光胶层3,感光胶材料为SU8感光胶;
B、制作包含不同大小和周期的斜柱子阵列微孔4:对A步骤的有膜层石英光学模板5用背曝光7和斜向旋转曝光6制作斜柱子阵列微孔4;本步骤中,是用L-Edit绘图并制作光学模板,结构包括大小为8微米, 周期为30微米、40微米、50微米、60微米的孔阵列;
C、去掉高分子材料膜层2:使斜柱子阵列交叉形成的高分子材料膜层2剥离。
在上述步骤中:所述的斜向旋转曝光6的倾斜角β为0-90度,如图1所示,本实施例倾斜角β选为30度,当选0度或90度是另外的实施例。所述的斜向旋转曝光6的次数至少为2次,每次旋转角θ小于等于180度,如图1所示,本实施例斜向旋转曝光6的次数选为3次,每次旋转角θ为120度。斜向旋转曝光6的次数选为4次或6次,每次旋转角θ分别为90度或60度,则是另外的实施例。更具体是:如图1所示,将石英光学模板反置于事先制作的倾斜角度为30度的机械平台上;连续3次进行光学曝光,每次旋转机械平台120度。 显影后,用对应溶剂并超声除去牺牲层,将支架膜剥离。图2、图3显示在扫描电子显微镜下观察到的内部结构。
实施例5:
本实施例为本发明的晶格状三维细胞培养支架在培养细胞中的应用方法的基本实施例,包括下述步骤:
a步骤、高温灭菌:将制作好的三维细胞培养支架用灭菌锅进行高温蒸汽灭菌;
b步骤、表面修饰:对灭菌后的三维细胞培养支架用蛋白,或多肽,或多糖,进行表面修饰;蛋白,或多肽,或多糖,具体可选纤维连接蛋白,或层粘连蛋白,或黏多糖,或精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸等;
c步骤、细胞植入和培养:将一定浓度细胞植于三维细胞培养支架表面,然后置于培养液中培养;
d步骤、细胞固定:待细胞在三维细胞培养支架中培养若干天后,用一定浓度的多聚甲醛溶液, 将每个细胞培养单元中的细胞固定一定时间;
细胞透化和封闭:然后分别用一定浓度的聚乙二醇辛基苯基醚/磷酸盐缓冲溶液透化和用一定浓度的牛血清白蛋白溶液封闭一段时间;
e步骤、在上述d步骤完成后,对细胞进行染色;所述染色为细胞化学染色,或苏木精—伊红染色,或免疫荧光染色。本实施例是将固定好的细胞在异硫氰酸荧光素鬼笔环肽溶液溶液中染色;细胞染色好后,用磷酸盐缓冲溶液清洗。
上述步骤其中:
b步骤:对灭菌后的三维细胞培养支架用30~80微克/毫升的纤维连接蛋白水溶液进行表面修饰约15~60分钟;
c步骤:将1毫升浓度为104个/毫升的NIH3T3细胞植于三维细胞培养支架表面,然后置于含1~10%胎牛血清的DMEM培养液中培养;
d步骤:待细胞在三维细胞培养支架中培养4~8天后,用4%多聚甲醛溶液将每个细胞培养单元中的细胞固定10~20分钟;
e步骤:在d步骤完成后,按下列苏木精—伊红染色方法染色:二甲苯-I 15分钟,二甲苯-II 15分钟,100%乙醇-I 5分钟,100%乙醇-II 5分钟,80%乙醇5分钟,蒸馏水洗5分钟,苏木素染色5分钟,用流水冲洗,1%盐酸乙醇3秒,蒸馏水浸泡15分钟,伊红染色2分钟,蒸馏水洗1分钟,80%乙醇洗1分钟,80%乙醇1分钟,95%乙醇-I 3秒,95%乙醇-II 5秒,100%乙醇10分钟,石炭酸二甲苯10分钟,二甲苯-I 2分钟,二甲苯-II 2分钟,二甲苯-III 2分钟,中性树胶封固。
实施例6:
与上述实施例5不同的是:
b步骤:对灭菌后的三维细胞培养支架用50微克/毫升的纤维连接蛋白溶液进行表面修饰约15分钟;
c步骤:将1毫升浓度为104个/毫升的NIH3T3细胞植于三维细胞培养支架表面,然后置于含1%胎牛血清的DMEM培养液中培养;
d步骤:待细胞在三维细胞培养支架中培养5天后,用4%甲醛/磷酸盐缓冲溶液将每个细胞培养单元中的细胞固定10分钟;
然后分别用0.5% 聚乙二醇辛基苯基醚/磷酸盐缓冲溶液透化和用3% 牛血清蛋白溶液封闭30分钟;
e步骤:固定好的细胞在1微克/毫升异硫氰酸荧光素鬼笔环肽溶液中孵化20分钟;细胞染色好后,用磷酸盐缓冲溶液清洗3次,用共聚焦显微镜观察不同高度的位置细胞骨架。
本发明效果显著。如图4所示,是在三维细胞培养支架中不同层面NIH3T3细胞的荧光图。如图5所示,是在普通的细胞培养皿中按同样的实验条件进行NIH3T3细胞培养,与本发明在晶格状三维细胞培养支架中培养效果的对比, “2D”为现有技术,“3D”为本发明,所显示的在二维和三维条件下细胞的扩增情况有很大差异,显然,本发明优于现有技术。
本发明权利要求保护范围不限于上述实施例。
Claims (13)
1.一种晶格状三维细胞培养支架,其特征在于,它包括微孔石英光学模板;所述微孔石英光学模板由有膜层石英光学模板(5)制成,微孔为斜柱子阵列;所述有膜层石英光学模板(5)是在石英光学模板(1)表面上沉积用作牺牲层的高分子材料膜层(2)后再附着一层感光胶层(3)的光学模板;斜柱子阵列微孔(4)是通过背曝光(7)和斜向旋转曝光(6)制得的微孔;所述的斜向旋转曝光(6)的倾斜角β为小于等于90度,斜向旋转曝光(6)的次数至少为2次,每次旋转角θ小于等于180度。
2.如权利要求1所述的晶格状三维细胞培养支架,其特征在于,斜柱子阵列微孔(4)其深度与直径比大于等于5,小于等于20。
3.如权利要求1所述的晶格状三维细胞培养支架,其特征在于,所述牺牲层的高分子材料膜层(2)其材料为水溶性高分子材料。
4.如权利要求1所述的晶格状三维细胞培养支架,其特征在于,所述的感光胶层(3)厚度大于等于50微米,小于等于200微米。
5.如权利要求1所述的晶格状三维细胞培养支架,其特征在于,所述的感光胶层(3)是具有感光性和生物兼容性及生物可降解性的高分子聚合物,选自于光功能高分子材料,或生物医用高分子材料,或仿生高分子材料。
6.一种权利要求1所述的晶格状三维细胞培养支架的制作方法,其特征在于,三维细胞培养支架包括微孔石英光学模板;制作方法包括如下步骤:
A、制作有膜层石英光学模板(5);
a、制作高分子材料膜层(2):在石英光学模板(1)的表面沉积高分子材料膜层(2)作为牺牲层;
b、制作感光胶层(3):在高分子材料膜层(2)上附着感光胶,形成感光胶层(3);
B、制作斜柱子阵列微孔(4):对A步骤的有膜层石英光学模板(5)用背曝光(7)和斜向旋转曝光(6)制作斜柱子阵列微孔(4);
C、去掉高分子材料膜层(2):使斜柱子阵列交叉形成的高分子材料膜层(2)剥离。
7.如权利要求6所述的晶格状三维细胞培养支架的制作方法,其特征在于,斜向旋转曝光(6)的倾斜角β为90度。
8.如权利要求6所述的晶格状三维细胞培养支架的制作方法,其特征在于,斜向旋转曝光(6)的倾斜角β为30度。
9.如权利要求6所述的晶格状三维细胞培养支架的制作方法,其特征在于,斜向旋转曝光(6)的曝光次数至少为2次,每次旋转角θ等于180度。
10.如权利要求6所述的晶格状三维细胞培养支架的制作方法,其特征在于,斜向旋转曝光(6)的曝光次数为3次,每次旋转角θ为120度。
11.一种权利要求1所述的晶格状三维细胞培养支架在培养细胞中的应用方法,其特征在于,包括下述步骤:
a步骤、高温灭菌:将制作好的三维细胞培养支架用灭菌锅进行高温蒸汽灭菌;
b步骤、表面修饰:对灭菌后的三维细胞培养支架用细胞外基质蛋白,或多肽,或多糖进行表面修饰;
c步骤、细胞植入和培养:将一定浓度细胞植于三维细胞培养支架表面,然后置于培养液中培养;
d步骤、细胞固定:待细胞在三维细胞培养支架中培养若干天后,用一定浓度的多聚甲醛溶液将每个细胞培养单元中的细胞固定一定时间;
e步骤、细胞染色:在上述d步骤完成后,对细胞进行染色;所述染色为细胞化学染色,或苏木精—伊红染色,或免疫荧光染色。
12.如权利要求11所述的晶格状三维细胞培养支架在培养细胞中的应用方法,其特征在于,所述步骤中:
b步骤:对灭菌后的三维细胞培养支架用30~80微克/毫升的纤维连接蛋白水溶液进行表面修饰15~60分钟;
c步骤:将1毫升浓度为104个/毫升的NIH3T3细胞植于三维细胞培养支架表面,然后置于含1~10%胎牛血清的DMEM培养液中培养;
d步骤:待细胞在三维细胞培养支架中培养4~8天后,用4%多聚甲醛溶液将每个细胞培养单元中的细胞固定10~20分钟;
e步骤:在d步骤完成后,按下列苏木精—伊红染色方法染色:二甲苯-I 15分钟,二甲苯-II 15分钟,100%乙醇-I 5分钟,100%乙醇-II 5分钟,80%乙醇5分钟,蒸馏水洗5分钟,苏木素染色5分钟,用流水冲洗,1%盐酸乙醇3秒,蒸馏水浸泡15分钟,伊红染色2分钟,蒸馏水洗1分钟,80%乙醇洗1分钟,80%乙醇1分钟,95%乙醇-I 3秒,95%乙醇-II 5秒,100%乙醇10分钟,石炭酸二甲苯10分钟,二甲苯-I 2分钟,二甲苯-II 2分钟,二甲苯-III 2分钟,中性树胶封固。
13.一种如权利要求1所述的晶格状三维细胞培养支架在培养细胞中的应用方法,其特征在于,步骤为:
a步骤、高温灭菌:将制作好的三维细胞培养支架用灭菌锅进行高温蒸汽灭菌;
b步骤:对灭菌后的三维细胞培养支架用50微克/毫升的纤维连接蛋白溶液进行表面修饰15分钟;
c步骤:将1毫升浓度为104个/毫升NIH3T3细胞植于三维细胞培养支架表面,然后置于含1%含胎牛血清的DMEM培养液中培养;
d步骤:待细胞在三维细胞培养支架中培养5天后,用4%甲醛/磷酸盐缓冲溶液将每个细胞培养单元中的细胞固定10分钟;
然后分别用0.5%聚乙二醇辛基苯基醚/磷酸盐缓冲溶液透化和用3% 牛血清蛋白溶液封闭30分钟;
e步骤:固定好的细胞在1微克/毫升异硫氰酸荧光素鬼笔环肽溶液中染色20分钟;
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