WO2015129822A1 - 自己組織化用細胞集合体の作製方法 - Google Patents

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貴則 武部
英樹 谷口
洋史 吉川
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    • C12N2535/00—Supports or coatings for cell culture characterised by topography

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a cell assembly for self-assembly, and more particularly, to a method for producing a cell assembly necessary for inducing self-organization into a target tissue / organ.
  • Non-patent Documents 1 and 2 a method utilizing self-organization ability inherent in cells has been attracting attention.
  • Self-organization means that one or a few types of elements do not receive any special “instruction” information from the outside, and assemble their high-level structure by demonstrating their intrinsic characteristics. Is to go. For example, spontaneous phenomena such as the formation of snow crystals, spontaneous formation of patterns in spontaneous patterns are observed, and nanotechnology and optical crystal production. It is also used in engineering.
  • Aggregate As a requirement for inducing self-organization, it is necessary to form an aggregate (Aggregate) composed of uniform cells in a high-density environment. It has been reported that Aggregates are prepared from cultured ES ⁇ iPS cells to produce brains, eye cups, pituitaries, teeth, and the like (Non-patent Documents 3-6). As a method for producing such an Aggregate, a small number of cells (about several thousand) can be obtained by using a base material that gathers on the bottom surface, such as 96 well having a U-shaped or V-shaped bottom surface. A method of forming a tissue of several hundred ⁇ m level from the cell aggregates is mainly used.
  • the inventors have developed an innovative three-dimensional culture technology that realizes "induction of organ cell differentiation based on organ reorganization” by utilizing the spatio-temporal interaction of three different cell lineages. Established. In other words, by reproducing cell-cell interactions between organ cells, vascular cells, and mesenchymal cells that are essential for the initial process of organ development, three-dimensional organ primordia (organ species) are induced, and blood vessels A basic technology that enables creation of a functional organ having a net has been established (Nature, 499 (7459), 481-484, PCT / JP2012 / 074840: tissue and organ production method).
  • the inventors of the present invention succeeded in producing a three-dimensional tissue / organ having a complex higher-order structure from a plurality of types of isolated cells and tissues by the following operations 1 to 4, thereby completing the present invention. It came to. 1. Preparation of necessary cells / tissues A) Any kind of cells / tissues necessary for self-organization into a tissue having a complex structure is prepared. There are no restrictions on the type or number of combinations. B) About 100,000 to 400,000 isolated mesenchymal cells are mixed with a mixed solution composed of any kind of cells and tissues having a total cell number of about 2 million. 2. Preparation of support A) A support having an appropriate hardness is formed on a culture dish for cell culture and solidified.
  • a hydrogel polyacrylamide gel or the like
  • the produced support is chemically and physically modified. At this time, it is not an essential requirement to give modification to the support. As a chemical factor, it is preferable to use matrigel or laminin, but not limited thereto.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • the cells mixed with the mesenchymal cells are pluripotent cells.
  • the tissue mixed with the mesenchymal cells is a tissue derived from pluripotent cells.
  • the pluripotent cell is a pluripotent cell obtained from a living body, a pluripotent cell obtained by reprogramming, or a combination thereof.
  • mesenchymal stem cells by combining mesenchymal stem cells and a support, or a base material that collects on the bottom surface, it is possible to form an assembly of any complex composition in theory. According to the present invention, it is possible to construct a tissue / organ without using a scaffold material (scaffold).
  • A Time course of cell assembly formation process.
  • Green iPSC-hepatic endoderm cells, (light red) human vascular endothelial cells, (colorless) mesenchymal cells.
  • B Formation of self-assembled iPSC or iPS cell-derived hepatoblasts.
  • C Time evolution dynamics of cell assembly formation.
  • Red Square root of aggregate projected area. It can be used as an index indicating the position of the outer periphery of the aggregate. After about 13h, it can be approximated by an exponential function (black dotted line).
  • Blue The circularity of the aggregate. It was calculated from the projected area and the perimeter of the aggregate.
  • CG The time dependence (D, E) and substrate hardness dependence (F, G) of the trajectory (C) of MSCs in the cell assembly, the moving speed and the movement orientation. Self-organizing assembly formation experiment using cells derived from various tissues.
  • A, B Cell assembly formation using pancreatic ⁇ cells
  • B self-organization
  • C, D Cell assembly formation experiments using cells and tissues of other organs In vivo self-organization and functional expression of cell aggregates derived from various tissues.
  • A Transplantation causes functional vascularization in 2-3 days.
  • B Comparison of time required for blood perfusion compared to the conventional method.
  • C Direct anastomosis of mouse and human blood vessels.
  • D Glomeruli / tubules formed by aggregates formed from fetal kidney cells.
  • E Islet-like tissue formed by aggregates formed from ⁇ cells.
  • F A therapeutic effect determination model of an aggregate formed from ⁇ cells.
  • G Change in blood glucose level over time in a diabetes model mouse transplanted with aggregates formed from ⁇ cells.
  • A Formation of a cell aggregate that does not contain vascular endothelial cells.
  • B Formation of cell aggregates using human or mouse mesenchymal cells. Formation of cell aggregates using U bottom gel. Reconstruction of a functional vascular network by kidney primordia transplantation made on a support. Maturation of transplanted kidney primordia. Structural analysis of mature kidney primordium after transplantation. Live observation of the urine production function of the transplanted kidney primordium. Measurement of the hardness characteristics of the support before and after biochemical coating. Production of a support having a multi-pattern of hardness. Production of cell aggregates on a support having a multi-pattern of hardness. Fabrication on a support with a complex multi-pattern.
  • the present invention provides a method for producing a cell aggregate in vitro, comprising culturing a mixture of any kind of cells and / or tissue and mesenchymal cells to form a cell aggregate.
  • a mesenchymal cell is a connective tissue cell that exists in connective tissue mainly derived from mesoderm and forms a support structure for cells that function in the tissue.
  • the term “mesenchymal cell” This concept includes cells that have been determined to differentiate into mesenchymal cells but have not yet differentiated into mesenchymal cells.
  • the mesenchymal cells used in the present invention may be differentiated or undifferentiated, but it is preferable to use undifferentiated mesenchymal cells. Whether a cell is an undifferentiated mesenchymal cell is confirmed by examining whether a marker protein, for example, Stro-1, CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD133, CD271, or Nestin is expressed.
  • mesenchymal stem cells mesenchymal progenitor cells
  • mesenchymal cells mesenchymal cells (R. Peters, et al. PLoS One. 30; 5 (12): e15689. (2010), etc. Included in lineage cells.
  • Mesenchymal cells are mainly derived from humans, but animals other than humans (for example, animals used for laboratory animals, pets, working animals, racehorses, dogs, etc., specifically mice, rats) , Rabbits, pigs, dogs, monkeys, cows, horses, sheep, chickens, sharks, rays, sharks, salmon, shrimps, crabs, etc.).
  • Arbitrary types of cells and / or tissues to be mixed with mesenchymal cells may be any type of cells and / or tissues regardless of the type or number of combinations. Moreover, it may be derived from any organ or tissue such as liver, pancreas, intestine, lung, kidney, heart, brain, etc., regardless of cell and / or tissue origin, or also derived from cancer. It may be a thing.
  • the cells mixed with the mesenchymal cells are preferably functional cells constituting organs or tissues, or undifferentiated cells or pluripotent cells that differentiate into functional cells.
  • the tissue mixed with the mesenchymal cells may be a tissue separated from an individual, or derived from an undifferentiated cell or a pluripotent cell that differentiates into an organ or tissue, or a functional cell. It may be an organized organization.
  • undifferentiated cells may include cells that can differentiate into organs such as kidney, heart, lung, spleen, esophagus, stomach, thyroid, parathyroid, thymus, gonad, brain, spinal cord, and the like. , Adrenal medulla, epidermis, hair, nails, skin glands, sensory organs, peripheral nerves, cells that can differentiate into ectodermal organs such as lens, kidney, ureter, heart, blood, gonad, adrenal cortex, muscle, skeleton, dermis And cells capable of differentiating into mesodermal organs such as connective tissue and mesothelium, and cells capable of differentiating into endoderm organs such as liver, pancreas, intestinal tract, lung, thyroid, parathyroid gland and urinary tract.
  • organs such as kidney, heart, lung, spleen, esophagus, stomach, thyroid, parathyroid, thymus, gonad, brain, spinal cord, and the like.
  • a cell is a cell that can differentiate into an ectodermal organ, mesodermal organ, or endodermal organ can be confirmed by examining the expression of a marker protein (either one or more of the marker proteins are expressed). If so, it can be determined that the cell can differentiate into an endoderm organ.
  • a marker protein either one or more of the marker proteins are expressed.
  • HHEX, SOX2, HNF4A, AFP, ALB, etc. are markers
  • PDX1, SOX17, SOX9, etc. are markers that can differentiate into the intestinal tract. Then, CDX2, SOX9, etc.
  • markers are markers, and in cells that can differentiate into kidney, SIX2, SALL1, in cells that can differentiate into heart, NKX2-5 MYH6, ACTN2, MYL7, HPPA, in cells that can differentiate into blood, For C-KIT, SCA1, TER119, HOXB4, and cells that can differentiate into the brain and spinal cord, HNK1, AP2, NESTIN, etc. are markers.
  • hepatoblast hepatic progenitor cells, pancreatoblast, hepatic precursor cells, pancreatic progenitors, pancreatic progenitor cells, pancreatic precursor cells, endocrine precursors, intestinal progenitor cells, intestinal precursor cells, intermediate mesoderm, metanephric mesenchymal precursor cells, multipotent nephron pr gen., real progenitor cells, cardiac mesoderm, cardiovascular progenitor cells, cardiac progenitor cells, (JR. Spence, et al. Nature .: 070 (732). 25 (21): 5214-5228. (2006), J. Zhang, et al.
  • pluripotent cells pluripotent cells obtained from a living body (for example, ES cells, pluripotent cells obtained by induction from reprogramming (for example, iPS cells, STAP cells (Stimulus-triggered fate conversion of) somatic cells into pluripotency. Nature, 2014), MUSE cells (Multilineage-differentiating stress-enduring (Muse) cells are a primary source of induced pluripotent stem cells in human fibroblasts.
  • iMPC cells induced multipot Examples include nt progenitor cell; Mouse liver repopulation with hepatocytes generated generated human blasts. Nature, 2014), undifferentiated cells, artificial pluripotent cells, stem cells, and artificial pluripotent cells.
  • ES cells can be prepared according to a known method, for example, K. Si-Taiyeb, et al. Hepatology, 51 (1): 297-305 ( 2010), T. Touboul, et al. Hepatology.51 (5): 1754-65. (2010), Cells that can differentiate into the viscera can be prepared according to D. Zhang, et al., Cell Res.; 19 (4): 429-38.
  • Functional cells that make up organs and tissues include pancreatic endocrine cells, pancreatic pancreatic duct epithelial cells, liver hepatocytes, intestinal epithelial cells, renal tubular epithelial cells, renal glomerular epithelial cells, and cardiac myocardial cells Examples thereof include blood lymphocytes and granulocytes, red blood cells, brain neurons and glial cells, spinal cord neurons and Schwann cells.
  • Cells are mainly derived from humans, but animals other than humans (for example, experimental animals, pets, working animals, racehorses, animals used for fighting dogs, specifically mice, rats, rabbits, Pigs, dogs, monkeys, cows, horses, sheep, chickens, sharks, rays, sharks, salmon, shrimps, crabs, etc.) cells may be used.
  • animals other than humans for example, experimental animals, pets, working animals, racehorses, animals used for fighting dogs, specifically mice, rats, rabbits, Pigs, dogs, monkeys, cows, horses, sheep, chickens, sharks, rays, sharks, salmon, shrimps, crabs, etc.
  • vascular cells may be further added to a mixture of arbitrary types of cells and / or tissues and mesenchymal cells.
  • vascular cells can be isolated from vascular tissue, but are not limited to cells isolated from vascular tissue, and are induced to differentiate from cells having totipotency or pluripotency such as iPS cells and ES cells. It may be a thing.
  • vascular cells vascular endothelial cells are preferable.
  • “vascular endothelial cells” refer to cells that constitute vascular endothelium or cells that can differentiate into such cells (for example, vascular endothelial progenitor cells). , Vascular endothelial stem cells, etc.).
  • a certain cell is a vascular endothelial cell can be confirmed by examining whether a marker protein, for example, TIE2, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, VE-cadherin, or CD31 is expressed (see above). If any one or more of the marker proteins are expressed, it can be judged as a vascular endothelial cell). Further, c-kit, Sca-1 and the like have been reported as markers for vascular endothelial progenitor cells, and expression of these markers can be confirmed to be vascular endothelial progenitor cells (S Fang, et al. PLOS Biology. 2012; 10 (10): e1001407.).
  • a marker protein for example, TIE2, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, VE-cadherin, or CD31 is expressed (see above). If any one or more of the marker proteins are expressed, it can be judged as a vascular endothelial cell). Further, c-kit,
  • endothelial cells is included in the vascular endothelial cells in the present invention.
  • the blood vessel cells are mainly derived from humans, but animals other than humans (for example, animals used for laboratory animals, pet animals, working animals, racehorses, dogs, etc., specifically mice, rats, rabbits).
  • Vascular cells derived from animals such as pigs, dogs, monkeys, cows, horses, sheep, chickens, sharks, rays, sharks, salmon, shrimps, crabs, etc.).
  • Vascular cells are obtained from umbilical cord blood, umbilical cord blood vessels, neonatal tissue, liver, aorta, brain, bone marrow, adipose tissue and the like.
  • the “vasculature” means a structure composed of vascular endothelial cells and their supporting cells, and the vasculature not only maintains tissues but also plays an important role in the maturation process. .
  • the vascular structure not only has a role of delivering oxygen and nutrients necessary for the survival of the tissue to the inside of the tissue after transplantation, but also the blood vessels (even before the blood flows into the inside). It is thought that reproducing the accompanying three-dimensional tissue structure and cell polarity is important for cell differentiation, proliferation and maintenance. Therefore, tissues that do not have blood vessels not only do not settle after transplantation but necrotic inside, tissue maturation associated with vascularization is not achieved, and it is difficult to exert sufficient functions. there were.
  • vasculature and “vascularization” means that the vascular system consisting of vascular endothelial cells and supporting cells is directly integrated with the target tissue, and is given the vascular system.
  • vascular endothelial cells and supporting cells are directly integrated with the target tissue, and is given the vascular system.
  • the total number of cells is 400,000 or more (preferably 400,000 to 4.4 million, more preferably about 2 million) and any kind of cells and / or tissues and 40,000 or more.
  • a mixture with mesenchymal cells (preferably 50,000 to 1,000,000, more preferably 100,000 to 400,000) may be cultured.
  • cell aggregates are autonomously formed, and cell aggregates having various sizes, for example, a size of 1 mm or more (preferably 1 to 20 mm, more preferably 1 to 8 mm) are obtained.
  • the ratio of any type of cells and / or tissue to mesenchymal cells is not particularly limited as long as a cell aggregate having a desired size can be formed, but a suitable number ratio of cells is arbitrary.
  • mesenchymal cells 10: 0.5-3.
  • the total number of cells is 400,000 or more (preferably 400,000 to 4.4 million, more preferably about 2 million) and any type of cells and / or tissues and 40,000. More than 4000 cells (preferably 50,000-1 million cells, more preferably 100,000-400,000 cells) and more than 4000 cells (preferably 20,000-400,000 cells, more preferably 4 10,000 to 280,000 blood vessel cells may be added.
  • the medium used for culturing may be any medium as long as cell aggregates are formed, but a composition that promotes induction of self-organization of the target tissue is preferable.
  • a mixture of a vascular endothelial cell medium and a target organ cell medium in a ratio of 1: 1 may be used.
  • EGM As media for vascular endothelial cells, EGM (registered trademark) BulletKit (registered trademark) (Lonza CC-4133), EGM-2 (registered trademark) BulletKit (Lonza CC-3162), EGM-2 (registered trademark) MV ( It is preferable to use one such as Lonza CC-3156), but this is not a limitation.
  • organ cell culture media include 20% fetal bovine serum (BWT Lot. S-1560), 100 ⁇ g / ml penicillin / streptomycin (Gibco), Insulin- in RPMI1640 (Wako) for adult kidney cells. What added Transferrin-SeleniumX (GIBCO) is good.
  • D-MEM High-Glucose Wako 043-30085
  • 10% fetal bovine serum BWT Lot. S-1560
  • 100 ⁇ g / ml penicillin / streptomycin Gibco
  • Any kind of cells and / or a mixture of tissue and mesenchymal cells may be cultured on a gel-like support on which mesenchymal cells can contract.
  • the contraction of mesenchymal cells is morphologically observed with a microscope or with the naked eye, and shows that the tissue shape is strong enough to maintain the shape of the tissue following recovery with a medicine spoon (Takebe, etc.) et al. Nature 499 (7459), 481-484, 2013)).
  • the support has an appropriate hardness (for example, a Young's modulus of 200 kPa or less (in the case of a gel having a flat shape coated with Matrigel, etc.), but the appropriate hardness of the support can vary depending on the coating and shape.)
  • the base material is preferably a gel-like base material, and examples of such a base material include hydrogels (eg, acrylamide gel, gelatin, matrigel, etc.), but are not limited thereto.
  • the hardness of the support is not necessarily uniform depending on the shape, size, and quantity of the target assembly, and it is necessary to set a spatial and temporal gradient in the hardness (for example, implementation described later).
  • Example 6 and patterning (for example, Example 7 described later) are possible.
  • the hardness of the support is preferably 100 kPa or less, more preferably 1 to 50 kPa.
  • the gel-like support may be flat, or the cross-section on the side of the gel-like support to be cultured may be U-shaped or V-shaped. Since the cross-section of the gel-like support on the side to be cultured has a U or V shape, the cells gather on the culture surface of the support, and a cell aggregate is formed with a smaller number of cells and / or tissues. This is advantageous.
  • the support may be chemically and physically modified. Examples of the modifying substance include matrigel, laminin, entactin, collagen, fibronectin, vitronectin and the like.
  • a spatial gradient is set in the hardness of the gel-like culture support
  • a gel-like culture support (Example 6 described later, FIGS. 20 and 21) in which the hardness at the center is harder than the hardness at the periphery.
  • the center hardness should be 200 kPa or less, and the periphery hardness should be softer than the center.
  • the appropriate center and periphery hardness varies depending on the coating and shape. sell.
  • Another example in which a spatial gradient is set in the hardness of the gel-like culture support is a gel-like culture support in which the hardness at the periphery is harder than the hardness at the center.
  • a patterned gel-like culture support is a gel-type culture support having one or more patterns in which the hardness of the central part is harder than the hardness of the peripheral part (Example 7, described later, FIG. 22 left, positive pattern) It is.
  • the center hardness should be 200 kPa or less, and the periphery hardness should be softer than the center. However, the appropriate center and periphery hardness varies depending on the coating and shape. sell.
  • Another example of the patterned gel-like culture support is a gel-type culture support having one or more patterns in which the hardness of the peripheral part is harder than the hardness of the central part (Example 7 described later, FIG. 22 right, negative Pattern).
  • the hardness of the periphery is appropriate to be 200 kPa or less, and the hardness of the center should be softer than the periphery.
  • the appropriate hardness of the center and periphery of the support varies depending on the coating and shape. sell.
  • the temperature during the cultivation is not particularly limited, but is preferably 30 to 40 ° C, more preferably 37 ° C.
  • the oxygen supply amount is suitably 4% to 50%, preferably 10% to 30%, more preferably 18% to 25%.
  • the culture period is not particularly limited, but is preferably 12 to 144 hours.
  • 48 hours are preferable, and in order to form a cell aggregate having a size of 0.4 to 10 mm from cells and / or tissues separated from the pancreas, it is preferably 12 to 144 hours and separated from the intestine.
  • it is preferably 12 to 96 hours, and 0.4 to 1 mm from cells and / or tissues separated from the lung.
  • it is preferably 12 to 96 hours.
  • a cell aggregate having a size of 0.4 to 10 mm from cells and / or tissues separated from the heart It is preferably 2 to 96 hours, and in order to form a cell aggregate having a size of 0.4 to 5 mm from cells and / or tissues separated from the kidney, it is preferably 12 to 144 hours.
  • a cell aggregate having a size of 0.4 to 10 mm from the separated cells and / or tissues it is preferably 12 to 144 hours, and 0.4 to 0.4 hours from the cells and / or tissues separated from the cancer.
  • a cell aggregate having a size of 10 mm it is preferably 12 to 144 hours.
  • a cell aggregate having a size of 0.4 to 10 mm from pluripotent cells such as iPS cells it is preferably 48 to 144 hours.
  • the cell assembly produced by the method of the present invention reproduces the biological environment that occurs in the womb because of the close interaction between cells. As a result, induction of early differentiation into organ progenitor cells occurs efficiently, and the existence frequency and number are considered to improve. Moreover, the cell aggregate produced by the method of the present invention has cells strongly adhered to each other and can be recovered nondestructively.
  • the cell aggregates described in the present application are organ buds and organoids (organ buds (WO2013 / 047639), liver bud, liver diverticula, liver organic bioids, dancreatic (dorsal or invertentral, budricant, bicreatic, bioreactive). , Intestinal organoid (K. Matsumoto, et al. Science.
  • organ buds are comparable to those formed early in organ development, In principle, there are three types of cells: functional cells that make up organs and tissues (or undifferentiated cells that differentiate into functional cells), vascular cells, and mesenchymal cells. It consists only of the constituent cells, and is basically small (1 mm or less).
  • the cell aggregate forms a three-dimensional tissue structure to which a higher-order structure is added by self-organization, and thus it is possible to realize terminal differentiation induction of progenitor cells.
  • Self-organization may be performed either in vivo or in vitro. For example, by transplanting a cell aggregate prepared by the method of the present invention into a living body, a vascular network is formed, blood perfusion is induced, and self-organization into a higher-order tissue having a complicated structure occurs. It becomes possible to produce a tissue or an organ having a highly ordered tissue structure equivalent to that of an adult tissue.
  • the present invention also provides a cell aggregate produced by the above method.
  • the present invention also provides a method for producing a three-dimensional tissue structure, comprising self-organizing the cell aggregate produced by the above method to form a three-dimensional tissue structure to which a higher order structure is added. .
  • the present invention provides a gel-like culture support having a U-shaped or V-shaped cross section on the side to be cultured.
  • the culture support of the present invention has a U-shaped or V-shaped cross-section on the side of the gel-like support to be cultured, so that cells gather on the culture surface of the support, and a smaller number of cells and / or Alternatively, it is advantageous because cell aggregates are formed in the tissue.
  • the gel-like culture support having a U-shaped or V-shaped cross section on the side to be cultured is as described above.
  • the present invention also provides a gel-like culture support in which the hardness at the center is harder than the hardness at the periphery. One embodiment is shown in Example 6 (FIGS. 20 and 21) described later.
  • the center hardness should be 200 kPa or less, and the periphery hardness should be softer than the center.
  • the appropriate center and periphery hardness varies depending on the coating and shape. sell.
  • the present invention also provides a gel-like culture support in which the hardness of the peripheral part is harder than the hardness of the central part.
  • the present invention also provides a gel-like culture support having one or more patterns in which the hardness of the central part is harder than the hardness of the peripheral part.
  • One embodiment is shown in Example 7 (left side of FIG. 22, positive pattern).
  • the center hardness should be 200 kPa or less, and the periphery hardness should be softer than the center.
  • the present invention also provides a gel culture support having one or more patterns in which the hardness of the peripheral part is harder than the hardness of the central part.
  • One embodiment is shown in Example 7 (right side of FIG. 22, negative pattern) described later.
  • the hardness of the periphery is appropriate to be 200 kPa or less, and the hardness of the center should be softer than the periphery.
  • the appropriate hardness of the center and periphery of the support varies depending on the coating and shape. sell.
  • the present invention provides a cell assembly comprising culturing a mixture of any kind of cells and / or tissue and mesenchymal cells on the gel culture support to form a cell assembly. Also provided is a method of making a body in vitro. The culture of a mixture of any kind of cells and / or tissue and mesenchymal cells is as described above.
  • liver is formed from a collection of tissue masses called liver buds at 5-8 weeks of human pregnancy.
  • mesenchymal stem cells, undifferentiated vascular endothelial cells and anterior visceral endoderm cells is required for initiation of liver regeneration called basic liver budding (also called hepatoblasts) in the foregut (1).
  • basic liver budding also called hepatoblasts
  • PSCs pluripotent stem cells
  • single PSC-derived hepatocytes autonomously form a three-dimensional aggregate by co-culture with endothelial cells and mesenchymal cells (2).
  • endothelial cells and mesenchymal cells (2).
  • self-organization into hepatic bud tissue that has a structure resembling an organ present in the womb proceeds under complete in vitro conditions after a few days (3).
  • Transplantation of buds of organs grown in vitro further self-organizes (matures) in the body, resulting in a vascularized and functional liver. This method opens up new avenues for the artificial reconstruction of vascularized organ systems (4).
  • iPSC Human-derived pluripotent stem cells
  • HAVEC umbilical cord-derived endothelial cells
  • MSC mesenchymal stem cells
  • MII myosin II
  • a hydrogel having characteristics capable of freely adjusting biochemical / mechanical conditions was prepared for evaluation of the external environment on the cellular response (FIG. 2) (13).
  • FIG. 2 a hydrogel having characteristics capable of freely adjusting biochemical / mechanical conditions was prepared for evaluation of the external environment on the cellular response (FIG. 2) (13).
  • pancreas follows a developmental program that is relatively close to the liver, in order to test this hypothesis, we first selected pancreatic cells for co-culture.
  • pancreatic ⁇ cells MIN6
  • HUVEC and MSC formation of cell aggregates was also observed (FIG. 3).
  • confocal microscopy analysis was performed using fluorescently labeled cells.
  • Three-dimensional z-stack projection images revealed that kusterrorism orange (KO) -labeled MIN6 is self-assembled to form islet-like tissue 72 hours after transplantation.
  • HUVEC labeled with green fluorescent protein (EGFP) formed a network structure covering the MIN6-derived islets within the organoid. From the above, it was shown that the operating principle found in the liver could be extended in the pancreas.
  • pancreatic cells Transplantation of 3D pancreatic organoids resulted in rapid ( ⁇ 48 hours) reperfusion and ⁇ -cell engraftment, which was confirmed by in vivo imaging analysis.
  • the graft formed an islet-like structure (Figure 4, E) with a functional microvascular network connected to the recipient's circulatory system ( Figure 4, C).
  • Figure 4, E Such blood perfusion was not observed when an assembly without vascular endothelial cells was transplanted
  • the reconstructed islets were directly connected to the surrounding mouse blood vessels and highly vascularized by a dense network of capillaries (FIG. 10).
  • the islet capillary network in the living body is about 5 times higher in density than the blood vessel network surrounding the exocrine tissue, and is consistently reconstructed by quantifying the functional blood vessel density in the living body.
  • the capillary network was shown to be much denser (4.2 times) compared to the periphery of the normal tissue (FIGS. 4 and 9). From the histological analysis, it has a structure similar to that of an adult islet, and it was considered that the mature tissue was reconstructed by self-organization (FIG. 11).
  • in vitro-derived ⁇ -cell organoids were transplanted under the kidney capsule of type I fulminant diabetic model mice.
  • mice in the non-transplanted group died on day 6 after induction of diabetes through diphtheria toxin (DT) administration, whereas mice transplanted with ⁇ -cell organoids maintained normal blood glucose levels and survived (FIG. 4, G). ). From the above, we have demonstrated that this principle can be applied to other organ systems by experimentally reconstructing angiogenesis and functional three-dimensional tissue in vivo.
  • MC mesenchymal cells
  • C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP) mouse Japan SLC
  • diethyl ether Wako
  • the abdomen of gestation day 12-17 was sterilized with 70% ethanol and then opened.
  • the fetus was removed.
  • the brain, heart, lungs, liver, metanephros, or intestine was removed from the fetus.
  • the brain, heart, lung, liver, kidney, or intestine of C57BL / 6-BALB / c RFP hair mouse purchased from Anticancer Inc. 6 weeks of age or older was removed.
  • the medium was added, and the mixture was centrifuged through a 100 ⁇ m cell strainer. After centrifugation, a medium was added and used for cell culture.
  • the brain, heart, lung, and liver of an adult mouse are minced with scissors, filtered using a 100 ⁇ m cell strainer, and the flow-through is filtered using a 40 ⁇ m cell strainer, and the cell mass remaining on the 40 ⁇ m cell strainer.
  • the washed small intestine was cut longitudinally and cut at 4 cm intervals into 2 mM EDTA, 0.5 mM DTT in PBS and shaken at 37 ° C. for 20 minutes. Then, it filtered using a 100 micrometer cell strainer, and added PBS. After centrifuging and sucking the supernatant, PBS was added for washing. Thereafter, centrifugation was performed, and a medium was added for cell culture.
  • VEC Normal Umbilical Vein Endothelial Cells
  • EGM® Bullet Kit Using (Lonza CC-4133), the cells were cultured for 5 passages. All cells were fluorescently labeled with a retroviral vector as necessary.
  • HepG2 was cultured in DMEM with 10% FBS added. Each cell was cultured in an incubator at 37 ° C. and 5% CO 2.
  • ⁇ Preparation of cell assembly for self-assembly A PA gel flat substrate was left standing, or a Matrigel coating (Matrigel (BD) stock solution or a solution in which Matrigel and medium were mixed at a ratio of 1: 1) per well.
  • Matrigel coating Matrigel (BD) stock solution or a solution in which Matrigel and medium were mixed at a ratio of 1: 1:
  • reaction solution was bumped using a vacuum chamber, and then 100 ⁇ L of APS (5 g / DW50 mL, 01307-00, KANTO, 0.20 mm filtered) and 10 ⁇ L TEMED (T9281, Sigma) were added in order. . Thereafter, 25 ⁇ L of this reaction solution was dropped on a slide glass (S2112, MATSUNAMI) surface-hydrophobized with dimethyldichlorosilane (DCDMS, D0358, TCI), and then allyltrichlorosilane (ATCS, 107778-5 g, Sigma) was treated from above.
  • APS 5 g / DW50 mL, 01307-00, KANTO, 0.20 mm filtered
  • TEMED 10 ⁇ L TEMED
  • 25 ⁇ L of this reaction solution was dropped on a slide glass (S2112, MATSUNAMI) surface-hydrophobized with dimethyldichlorosilane (DCDMS, D03
  • Table 1 shows the mixing ratio of typical reaction solutions and the Young's modulus of the gel. The Young's modulus of the gel was determined by nanoindentation measurement with an atomic force microscope (Nanowizard 3, JPK Instruments, Germany). Coating of adhesion molecules (Matrigel or laminin) on the surface of the PA gel was performed by the following procedure.
  • Example 2 Matrigel coating (Matrigel (BD) stock solution or Matrigel-medium mixed solution at a ratio of 1: 1 is added 300 ⁇ l per well and left in an incubator at 37 ° C., 5% CO 2 for 10 minutes or more to harden. 2 ⁇ 10 6 cells of iPS cell-derived hepatic endoderm cells or human adult hepatocytes and 5 ⁇ 10 5 cells of human or mouse MSC in one well of a 24-well plate And sowing. Thereafter, the cells were cultured in an incubator at 37 ° C. for 1 day. After seeding, cell co-culture with a stereomicroscope or a confocal microscope was observed over time. As shown in FIG. 13, even if there are no vascular endothelial cells, if there are mesenchymal cells, a cell aggregate is formed.
  • Example 3 Preparation of U-bottom PA gel Prepared by mixing acrylamide solution (40% w / v, A4058, Sigma), bisacrylamide solution (2% w / v, M1533, Sigma), and distilled water as a reaction solution for gel 10 mL of the solution was prepared. At this time, the Young's modulus of the gel was adjusted by changing the mixing ratio of each solution. After adding 500 ⁇ L of the reaction solution to 24-well tissue culture plate (353047, BD), 0.5 ⁇ L TEMED (T9281, Sigma) and 5 ⁇ L of APS (5 g / DW50 mL, 01307-00, KANTO, 0 .20 mm filtered) were added in this order and immediately mixed well.
  • FIG. 14 A cross-sectional view of the U bottom gel is shown in FIG.
  • the iPS cell-derived hepatic endoderm cells were mixed with 7 ⁇ 10 5 cells of HUVEC and 2 ⁇ 10 5 cells of human MSC and seeded. Thereafter, the cells were cultured in an incubator at 37 ° C. for 1 day. After seeding, cell co-culture with a stereomicroscope or a confocal microscope was observed over time, and it was shown that cell aggregates were formed (FIG. 14).
  • Example 4 C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP) mice (Japan SLC) anesthetized with diethyl ether (Wako), sterilized the abdomen of gestation day 12.5 and 13.5 with 70% ethanol, opened, and fetus was extracted. After removing the metanephros from the fetus, it was placed in 200 ⁇ L of 0.05% Trypsin-EDTA (GIBCO) and incubated at 37 ° C. for 20 minutes. Thereafter, the tissue was disrupted with a pipette and added to 4.8 mL of medium.
  • the medium was added and the number of cells was counted, and then the cells treated with the enzyme to single cells were used for co-culture. Thereafter, it was mixed with mesenchymal stem cells (hMSCs) isolated from human bone marrow and normal umbilical vein endothelial cells (Normal Universal Cells: HUVEC), and a stock solution of matrigel (BD) of Example 2 ) And a medium for vascular endothelial cells (EGM BulletKit (registered trademark), Lonza CC-4133) in a ratio of 1: 1 was seeded on wells that had been hardened.
  • hMSCs mesenchymal stem cells isolated from human bone marrow and normal umbilical vein endothelial cells isolated from human bone marrow and normal umbilical vein endothelial cells (Normal Universal Cells: HUVEC), and a stock solution of matrigel (BD) of Example 2 )
  • BD matrigel
  • EMM BulletKit registered trademark
  • kidney primordia were transplanted into the immunodeficient mouse womb, a macroscopic observation was performed. As a result, blood inflow was confirmed on the 2nd to 3rd days of transplantation (upper part of FIG. 15). A white dotted line in FIG. 15 indicates a transplant area. The dispersed cells formed a spherical glomerular tissue on the 8th day of transplantation (lower part of FIG. 15). As a result of fluorescence observation shown on the left of FIG. 16, many glomerular structures were formed by culturing on the support, but not by the conventional method (pellet transplant group). As a result of the comprehensive gene expression analysis shown on the right side of FIG.
  • the graft in the first month of transplantation had a maturity level such as the 0 to 8 week phase.
  • the result of electron microscopic observation of the tissue at 4 weeks after transplantation is that the formed tissues are podocytes, slit membranes, endothelial cells, proximal tubules, mesangial cells, etc.
  • a normal nephron structure was formed.
  • the presence of podocytes and slit membranes was shown as a result of immunostaining.
  • the results of live fluorescence observation after administration of low molecular weight fluorescent dextran at 3 weeks after transplantation are shown (FIG. 18).
  • the formed tissue first flowed into the blood vessel, was filtered inside the glomerulus, and collected in the proximal tubule, indicating that it has a function of generating the original urine of the kidney (FIG. 18). ). From the above, we succeeded in inducing autonomous maturation and creating functional kidney tissue by transplanting the artificially produced kidney primordium according to the present invention into the living body.
  • Example 5 Changes in Young's modulus before (triangled) and after (black solid) Matrigel coating of supports (preparation of PA gel flat substrate) under different hardness conditions (Sample A, B, C). It shows that the hardness condition can be strictly controlled regardless of the presence or absence of coating (FIG. 19).
  • the gel substrate was produced using the method described in Example 1.
  • Example 6 We succeeded in producing a multi-pattern gel with hardness in which different hardness conditions coexist on one substrate (FIG. 20).
  • a gel having a hard center part was produced, and in the pattern 2, a gel having a slightly hard center part was produced (the left figure in FIG. 20).
  • the right figure of FIG. 20 shows the result of measuring the hardness condition in the major axis direction, and shows that the intended hardness condition is produced.
  • the method for producing a gel substrate having a hardness spatial pattern is as follows.
  • aqueous acrylamide solution 50% w / v, A4058, Sigma
  • an aqueous bisacrylamide solution 2% w / v, M1533, Sigma
  • 50 mg of Irgacure 2959 (0.5% w / v, DY15444, Ciba) was added while being shielded from light, and then dissolved in a 37 ° C. hot water bath and bumped using a vacuum chamber.
  • the mask pattern was designed using Adobe Photoshop to produce a circular mask having an outer diameter of 12 mm and an inner diameter of 2 to 4 mm.
  • a mercury lamp C-HGFI, Nikon
  • an optical fiber and a floodlight were used to uniformly irradiate the reaction solution.
  • the ultraviolet irradiation time was adjusted in increments according to the target hardness. After that, distilled water was added, and the glass was peeled from the slide glass substrate to obtain a cover glass substrate coated with gel. Thereafter, a phosphate buffer was added and allowed to stand for one day to remove unreacted monomers.
  • the Young's modulus of the gel was determined by nanoindentation measurement with an atomic force microscope (Nanowizard 3, JPK Instruments, Germany). Coating of adhesion molecules (Matrigel or laminin) on the surface of the PA gel was performed by the following procedure. First, a 20 mg HEPES (pH 8.5) solution of 0.2 mg / mL of N-Sulfosuccinimidyl-6- (4′-azido-2′-nitrophenylamino) hexanoate (Sulfo-SANPAH, 22589, Pierce) was added to a PA gel substrate. The solution was dropped on the top and irradiated with a UV lamp (Z169633-1EA, Sigma) for 20 minutes.
  • a UV lamp Z169633-1EA, Sigma
  • iPS-derived liver endoderm cells, HUVEC, and MSC are mixed at a ratio of 10: 7: 2, and about 2 ⁇ 10 6 cells are seeded as the total number of cells (FIG. 21).
  • FIG. 21 the total number of cells
  • Example 7 In the positive pattern, each circular portion was designed to be hard and its periphery soft (FIG. 22 left). The negative pattern was designed so that each circular portion was soft and the periphery thereof was hard (right in FIG. 22).
  • Such a gel substrate having a large number of hardness patterns is based on the method described in Example 6 and has a 4 ⁇ 4 circular pattern (circle diameter of about 2 mm, circle center distance of about 2.7 mm). A gel substrate having a diameter of 25 mm was exposed to light using a photomask. It is considered that an aggregate having an arbitrary size can be formed at an arbitrary place by using these patterned supports. All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.
  • the present invention can be used for searching for new drugs and determining their efficacy, regenerative medicine, disease, pathological diagnosis, production of useful substances, and the like.

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Abstract

　ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて多数の細胞（数万～数百万個）から細胞集合体の作製に必要となる要件を発見するとともに、肝臓や腎臓などの複雑な高次構造や、他の臓器との相互作用を実現することの可能な自己組織化用細胞集合体の形成方法を提供する。　総細胞数として４０万個以上の任意の種類の細胞及び／又は組織と１０万～４０万個の間葉系細胞との混合物を培養し、大きさが１ｍｍ以上である細胞集合体を形成させることを含む、細胞集合体をｉｎ　ｖｉｔｒｏで作製する方法。前記方法で作製された細胞集合体。前記方法で作製された細胞集合体を自己組織化させ、高次構造が付加された三次元組織構造を形成させることを含む、三次元組織構造の作製方法。培養する側の断面がＵ又はＶ字の形状であるゲル状培養支持体。

Description

自己組織化用細胞集合体の作製方法
　本発明は、自己組織化用細胞集合体の作製方法に関し、より詳細には、目的とする組織・臓器への自己組織化を誘導するために必要な細胞集合体の作製方法に関する。
　近年、複雑な構造を有する組織・臓器を形成する方法として、細胞が本来有する自己組織化能（Ｓｅｌｆ-Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）を利用する方法が注目されている（非特許文献１，２）。自己組織化とは、１種類あるいは少数の種類の要素が、外部から特別の「指示」となる情報を受けることなく、自分たちの内在的な特性を発揮して複雑な高次の構造を組み上げて行くことである。例えば、雪の結晶形成などのように、パターンのない集合体の中で、自発的な秩序が生まれてパターンが形成されて行く自然現象が観察されるほか、ナノテクノロジーや光学結晶の作製などで工学的にも利用されている。
　自己組織化を誘導するための要件としては、高密度環境で均一な細胞からなる集合体（Ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を形成することが必要となる。培養を行ったＥＳ・ｉＰＳ細胞からＡｇｇｒｅｇａｔｅを作成し、脳、眼杯、下垂体、歯などを作製することが報告されている（非特許文献３-６）。このような、Ａｇｇｒｅｇａｔｅを作製するための手法としては、底面がＵやＶ状の構造を持つ９６ｗｅｌｌなどのように底面に集まるような基材を用いることにより、少数の細胞（数千個程度）の細胞集合体から数百μｍレベルの組織を形成する方法が主として用いられている。しかし、多数の細胞（数万～数百万個）からより大型（２００μｍ以上～）の細胞集合体を形成することは達成困難であった。このために、さまざまな種類の細胞からなるＡｇｇｒｅｇａｔｅを作製するためには従来の方法を適応することは困難であった。
　したがって、マウスなどの小型動物の組織・臓器と比較して、自己組織化を利用してヒトなどのように大型の複雑な組織・臓器を作製するための集合体を作製する手法の開発が望まれていた。
Ｃａｍａｚｉｎｅ，　Ｓ．，　Ｄｅｎｅｕｂｏｕｒｇ，　Ｊ．　-Ｌ．，　Ｆｒａｎｋｓ，　Ｎ．　Ｒ．，　Ｓｎｅｙｄ，　Ｊ．，　Ｔｈｅｒａｕｌａｚ，　Ｇ．　＆　Ｂｏｎａｂｅａｕ，　Ｅ．　Ｓｅｌｆ-Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ　Ｕｎｉｖ．　Ｐｒｅｓｓ，　２００１）． Ｔａｋｅｉｃｈｉ，　Ｍ．　Ｓｅｌｆ-ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｉｍａｌ　ｔｉｓｓｕｅｓ：　ｃａｄｈｅｒｉｎ-ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．　Ｄｅｖ．　Ｃｅｌｌ　２１，　２４-２６　（２０１１）．） Ｅｉｒａｋｕ，　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｓｅｌｆ-ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ　ｏｐｔｉｃ-ｃｕｐ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　ｔｈｒｅｅ-ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ．　Ｎａｔｕｒｅ　４７２，　５１-５６　（２０１１）． Ｅｉｒａｋｕ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｓｅｌｆ-ｏｒｇａｎｉｚｅｄ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｌａｒｉｚｅｄ　ｃｏｒｔｉｃａｌ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｆｒｏｍ　ＥＳＣｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｃｔｉｖｅ　ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ　ｓｉｇｎａｌｓ．　Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　３，　５１９-５３２　（２００８）． Ｓｕｇａ，　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｓｅｌｆ-ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｄｅｎｏｈｙｐｏｐｈｙｓｉｓ　ｉｎ　ｔｈｒｅｅ-ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ．　Ｎａｔｕｒｅ　４８０，　５７-６２　（２０１１）． Ｓａｔｏ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｓｉｎｇｌｅ　Ｌｇｒ５　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｂｕｉｌｄ　ｃｒｙｐｔ-ｖｉｌｌｕｓ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ａ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｎｉｃｈｅ．　Ｎａｔｕｒｅ　４５９，　２６２-２６５　（２００９）．
　発明者らは、３種類の異なった細胞系譜の時空間的な相互作用を活用することにより、「臓器の再構成に基づく臓器細胞の分化誘導」を実現化した革新的な三次元培養技術を確立している。すなわち、臓器発生の初期プロセスに必須である臓器細胞と血管細胞と間葉系細胞との細胞間相互作用を再現化することにより立体的な臓器の原基（臓器の種）を誘導し、血管網を有する機能的な臓器の創出を可能とする基盤技術を確立している（Ｎａｔｕｒｅ，４９９　（７４５９），　４８１-４８４、ＰＣＴ／ＪＰ２０１２／０７４８４０：組織及び臓器の作製方法）。
　一方、腎臓や肝臓・肺臓などの疾患に対する医薬品開発や再生医療の実現を目指すためには、血管構造のみならず、例えば、尿管構造や、胆管構造、気管構造などのように、さらなる高次構造が付加された３次元的な複雑な構造や細胞極性を再現することが必須である。さらにいえば、他の臓器との相互作用を経ることで目的臓器の誘導が達成される。
　したがって、多能性幹細胞より誘導された組織や個体より分離した組織の機能を最大化するためには、多様な高次構造や他臓器との連続性の再構築を可能とする三次元組織体の形成が必要である。しかし、従来考案されている方法においては、３種類の細胞や組織から血管構造のみを有する組織体を作製するのみであり、より複雑な高次構造（尿管構造や、胆管構造、気管構造）を作製するための手法は考案されていなかった。
　本発明では、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて多数の細胞（数万～数百万個）から細胞集合体の作製に必要となる要件を発見するとともに、肝臓や腎臓などの複雑な高次構造や、他の臓器との相互作用を実現することの可能な自己組織化用細胞集合体の形成方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、下記１～４の操作により、単離された複数種類の細胞や組織から複雑な高次構造を有する三次元組織・臓器を作製することに成功し、本発明を完成させるに至った。
１．必要な細胞・組織の調製
Ａ）複雑な構造を有する組織への自己組織化に必要な任意の種類の細胞や組織を調製する。種類や組み合わせる数は、問わない。
Ｂ）総細胞数として２００万個程度の、任意の種類の細胞や組織よりなる混合液に対し、単離した間葉系細胞を１０～４０万個程度混合する。

２．支持体の作製
Ａ）細胞培養用の培養皿に、適正な硬さの支持体を形成し、固層化する。この際、支持体の材料としては、ハイドロゲル（ポリアクリルアミドゲルなど）を用いることが好ましいが、その限りではない。
Ｂ）作製した支持体上に、化学的・物理的に修飾を施す。この際、支持体への修飾の付与は必須要件ではない。化学因子としては、マトリゲルやラミニンを用いることが好ましいがこの限りではない。
Ｃ）なお、目的とする集合体の形・サイズ・量に応じて、支持体の硬さは均一である必然性はなく、硬さに空間的・時間的な勾配を設定することやパターン化することによって、以後の実験に用いることが可能である。
３．細胞集合体の作製・培養
１．で作製した細胞・組織の混合液を、２．で作製した支持体上に播種し、集合体を形成する。形成された集合体は、培養期間を延長することにより、試験管内において目的とする臓器の自己組織化に用いることが可能である。
　なお、底面に細胞が集まるような培養基材と間葉系細胞を組み合わせることによっても、少数の細胞からであれば集合体を作製することが可能である。
４．細胞集合体の移植
３．で作製した集合体を長期培養や生体内へ移植することにより、血液灌流を誘導し、複雑な構造を有する高次組織への自己組織化させることにより、成体組織と同等な高度に秩序だった組織構造を有する組織・臓器を作製することが可能となる。
　このように間葉系細胞と支持体の物理・化学特性を組み合わせることにより、任意の種類の細胞からなる複雑な細胞集合体を作製する手法は過去には存在せず、新規性の極めて高い方法であると考えられる。
　本発明の要旨は以下の通りである。
（１）任意の種類の細胞及び／又は組織と間葉系細胞との混合物を培養し、細胞集合体を形成させることを含む、細胞集合体をｉｎ　ｖｉｔｒｏで作製する方法。
（２）細胞集合体が、自己組織化により、高次構造が付加された三次元組織構造を形成できるものである（１）記載の方法。
（３）任意の種類の細胞及び／又は組織と間葉系細胞との混合物を間葉系細胞が収縮可能なゲル状支持体の上で培養する（１）又は（２）記載の方法。
（４）培養が二次元培養である（３）記載の方法。
（５）ゲル状支持体が平面であるか、あるいは、ゲル状支持体の培養する側の断面がＵ又はＶ字の形状である（３）又は（４）記載の方法。
（６）ゲル状支持体の中心部の硬さが周辺部の硬さより固い（３）～（５）のいずれかに記載の方法。
（７）ゲル状支持体の周辺部の硬さが中心部の硬さより固い（３）～（５）のいずれかに記載の方法。
（８）ゲル状支持体がパターン化されており、中心部の硬さが周辺部の硬さより固いというパターンを１個以上有する（３）～（５）のいずれかに記載の方法。
（９）ゲル状支持体がパターン化されており、周辺部の硬さが中心部の硬さより固いというパターンを１個以上有する（３）～（５）のいずれかに記載の方法。
（１０）任意の種類の細胞及び／又は組織が総細胞数として４０万個以上であり、間葉系細胞が１０万～４０万個である（１）～（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）細胞集合体の大きさが１ｍｍ以上である（１）～（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）細胞集合体の形成が自律的なものである（１）～（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）足場材料を用いることなく、任意の種類の細胞及び／又は組織と間葉系細胞との混合物を培養する（１）～（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）間葉系細胞と混合する細胞及び／又は組織が、肝臓、膵臓、腸、肺、腎臓、心臓、脳又は癌に由来する（１）～（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）間葉系細胞と混合する細胞が、多能性細胞である（１）～（１３）のいずれかに記載の方法。
（１６）間葉系細胞と混合する組織が、多能性細胞より誘導された組織である（１）～（１３）のいずれかに記載の方法。
（１７）多能性細胞が、生体より得られた多能性細胞、再プログラムから誘導して得られた多能性細胞、又はそれらの組み合わせである（１５）又は（１６）記載の方法。
（１８）（１）～（１７）のいずれかに記載の方法で作製された細胞集合体。
（１９）（１）～（１７）のいずれかに記載の方法で作製された細胞集合体を自己組織化させ、高次構造が付加された三次元組織構造を形成させることを含む、三次元組織構造の作製方法。
（２０）培養する側の断面がＵ又はＶ字の形状であるゲル状培養支持体。
（２１）中心部の硬さが周辺部の硬さより固いゲル状培養支持体。
（２２）周辺部の硬さが中心部の硬さより固いゲル状培養支持体。
（２３）中心部の硬さが周辺部の硬さより固いというパターンを１個以上有するゲル状培養支持体。
（２４）周辺部の硬さが中心部の硬さより固いというパターンを１個以上有するゲル状培養支持体。
（２５）（２０）～（２４）のいずれかに記載のゲル状培養支持体の上で、任意の種類の細胞及び／又は組織と間葉系細胞との混合物を培養し、細胞集合体を形成させることを含む、細胞集合体をｉｎ　ｖｉｔｒｏで作製する方法。
　本発明によれば、間葉系幹細胞と支持体、ないし、底面に集まるような基材を組み合わせることにより、理論上どの様な複雑な組成の集合体をも形成することが可能となる。本発明により、足場材料（スキャホールド）を用いることなく、組織・臓器の構築が可能となる。
　第一に、より複雑な組織・臓器の人為的構成系としての活用が期待される。例えば、血管網以外にも尿管構造や、胆管構造、気管構造などのように、さらなる高次構造が付加された３次元的な複雑な構造を作製できる可能性がある。さらに、肝臓などのように、その機能発現のためには、肝臓のみならず、胆管や膵管との合流、十二指腸への連結など他臓器との連関の再構成が必須となる臓器が多数存在する。本発明により、他の臓器との相互作用を再現する集合体を作製ことにより、体内に存在する複雑な臓器の自己組織化誘導系としての活用が期待される。
　第二に、安価で、比較的に容易に加工することが可能な支持体を用いているため、大量の組織創出を目指す産業応用上の有用性が高い。支持体のマルチパターン化などの手法を組み合わせることにより、低コストで、任意の形・サイズ・数の大量組織作製が可能となる。
　ｉＰＳ細胞等の幹細胞から作成した細胞凝集体から自己組織化した立体的な組織体を構築することにより、これまで達成が困難であったヒト機能細胞の創出、組織・臓器移植、創薬スクリーニング、薬剤の効果発現と支持組織（血管、神経、間質など）、との関連性などを評価する新たな解析系などへの応用が可能である。
　本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2014‐037341の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
間葉系細胞の収縮による細胞集合体の作製。（Ａ）　細胞集合体形成過程の経時変化。（緑色）ｉＰＳＣ-肝内胚葉細胞、（薄赤色）ヒト血管内皮細胞、（無色）間葉系細胞。（Ｂ）自己組織化したｉＰＳＣ又はｉＰＳ細胞由来肝芽の形成。（Ｃ）細胞集合体形成の時間発展ダイナミクス。（赤色）集合体投影面積の平方根。集合体外周部の位置を示す指標として用いることができる。約１３ｈ以降は指数関数（黒色点線）で良く近似できる。（青色）集合体の円形度。集合体の投影面積と外周長から計算した。（Ｄ）細胞集合体形成における間葉系細胞の必要性。（Ｅ）各種化学物質を用いた細胞集合体形成過程の阻害実験。（Ｆ）活性化型ミオシン含有率の時間変化とその阻害。 細胞集合体形成における硬さ環境の至適化。（Ａ、Ｂ）様々な硬さ条件下における細胞集合体形成実験。（Ａ）は培養４８時間後の肉眼観察写真。（Ｂ）は共焦点レーザー顕微鏡による細胞移動の時間変化を示す。（Ｃ-Ｇ）細胞集合体中のＭＳＣｓの軌跡（Ｃ）、移動速度および運動配向性の時間依存性（Ｄ、Ｅ）と基板硬さ依存性（Ｆ、Ｇ）。 様々な組織に由来する細胞を用いた自己組織化用集合体形成実験。（Ａ、Ｂ）膵臓β細胞を用いた細胞集合体形成（Ａ）と自己組織化（Ｂ）（Ｃ、Ｄ）他の臓器の細胞・組織を用いた細胞集合体形成実験 様々な組織に由来する細胞集合体のｉｎ　ｖｉｖｏ　自己組織化と機能発現。（Ａ）移植により２-３日で機能的な血管化が生じる。（Ｂ）従来法と比較して、血液灌流に要する時間の比較。（Ｃ）マウス血管とヒト血管の直接吻合。（Ｄ）胎児腎臓細胞より形成した集合体が形成した糸球体・尿細管。（Ｅ）β細胞より形成した集合体が形成した膵島様組織。（Ｆ）β細胞より形成した集合体の治療効果判定モデル。（Ｇ）β細胞より形成した集合体を移植した糖尿病モデルマウスにおける血糖値の経時変化。 各硬さ条件における細胞集合体中のＭＳＣｓの軌跡、移動速度および運動配向性の時間変化。 各種阻害物質を用いた細胞集合体形成過程の経時観察。 成体腎組織を用いた細胞集合体のｉｎ　ｖｉｖｏ自己組織化。 胎児肺組織を用いた細胞集合体のｉｎ　ｖｉｖｏ自己組織化。 β細胞を用いた細胞集合体のｉｎ　ｖｉｖｏ血管導入過程の追跡。 β細胞を用いた細胞集合体のｉｎ　ｖｉｖｏホスト血管との接続部位の観察。 β細胞を用いた細胞集合体より形成された組織の組織学的解析。 Ｕボトムゲルの断面図。 （Ａ）血管内皮細胞を含まない細胞集合体の形成。（Ｂ）ヒト又はマウス間葉系細胞を用いた細胞集合体の形成。 Ｕボトムゲルを用いた細胞集合体の形成。 支持体上で作製した腎臓原基移植による機能的な血管網の再構成。 移植を行った腎臓原基の成熟化。 移植後成熟した腎臓原基の構造学的解析。 移植を行った腎臓原基の原尿生成機能のライブ観察。 生化学物質コーティング前後の支持体の硬さ特性の計測。 硬さのマルチパターンを有した支持体の作製。 硬さのマルチパターンを有した支持体上での細胞集合体の作製。 複雑なマルチパターンを有した支持体上の作製。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、任意の種類の細胞及び／又は組織と間葉系細胞との混合物を培養し、細胞集合体を形成させることを含む、細胞集合体をｉｎ　ｖｉｔｒｏで作製する方法を提供する。
　間葉系細胞は、主として中胚葉に由来する結合組織に存在し、組織で機能する細胞の支持構造を形成する結合組織細胞であるが、本明細書において、「間葉系細胞」とは、間葉系細胞への分化運命が決定しているが、まだ間葉系細胞へ分化していない細胞も含む概念である。本発明に用いる間葉系細胞は、分化したものであっても、未分化なものであってもよいが、未分化間葉系細胞を用いることが好ましい。ある細胞が未分化間葉系細胞であるかどうかは、マーカータンパク質、例えば、Ｓｔｒｏ-１、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３３、ＣＤ２７１、Ｎｅｓｔｉｎが発現しているかどうかを調べることにより確認できる（前記マーカータンパク質のいずれか一つあるいは複数が発現していれば未分化間葉系細胞であると判断できる。）。また、前項のマーカーのいずれも発現していない間葉系細胞は分化間葉系細胞と判断できる。当業者間で使用されている用語のうち、ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ、ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ、ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｃｅｌｌｓ（Ｒ．　Ｐｅｔｅｒｓ，　ｅｔ　ａｌ．　ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．　３０；５（１２）：ｅ１５６８９．（２０１０））などは間葉系細胞に含まれる。間葉系細胞は、主としてヒト由来のものを用いるが、ヒト以外の動物（例えば、実験動物、愛玩動物、使役動物、競走馬、闘犬などに利用される動物、具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ニワトリ、サメ、エイ、ギンザメ、サケ、エビ、カニなど）由来の間葉系細胞を用いてもよい。
　間葉系細胞と混合する任意の種類の細胞及び／又は組織は、種類や組み合わせる数を問わず、いかなる細胞及び／又は組織であってもよい。また、細胞及び／又は組織の由来も問わず、肝臓、膵臓、腸、肺、腎臓、心臓、脳などのいかなる臓器又は組織に由来するものであってもよいし、あるいはまた、癌に由来するものであってもよい。間葉系細胞と混合する細胞は、臓器や組織を構成する機能細胞、又は機能細胞へと分化する未分化細胞や多能性細胞であるとよい。また、間葉系細胞と混合する組織は、個体より分離した組織であってもよいし、臓器や組織を構成する機能細胞、又は機能細胞へと分化する未分化細胞や多能性細胞より誘導された組織であってもよい。
　未分化細胞としては、例えば、腎臓、心臓、肺、脾臓、食道、胃、甲状腺、副甲状腺、胸腺、生殖腺、脳、脊髄などの器官に分化可能な細胞などであってもよく、脳、脊髄、副腎髄質、表皮、毛髪・爪・皮膚腺、感覚器、末梢神経、水晶体などの外胚葉性器官に分化可能な細胞、腎臓、尿管、心臓、血液、生殖腺、副腎皮質、筋肉、骨格、真皮、結合組織、中皮などの中胚葉性器官に分化可能な細胞、肝臓、膵臓、腸管、肺、甲状腺、副甲状腺、尿路などの内胚葉性器官に分化可能な細胞などを挙げることができる。ある細胞が外胚葉性器官、中胚葉性器官又は内胚葉性器官に分化可能な細胞であるかどうかは、マーカーとなるタンパク質の発現を調べることにより確認できる（マーカータンパク質のいずれか一つあるいは複数が発現していれば内胚葉性器官に分化可能な細胞であると判断できる。）。例えば、肝臓に分化可能な細胞では、ＨＨＥＸ、ＳＯＸ２、ＨＮＦ４Ａ、ＡＦＰ、　ＡＬＢなどがマーカーになり、膵臓に分化可能な細胞では、ＰＤＸ１、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ９などがマーカーになり、腸管に分化可能な細胞では、ＣＤＸ２、ＳＯＸ９などがマーカーになり、腎臓に分化可能な細胞では、ＳＩＸ２、ＳＡＬＬ１、心臓に分化可能な細胞では、ＮＫＸ２-５　ＭＹＨ６、ＡＣＴＮ２、ＭＹＬ７、ＨＰＰＡ、血液に分化可能な細胞では、Ｃ-ＫＩＴ、ＳＣＡ１、ＴＥＲ１１９、ＨＯＸＢ４、脳や脊髄に分化可能な細胞では、ＨＮＫ１、ＡＰ２、ＮＥＳＴＩＮなどがマーカーになる。当業者間で使用されている用語のうち、ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔ、ｈｅｐａｔｉｃ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ、ｐａｎｃｒｅａｔｏｂｌａｓｔ、ｈｅｐａｔｉｃ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｃｅｌｌｓ、　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ、ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ、ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｃｅｌｌｓ、ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ、ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ、ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｃｅｌｌｓ、ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ　ｍｅｓｏｄｅｒｍ、ｍｅｔａｎｅｐｈｒｉｃ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｃｅｌｌｓ、ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｎｅｐｈｒｏｎ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ、ｒｅｎａｌ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ、ｃａｒｄｉａｃ　ｍｅｓｏｄｅｒｍ、ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ、ｃａｒｄｉａｃ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ、（ＪＲ．　Ｓｐｅｎｃｅ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ．；４７０（７３３２）：１０５-９．（２０１１）、Ｓｅｌｆ，　ｅｔ　ａｌ．　ＥＭＢＯ　Ｊ．；　２５（２１）：　５２１４-５２２８．（２００６）、Ｊ．　Ｚｈａｎｇ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ．；　１０４：　ｅ３０-ｅ４１（２００９）、Ｇ．　Ｌｅｅ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２５，　１４６８　-　１４７５　（２００７））などは本発明における未分化細胞に含まれる。多能性細胞としては、生体より得られた多能性細胞（例えば、ＥＳ細胞、再プログラムから誘導して得られた多能性細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＳＴＡＰ細胞（Ｓｔｉｍｕｌｕｓ-ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ　ｆａｔｅ　ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　ｏｆ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎｔｏ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ．　Ｎａｔｕｒｅ，　２０１４）、ＭＵＳＥ細胞（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ-ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ　ｓｔｒｅｓｓ-ｅｎｄｕｒｉｎｇ　（Ｍｕｓｅ）　ｃｅｌｌｓ　ａｒｅ　ａ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｓｏｕｒｃｅ　ｏｆ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．　ＰＮＡＳ，　２０１１）、ｉＭＰＣ　細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌ；Ｍｏｕｓｅ　ｌｉｖｅｒ　ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ　ｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．　Ｎａｔｕｒｅ，　２０１４））、それらの組み合わせなどを例示することができる。未分化細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などの多能性幹細胞から公知の方法に従って作製することができる。例えば、肝臓に分化可能な細胞は、Ｋ．Ｓｉ-Ｔａｉｙｅｂ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，　５１　（１）：　２９７-　３０５（２０１０）、Ｔ．　Ｔｏｕｂｏｕｌ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．　５１（５）：１７５４-６５．（２０１０）に従って作製することができ、膵臓に分化可能な細胞は、Ｄ．　Ｚｈａｎｇ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．；１９（４）：４２９-３８．（２００９）に従って作製することができ、腸管に分化可能な細胞は、Ｊ．　Ｃａｉ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．；２（１）：５０-６０（２０１０）、Ｒ．　Ｓｐｅｎｃｅ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ．；４７０（７３３２）：１０５-９．（２０１１）に従って作製することができ、心臓に分化可能な細胞は、Ｊ．　Ｚｈａｎｇ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ．；　１０４：　ｅ３０-ｅ４１（２００９）　に従って作製することができ、脳や脊髄に分化可能な細胞では、Ｇ．　Ｌｅｅ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２５，　１４６８　-　１４７５　（２００７）　に従って作製することができる。臓器や組織を構成する機能細胞としては、膵臓の内分泌細胞、膵臓の膵管上皮細胞、肝臓の肝細胞、腸管の上皮細胞、腎臓の尿細管上皮細胞、腎臓の糸球体上皮細胞、心臓の心筋細胞、血液のリンパ球や顆粒球、赤血球、脳の神経細胞やグリア細胞、脊髄の神経細胞やシュワン細胞などを例示できる。細胞は、主としてヒト由来のものを用いるが、ヒト以外の動物（例えば、実験動物、愛玩動物、使役動物、競走馬、闘犬などに利用される動物、具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ニワトリ、サメ、エイ、ギンザメ、サケ、エビ、カニなど）由来の細胞を用いてもよい。
　細胞集合体に血管系を付与したい場合には、任意の種類の細胞及び／又は組織と間葉系細胞との混合物に、さらに、血管細胞を添加するとよい。血管細胞は、血管組織から分離することができるが、血管組織から分離された細胞に限定されることはなく、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの全能性あるいは多能性を有する細胞から分化誘導されたものであってもよい。血管細胞としては、血管内皮細胞が好ましく、本明細書において、「血管内皮細胞」とは、血管内皮を構成する細胞、又はそのような細胞に分化することのできる細胞（例えば、血管内皮前駆細胞、血管内皮幹細胞など）をいう。ある細胞が血管内皮細胞であるかどうかは、マーカータンパク質、例えば、ＴＩＥ２、ＶＥＧＦＲ-１、ＶＥＧＦＲ-２、ＶＥＧＦＲ-３、ＶＥ-ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＣＤ３１が発現しているかどうかを調べることにより確認できる（前記マーカータンパク質のいずれか一つあるいは複数が発現していれば血管内皮細胞であると判断できる）。また、血管内皮前駆細胞のマーカーとしては、ｃ-ｋｉｔ、Ｓｃａ-１などが報告されており、これらのマーカーの発現により、血管内皮前駆細胞であることを確認しうる（Ｓ　Ｆａｎｇ，ｅｔ　ａｌ．　ＰＬＯＳ　Ｂｉｏｌｏｇｙ．　２０１２；１０（１０）：ｅ１００１４０７．）。当業者間で使用されている用語のうち、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ、ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　ｖｅｉｎ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｃｅｌｌｓ、ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｉｃ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ、ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔ（ＨＪ．　Ｊｏｏ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｌｏｏｄ．　２５；１１８（８）：２０９４-１０４．（２０１１））などは本発明における血管内皮細胞に含まれる。血管細胞は、主としてヒト由来のものを用いるが、ヒト以外の動物（例えば、実験動物、愛玩動物、使役動物、競走馬、闘犬などに利用される動物、具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ニワトリ、サメ、エイ、ギンザメ、サケ、エビ、カニなど）などの動物由来の血管細胞を用いてもよい。血管細胞は、臍帯血、臍帯血管、新生児組織、肝臓、大動脈、脳、骨髄、脂肪組織などから得られる。
　本明細書において、「血管系」とは、血管内皮細胞およびその支持細胞よりなる構造をいい、血管系は、組織を維持するのみならず、その成熟化過程においても重要な役割を担っている。血管構造は、移植した後に、組織が生存するために必要な酸素及び栄養素などを組織内部に送達する役割を有しているのみならず、（内部に血液が流入する以前にも、）血管を伴う三次元的な組織構造や細胞極性を再現することが細胞の分化・増殖・維持に重要であると考えられている。したがって、血管を有さない組織は、単に、移植後に定着せずに内部が壊死することのみならず、血管化に伴う組織の成熟化が達成されず、充分な機能を発揮することが困難であった。
　本明細書において、「血管系を付与する」及び「血管化」とは、血管内皮細胞および支持細胞からなる血管系が、対象とする組織と直接統合することをいい、血管系を付与された生物学的組織を生体に移植すると、血管の成熟化が観察され、ホスト血管と接続して、血管灌流が開始し、血管網を有する機能的な組織・臓器への誘導が可能となる。
　本発明において、例えば、総細胞数として４０万個以上（好ましくは、４０万個～４４０万個、より好ましくは、２００万個程度）の任意の種類の細胞及び／又は組織と４万個以上（好ましくは、５万～１００万個、より好ましくは、１０万～４０万個）の間葉系細胞との混合物を培養するとよい。本発明の方法により、細胞集合体が自律的に形成され、種々の大きさ、例えば、大きさが１ｍｍ以上（好ましくは、１～２０ｍｍ、より好ましくは、１～８ｍｍ）である細胞集合体を形成させることができる。任意の種類の細胞及び／又は組織と間葉系細胞との比は、所望の大きさの細胞集合体が形成できる範囲であれば、特に限定されないが、好適な細胞の数比は、任意の種類の細胞及び／又は組織：間葉系細胞＝１０：０．５～３である。
　血管細胞を添加する場合は、総細胞数として４０万個以上（好ましくは、４０万個～４４０万個、より好ましくは、２００万個程度）の任意の種類の細胞及び／又は組織と４万個以上（好ましくは、５万～１００万個、より好ましくは、１０万～４０万個）の間葉系細胞に、４０００個以上（好ましくは、２万～４０万個、より好ましくは、４万～２８万個）の血管細胞を添加するとよい。任意の種類の細胞及び／又は組織と間葉系細胞と血管細胞との比は、所望の大きさの細胞集合体が形成できる範囲であれば、特に限定されないが、好適な細胞の数比は、任意の種類の細胞及び／又は組織：間葉系細胞：血管細胞＝１０：１～３：０．１～７である。
　任意の種類の細胞及び／又は組織と間葉系細胞との混合物は、二次元培養で、細胞集合体を形成することができる。培養の際に使用する培地は、細胞集合体が形成されるものであれば、どのような培地であってもよいが、目的の組織の自己組織化誘導を促進する組成が好ましい。例えば、生体内への移植より自己組織化を誘導する場合には、血管内皮細胞用の培地と目的とする臓器細胞の培地を１：１で混合したものを用いると良い。血管内皮細胞用の培地としては、ＥＧＭ（登録商標）　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（登録商標）　（Ｌｏｎｚａ　ＣＣ-４１３３）やＥＧＭ-２（登録商標）　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ　ＣＣ-３１６２）、ＥＧＭ-２（登録商標）　ＭＶ（Ｌｏｎｚａ　ＣＣ-３１５６）などのいずれかを用いることが好ましいがこの限りではない。臓器細胞用培地の例としては、成体の腎臓細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０　（Ｗａｋｏ）中に、２０％　ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ（ＢＷＴ　Ｌｏｔ．Ｓ-１５６０）、１００μｇ／ｍｌ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ）、Ｉｎｓｕｌｉｎ-Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ-ＳｅｌｅｎｉｕｍＸ（ＧＩＢＣＯ）を加えたものを用いると良い。胎児の腎臓細胞であれば、Ｄ-ＭＥＭ　Ｈｉｇｈ-Ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｗａｋｏ　０４３-３００８５）、１０％　ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ（ＢＷＴ　Ｌｏｔ．Ｓ-１５６０）、１００μｇ／ｍｌ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ）などを用いることが好ましい
　任意の種類の細胞及び／又は組織と間葉系細胞との混合物は、間葉系細胞が収縮可能なゲル状支持体上で培養するとよい。
　間葉系細胞の収縮は、（顕微鏡、ないし肉眼で）形態学的に立体組織形成を認めることや、薬さじなどによる回収に伴い組織の形状が保たれる強度を有することを示すなど（Ｔａｋｅｂｅ　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ　４９９　（７４５９），　４８１-４８４、２０１３））のようにして確認することができる。
　支持体は、適正な硬さ（例えば、ヤング率２００ｋＰａ以下(マトリゲルをコートした形状が平坦なゲルの場合など)であるが、支持体の適正な硬さはコーティングと形状によって変化しうる。）を有するゲル状基材であるとよく、そのような基材としては、ハイドロゲル（例えば、アクリルアミドゲル、ゼラチン、マトリゲルなど）などを例示することができるが、それらに限定されることはない。なお、目的とする集合体の形・サイズ・量に応じて、支持体の硬さは均一である必然性はなく、硬さに空間的・時間的な勾配を設定すること（例えば、後述の実施例６）やパターン化する（例えば、後述の実施例７）ことが可能である。支持体の硬さが均一である場合には、支持体の硬さは、好ましくは、１００ｋＰａ以下、より好ましくは１～５０ｋＰａである。ゲル状支持体は、平面であってもよいし、あるいは、ゲル状支持体の培養する側の断面がＵ又はＶ字の形状であるとよい。ゲル状支持体の培養する側の断面がＵ又はＶ字の形状であることにより、支持体の培養面に細胞が集まるようになり、より少ない数の細胞及び／又は組織で細胞集合体が形成されるので有利である。また、支持体に、化学的・物理的な修飾を施してもよい。修飾物質としては、マトリゲル、ラミニン、エンタクチン、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチンなどを例示することができる。
　ゲル状培養支持体の硬さに空間的な勾配を設定した一例は、中心部の硬さが周辺部の硬さより固いゲル状培養支持体（後述の実施例６、図２０及び２１）である。中心部の硬さは、２００ｋＰａ以下が適正であり、周辺部の硬さは、中心部より柔らかければよいが、支持体の中心部と周辺部の適正な硬さはコーティングと形状によって変化しうる。ゲル状培養支持体の硬さに空間的な勾配を設定した別の一例は、周辺部の硬さが中心部の硬さより固いゲル状培養支持体である。
　パターン化したゲル状培養支持体の一例は、中心部の硬さが周辺部の硬さより固いというパターンを１個以上有するゲル状培養支持体（後述の実施例７、図２２左、ポジティブパターン）である。中心部の硬さは、２００ｋＰａ以下が適正であり、周辺部の硬さは、中心部より柔らかければよいが、支持体の中心部と周辺部の適正な硬さはコーティングと形状によって変化しうる。パターン化したゲル状培養支持体の別の一例は、周辺部の硬さが中心部の硬さより固いというパターンを１個以上有するゲル状培養支持体（後述の実施例７、図２２右、ネガティブパターン）である。周辺部の硬さは、２００ｋＰａ以下が適正であり、中心部の硬さは、周辺部より柔らかければよいが、支持体の中心部と周辺部の適正な硬さはコーティングと形状によって変化しうる。
　培養時の温度は特に限定されないが、３０～４０℃とするのが好ましく、３７℃とするのが更に好ましい。組織が大型化する際には、培養器内の酸素供給量を上げることが好ましい。酸素供給量は、４％～５０％が適当であり、１０％～３０％が好ましく、１８％～２５％がより好ましい。
　培養期間は特に限定されないが、１２～１４４時間とするのが好ましく、例えば、肝臓から分離した細胞及び／又は組織から０．４～１０ｍｍの大きさの細胞集合体を形成させるには、１２～４８時間とするのが好ましく、膵臓から分離した細胞及び／又は組織から０．４～１０ｍｍの大きさの細胞集合体を形成させるには、１２～１４４時間とするのが好ましく、腸から分離した細胞及び／又は組織から０．４～３ｍｍの大きさの細胞集合体を形成させるには、１２～９６時間とするのが好ましく、肺から分離した細胞及び／又は組織から０．４～１ｍｍの大きさの細胞集合体を形成させるには、１２～９６時間とするのが好ましく、心臓から分離した細胞及び／又は組織から０．４～１０ｍｍの大きさの細胞集合体を形成させるには、１２～９６時間とするのが好ましく、腎臓から分離した細胞及び／又は組織から０．４～５ｍｍの大きさの細胞集合体を形成させるには、１２～１４４時間とするのが好ましく、脳から分離した細胞及び／又は組織から０．４～１０ｍｍの大きさの細胞集合体を形成させるには、１２～１４４時間とするのが好ましく、癌から分離した細胞及び／又は組織から０．４～１０ｍｍの大きさの細胞集合体を形成させるには、１２～１４４時間とするのが好ましい。また、ｉＰＳ細胞などの多能性細胞から０．４～１０ｍｍの大きさの細胞集合体を形成させるには、４８～１４４時間とするのが好ましい。
　本発明の方法により作製される細胞集合体は、細胞間の相互作用が緊密に行われるために、胎内で生じるような生物学的な環境が再現される。これにより臓器の前駆細胞への初期分化誘導が効率的に生じるために、その存在頻度・数が向上すると考えられる。また、本発明の方法により作製される細胞集合体は、細胞同士が強く接着しており、非破壊的に回収が可能である。
　本願に記載の細胞集合体は、器官芽やオルガノイド（器官芽（ＷＯ２０１３／０４７６３９）、ｌｉｖｅｒ　ｂｕｄ、ｌｉｖｅｒ　ｄｉｖｅｒｔｉｃｕｌａ、ｌｉｖｅｒ　ｏｒｇａｎｏｉｄ、ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　（ｄｏｒｓａｌ　ｏｒ　ｖｅｎｔｒａｌ）　ｂｕｄｓ、ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｔｉｃｕｌａ、ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｏｒｇａｎｏｉｄ、ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｂｕｄ、ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｄｉｖｅｒｔｉｃｕｌａ、ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｏｒｇａｎｏｉｄ（Ｋ．　Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９；２９４（５５４２）：５５９-６３．（２００１））などを包含する概念であり、細胞集合体は、構成する細胞の種類や種類の数を問わないが、器官芽は、器官発生初期に形成されるものに相等し、構成する細胞の種類は、原則、臓器や組織を構成する機能細胞（又は機能細胞へと分化する未分化細胞）、血管細胞及び間葉系細胞の三種類であり、オルガノイドは、上皮性組織を構成する細胞のみから成り立ち、基本的には小型（１ｍｍ以下）である。
　細胞集合体は、自己組織化により、高次構造が付加された三次元組織構造を形成し、これにより前駆細胞の終末分化誘導を実現することが可能である。自己組織化は、ｉｎ　ｖｉｖｏ、ｉｎ　ｖｉｔｒｏのいずれで行われてもよい。例えば、本発明の方法で調製した細胞集合体を生体内へ移植することにより、血管網が形成されて、血液灌流が誘導され、複雑な構造を有する高次組織への自己組織化が起こって、成体組織と同等な高度に秩序だった組織構造を有する組織や臓器を作製することが可能となる。血管網以外にも、尿管構造、胆管構造、気管構造などのさらなる高次構造が付加された高次組織を形成できる可能性がある。さらに、肝臓などのように、その機能発現のためには、肝臓のみならず、胆管や膵管との合流、十二指腸への連結など他臓器との連関の再構成が必須となる臓器が多数存在する。本発明により、他の臓器との相互作用を再現する集合体を作製することにより、体内に存在する複雑な臓器の自己組織化誘導系としての活用が期待される。
　本発明は、上記の方法で作製された細胞集合体も提供するものである。
　また、本発明は、上記の方法で作製された細胞集合体を自己組織化させ、高次構造が付加された三次元組織構造を形成させることを含む、三次元組織構造の作製方法も提供する。
　さらにまた、本発明は、培養する側の断面がＵ又はＶ字の形状であるゲル状培養支持体を提供する。本発明の培養支持体は、ゲル状支持体の培養する側の断面がＵ又はＶ字の形状であることにより、支持体の培養面に細胞が集まるようになり、より少ない数の細胞及び／又は組織で細胞集合体が形成されるので有利である。培養する側の断面がＵ又はＶ字の形状であるゲル状培養支持体は上述の通りである。
　本発明は、中心部の硬さが周辺部の硬さより固いゲル状培養支持体も提供する。その一実施態様を後述の実施例６（図２０及び２１）に示す。中心部の硬さは、２００ｋＰａ以下が適正であり、周辺部の硬さは、中心部より柔らかければよいが、支持体の中心部と周辺部の適正な硬さはコーティングと形状によって変化しうる。
　また、本発明は、逆に、周辺部の硬さが中心部の硬さより固いゲル状培養支持体も提供する。
　本発明は、中心部の硬さが周辺部の硬さより固いというパターンを１個以上有するゲル状培養支持体も提供する。その一実施態様を後述の実施例７（図２２左、ポジティブパターン）に示す。中心部の硬さは、２００ｋＰａ以下が適正であり、周辺部の硬さは、中心部より柔らかければよいが、支持体の中心部と周辺部の適正な硬さはコーティングと形状によって変化しうる。
　本発明は、周辺部の硬さが中心部の硬さより固いというパターンを１個以上有するゲル状培養支持体も提供する。その一実施態様を後述の実施例７（図２２右、ネガティブパターン）に示す。周辺部の硬さは、２００ｋＰａ以下が適正であり、中心部の硬さは、周辺部より柔らかければよいが、支持体の中心部と周辺部の適正な硬さはコーティングと形状によって変化しうる。
　さらに、本発明は、上記のゲル状培養支持体の上で、任意の種類の細胞及び／又は組織と間葉系細胞との混合物を培養し、細胞集合体を形成させることを含む、細胞集合体をｉｎ　ｖｉｔｒｏで作製する方法も提供する。任意の種類の細胞及び／又は組織と間葉系細胞との混合物の培養については、上述の通りである。
　以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
〔実施例１〕
　細胞集合塊形成は、単離された未熟な細胞が自己組織化を経て三次元で複雑な臓器を形成するのに重要な原則だと古くから考えられている。我々は、器官形成期に生じる細胞間相互作用を再現することによりｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、単離されたヒト肝前駆細胞からｍｍ単位の肝原基が自立的に形成されることを見出した。しかし、この様なダイナミックな三次元組織化の背後にあるメカニズムは全く不明であった。我々はこの立体組織形成は複数種の細胞ユニットの自己集合反応から始まり、その進行には間葉系幹細胞において生じるミオシンIIの細胞骨格の収縮力の存在が必要であることを明らかにした。この動的な細胞集合反応は、基板マトッリクスの剛性（硬さ）条件によって支配されている。さらに最適化された基板の条件下では、肝臓、膵臓、腸、肺、心臓、腎臓、脳、さらには癌を含む様々な臓器から分離した細胞／組織から３次元の臓器原基を作ることに成功した。作製された３次元原基は、血管内皮細胞を組み込むことで移植の際にすぐに血管化され、さらに、治療効果を持つ自己組織化した三次元組織構造を自律的に形成した。将来の再生医療を目指す上で、この原則は、動的な細胞集合とそれに続く自己組織化を通じて、幹細胞から複数の血管化された複雑な器官系を再構築するための汎用性の高いプラットホームを設立することにつながるだろう。
　生理器官形成の間に、肝臓はヒトの妊娠５－８週目で肝芽と呼ばれる組織塊が集まったものから形成されることが知られている。間葉系幹細胞、未分化の血管内皮細胞と前臓側内胚葉細胞との細胞間相互作用が、前腸内の基本的な肝臓の出芽と呼ばれる（肝芽とも呼ばれる）肝再生の開始に必要である（１）。器官形成におけるこれらの基本的な理解と並行して、再生医学の最近の進歩は、この動的な三次元（３-Ｄ）の転位を、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を用いた培養において器官形成期の細胞相互作用を再現することによって模倣することができることも実証した。固化した軟質マトリックスゲル上に播種すると、単体のＰＳＣ-由来肝細胞が内皮細胞および間葉細胞との共培養で自律的に３次元の集合体を形成する（２）。一旦集合体が確立されると、数日ののち完全なｉｎ　ｖｉｔｒｏの条件下で胎内に存在する臓器に似た構造を持つ肝芽組織への自己組織化が進む（３）。ｉｎ　ｖｉｔｒｏで成長した臓器の芽の移植は、生体内でさらに自己組織化（成熟）され結果として血管化され機能をもった肝臓になる。この方法は、血管化された器官系の人工的な再構成のための新しい道を開くものである（４）。このような以前の観察より最も魅力的なのは、平坦な２次元培養プレートの下の培養にも関わらず共培養した細胞に非常に大きな形態形成の変化がみられたことである。自己組織化の先行研究では、一般に急峻な底の９６ウェルプレートでミクロンスケールの集合体を生産していたが、このシステムではミリあるいはセンチメートルスケールにまで成長することができる（５，６）。そこで、本研究の主目的は、この驚くべき度合いのダイナミックな動的な集合反応の中心となるメカニズムを分析し、現象を再現するために不可欠な要因を明らかにすることであった。そして最適化された条件の下で、我々は最終的に他の器官系を再構成することに向けたこのアプローチの拡張性を評価した。
　我々はまず、タイムラプスイメージング解析によりオルガノイド形成中の細胞の動きを追跡した。ヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の肝内胚葉細胞、臍帯由来の内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）および間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を個別の蛍光で標識し、前述の凝固したマトリックスゲル上で共培養した。ライブセル追跡は、血管化されたオルガノイドの形成が、内皮のようなネットワークの形成（図１）によって示されるような自己組織化を通じた空間の再構成に先立って、迅速な細胞集合反応から始まることが判明した。すなわち、初期自己集合相では、細胞がグループとして挙動する、いわば多細胞集合ユニットとして振る舞い、すぐに集合中心に収束することが明らかとなった（図１）。このような集合体形成ダイナミクスをより詳細に解析するために、画像解析により集合体外周部の位置（ｓｑｕａｒｅ　ｒｏｏｔ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ａｒｅａ）と円形度（Ｃｉｒｃｕｌａｒｉｔｙ）の時間発展を求めた（図１ｂ）。その結果、集合体は細胞播種後約７時間までは１０　μｍ／ｈ以下でゆるやかに収縮し、その後数時間で最大～５００　μｍ／ｈに達するほどに加速したのち指数関数的に減少し収束した。一方、Ｃｉｒｃｕｌａｒｉｔｙは細胞播種後からほぼ単調減少し、１０～１３時間後には約０．５の最小値を示した。その後は増加に転じ、２０時間後にはほぼ一定値（０．８５）に収束した。
　以上の結果は、本研究における集合体の形成が、細胞の遊走ではなく、細胞組織の収縮によるものであることを示唆している。まず集合体外周部の最大速度は、細胞播種後１０～１５時間で約５００　μｍ／ｈにも達し、これは一般的な細胞遊走速度をはるかに凌駕している。さらに移動速度は最終的に指数関数的に減少したが、これは集合体がＫｅｌｖｉｎ-Ｖｏｉｇｔ　ｍｏｄｅｌという指数関数で示される力学モデルに沿って収縮していることを暗示している。実際これまでに、様々な細胞組織やストレスファイバー収縮がＫｅｌｖｉｎ-Ｖｏｉｇｔ　ｍｏｄｅｌで近似できることが示されている。また、このような集合体の大きな収縮の開始には約１０時間要したが、これは細胞―細胞間の接着や、収縮に必要なストレスファイバーの形成が進行する時間としては妥当な範囲であると考えられる。実際ｃｉｒｃｕｌａｒｉｔｙの結果は、初期の１０時間では集合体が真円から外れ、ひずんだ形で収縮していることを示していた。これは集合体形成初期では、その収縮力が、細胞―外場（細胞ー基板間、細胞―容器壁面）間の接着力と同程度もしくは下回っていることを示唆していると考えられる。
　ｉｎ　ｖｉｔｒｏで、このような動的で指向性のある細胞集合現象を惹起するために重要な細胞の種類を同定するために、我々は共培養において３系統のすべての可能な組み合わせを検討した。その結果、間葉系幹細胞が欠如すると集合体形成が不能であることが判明した（図中の、ｉＰＳＣ＋ＥＣ，　ＥＣ，　ｉＰＳＣ）。一方、細胞集合体形成には、ＭＳＣと組み合わせることが十分条件であって、血管内皮細胞の存在は必須でない。例えば、ｉＰＳＣ由来の肝内胚葉細胞とＭＳＣとの共培養（ｉＰＳＣ＋ＭＳＣ）、血管内皮細胞とＭＳＣ（ＥＣ＋ＭＳＣ）、によっても、細胞集合体形成は可能であった（図１）。ＭＳＣ単独でも集合体は形成されたが、ＭＳＣ非存在下での培養群は、ＥＣ単独、ｉＰＳＣ単独、ｉＰＳＣ＋ＥＣのいずれにおいても、シート状の脆い組織を形成するのみで、非破壊的に回収することは不能であったことから集合体は形成されなかった。また支持体上で培養しない場合も（２-Ｄ　ｉＰＳＣ＋ＥＣ＋ＭＳＣ）、集合体形成は認めなかった。上述した観察によって示唆される、'収縮機構'を明らかにするために、我々はその後、それらの基体と周囲の細胞に対するＭＳＣの収縮力の寄与を分子レベルで評価した。生理初期発生過程における胚の原腸陥入においては、ある細胞の群は収縮を受け、ミオシンＩＩ（ＭＩＩ）活性により駆動される細胞-細胞間結合が急激な内側への変位は、胚の原腸形成期に細胞が陥入することをもたらすことが知られる。そこで、我々は、リン酸特異的抗体（７）と細胞内フローサイトメトリーによる筋フィラメントの分解を通してＭＩＩＡを不活性化するＳ１９４３（ｐＳ１９４３）でのＭＩＩＡのリン酸化の時間経過依存性の変化を測定することによって、ＭＩＩの活性を評価した。ＭＩＩＡ活性を推定するための報告された式（８）に基づいて、我々は集合体形成中の間質細胞内でアクティブＭＩＩＡが著しくアップレギュレートされて６時間にピークを迎え、それは細胞が最大速度で移動しているタイミングに対応することを示した（１）。一方、ｉＰＳＣ由来肝細胞において活性化ＭＩＩＡは集合体形成を通してほぼ一定であることが分かる。これはＭＳＣによるＭＩＩＡの活性化がこの強固な３次元転位の責任を担っていることを示唆している。さらに、この活性化ＭＩＩＡ減少の直接的な証拠を指示するデータとして、我々は、この集合体形成が、ブレビスタチン（ミオシンＩＩ（ＭＩＩ）ＡＴＰアーゼ阻害剤）により完全に拮抗できることを示した（９）。同様に、共培養中のＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ-２７６３２の添加は、部分的に集合体形成（図１）を遅延させることが判明した。一方、最近の報告であるような、器官形成（図１）の間に自律的に生成されるケモカイン勾配による細胞集合メカニズムに関しては、ＡＭＤ３１００の添加によるケモカイン受容体経路の薬理学的阻害によって（１０）細胞集合体の形成を妨げることができなかったために適応し難いと考えられた。アクトミオシン細胞骨格による収縮力は、細胞集合の指向性と大幅な移動のために重要な役割を果たしていることがこの結果から明らかになった。
　このような培養中の細胞内骨格収縮は、マトリックスアンカーへの結合度で調節されることが単一細胞レベルでは示唆されている（１１）。つまり、単一細胞の牽引力を測定する最近の研究において、細胞骨格の張力は、基板の生化学的および生物物理学的パラメータによって調節されることが示されている（１２）。そこで我々は、細胞集合における収縮メカニズムにおいてもこのプロセスが適応できるのであれば、基板条件の硬さ調節によって集合反応を変化させることができると仮定した。我々の先行研究においてヒドロゲル、コラーゲン、ラミニン、ｅｎｔａｃｔｉｎｓおよびそれらの組み合わせなど様々な生化学の条件下でテストを行い、マトリゲルなどの基底膜複合体が最も効率的なマトリックスであることを示した。さらに重要な要因を明確にするために、我々はここで、基板の生物物理学的剛性状態の影響を評価した。具体的には、外部環境が細胞応答におよぼす評価のために、生化学・力学的条件を自在に調整可能な特性を有するヒドロゲルを作製した（図２）（１３）。本法によって作製した様々な硬さ条件の基板上に細胞を播種したところ、２４時間程度の培養後に明らかな細胞集合挙動に違いが認められることが明らかとなった。つまり、集合体形成中のＭＳＣｓの運動をトレースし、速度（ｖｅｌｏｃｉｔｙ）と運動配向性（ｏｒｄｅｒ　ｐａｒａｍｅｔｅｒ）を解析したところ、両パラメータともＥ＝１７　ｋＰａの時に極大を示すことが明らかとなった。この結果は、細胞外環境の硬さが集合体形成の重要パラメータの一つであることを明確に示している。実際、本系での集合体形成のキー細胞であるＭＳＣｓは、分化や接着をはじめ様々なプロセスでｍｅｃｈａｎｏ-ｒｅｓｐｏｎｓｅを示すことが知られている。一般にスフェロイドなどの集合体の形成には、細胞―細胞間の相互作用が、細胞―外場間の相互作用を上回ることが必要であるため、本系でもＥ　＝　１７　ｋＰａの外場硬さ環境がこのような条件を実現したと考えられる。ＭＳＣ（図１）の必要性を考慮することで、我々はより柔らかい基板に対する間葉系細胞の収縮が共培養システムでこれらの集合反応を起こしている可能性があると結論付けた。
　ＭＳＣ由来の収縮力がこの自己集合挙動の中心であることを考慮すると、この原理は、将来の再生医療を目的とする上での胚葉の由来に関係なく、他の臓器の自己組織化系に拡張することができるものと考えられる。中でも、膵臓は、肝臓に比較的近い発生プログラムに従うことであることが明らかになってきているので、この仮説を検証するために、我々はまず膵臓細胞を選択し共培養用に用いた。単離されたマウスの膵臓β細胞（ＭＩＮ６）を、ＨＵＶＥＣとＭＳＣと共培養したところ、同様に細胞集合体の形成を認めた（図３）。生成されたオルガノイドの内部構造を可視化するために、共焦点顕微鏡分析は蛍光標識された細胞を用いて行った。三次元ｚスタック投影画像でｋｕｓａｂｉｒａオレンジ（ＫＯ）標識ＭＩＮ６が移植後７２時間で膵島様組織を形成するために自己組織化されることを明らかにした。それに対して、緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）標識したＨＵＶＥＣはオルガノイド内部のＭＩＮ６由来の膵島を覆うネットワーク構造を形成した。以上から、肝臓において見出した動作原理が、膵臓においても拡張できる可能性が示された。
　次に、我々は、このアプローチのさらなる汎用性を評価するために、胚または成体マウスからの（最大２００μｍの）複数の細胞又は組織断片を単離した。驚くべきことに、細胞集団の指向性のある自律的集合現象は膵臓、肝臓、腸、肺、心臓、腎臓、脳、さらには癌（図３）を含むテストしたすべての細胞／組織タイプで保たれていた。タイムラプスイメージングは、胚および成体の両方の細胞／組織がうまく移植手術を含む追加の操作に耐え、自律的に単一の３Ｄオルガノイドを形成したことを示した（図３）。集合体は、培養内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を含むように設計されると、信頼性のある従来の組織工学的アプローチ（平均灌流時間；～１９２時間）と比べて、移植されてからはるかに短い時間でレシピエントの循環で血液灌流されることが明らかとなった（平均灌流時間；～７２時間）。これは、血管新生のためには足場のない自己集合アプローチが優位であることを示唆している（図４）。内皮細胞の存在は集合体を生成するためには不要だが、ＨＵＶＥＣ無しでは移植後の結果は非常に悪い。なぜなら、機能的血管形成の兆候がｉｎ　ｖｉｖｏで観察されないからだ（図４）。
　興味深いことに、機能的血管新生が保たれているにもかかわらず、成体器官由来の細胞はほとんどが移植の際に元のものに似た組織を再構成しない（図７）。しかし、胚細胞由来の集合体は効率的に機能的な組織ユニットを自己組織化により再構成した。例えば、胎児腎臓由来のオルガノイドの移植は、血液濾過の兆候のある糸球体のようなミクロ組織を再構成（図４Ｄ）したが、成体の腎臓や肺に由来するオルガノイドはそのような組織（図７、８）を生成するのに失敗した。この結果は、ＰＳＣから直接分化した細胞を利用する成熟した細胞移植は臓器不全を治療するのに有効かもしれないという優勢な再生医学のパラダイムの疑問を提起する。なぜなら、最終分化した細胞はよく血管新生した条件下であっても、移植に際して機能的な組織を再構築する能力に乏しいからだ。
　さらに、膵臓細胞を対象として、詳細な解析を実施した。３次元膵臓オルガノイドの移植は迅速（～４８時間）な再灌流とβ細胞の生着が起こり、これらは生体イメージング解析により確認された。１４日目に移植片はレシピエントの循環系（図４，Ｃ）に接続した、機能的微小血管ネットワークをもつ膵島様構造（図４，Ｅ）を形成した。このような血液灌流は、血管内皮細胞を含めない集合体を移植した場合には認められなかった（図９）。再構成された膵島は、周辺部のマウス血管と直接接続し、毛細血管の密なネットワークによって高度に血管化されていた（図１０）。生体における膵島毛細血管網は、外分泌組織を取り巻く血管網よりも約５倍の密度が高いことが知られるが、これと一致して、生体内の機能的血管密度の定量化で、再構成された膵島様組織において正常組織（図４、図９）の周囲に比べ毛細血管網が遥かに緻密（４．２倍）であることが示された。組織学的な解析からも成体膵島に類似した構造を有しており、自己組織化により成熟組織を再構成しているものと考えられた（図１１）。さらに、治療上の有効性を評価するために、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ由来のβ細胞オルガノイドをＩ型劇症糖尿病モデルマウスの腎臓被膜下に移植した。糖尿病モデルとして、我々は、インスリンプロモーターにジフテリア毒素受容体ｃＤＮＡ導入遺伝子を持つ、毒素受容体を介した細胞ノックアウト（トレック）-Ｔｇマウスを採用した。非移植群のマウスはジフテリア毒素（ＤＴ）投与を介した糖尿病誘導後６日目に死亡したのに対し、β細胞オルガノイドを移植されたマウスは血糖値を正常に保ち生き延びた（図４，Ｇ）。以上から、我々は実験的にｉｎ　ｖｉｖｏで血管新生化および機能的三次元組織を再構成することによって、この原理が他の器官系にも適用可能であることを実証した。
　１９６０年代には、単離した胚細胞の集合体は、自己組織化を通じて、元の臓器に似た構造を有する組織を再構成することが示されている。いったん、必要となる様々な少数の細胞が密に相互作用できるように集められると、個々の細胞は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで機能的組織を自己形成することができる（１４）。自己組織化についてのこの古典的な知識は、この分野の１つの本質的な挑戦であるＰＳＣから臓器を成長させるための原則を設計する再生医学の分野において技術革新をもたらすことができる。この原則は現在では、ＰＳＣ由来細胞集合体からの脳、眼杯、腎臓および肝臓を含む我々やその他の研究者の観察により強化されている（１５）。この流れにおいて、我々はここで１つの有望な原則を示している。つまり、従来の様ないずれも小型の集合体しか形成できなかった方法と比較して、希望する複数の多数の細胞／組織から集合を通じて、その自己組織下したオルガノイドを設計することができる。集合体は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよび　ｉｎ　ｖｉｖｏの両方でその後の自己組織化能力を調べるために使用することができる。この研究では実験的に内皮細胞を組み込むことで、迅速な血管新生とそれに続く機能化を評価することを行ったが、より正確な組織再構築のために、神経細胞などの未開拓の支援細胞の貢献を評価することも、我々や他のグループにとって興味深いところである。標的となる組織の自己組織化のための最適な条件を決定するためにさらなる改良が必要とされるが、我々はこの培養原理が、多能性幹細胞を用いたヒト生物学および病理学を研究するための強力なツールであるだけでなく、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで成長した複雑な組織構造を用いることで、現在治療不可能な患者のための次世紀の再生医療の実現を可能にすると考える。
参考文献
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８．　　　　　　Ｊ．　Ｗ．　Ｓｈｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ　ｆｏｒｃｅｓ　ｓｕｓｔａｉｎ　ａｎｄ　ｐｏｌａｒｉｚｅ　ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ　ｆｒｏｍ　ｓｔｅｍ　ａｎｄ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ．　Ｃｅｌｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　１４，　８１　（Ｊａｎ　２，　２０１４）．
９．　　　　　　Ａ．　Ｆ．　Ｓｔｒａｉｇｈｔ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ　ｔｅｍｐｏｒａｌ　ａｎｄ　ｓｐａｔｉａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ　ｗｉｔｈ　ａ　ｍｙｏｓｉｎ　ＩＩ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２９９，　１７４３　（Ｍａｒ　１４，　２００３）．
１０．　　　　　　Ｅ．　Ｄｏｎａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　ｔｉｓｓｕｅ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ａ　ｓｅｌｆ-ｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ　ｇｒａｄｉｅｎｔ．　Ｎａｔｕｒｅ　５０３，　２８５　（Ｎｏｖ　１４，　２０１３）．
１１．　　　　　　Ｄ．　Ｅ．　Ｄｉｓｃｈｅｒ，　Ｐ．　Ｊａｎｍｅｙ，　Ｙ．　Ｌ．　Ｗａｎｇ，　Ｔｉｓｓｕｅ　ｃｅｌｌｓ　ｆｅｅｌ　ａｎｄ　ｒｅｓｐｏｎｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ　ｏｆ　ｔｈｅｉｒ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　３１０，　１１３９　（Ｎｏｖ　１８，　２００５）．
１２．　　　　　　Ｚ．　Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　ｔｕｇｇｉｎｇ　ｆｏｒｃｅ　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｔｈｅ　ｓｉｚｅ　ｏｆ　ｃｅｌｌ-ｃｅｌｌ　ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ．　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ　１０７，　９９４４　（Ｊｕｎ　１，　２０１０）．
１３．　　　　　　Ｈ．　Ｙ．　Ｙｏｓｈｉｋａｗａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｃｈａｎｏｓｅｎｓｉｎｇ　ｏｆ　ｃｅｌｌｓ　ｏｎ　ｄｙｎａｍｉｃａｌｌｙ　ｔｕｎａｂｌｅ　ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　１３３，　１３６７　（Ｆｅｂ　９，　２０１１）．
１４．　　　　　　Ｍ．　Ｔａｋｅｉｃｈｉ，　Ｓｅｌｆ-ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｉｍａｌ　ｔｉｓｓｕｅｓ：　ｃａｄｈｅｒｉｎ-ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｃｅｌｌ　２１，　２４　（Ｊｕｌ　１９，　２０１１）．
１５．　　　　　　Ｙ．　Ｓａｓａｉ，　Ｃｙｔｏｓｙｓｔｅｍｓ　ｄｙｎａｍｉｃｓ　ｉｎ　ｓｅｌｆ-ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｉｓｓｕｅ　ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ．　Ｎａｔｕｒｅ　４９３，　３１８　（Ｊａｎ　１７，　２０１３）．
材料と方法
・間葉系細胞（ＭＣ）の調製
　ＭＣについては、ヒト骨髄より分離した細胞、ヒト臍帯間質（ワルトン鞘）より分離した細胞、ヒト耳介より分離した細胞、マウス骨髄より分離した細胞、ヒト線維芽細胞などのいずれかを用いた。本実験で主として用いた、ヒト骨髄より分離した間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ：　ｈＭＳＣ）　は、ｈＭＳＣ培養に調製された専用の培地（ＭＳＣＧＭTM　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（登録商標））（Ｌｏｎｚａ　ＰＴ-３００１）を用いて培養した。
・各種細胞の調製
　ジエチルエーテル（Ｗａｋｏ）を用いて麻酔したＣ５７ＢＬ／６-Ｔｇ（ＣＡＧ-ＥＧＦＰ）マウス（日本ＳＬＣ）妊娠１２-１７日目の腹部を７０％エタノールで消毒した後、開腹し、胎児を摘出した。胎児から脳、心臓、肺、肝臓、後腎、または腸管を摘出した。また、６週齢以上のＣ５７ＢＬ／６-ＢＡＬＢ／ｃ　ＲＦＰ　ｈａｉｒｙ　ｍｏｕｓｅ　（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｃ．より購入）の脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、または腸管を摘出した。摘出した組織より単離した細胞を用いる場合には、０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ-ＥＤＴＡ　（ＧＩＢＣＯ）２００μＬ中に入れ、３７℃で２０分間インキュベートした。その後、ピペットで組織を崩し、４．８ｍＬの培地に加えた。遠心し、培地を加え細胞数を数えた後、単一細胞まで酵素処理した細胞を共培養に用いた。また摘出した組織を小組織の状態で用いる場合には、摘出した胎児組織をハサミでミンスし、０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ　１０ｍＬ中に入れ、３７℃で２０分間振盪した。その後、培地を加え１００μｍのセルストレーナーを通し、遠心を行った。遠心後、培地を加え、細胞培養に用いた。また、成体マウスの脳、心臓、肺、肝臓をハサミでミンスし、１００μｍのセルストレーナーを用いて濾過し、フロースルーを４０μｍのセルストレーナーを用いて濾過し、４０μｍのセルストレーナーに残った細胞塊を培地で回収し細胞の共培養に用いた。また、成体マウスの小腸においては、中身を生理食塩水で洗浄した。洗浄した小腸を縦に切り、４ｃｍ間隔に切ったものを、２ｍＭ　ＥＤＴＡ，　０．５ｍＭ　ＤＴＴ　ｉｎ　ＰＢＳに入れ３７℃で２０分間振盪した。その後、１００μｍのセルストレーナーを用いて濾過し、ＰＢＳを加えた。遠心を行い、上清を吸ったあとＰＢＳを加え洗浄した。その後、遠心を行い、培地を加え細胞培養に用いた。
　正常臍帯静脈内皮細胞（Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　Ｖｅｉｎ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌｓ：　ＨＵＶＥＣ）　は、説明と同意を取得した妊産婦の分娩時に提供を頂いた臍帯より分離した細胞、ないし購入した細胞をＥＧＭ（登録商標）　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（登録商標）　（Ｌｏｎｚａ　ＣＣ-４１３３）を用いて、５回以内の継代回数で培養した。なお、いずれの細胞も必要に応じてレトロウイルスベクターによる蛍光標識を行った。また、ＨｅｐＧ２はＤＭＥＭに１０％ＦＢＳを加えたもので培養した。それぞれの細胞は３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で培養した。
・自己組織化用細胞集合体の作製
　ＰＡゲル平面基板を静置した、または、マトリゲルコーティング（マトリゲル（ＢＤ）の原液、ないしマトリゲルと培地を１：１の割合で混合した溶液を１ウェル毎に３００μＬずつ入れ、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内に１０分以上静置し固めた）を行った、２４ウェルプレートの１ウェルに細胞数として２×１０６　ｃｅｌｌｓ以上相当の任意の組み合わせの種類の細胞（胎児・成体より分離した組織または、ＫＯ-ＨｅｐＧ２、ＨＵＶＥＣなど）と、２×１０５　ｃｅｌｌｓのＭＳＣと混合し、細胞を播種した。また小型の細胞集合体を形成するためには、４×１０３　ｃｅｌｌｓ以上相当の任意の組み合わせの種類の細胞（胎児・成体より分離した組織または、ＫＯ-ＨｅｐＧ２、ＨＵＶＥＣ）へ、５×１０３　ｃｅｌｌｓ以上のＭＳＣと混合し、播種した。その後、３７℃のインキュベーターで１日間培養した。播種後、実体顕微鏡または共焦点顕微鏡を用いた細胞共培養の経時観察を実施した。任意の組み合わせには種類の限定はなく、例えば、膵臓・肝臓・腸管・神経などの異なる組織に由来する細胞を混合したものを用いても良く、その後に目的とする臓器の自己組織化に最適な組成を用いることができた。
　なお、細胞の画像解析を行ったＰＡゲル平面基板を静置したプレートを用いた実験では、ＨＵＶＥＣを２～４×１０６　ｃｅｌｌｓ、ｈＭＳＣを２～４×１０５　ｃｅｌｌｓの２種類の細胞を播種することによって得られた集合体形成過程の動画をもとに評価を行った。
・ＰＡゲル平面基板の作製（面内の硬さ均一）
　ゲルの反応溶液として、アクリルアミド水溶液（４０％　ｗ／ｖ，Ａ４０５８，Ｓｉｇｍａ）、ビスアクリルアミド水溶液（２％　ｗ／ｖ，　Ｍ１５３３，　Ｓｉｇｍａ）、蒸留水を混合して作製した溶液１０　ｍＬを作製した。この時それぞれの溶液の混合比率を変えることで、ゲルのヤング率を調節した。この反応溶液を真空チャンバーを用いて突沸させた後、１００　μＬ　のＡＰＳ（５　ｇ　／　ＤＷ５０　ｍＬ，　０１３０７-００，　ＫＡＮＴＯ，　０．２０　ｍｍ　ｆｉｌｔｅｒｅｄ）と１０　μＬ　ＴＥＭＥＤ（Ｔ９２８１，Ｓｉｇｍａ）を順に加えた。その後、本反応液２５　μＬ　をＤｉｍｅｔｈｙｌｄｉｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅ（ＤＣＤＭＳ，Ｄ０３５８，ＴＣＩ）で表面疎水化されたスライドガラス（Ｓ２１１２，ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）上に滴下した後、上からＡｌｌｙｔｒｉｃｈｏｌｏｒｏｓｉｌａｎｅ（ＡＴＣＳ，１０７７７８-５ｇ，Ｓｉｇｍａ）処理した丸型カバーガラス（φ＝１２　～　２５　ｍｍ，ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）を重ねてサンドイッチ構造とし、３０分間静置した。その後蒸留水を加え、一晩静置した後、スライドガラス基板から剥離し、ゲルがコートされたカバーガラス基板を得た。その後リン酸緩衝液を加えて一日静置し、未反応のモノマーを除去した。表１に代表的な反応溶液の配合比とゲルのヤング率を示す。ゲルのヤング率は原子間力顕微鏡（Ｎａｎｏｗｉｚａｒｄ　３，　ＪＰＫ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）のナノインデンテーション測定により決定した。
　ＰＡゲル表面への接着分子（マトリゲルまたはラミニン）のコーティングは以下の手順で行った。まず、０．２　ｍｇ／ｍＬのＮ-Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ-６-（４'-ａｚｉｄｏ-２'-ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏ）　ｈｅｘａｎｏａｔｅ　（Ｓｕｌｆｏ-ＳＡＮＰＡＨ，２２５８９，Ｐｉｅｒｃｅ）の２０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．５）溶液をＰＡゲル基板上に滴下し、ＵＶランプ（Ｚ１６９６３３-１ＥＡ，　Ｓｉｇｍａ）を２０分間照射した。その後、４．４　ｍｇ／ｍＬのマトリゲル溶液（原液を２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．５）溶液で２２７倍に希釈，　３５４２３４，　ＢＤ）、または１０．０　ｍｇ／ｍＬのラミニン溶液（原液を２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．５）溶液で２２７倍に希釈，　３５４２３２，　ＢＤ）を数ｍＬ滴下し、１６時間３７℃インキュベーターに静置した．その後　ＰＡゲルをリン酸緩衝液でよくリンスし、未架橋のマトリゲルやラミニンを除去した．
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
〔実施例２〕
　マトリゲルコーティング（マトリゲル（ＢＤ）の原液、ないしマトリゲルと培地を１：１の割合で混合した溶液を１ウェル毎に３００μｌずつ入れ、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内に１０分以上静置し固めた）を行った、２４ウェルプレートの１ウェルに細胞数として２×１０６　ｃｅｌｌｓのｉＰＳ細胞由来肝内胚葉細胞、ないしヒト成体肝細胞と、５×１０５　ｃｅｌｌｓのヒトまたは、マウスＭＳＣと混合し、播種した。その後、３７℃のインキュベーターで１日間培養した。播種後、実体顕微鏡または共焦点顕微鏡を用いた細胞共培養の経時観察を実施した。図１３に示すように血管内皮細胞がなくても、間葉系細胞があれば、細胞集合体が形成されることが示される。
〔実施例３〕
・ＵボトムＰＡゲルの調製
ゲルの反応溶液として，アクリルアミド溶液（４０％　ｗ／ｖ，Ａ４０５８，Ｓｉｇｍａ），ビスアクリルアミド溶液（２％　ｗ／ｖ，Ｍ１５３３，Ｓｉｇｍａ），蒸留水を混合して作製した溶液１０　ｍＬを作製した。この時それぞれの溶液の混合比率を変えることで、ゲルのヤング率を調節した。２４-ｗｅｌｌ　ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｐｌａｔｅ　（３５３０４７，　ＢＤ）　に反応溶液を５００　μＬ加えた後、０．５　μＬ　ＴＥＭＥＤ（Ｔ９２８１，Ｓｉｇｍａ）と５　μＬ　のＡＰＳ（５　ｇ　／　ＤＷ５０　ｍＬ，　０１３０７-００，　ＫＡＮＴＯ，　０．２０　ｍｍ　ｆｉｌｔｅｒｅｄ）をこの順で加え、すぐによく混合した。その後５０　℃のホットプレートの上で１５分静置した。その後リン酸緩衝液を加えて一日静置し、未反応のモノマーを除去した。Ｕボトムゲルの断面図を図１２に示す。
　本ゲル（深さ3ミクロン以降の硬さは、約30 kPaで一定であった。）を用いた細胞集合体の形成実験には、２４ウェルプレートの１ウェルに細胞数として２×１０６　ｃｅｌｌｓのｉＰＳ細胞由来肝内胚葉細胞と、７×１０５　ｃｅｌｌｓのＨＵＶＥＣ、２×１０５　ｃｅｌｌｓのヒトＭＳＣと混合し、播種した。その後、３７℃のインキュベーターで１日間培養した。播種後、実体顕微鏡または共焦点顕微鏡を用いた細胞共培養の経時観察を実施した結果、細胞集合体が形成されることが示された（図１４）。
〔実施例４〕
（方法と結果）
　ジエチルエーテル（Ｗａｋｏ）を用いて麻酔したＣ５７ＢＬ／６-Ｔｇ（ＣＡＧ-ＥＧＦＰ）マウス（日本ＳＬＣ）妊娠１２．５および１３．５日目の腹部を７０％エタノールで消毒した後、開腹し、胎児を摘出した。胎児から後腎を摘出したのち、０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ-ＥＤＴＡ　（ＧＩＢＣＯ）２００μＬ中に入れ、３７℃で２０分間インキュベートした。その後、ピペットで組織を崩し、４．８ｍＬの培地に加えた。遠心し、培地を加え細胞数を数えた後、単一細胞まで酵素処理した細胞を共培養に用いた。その後、ヒト骨髄より分離した間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ：　ｈＭＳＣ）および、　正常臍帯静脈内皮細胞（Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　Ｖｅｉｎ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌｓ：　ＨＵＶＥＣ）と混合し、マトリゲル（実施例２のマトリゲル（ＢＤ）の原液）と血管内皮細胞用培地（ＥＧＭ　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（登録商標）、Ｌｏｎｚａ　ＣＣ-４１３３）を１：１の割合で混合した溶液を固めたウェル上に播種を行った。２４ウェルプレートの１ウェル相等の場合は、総細胞数として約２×１０６　ｃｅｌｌｓの任意の組み合わせの種類の細胞を播種した。なお、胎児腎臓細胞、ＭＳＣとＨＵＶＥＣの比率は、順番に、１０：２：０．１～１としたがその限りではない。その後、３７℃のインキュベーターで１日間培養し、３次元組織を自律的に形成した。図１６下段に記載の結果については、ペレット培養を行った組織を用いた。ペレット組織の作製法については、Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｏｓ　Ｘｉｎａｒｉｓ，　ｅｔ　ａｌ．（Ｉｎ　Ｖｉｖｏ　Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｒｅｎａｌ　Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ　Ｆｏｒｍｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｃｅｌｌ　Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ．　Ｊ　Ａｍ　Ｓｏｃ　Ｎｅｐｈｒｏｌ．　２０１２　Ｎｏｖ；　２３（１１）：　１８５７-１８６８．）に記載の方法に準じており、一斉回収した単離された細胞を遠心力によりチューブ底面に集合させ移植用組織を形成する手法をとった。
　形成した腎臓原基を免疫不全マウス胎内へ移植を行った後、肉眼観察を実施した結果、移植２-３日で血液流入が確認された（図１５の上段）。図１５中の白点線は、移植領域を示す。分散していた細胞が、移植８日目には、球状の糸球体組織を形成した（図１５の下段）。図１６左に示す蛍光観察の結果、支持体上で培養を行うことにより多数の糸球体構造が形成されたのに対し、従来法（ペレット移植群）では形成されなかった。図１６右に示す網羅的遺伝子発現解析の結果、移植１ヶ月目の移植片は、生後０～８週相等の成熟度合いであることが示された。図１７に示す左３列の結果より、移植４週目の組織を対象とした電子顕微鏡観察の結果、形成された組織は、足細胞、スリット膜、内皮細胞、近位尿細管、メサンギウム細胞などよりなる正常ネフロンの構造を形成した。図１７右図より、免疫染色の結果、足細胞やスリット膜の存在が示された。さらに、移植３週目に低分子量蛍光デキストランを投与後蛍光ライブ観察した結果を示す（図１８）。形成された組織は、まず、血管内に流入し、糸球体内部で濾過され、近位尿細管に回収されたことから腎臓の原尿生成機能を有していることが示された（図１８）。以上から、本発明により人為的に作製した腎臓原基を生体内へ移植することにより、自律的な成熟を誘導し、機能的な腎組織を作成することに成功した。
〔実施例５〕
（方法と結果）
異なる硬さ条件（Sample A, B, C）の支持体（ＰＡゲル平面基板の作製）のマトリゲルコーティング前（斜線）・後（黒ベタ）におけるヤング率の変化。コーティングの有無に関わらず、硬さ条件が厳密に制御できることを示す（図１９）。本ゲル基板の作製は実施例１に記載の方法を用いて行った。
〔実施例６〕
（方法と結果）
一つの基板上に、異なる硬さ条件が混在する硬さのマルチパターンゲルを作製することに成功した（図２０）。パターン１では中心部が固いゲルを、パターン２では中心部がやや硬いゲルを作製した（図２０左図）。図２０右図は、硬さ条件を長軸方向に測定した結果を示し、目的とする硬さ条件が作製されていることを示す。
　硬さの空間パターンを有するゲル基板の作製方法は以下のとおりである．ゲルの反応溶液として、アクリルアミド水溶液（４０％　ｗ／ｖ，Ａ４０５８，Ｓｉｇｍａ）、ビスアクリルアミド水溶液（２％　ｗ／ｖ，　Ｍ１５３３，　Ｓｉｇｍａ）、蒸留水を混合して作製した溶液１０　ｍＬを作製した。その後、遮光しながらＩｒｇａｃｕｒｅ２９５９（０．５ ％ ｗ／ｖ， ＤＹ１５４４４， Ｃｉｂａ）を５０ ｍｇ加えた後に３７ ℃の湯浴で溶解し、真空チャンバーを用いて突沸させた。その後、本反応液１０　μＬ　をＤｉｍｅｔｈｙｌｄｉｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅ（ＤＣＤＭＳ，Ｄ０３５８，ＴＣＩ）で表面疎水化されたスライドガラス（Ｓ２１１２，ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）上に滴下した後、上からＡｌｌｙｔｒｉｃｈｏｌｏｒｏｓｉｌａｎｅ（ＡＴＣＳ，１０７７７８-５ｇ，Ｓｉｇｍａ）処理した丸型カバーガラス（φ＝１２　ｍｍ，ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）を重ねてサンドイッチ構造とした。その上に、フォトマスクを置き、２５４ ｎｍの紫外光を照射した。フォトマスクはアセチルセルロース（Ｇ２５４Ｂ， Ａｇａｒ）にレーザープリンタ（ＭＣ８６０， ＯＫＩ）を用いて印刷したものを用いた．マスクパターンのデザインはＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを利用し、外径１２ ｍｍ、内径２~４ｍｍの円形マスクを作製した。光照射には、光源を水銀ランプ（Ｃ‐ＨＧＦＩ， Ｎｉｋｏｎ）とし、反応溶液に均一に照射するため光ファイバーと投光管を使用した。紫外線照射時間は、目的の硬さに応じて分刻みで調整した。その後蒸留水を加え、スライドガラス基板から剥離し、ゲルがコートされたカバーガラス基板を得た。その後リン酸緩衝液を加えて一日静置し、未反応のモノマーを除去した。ゲルのヤング率は原子間力顕微鏡（Ｎａｎｏｗｉｚａｒｄ　３，　ＪＰＫ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）のナノインデンテーション測定により決定した。ＰＡゲル表面への接着分子（マトリゲルまたはラミニン）のコーティングは以下の手順で行った。まず、０．２　ｍｇ／ｍＬのＮ-Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ-６-（４'-ａｚｉｄｏ-２'-ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏ）　ｈｅｘａｎｏａｔｅ　（Ｓｕｌｆｏ-ＳＡＮＰＡＨ，２２５８９，Ｐｉｅｒｃｅ）の２０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．５）溶液をＰＡゲル基板上に滴下し、ＵＶランプ（Ｚ１６９６３３-１ＥＡ，　Ｓｉｇｍａ）を２０分間照射した。その後、４．４　ｍｇ／ｍＬのマトリゲル溶液（原液を２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．５）溶液で２２７倍に希釈，　３５４２３４，　ＢＤ）、または１０．０　ｍｇ／ｍＬのラミニン溶液（原液を２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．５）溶液で２２７倍に希釈，　３５４２３２，　ＢＤ）を１ｍＬ滴下し、１６時間３７℃インキュベーターに静置した．その後　ＰＡゲルをリン酸緩衝液でよくリンスし、未架橋のマトリゲルやラミニンを除去した．
　次に作製したパターンゲルを用いて、ｉＰＳ由来肝臓内胚葉細胞、ＨＵＶＥＣ、ＭＳＣを、１０：７：２の割合で混合し、総細胞数として約２×１０６　ｃｅｌｌｓを播種したい（図２１）。その結果、パターン１では、細胞播種後３０時間の間に中心の硬い領域に細胞が集まり、速やかに集合体を形成した。パターン２では、細胞集合体の形成を認めたが中心への集合速度はやや遅延する傾向にあった。中心部が１００ｋＰａの条件が最適と示唆された。
〔実施例７〕
（方法と結果）
ポジティブパターンでは、各円形部分が固く、その周辺が柔らかくなるように設計した（図２２左）。ネガティブパターンでは、各円形部分が柔らかく、その周辺が硬くなるように設計した（図２２右）。このような多数の硬さパターンを有するゲル基板は，実施例６に記載の手法をベースとし、４×４の円形パターン（円の直径約２ｍｍ、円の中心間距離約２．７ｍｍ）を有するフォトマスクにより、直径２５ｍｍのゲル基板に露光して作製した。これらのパターン化支持体を用いることで任意の場所に、任意の大きさの集合体を形成できるものと考えられる。

　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
　本発明は、新薬の探索及び薬効の判定、再生医療、疾病、病態の診断、有用物質生産などに利用可能である。

Claims (25)

  1. 任意の種類の細胞及び／又は組織と間葉系細胞との混合物を培養し、細胞集合体を形成させることを含む、細胞集合体をｉｎ　ｖｉｔｒｏで作製する方法。
  2. 細胞集合体が、自己組織化により、高次構造が付加された三次元組織構造を形成できるものである請求項１記載の方法。
  3. 任意の種類の細胞及び／又は組織と間葉系細胞との混合物を間葉系細胞が収縮可能なゲル状支持体の上で培養する請求項１又は２記載の方法。
  4. 培養が二次元培養である請求項３記載の方法。
  5. ゲル状支持体が平面であるか、あるいは、ゲル状支持体の培養する側の断面がＵ又はＶ字の形状である請求項３又は４記載の方法。
  6. ゲル状支持体の中心部の硬さが周辺部の硬さより固い請求項３～５のいずれかに記載の方法。
  7. ゲル状支持体の周辺部の硬さが中心部の硬さより固い請求項３～５のいずれかに記載の方法。
  8. ゲル状支持体がパターン化されており、中心部の硬さが周辺部の硬さより固いというパターンを１個以上有する請求項３～５のいずれかに記載の方法。
  9. ゲル状支持体がパターン化されており、周辺部の硬さが中心部の硬さより固いというパターンを１個以上有する請求項３～５のいずれかに記載の方法。
  10. 任意の種類の細胞及び／又は組織が総細胞数として４０万個以上であり、間葉系細胞が１０万～４０万個である請求項１～９のいずれかに記載の方法。
  11. 細胞集合体の大きさが１ｍｍ以上である請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
  12. 細胞集合体の形成が自律的なものである請求項１～１１のいずれかに記載の方法。
  13. 足場材料を用いることなく、任意の種類の細胞及び／又は組織と間葉系細胞との混合物を培養する請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
  14. 間葉系細胞と混合する細胞及び／又は組織が、肝臓、膵臓、腸、肺、腎臓、心臓、脳又は癌に由来する請求項１～１３のいずれかに記載の方法。
  15. 間葉系細胞と混合する細胞が、多能性細胞である請求項１～１３のいずれかに記載の方法。
  16. 間葉系細胞と混合する組織が、多能性細胞より誘導された組織である請求項１～１３のいずれかに記載の方法。
  17. 多能性細胞が、生体より得られた多能性細胞、再プログラムから誘導して得られた多能性細胞、又はそれらの組み合わせである請求項１５又は１６記載の方法。
  18. 請求項１～１７のいずれかに記載の方法で作製された細胞集合体。
  19. 請求項１～１７のいずれかに記載の方法で作製された細胞集合体を自己組織化させ、高次構造が付加された三次元組織構造を形成させることを含む、三次元組織構造の作製方法。
  20. 培養する側の断面がＵ又はＶ字の形状であるゲル状培養支持体。
  21. 中心部の硬さが周辺部の硬さより固いゲル状培養支持体。
  22. 周辺部の硬さが中心部の硬さより固いゲル状培養支持体。
  23. 中心部の硬さが周辺部の硬さより固いというパターンを１個以上有するゲル状培養支持体。
  24. 周辺部の硬さが中心部の硬さより固いというパターンを１個以上有するゲル状培養支持体。
  25. 請求項２０～２４のいずれかに記載のゲル状培養支持体の上で、任意の種類の細胞及び／又は組織と間葉系細胞との混合物を培養し、細胞集合体を形成させることを含む、細胞集合体をｉｎ　ｖｉｔｒｏで作製する方法。
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