WO2019087988A1 - 構造体と細胞塊を連結した構築物 - Google Patents

構造体と細胞塊を連結した構築物 Download PDF

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organ buds
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英樹 谷口
友美 田所
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    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates

Definitions

  • the present invention relates to a construct in which a structure and a cell mass are linked.
  • organoid organ analogue
  • Organoide creation is a tissue based on autonomous multi-lineage cell differentiation by three-dimensional culture of undifferentiated cells as represented by the preparation of embryoid bodies from embryonic stem cells (ES cells)
  • ES cells embryonic stem cells
  • Non-patent document 2 Sato T et al., Nature, 2009
  • Organoid having both epithelium and stroma Organoid having a vascular network inside, etc.
  • Non- Patent Document 4 Takebe T et al., Nature, 2013;
  • Non-patent Document 5 Takebe T et al., Cell Stem Cell, 2015,
  • Patent Document 1 WO2013 / 047639
  • Self-organization utilizing intercellular interaction Guidance and control methods are being established.
  • An object of the present invention is to provide an artificial guidance and control system of "inter-tissue interaction" between a plurality of tissues.
  • the present inventors are to create in vitro a fusion of an organoid and a vascular system structure including large blood vessels and artificial blood vessels in order to realize blood perfusion to transplanted tissue at an early stage after transplantation.
  • the present invention has been completed.
  • the gist of the present invention is as follows. (1) A construct in which a structure and a cell mass are linked, wherein the structure is an object having a three-dimensional structure, which is capable of mimicking or resembling the structure and / or function of a living body, which is transplanted into a living body For the above construction. (2) The construct according to (1), wherein the construct has a luminal structure, a non-luminal structure or a combination thereof.
  • the structure is a blood vessel, bile duct, esophagus, pancreatic duct, trachea, bronchus, bronchioles, ureter, oviduct, vas deferens, sweat gland, Walton duct, stenon duct, lacrimal gland, heart, nerve, cerebrum, midbrain, Cerebellum, thalamus, hypothalamus, pituitary, bridge, bulbar, eye, tongue, teeth, skin, pharynx, larynx, thymus, vocal cords, stomach, duodenum, small intestine, large intestine, rectum, anus, lung, diaphragm, liver, gallbladder Selected from the group consisting of pancreas, kidney, adrenal gland, thyroid gland, parathyroid gland, spleen, bladder, testis, ovary, uterus, bone, cartilage, tendon, hair follicle, serous membrane, omental tissue, mucosal tissue, muscle
  • the combination of structure and cell mass includes blood vessels and organ buds, bile duct and organ buds, esophagus and organ buds, pancreatic duct and organ buds, trachea and organ buds, bronchial and organ buds, bronchioles and organ buds, ureter And organ buds, oviduct and organ buds, vas deferens and organ buds, sweat glands and organ buds, Walton's duct and organ buds, stenon's tube and organ buds, lacrimal gland and organ buds, heart and organ buds, nerve and organ buds, cerebrum and Organ buds, midbrain and organ buds, cerebellum and organ buds, thalamus and organ buds, hypothalamus and organ buds, pituitary and organ buds, bridges and organ buds, medulla and organ buds, eyes and organ buds, tongue and organs Bud, tooth and organ bud, skin and organ bud, pharynx and organ bud, larynx and organ bud, thymus and organ bud, vocal cord and organ bud,
  • a method for regenerating or restoring function of a tissue or an organ comprising transplanting the construct according to any one of (1) to (10) into a human or non-human animal.
  • a method for producing a non-human chimeric animal comprising transplanting the construct according to any one of (1) to (10) into a non-human animal.
  • a construct according to any of (1) to (10), a tissue and an organ produced by the method according to (11), and a non-human chimeric animal produced by the method according to (13) A method of evaluating a drug using at least one selected.
  • a composition for regenerative medicine comprising the construct according to any one of (1) to (10).
  • the present invention provides a new artificial control system for "inter-tissue interaction" between a plurality of organoids, as well as organ analogs and organs produced by the artificial control system. Furthermore, the present invention provides an artificial control system of “inter-tissue interaction” between a plurality of organoids and a foreign structure such as a large blood vessel, and provides an organ analog or an organ produced by the artificial control system. Furthermore, the present invention is not limited to the provision of a simple interaction control system between living tissues, and an interaction with artifacts such as chemical substances and metals represented by polymer structures such as artificial blood vessels. The control system of the present invention, as well as organ analogs and organs produced by the artificial control system.
  • Cyfuse patent [WO2008 / 123614, WO2014 / 141528, WO2014 / 148647] and published paper [Birey F et al., Nature] 545, pp 54-59, 2017: Brain preparation by fusion of a brain outer organid and an outer brain lower organide)] is a completely different method and has inventive step. Provision of an artificial control system for "interaction" with structures and artifacts, and organ analogs and organs produced by the artificial control system are clearly novelty.
  • the present invention is an important technology for innovatively developing technology for artificially creating an organoid (organ analogue) having a three-dimensional structure and biological functions similar to human organs.
  • organoid organ analogue
  • the present specification includes the contents described in the specification and / or drawings of Japanese Patent Application No. 2017-208853, which is the basis of the priority of the present application.
  • the present invention provides a new artificial control system of "inter-tissue interaction" between a plurality of organoids, and an artificial control system of "inter-tissue interaction" between a plurality of organoids and a structure such as a large blood vessel.
  • hiPSC fusion of liver buds and mouse large vessels hiPSC Vascular / biliary duct technology to liver buds. hiPSC fusion of liver sprouts and artificial blood vessels. In vivo functional analysis of large-vessel fusion liver buds.
  • the present invention relates to a construct in which a structure and a cell mass are linked, wherein the structure is an object having a three-dimensional structure, which is capable of mimicking or resembling the structure and / or function of a living body.
  • a structure is an object having a three-dimensional structure, and may mimic or resemble the structure and / or function of a living body.
  • the structure may be one that mimics or resembles the structure and / or function of all or part of the tissue and / or organ of the living body at the in vitro stage, or mimics or resembles the in vitro stage. Alternatively, they may be mimic or similar after transplantation into a living body (at the in vivo stage).
  • the construct may be of the same origin as the cell mass (homologous) or of a different origin from the cell mass (heterologous).
  • Examples of the structure include living tissues and organs derived from the same or different organisms as the cell mass, artificial tissues and organs, etc.
  • the structure may be a luminal structure, a non-luminal structure or a combination thereof And may be derived from a living organism or may be an artificial one.
  • the structures may take the form of sheet-like structures, tubular structures, thread-like structures and the like.
  • the structure When the structure is an artificial product, it may be formed of a biocompatible material.
  • biocompatible materials include metals (eg, stainless steel, cobalt alloy, titanium alloy, etc.), glass, ceramic, synthetic polymers (eg, nylon, polypropylene, polydioxanone, polylactic acid, polyethylene terephthalate, Teflon (registered trademark)) Etc.), bio-derived materials (eg, silk, collagen, decellularized tissue) and the like can be exemplified, but not limited thereto.
  • cell clusters cell masses
  • organ buds, spheroids, cell aggregates, cell spheres or cell clusters are fused. It may be
  • the structure and / or function of the living body to which the structure may mimic or be similar is not particularly limited, and may be a structure existing in the living body or any function occurring in the living body, and all of the living tissues and organs. Or a part of the structure, the function of cells or interaction between cells, the function of tissues or organs formed by cells, interaction between tissues or organs, etc. It does not mean that In addition, the concept of the biological function is intended to include the compensation of a defective part of a living tissue or organ or the reinforcement of an injured part of a living tissue or organ. The degree to which the structure and / or function of the living body is mimicked or similar may be large or small, regardless of the size.
  • the cell mass may be any cell aggregate such as organ bud (organoid), spheroid, cell aggregate, cell sphere, etc., including one type of cell or two or more types of cell It may be In addition, cell aggregates may be fused together.
  • An “organ sprout” is a structure that can be differentiated into an organ upon maturation, and as an example, WO 2013/047639 includes organ cells, blood vessel cells (preferably, vascular endothelial cells), and undifferentiated cells. A method of producing an organ sprout from three types of cells of mesenchymal cells or cells differentiated therefrom is disclosed, and in the present invention, an organ sprout produced by this method can be suitably used.
  • organ cell refers to a functional cell that constitutes an organ, or an undifferentiated cell that differentiates into a functional cell.
  • organ cells may be cells that can be differentiated into organs such as kidney, heart, lung, spleen, esophagus, stomach, thyroid, parathyroid, thymus, gonads, brain, spinal cord, etc.
  • Cells that can differentiate into ectodermal organs such as brain, spinal cord, adrenal medulla, epidermis, hair, nails, skin glands, sensory organs, peripheral nerves, lenses etc., kidney, ureter, heart, blood, gonads, adrenal cortex, muscles Cells that can be differentiated into mesodermal organs such as skeletal tissue, dermis, connective tissue and mesothelium, and cells that can differentiate into endodermal organs such as liver, pancreas, intestine, lung, thyroid, parathyroid, and urinary tract Can.
  • hepatoblast hepatic progenitor cells, pancreatoblast, hepatic precursor cells, pancreatoblast, pancreatic progenitors, pancreatic progenitor cells, pancreatic precursor cells, endocretic precursors, intestinal proteases, , Metanephric mesenchymal precursor cells, multipotent nephrogen progenitors, renal progenitor cells, cardiac mesoderm, cardiac vascular progenitor cells, cardiac progenitor cells, (JR. Spence, et al. Nature .; 470 (7332): 105-9, (2011), Self. , Et al.
  • Undifferentiated organ cells can be produced from pluripotent stem cells such as induced pluripotent stem cells (iPS cells) and embryonic stem cells (ES cells) according to a known method.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • ES cells embryonic stem cells
  • Vascular cells are cells that constitute blood vessels or cells that can differentiate into such cells, and may be differentiated or undifferentiated.
  • Vascular cells can be isolated from vascular tissue such as umbilical vein, but are not limited to cells isolated from vascular tissue, and can be from pluripotent or pluripotent cells such as iPS cells and ES cells It may be differentiation-induced. As vascular cells, vascular endothelial cells are preferred.
  • the "vascular endothelial cell” refers to a cell constituting vascular endothelium or a cell capable of differentiating to such a cell. The vascular endothelial cells may be differentiated or undifferentiated.
  • endothelial cells are connective tissue cells that exist mainly in the connective tissue derived from mesoderm and form a support structure for cells that function in the tissue, but the differentiation fat to mesenchymal cells is determined It is a concept that includes cells that have not yet differentiated into mesenchymal cells.
  • the mesenchymal cells may be differentiated or undifferentiated.
  • mesenchymal stem cells, mesenchymal progenitor cells, mesenchymal cells are mesenchymal. Included in lineage cells.
  • the mesenchymal cells may be those derived from totipotent or pluripotent cells such as iPS cells and ES cells or cells derived from somatic cells such as bone marrow and fat.
  • hepatic progenitor cells differentiated from iPS cells, hepatic stem cells prepared from mesenchymal stem cells and umbilical vein-derived vascular endothelial cells were used.
  • the combination of structure and cell mass includes blood vessels and organ buds, bile ducts and organ buds, esophagus and organ buds, pancreatic ducts and organ buds, trachea and organ buds, bronchial and organ buds, bronchioles and organ buds, ureteral ducts and organs Bud, oviduct and organ buds, vas deferens and organ buds, sweat glands and organ buds, walton's duct and organ buds, stenon's tube and organ buds, lacrimal gland and organ buds, heart and organ buds, nerve and organ buds, cerebrum and organ buds , Midbrain and organ buds, cerebellum and organ buds, thalamus and organ buds, hypothalamus and organ buds, pituitary and organ buds, bridges and organ buds, bulbar and organ buds, eyes and organ buds, tongue and organ buds, Teeth and organ buds, skin and organ buds, pharynx and organ buds, larynx and organ buds, thymus and organ buds, vocal cords and organ buds,
  • Organ buds include liver buds, lung organoids, airway epithelial organoids, intestinal organoids, pancreatic organoids, kidney organoids, brain organoids, airway organoids, gastric organoids, gastric organoids, thyroid organoids, thymus organoids, thymus organoids, testicular organoids, esophagus organoids, skin organoids, nerve organoids Oviduct organoids, ovary organoids, salivary gland organoids, ocular vesicle organoids, eye cup organoids, bladder organoids, prostate organoids, cartilage organoids, cardiac organoids, heart tissue organoids, bone tissue organoids, muscle tissue organoids, cancer organoids, etc. Not limited to these.
  • the cell mass and the structure may be linked in any manner such as aggregation, aggregation, fusion, anastomosis, etc., since the connection of the structure and cell mass mimics or resembles the structure and / or function of the living body. It is sufficient if it is a combination of
  • the cell mass linked to the structure may exhibit a function. Furthermore, the connection between the structure and the cell mass may enhance the interaction between the cell mass and the interaction between the cell mass and the structure to improve the function of the cell mass. For example, in a structure in which cell clusters are linked, the cell clusters are fused with the structure together with the vascular network, thereby enhancing the interaction between the cell clusters and the structures and enhancing the function of the cell clusters connected to the structures. It is expected.
  • the construct preferably has a cell adhesion surface.
  • cell masses may be fused and then ligated with the construct.
  • the culture period may be 1 to 30 days, preferably 1 to 10 days.
  • the construct (the combination of the construct and the cell mass) may be matured by culturing for an appropriate period (eg, 1 to 30 days, preferably 5 to 14 days) it can.
  • the culture may be any of batch culture, semi-batch culture (feed-batch culture), and continuous culture (perfusion culture), but perfusion culture is preferable.
  • any of stationary culture, aeration culture, stirred culture, shake culture, and rotary culture may be used.
  • a vascular network is constructed in the transplanted tissue or organ, blood perfusion is initiated, and a tissue having a highly ordered tissue structure And organs can be created.
  • Animals to be transplanted include animals used for humans, experimental animals, companion animals, service animals, race horses, fighting dogs, etc. Specifically, mice, rats, rabbits, pigs, dogs, monkeys, cattle And non-human animals such as horses, sheep, chickens, sharks, rays, bullfrogs, salmon, shrimps and crabs. Also, non-human animals may be immunodeficient animals in order to avoid immune rejection.
  • the transplantation site of the cell mass linked structure may be any site as long as it can be transplanted, but blood vessels, intracranial, mesentery, liver, spleen, kidney, subcapsular kidney, above portal vein etc. It can be illustrated.
  • transplanting a structure in which cell clusters are linked to a living body human, non-human animal, etc.
  • it is possible to regenerate tissues and organs whose function has been lost or reduced, and in non-human animals, human tissues and organs Can be used for drug discovery screening.
  • a construct in which a structure and a cell mass are linked is cultured in vitro to further improve the function, and this is used as an organ analog or organ for human biology, regenerative medicine, drug discovery screening, etc. May be
  • the present invention provides a method for producing a tissue or an organ, which comprises transplanting a construct in which a construct and a cell mass are linked to a non-human animal.
  • the present invention also provides a method for regenerating or restoring function of a tissue or organ, which comprises transplanting a construct in which a structure and a cell mass are linked to a human or non-human animal.
  • a non-human chimeric animal can be produced by transplanting a construct in which a construct and a cell mass are linked to a non-human animal and engrafting.
  • the present invention provides a method for producing a non-human chimeric animal, which comprises transplanting a construct in which a construct and a cell mass are linked into a non-human animal.
  • a non-human animal eg, a mouse
  • transplanted with a construct in which a construct and a cell mass are linked can mimic the physiology of a cell mass-derived species (eg, human).
  • the present invention relates to a construct in which a structure and a cell mass are linked, a tissue and an organ produced from a construct in which the structure and the cell mass are linked, and a non-human chimeric animal transplanted with a construct in which the structure and cell mass are linked.
  • a method of evaluating a drug using at least one selected from the group consisting of As drug evaluation for example, evaluation of drug metabolism (for example, prediction of drug metabolism profile), efficacy evaluation (for example, screening of a pharmaceutically effective drug, etc.), toxicity evaluation, drug interaction evaluation, etc. may be mentioned.
  • drug evaluation for example, evaluation of drug metabolism (for example, prediction of drug metabolism profile), efficacy evaluation (for example, screening of a pharmaceutically effective drug, etc.), toxicity evaluation, drug interaction evaluation, etc. may be mentioned.
  • drug evaluation for example, evaluation of drug metabolism (for example, prediction of drug metabolism profile), efficacy evaluation (for example, screening of a pharmaceutically effective drug, etc.), toxicity evaluation, drug interaction evaluation, etc. may
  • the evaluation of drug metabolism is performed on a cell mass produced from cells of human origin, a construct having a structure and a cell mass linked, a tissue and an organ produced from a construct having a structure and a cell mass linked, and a structure
  • a human-type drug metabolism profile can be obtained by collecting and analyzing a biological sample after administration of a drug candidate compound.
  • the screening of a pharmaceutically effective agent is carried out by using a cell mass produced from human-derived cells as a target, a construct in which a structure and cell mass are linked, a tissue and an organ produced from a construct in which a structure and cell mass are linked, And, analysis can be conducted by administering a novel drug candidate compound using a non-human chimeric animal transplanted with a construct in which a construct and a cell mass are linked.
  • a novel drug candidate compound using a non-human chimeric animal transplanted with a construct in which a construct and a cell mass are linked.
  • Toxicity evaluation is performed using a construct in which a structure and a cell aggregate are linked, a tissue and an organ produced from a construct in which the structure and the cell aggregate are linked, and a non-human chimeric animal transplanted with a construct in which a structure and a cell aggregate are connected.
  • Drug interaction evaluations include a construct in which a structure and a cell mass are linked, a tissue and an organ produced from a construct in which the structure and the cell mass are linked, and a non-human chimeric animal into which a construct in which a structure and cell mass are linked is transplanted. After administration of a plurality of drugs using the drug, it can be carried out by performing pharmacokinetics such as distribution, metabolism, and excretion process of each drug, toxicity evaluation, and efficacy evaluation.
  • the present invention also provides a composition for regenerative medicine, which comprises a construct in which a structure and a cell mass are linked.
  • composition of the present invention can be transplanted in vivo to produce a tissue or an organ.
  • composition of the present invention can be transplanted in vivo to regenerate or restore function of a tissue or an organ.
  • a construct in which a structure and a cell mass are linked can be differentiated into a tissue or organ having a vascular network.
  • Blood perfusion can occur in the vascular network.
  • the occurrence of blood perfusion in the vascular network is considered to make it possible to create a tissue / organ having a highly ordered tissue structure which is equivalent to or close to adult tissue.
  • the composition of the present invention includes FGF2, HGF, VEGF and other tissue angiogenesis promoting agents, gelatin sponge for hemostasis associated with transplantation (trade name: Sponsel, Astellas Co., Ltd.), and Borheal (Teijin Ltd.) used for fixation of transplanted tissue.
  • Pharma Co., Ltd. Beriplast (CSL Baling Co., Ltd.) Takocombu (CSL Baling Co., Ltd.), collagen, a tissue adhesive such as Matrigel, etc. may be added.
  • Example 1 Experimental method ⁇ Culturing method of human inducible pluripotent stem cells (iPSC) Cell culture dishes or cell culture plates are coated with iMatrix-511 (Nippi, 0.7 to 0.9 ⁇ g / cm 2 ) at 37 ° C for 1 hour, and washed with PBS did. Cryopreserved human iPSC (TkDA3 strain or 1231A3 strain, provided by the University of Tokyo, Kyoto University iPS cell research institute, respectively) was immersed in hot water at 37 ° C. for 2 minutes and thawed while shaking by hand.
  • iMatrix-511 Nappi, 0.7 to 0.9 ⁇ g / cm 2
  • the cell storage solution was suspended in a 9-fold volume of AK02 medium (Ajinomoto), and centrifuged at 150-200 ⁇ g for 5 minutes. The cell supernatant was removed, and the cells were suspended in a medium obtained by adding Y-27632 (WAKO, 10 uM) to AK02 medium, and seeded with human iPSC at a concentration of 0.36-1.8 ⁇ 10 3 cells / cm 2 . The medium was replaced with AK02 medium on the first day of culture, and the medium was replaced every other day thereafter.
  • AK02 medium Ajinomoto
  • human iPSCs cultured for 1 week in a cell culture dish with a diameter of 10 cm were washed with PBS, 2 ml of Accutase (Innovative Cell Technology) was added, and treated for 5 minutes to 10 minutes at 37 ° C. to detach cells.
  • 2 ml of AK02 medium After adding 2 ml of AK02 medium, the cells were transferred to a 15 ml tube and centrifuged at 150-200 ⁇ g for 5 minutes. The cell supernatant was removed, and the cells were suspended in a medium obtained by adding Y-27632 (10 uM) to AK02 medium, and human iPSCs were seeded at a concentration of 0.36-1.8 ⁇ 10 3 cells / cm 2 .
  • iPSCs Cell culture dishes or cell culture plates (Thermo Fisher Scientific) are coated with iMatrix-511 (Nippi, 0.4 to 0.6 ⁇ g / cm 2 ) at 37 ° C. for 1 hour, and PBS It was washed. Human iPSCs cultured for 1 week in a cell culture dish with a diameter of 10 cm were washed with PBS, 1 ml of Accutase was added, and treated at 37 ° C. for 5 to 10 minutes to detach the cells.
  • the cells After adding 1 ml of AK02 medium, the cells were transferred to a 15 ml tube and centrifuged at 150-200 ⁇ g for 5 minutes. The cell supernatant is removed, and penicillin / streptomycin (Gibco, 1%), B27 (Gibco, 2%), Wnt3a (R & D, 50 ng / ml), Activin A (100 ng / ml), RPMI medium (WAKO), Y The cells were suspended in a medium to which ⁇ 27632 (10 uM) was added, and seeded at a density of 8.4 ⁇ 10 4 cells / cm 2 in a laminin-coated dish.
  • MSC human mesenchymal stem cells
  • Lonza Mesenchymal Stem cells
  • 3-5 x 10 5 cells suspended in MSCGM medium (Lonza) are used as a cell culture dish (diameter 10 cm) Sowed. The medium was replaced once every three days.
  • the cells were washed with PBS, 2 ml of Trypsin / EDTA (Gibco) was added, and the cells were treated at 37 ° C. for 5 minutes to carry out cell detachment. 2 ml of MSCGM medium was added, the cells were transferred to a 15 ml tube and centrifuged at 150-200 ⁇ g for 5 min.
  • HCM EGF-free
  • FBS Gold MP Biomedicals
  • HGF 10 ng / ml HGF 10 ng / ml
  • Oncostatin M R & D
  • HCM / EGM mixed medium HCM / EGM mixed medium
  • liver bud-large blood vessel / artificial blood vessel / bile duct / intestinal tract Twenty-four hours after preparation of liver bud, small liver bud was recovered from micropatterned well plate Elplasia RB 500 400 NA (Kuraray).
  • Thermo Fisher Scientific 12-well cell culture insert (Thermo Fisher Scientific) or 6-well cell culture insert (Thermo Fisher Scientific) on large blood vessels (mouse aorta, rat femoral artery, rat femoral vein, human umbilical artery), porcine bile duct, mouse fetal intestinal tract, Alternatively, an artificial blood vessel (Triplex, Terumo; PTFE porous tube, Chuko Kasei Kogyo Co., Ltd.) was placed, and the collected liver buds were arranged in proximity to each other. Alternatively, it is also possible to fuse small liver sprouts and then fuse them with large blood vessels / bile ducts / intestines or artificial blood vessels.
  • the samples were photographed using a fluorescence microscope BZ-X710 (Keyence), a confocal microscope SP5 or SP8. Liver sprouts fused to artificial blood vessels were collected 9 days after fusion and subjected to quantitative RT-PCR for functional evaluation. ⁇ Functional evaluation of large blood vessel-bearing liver sprouts using quantitative RT-PCR 10 days after culture of small liver sprouts prepared with Elplasia RB 500 400 NA (Kuraray) and fused liver sprouts cultured on Cell culture insert (Corning) The eyes were collected, and RNA was purified using PureLink RNA mini kit (Thermo Fisher Scientific).
  • cDNA synthesis was performed using iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad), and amplification and detection of the gene were performed using THUNDERBIRD Probe qPCR Mix (Takara) and LightCycler® 480 (Roche Life Science). Correction of gene expression, Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control (VIC TM / MGB probe, primer limited) was used. Primer information of other genes is shown below.
  • forward primer aatgttgccaagctgctga (SEQ ID NO: 1); reverse primer: cttcccttcatcccgaagtt (SEQ ID NO: 2), hAFP, probe # 61, forward primer: TCCTTGTAAGTGCTTCTTGATAC (SEQ ID NO: 3); , HCD31, probe # 46, forward primer: cattgttccccgtttcca (SEQ ID NO: 5); reverse primer: cagagagaccggctgtgg (SEQ ID NO: 6).
  • Immunodeficient rats (F344 / NJcl-rnu / rnu) were purchased from CLEA Japan, Inc. Another rat's femoral artery was collected and a large blood vessel-fed liver bud was prepared. Immunodeficient rats were transplanted by anastomosis of large blood vessel-appended liver sprouts to the femoral artery under isoflurane inhalation anesthesia. The blood was collected from the rat carotid artery every week after transplantation, and the concentration of human albumin in the blood was measured. Three weeks after transplantation, the grafts were collected and subjected to tissue analysis.
  • Paraffin Section Preparation Method The collected tissues were fixed for 16 hours in 4% paraformaldehyde / phosphate buffer (PBS). The fixed tissue is washed three times with PBS, and then dewatered by immersion in 70% ethanol, 95% ethanol and 100% ethanol (twice) while shaking each for 30 minutes or more. Then, it was immersed in a 50% ethanol / xylene solution, a 100% xylene solution, and a 100% paraffin solution (twice) while shaking each at 30 ° C. for 30 minutes or more, and then embedded in paraffin. The embedded tissue samples were sliced with a microtome to a thickness of 7-10 ⁇ m.
  • PBS paraformaldehyde / phosphate buffer
  • Hematoxylin and Eosin staining Paraffin sections are deparaffinized and hydrophilized through steps of xylene, 100% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol, and milli Q water. After washing with running water, stain with hematoxylin solution for 3 to 5 minutes, wash with running water, and then stain with eosin solution for 2 to 5 minutes. After washing with running water, dehydration with alcohol was conducted, and after clearing with xylene, the sample was covered with a non-aqueous sealant and covered and covered with a cover glass. Immunohistochemical analysis Paraffin sections are deparaffinized and hydrophilized through steps of xylene, 100% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol, and milliQ water.
  • FIGS. Fusion of human iPSC hepatoblasts and mouse large blood vessels Mouse large blood vessels were prepared from 8-week-old mice. Human iPSC liver buds (hereinafter, hiPSC liver buds) were attached to mouse large blood vessels and observed over time (FIG. 1A). As a result, even after 15 days of fusion, it was observed that hiPSC hepatoblasts were fused around the mouse large blood vessels (FIG. 1A to D).
  • FIGS. 1B and 1G After 15 days of fusion, formation of hiPSC liver sprout-derived vascular network structure was observed (FIGS. 1B and 1G). Macrovessel-bearing hiPSC hepatoblasts showed expression of hepatic differentiation markers such as HNF4A (FIG. 1E) and AFP (FIG. 1F), and human CD31-positive blood vessel formation was also recognized (FIG. 1G).
  • HNF4A FIG. 1E
  • AFP FIG. 1F
  • Human iPSC liver bud can be fused with human umbilical artery, rat femoral artery, rat femoral vein, pig bile duct, mouse fetal intestine, and vascular network is formed in hepatoblast It was shown that ( Figure 2A-E). Histological analysis of rat femoral vein-attached liver buds showed that the cells in the liver buds were of human origin and that the vascular network in the liver buds formed a tubular structure (FIG. 2F) .
  • the present invention can be used for human biology, regenerative medicine, drug evaluation and the like.

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Abstract

複数の組織同士の「組織間相互作用」の人為的誘導・制御系を提供する。構造体と細胞塊を連結した構築物であって、前記構造体は立体構造を有する物体であって、生体の構造及び／又は機能を模倣もしくは類似しうるものである、生体に移植するための前記構築物。

Description

構造体と細胞塊を連結した構築物
　本発明は、構造体と細胞塊を連結した構築物に関する。
　ヒューマン・バイオロジー、再生医療、薬剤評価などの諸分野において、ヒト臓器に類似した３次元構造と生体機能を有するオルガノイド（臓器類似体）の人為的創出技術が求められている。
　オルガノイドの創出は、胚性幹細胞（ES細胞）を材料とした胚様体（Embryoid  body）の作製に代表されるような、未分化細胞の３次元培養による自律的な多系列細胞分化に基づく組織構造体の創出が古典的に行われてきた[非特許文献１：Eiraku M et al., Nature, 2011]。この手法により初期胚の再構成は実現化できたものの、任意の臓器形成などを人為的・計画的に再現性を担保して実施することは困難であった。その後、任意の臓器形成の実現化を目指し、未分化細胞や変異導入細胞を用いて生体内の上皮構造に類似したオルガノイドを作製すること[非特許文献２：Sato T et al., Nature, 2009]、上皮と間質を共に有するオルガノイドを作製すること[非特許文献３：Spence JR et al., Nature, 2011]、内部に血管網を有するオルガノイドを作製することなどが行われており[非特許文献４：Takebe T et al., Nature, 2013; 非特許文献５：Takebe T et al., Cell Stem Cell, 2015、特許文献１：WO2013/047639]、細胞間相互作用を活用した自己組織化の誘導・制御法が確立しつつある。
　一方、このような細胞間相互作用を活用した自己組織化の誘導・制御の限界も明らかになりつつある。すなわち、上皮シート構造や毛細血管網などの微細な組織構造を人為的に再構成することは可能ではあるものの、例えば上皮シートと構造的に連結する複雑な導管構造や、毛細血管網に連結する太い細小動静脈以上の大血管系などの再構成には成功していない。
Eiraku M et al., Nature 472, pp51-56, 2011 Sato T et al., Nature 459, pp262-265, 2009 Spence JR et al., Nature 470, pp105-109, 2011 Takebe T et al., Nature 499, pp481-484, 2013 Takebe T et al., Cell Stem Cell 16, pp556-565, 2015
WO2013/047639
　上皮シートと構造的に連結する複雑な導管構造や、毛細血管網に連結する太い細小動静脈以上の大血管系などの再構成を達成するためには、細胞間相互作用だけではなく、複数の組織同士の「組織間相互作用」の人為的誘導・制御系の開発が極めて重要である。
　本発明は、複数の組織同士の「組織間相互作用」の人為的誘導・制御系を提供することを目的とする。
　生体移植において、移植片が血管と吻合するためには血管化オルガノイド内の血管のリモデリングが必要であり、移植から血液灌流が起こるまで数日の時間を要する。本発明者らは、移植後さらに早い段階での移植組織への血液灌流を実現するために、オルガノイドと大血管・人工血管を含めた血管系構造体との融合体をin vitroで創出することに成功し、本発明を完成させるに至った。
　本発明の要旨は以下の通りである。
（１）構造体と細胞塊を連結した構築物であって、前記構造体は立体構造を有する物体であって、生体の構造及び／又は機能を模倣もしくは類似しうるものである、生体に移植するための前記構築物。
（２）構造体が管腔構造、非管腔構造又はそれらの組み合わせを有する（１）記載の構築物。
（３）構造体が、血管、胆管、食道、膵管、気管、気管支、細気管支、尿管、卵管、精管、汗腺、ワルトン管、ステノン管、涙腺、心臓、神経、大脳、中脳、小脳、視床、視床下部、脳下垂体、橋、延髄、眼、舌、歯、皮膚、咽頭、喉頭、胸腺、声帯、胃、十二指腸、小腸、大腸、直腸、肛門、肺、横隔膜、肝臓、胆嚢、膵臓、腎臓、副腎、甲状腺、副甲状腺、脾臓、膀胱、精巣、卵巣、子宮、骨、軟骨、腱、毛包、漿膜、大網、粘膜組織、筋組織及び靭帯からなる群より選択される少なくとも１つである（２）記載の構築物。
（４）構造体が生体に由来する（３）記載の構築物。
（５）構造体が人工物である（３）記載の構築物。
（６）構造体が、シート状構造体、チューブ状構造体及び糸状構造体からなる群より選択される少なくとも１つである（２）記載の構築物。
（７）細胞塊が１種類又は２種類以上の細胞を含む（１）～（６）のいずれかに記載の構築物。
（８）細胞塊が、器官芽、スフェロイド、セルアグリゲート及びセルスフェアからなる群より選択される少なくとも１つである（１）～（７）のいずれかに記載の構築物。
（９）構造体と細胞塊の組み合わせが、血管と器官芽、胆管と器官芽、食道と器官芽、膵管と器官芽、気管と器官芽、気管支と器官芽、細気管支と器官芽、尿管と器官芽、卵管と器官芽、精管と器官芽、汗腺と器官芽、ワルトン管と器官芽、ステノン管と器官芽、涙腺と器官芽、心臓と器官芽、神経と器官芽、大脳と器官芽、中脳と器官芽、小脳と器官芽、視床と器官芽、視床下部と器官芽、脳下垂体と器官芽、橋と器官芽、延髄と器官芽、眼と器官芽、舌と器官芽、歯と器官芽、皮膚と器官芽、咽頭と器官芽、喉頭と器官芽、胸腺と器官芽、声帯と器官芽、胃と器官芽、十二指腸と器官芽、小腸と器官芽、大腸と器官芽、直腸と器官芽、肛門と器官芽、肺と器官芽、横隔膜と器官芽、肝臓と器官芽、胆嚢と器官芽、膵臓と器官芽、腎臓と器官芽、副腎と器官芽、甲状腺と器官芽、副甲状腺と器官芽、脾臓と器官芽、膀胱と器官芽、精巣と器官芽、卵巣と器官芽、子宮と器官芽、骨と器官芽、軟骨と器官芽、腱と器官芽、毛包と器官芽、漿膜と器官芽、大網と器官芽、粘膜組織と器官芽、筋組織と器官芽及び靭帯と器官芽からなる群より選択される少なくとも１つの組み合わせである（１）～（８）のいずれかに記載の構築物。
（１０）器官芽が、肝芽、肺オルガノイド、気道上皮オルガノイド、腸オルガノイド、膵臓オルガノイド、腎臓オルガノイド、脳オルガノイド、気道オルガノイド、胃オルガノイド、甲状腺オルガノイド、胸腺オルガノイド、精巣オルガノイド、食道オルガノイド、皮膚オルガノイド、神経オルガノイド、卵管オルガノイド、卵巣オルガノイド、唾液腺オルガノイド、眼胞オルガノイド、眼杯オルガノイド、膀胱オルガノイド、前立腺オルガノイド、軟骨オルガノイド、心臓オルガノイド、骨組織オルガノイド、筋組織オルガノイド及びがんオルガノイドからなる群より選択される少なくとも１つである（９）記載の構築物。
（１１）（１）～（１０）のいずれかに記載の構築物を非ヒト動物に移植することを含む、組織又は臓器の作製方法。
（１２）（１）～（１０）のいずれかに記載の構築物をヒト又は非ヒト動物に移植することを含む、組織又は臓器の再生又は機能回復方法。
（１３）（１）～（１０）のいずれかに記載の構築物を非ヒト動物に移植することを含む、非ヒトキメラ動物の作製方法。
（１４）（１）～（１０）のいずれかに記載の構築物、（１１）記載の方法で作製された組織及び臓器、並びに（１３）記載の方法で作製された非ヒトキメラ動物からなる群より選択される少なくとも１つを用いて、薬剤を評価する方法。
（１５）（１）～（１０）のいずれかに記載の構築物を含む、再生医療用組成物。
（１６）組織又は臓器を作製するために用いられる（１５）記載の組成物。
（１７）組織及び／又は臓器の再生及び／又は機能回復を行うために用いられる（１５）記載の組成物。
　本発明は、複数のオルガノイド間の「組織間相互作用」の新たな人為的制御系の提供、並びにその人為的制御系により作製される臓器類似体や臓器を提供するものである。さらに、複数オルガノイドと大血管などの異種構造体との「組織間相互作用」の人為的制御系を提供、並びにその人為的制御系により作製される臓器類似体や臓器を提供するものである。また、本発明は単純な生体組織間の相互作用制御系の提供にとどまらず、人工血管などの高分子構造体に代表されるような化学物質や金属等により作製された人工物との相互作用の制御系の提供、ならびにその人為的制御系により作製される臓器類似体や臓器を含むものである。
　複数のオルガノイド間の「組織間相互作用」の新たな人為的制御系の提供については、Cyfuse社特許[WO2008/123614、WO2014/141528、WO2014/148647]や既報論文[Birey F et al., Nature 545, pp54-59, 2017：脳外套オルガノイドと脳外套下部オルガノイドの融合による脳作製]とは全く異なる手法であり、進歩性を有している。構造体ならびに人工物との「相互作用」の人為的制御系の提供、その人為的制御系により作製される臓器類似体や臓器については明らかに新規性を有するものである。本発明は、ヒト臓器に類似した３次元構造と生体機能を有するオルガノイド（臓器類似体）の人為的創出技術を革新的に発展させる重要技術である。
　本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2017-208853の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明により、複数のオルガノイド間の「組織間相互作用」の新たな人為的制御系と複数オルガノイドと大血管などの構造体との「組織間相互作用」の人為的制御系が提供された。
hiPSC肝芽とマウス大血管の融合。 hiPSC肝芽への血管/胆管付与技術。 hiPSC肝芽と人工血管の融合。 大血管融合肝芽のin vivo機能解析。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、構造体と細胞塊を連結した構築物であって、前記構造体は立体構造を有する物体であって、生体の構造及び／又は機能を模倣もしくは類似しうるものである、生体に移植するための前記構築物を提供する。
　本発明において、構造体は、立体構造を有する物体であって、生体の構造及び／又は機能を模倣もしくは類似しうる。構造体は、生体の組織及び／又は臓器の全部又は一部の構造及び／又は機能をin vitroの段階で模倣もしくは類似しているものであってもよいし、in vitroの段階で模倣もしくは類似していなくても、生体に移植した後に（in vivoの段階で）模倣もしくは類似するものであってもよい。
　構造体は、細胞塊と由来を同じくするものでもよいし（同種）、細胞塊と由来を異にするものであってもよい（異種）。
　構造体としては、細胞塊と由来が同じあるいは異なる生物に由来する生体組織や臓器、人工組織や臓器などを例示することができ、構造体は、管腔構造、非管腔構造又はそれらの組み合わせを有するものであるとよく、生体に由来するものであっても、人工物であってもよい。具体的には、血管、胆管、食道、膵管、気管、気管支、細気管支、尿管、卵管、精管、汗腺、ワルトン管、ステノン管、涙腺、心臓、神経、大脳、中脳、小脳、視床、視床下部、脳下垂体、橋、延髄、眼、舌、歯、皮膚、咽頭、喉頭、胸腺、声帯、胃、十二指腸、小腸、大腸、直腸、肛門、肺、横隔膜、肝臓、胆嚢、膵臓、腎臓、副腎、甲状腺、副甲状腺、脾臓、膀胱、精巣、卵巣、子宮、骨、軟骨、腱、毛包、漿膜、大網、粘膜組織、筋組織及び靭帯などの生体組織や臓器、人工血管、人工気管、細胞シートなどの人工組織や臓器などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。構造体は、シート状構造体、チューブ状構造体、糸状構造体などの形状をとりうる。構造体が人工物である場合、生体適合性の材料で形成されているとよい。生体適合性の材料としては、金属（例えば、ステンレス鋼、コバルト合金、チタン合金など）、ガラス、セラミック、合成高分子（例えば、ナイロン、ポリプロピレン、ポリジオキサノン、ポリ乳酸、ポリエチレンテレフタレート、テフロン（登録商標）など）、生体由来材料（例えば、絹、コラーゲン、脱細胞組織）などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。また、構造体は、生体の構造及び／又は機能を模倣もしくは類似しうるものであれば、器官芽、スフェロイド、セルアグリゲート、セルスフェアなどの細胞集合体（細胞塊）や細胞集合体同士が融合したものであってもよい。
　構造体が模倣もしくは類似しうる生体の構造及び／又は機能は、特に限定されるものではなく、生体に存在する構造や生体の中で起こるいかなる機能であってもよく、生体組織や臓器の全部又は一部の構造、細胞の働きや細胞同士の相互作用、また、細胞が構成されてできた組織や臓器の働きや組織・臓器間の相互作用などを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。また、生体組織や臓器の欠損部の補填や生体組織や臓器の損傷部の補強なども生体機能の概念に含まれるものとする。生体の構造及び／又は機能を模倣もしくは類似する程度は、大きくても、小さくてもよく、その程度の大きさは問わない。
　細胞塊は、器官芽（オルガノイド）、スフェロイド、セルアグリゲート、セルスフェアなど、いかなる細胞の集合体であってもよく、１種類の細胞を含むものであっても、２種類以上の細胞を含むものであってもよい。また、細胞集合体同士が融合したものであってもよい。「器官芽」とは、成熟することで器官に分化することができる構造体であって、その一例として、WO2013/047639では、臓器細胞、血管細胞（好ましくは、血管内皮細胞）、及び未分化間葉系細胞若しくはそれから分化した細胞の三種類の細胞から器官芽を作製する方法が開示されており、本発明では、この方法で作製した器官芽を好適に用いることができる。「臓器細胞」とは、臓器を構成する機能細胞、又は機能細胞へと分化する未分化細胞をいう。「未分化な臓器細胞」としては、例えば、腎臓、心臓、肺臓、脾臓、食道、胃、甲状腺、副甲状腺、胸腺、生殖腺、脳、脊髄などの器官に分化可能な細胞などであってもよく、脳、脊髄、副腎髄質、表皮、毛髪・爪・皮膚腺、感覚器、末梢神経、水晶体などの外胚葉性器官に分化可能な細胞、腎臓、尿管、心臓、血液、生殖腺、副腎皮質、筋肉、骨格、真皮、結合組織、中皮などの中胚葉性器官に分化可能な細胞、肝臓、膵臓、腸管、肺、甲状腺、副甲状腺、尿路などの内胚葉性器官に分化可能な細胞などを挙げることができる。当業者間で使用されている用語のうち、hepatoblast、hepatic progenitor cells、pancreatoblast、hepatic precursor cells、pancreatoblast、 pancreatic progenitors、pancreatic progenitor cells、pancreatic precursor cells、endocrine precursors、intestinal progenitor cells、intestinal precursor cells、intermediate mesoderm、metanephric mesenchymal precursor cells、multipotent nephron progenitor、renal progenitor cell、cardiac mesoderm、cardiovascular progenitor cells、cardiac progenitor cells、（JR. Spence, et al. Nature.;470(7332):105-9.(2011)、Self, et al. EMBO J.; 25(21): 5214-5228.(2006)、J. Zhang, et al. Circulation Research.; 104: e30-e41(2009)、G. Lee, et al. Nature Biotechnology 25, 1468 - 1475 (2007)）などは、未分化な臓器細胞に含まれる。未分化な臓器細胞は、人工多能性幹細胞（iPS細胞）、胚性幹細胞（ES細胞）などの多能性幹細胞から公知の方法に従って作製することができる。血管細胞は、血管を構成する細胞又はそのような細胞に分化できる細胞であり、分化したものであっても、未分化なものであってもよい。血管細胞は、臍帯静脈などの血管組織から分離することができるが、血管組織から分離された細胞に限定されることはなく、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの全能性あるいは多能性を有する細胞から分化誘導されたものであってもよい。血管細胞としては、血管内皮細胞が好ましい。「血管内皮細胞」とは、血管内皮を構成する細胞、又はそのような細胞に分化することのできる細胞をいう。血管内皮細胞は、分化したものであっても、未分化なものであってもよい。当業者間で使用されている用語のうち、endothelial cells、umbilical vein endothelial cells、endothelial progenitor cells、endothelial precursor cells、vasculogenic progenitors、hemangioblast（HJ. joo, et al. Blood. 25;118(8):2094-104.(2011)）などは血管内皮細胞に含まれる。「間葉系細胞」とは、主として中胚葉に由来する結合織に存在し、組織で機能する細胞の支持構造を形成する結合織細胞であるが、間葉系細胞への分化運命が決定しているが、まだ間葉系細胞へ分化していない細胞も含む概念である。間葉系細胞は、分化したものであっても、未分化なものであってもよい。当業者間で使用されている用語のうち、mesenchymal stem cells、mesenchymal progenitor cells、mesenchymal cells（R. Peters, et al. PLoS One. 30;5(12):e15689.(2010)）などは間葉系細胞に含まれる。間葉系細胞は、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの全能性あるいは多能性を有する細胞から分化誘導したものであってもよいし、骨髄、脂肪等の体細胞由来の細胞であってもよい。後述の実施例では、iPS細胞から分化誘導した肝前駆細胞、間葉系幹細胞及び臍帯静脈由来血管内皮細胞から作製した肝芽を用いた。
　構造体と細胞塊の組み合わせとしては、血管と器官芽、胆管と器官芽、食道と器官芽、膵管と器官芽、気管と器官芽、気管支と器官芽、細気管支と器官芽、尿管と器官芽、卵管と器官芽、精管と器官芽、汗腺と器官芽、ワルトン管と器官芽、ステノン管と器官芽、涙腺と器官芽、心臓と器官芽、神経と器官芽、大脳と器官芽、中脳と器官芽、小脳と器官芽、視床と器官芽、視床下部と器官芽、脳下垂体と器官芽、橋と器官芽、延髄と器官芽、眼と器官芽、舌と器官芽、歯と器官芽、皮膚と器官芽、咽頭と器官芽、喉頭と器官芽、胸腺と器官芽、声帯と器官芽、胃と器官芽、十二指腸と器官芽、小腸と器官芽、大腸と器官芽、直腸と器官芽、肛門と器官芽、肺と器官芽、横隔膜と器官芽、肝臓と器官芽、胆嚢と器官芽、膵臓と器官芽、腎臓と器官芽、副腎と器官芽、甲状腺と器官芽、副甲状腺と器官芽、脾臓と器官芽、膀胱と器官芽、精巣と器官芽、卵巣と器官芽、子宮と器官芽、骨と器官芽、軟骨と器官芽、腱と器官芽、毛包と器官芽、漿膜と器官芽、大網と器官芽、粘膜組織と器官芽、筋組織と器官芽及び靭帯と器官芽などの組み合わせを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
　器官芽としては、肝芽、肺オルガノイド、気道上皮オルガノイド、腸オルガノイド、膵臓オルガノイド、腎臓オルガノイド、脳オルガノイド、気道オルガノイド、胃オルガノイド、甲状腺オルガノイド、胸腺オルガノイド、精巣オルガノイド、食道オルガノイド、皮膚オルガノイド、神経オルガノイド、卵管オルガノイド、卵巣オルガノイド、唾液腺オルガノイド、眼胞オルガノイド、眼杯オルガノイド、膀胱オルガノイド、前立腺オルガノイド、軟骨オルガノイド、心臓オルガノイド、骨組織オルガノイド、筋組織オルガノイド、がんオルガノイドなどを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
　本発明において、細胞塊と構造体は、集合、凝集、融合、吻合などのいかなる様式で連結されてもよく、構造体と細胞塊の連結は生体の構造及び／又は機能を模倣もしくは類似するための結合であればよい。
　構造体に連結した細胞塊は機能を発揮しているとよい。さらに、構造体と細胞塊が連結することで、細胞塊間の相互作用及び細胞塊と構造体との相互作用が高まり、細胞塊の機能が向上しうる。例えば、細胞塊が連結した構造体において、細胞塊は血管網を伴って構造体と融合することにより、細胞塊と構造体との相互作用が高まり、構造体に連結した細胞塊の機能が高まることが期待される。
　構造体と細胞塊を連結させるには、いかなる方法を用いてもよく、例えば、構造体上で細胞塊同士を近接させて配置し、培養することで連結することができる。構造体は、細胞接着表面を有することが好ましい。あるいはまた、細胞塊同士を融合させた後に構造体と連結させてもよい。培養期間は、１～３０日であるとよく、１～１０日が好ましい。構造体と細胞塊を連結させた後、適当な期間（例えば、１～３０日、好ましくは、５～１４日）培養することで構築物（構造体と細胞塊の連結体）を成熟させることができる。培養は、回分培養、半回分培養（流加培養）、連続培養（灌流培養）のいずれの方法でもよいが、灌流培養が好ましい。また、静置培養、通気培養、攪拌培養、振盪培養、回転培養のいずれであってもよい。
　細胞塊が連結した構造体をヒト又は非ヒト動物に移植することにより、例えば、移植された組織や臓器に血管網が構築され、血液灌流が開始し、高度に秩序だった組織構造を有する組織や臓器が創出されうる。移植の対象となる動物は、ヒトの他、実験動物、愛玩動物、使役動物、競走馬、闘犬などに利用される動物、具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ニワトリ、サメ、エイ、ギンザメ、サケ、エビ、カニなどの非ヒト動物を挙げることができる。また、非ヒト動物は、免疫拒絶反応を回避するために、免疫不全動物であるとよい。細胞塊が連結した構造体の移植部位は、移植可能であればどの部位であってもよいが、血管、頭蓋内、腸間膜、肝臓、脾臓、腎臓、腎被膜下、門脈上などを例示することができる。細胞塊が連結した構造体を生体（ヒト、非ヒト動物など）に移植することにより、機能が喪失あるいは低下した組織や臓器を再生させることができ、また、非ヒト動物中でヒト組織や臓器を作製させれば、創薬スクリーニングに利用することができる。
　あるいはまた、構造体と細胞塊を連結した構築物をin vitroで培養して、機能をさらに向上させ、これを臓器類似体あるいは臓器として、ヒューマン・バイオロジー、再生医療、創薬スクリーニングなどに利用してもよい。
　本発明は、構造体と細胞塊を連結した構築物を非ヒト動物に移植することを含む、組織又は臓器の作製方法を提供する。
　また、本発明は、構造体と細胞塊を連結した構築物をヒト又は非ヒト動物に移植することを含む、組織又は臓器の再生又は機能回復方法を提供する。
　構造体と細胞塊を連結した構築物を非ヒト動物に移植し、生着させることにより、非ヒトキメラ動物を作製することができる。よって、本発明は、構造体と細胞塊を連結した構築物を非ヒト動物に移植することを含む、非ヒトキメラ動物の作製方法を提供する。構造体と細胞塊を連結した構築物を移植した非ヒト動物（例えば、マウス）は、細胞塊の由来生物種（例えば、ヒト）の生理機能を模倣しうる。
　さらに、本発明は、構造体と細胞塊を連結した構築物、構造体と細胞塊を連結した構築物から作製された組織及び臓器、並びに構造体と細胞塊を連結した構築物を移植した非ヒトキメラ動物からなる群より選択される少なくとも１つを用いて、薬剤を評価する方法を提供する。薬剤の評価としては、例えば、薬物代謝の評価（例えば、薬物代謝プロファイルの予測）、薬効評価（例えば、医薬品として有効な薬剤をスクリーニングすることなど）、毒性評価、薬物相互作用評価などを挙げることができる。
　薬物代謝の評価は、ヒト由来の細胞から作製された細胞塊を対象として、構造体と細胞塊を連結した構築物、構造体と細胞塊を連結した構築物から作製された組織及び臓器、並びに構造体と細胞塊を連結した構築物を移植した非ヒトキメラ動物において、医薬品の候補化合物を投与したのちの生物試料を採取・解析することにより、ヒト型の薬物代謝プロファイルを取得することができる。これにより従来の技術では達成が極めて難しかったヒトでの医薬品の分布・代謝・排泄過程を予測することが可能となり、安全で効果のある医薬品の開発を飛躍的に加速できるものと期待される。
　医薬品として有効な薬剤のスクリーニングは、ヒト由来の細胞から作製された細胞塊を対象として、構造体と細胞塊を連結した構築物、構造体と細胞塊を連結した構築物から作製された組織及び臓器、並びに構造体と細胞塊を連結した構築物を移植した非ヒトキメラ動物を用いて、新規の医薬品候補化合物を投与することにより解析することが可能となる。これにより、従来のｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験では不十分であった、実際ヒトに投与した際の薬効の予測精度を大幅に改善できる可能性が期待される。
　毒性評価は、構造体と細胞塊を連結した構築物、構造体と細胞塊を連結した構築物から作製された組織及び臓器、並びに構造体と細胞塊を連結した構築物を移植した非ヒトキメラ動物を用いて、被験物質を投与したのちに、組織障害マーカーなどを測定することにより、障害予測の精度向上が可能となる。
　薬物相互作用評価は、構造体と細胞塊を連結した構築物、構造体と細胞塊を連結した構築物から作製された組織及び臓器、並びに構造体と細胞塊を連結した構築物を移植した非ヒトキメラ動物を用いて、複数の薬剤を投与したのちに、その後の各薬剤の分布・代謝・排泄過程などの薬物動態や毒性評価、薬効評価を行うことにより行うことができる。
　また、本発明は、構造体と細胞塊を連結した構築物を含む、再生医療用組成物を提供する。
　本発明の組成物を生体内に移植し、組織又は臓器を作製することができる。また、本発明の組成物を生体内に移植し、組織又は臓器の再生又は機能回復を行うことができる。
　本発明の組成物が生体に移植された後、構造体と細胞塊を連結した構築物は血管網を有する組織又は臓器に分化しうる。その血管網には血液灌流が生じうる。血管網に血液灌流が生じることにより、成体組織と同等若しくはそれに近い高度に秩序だった組織構造を有する組織・臓器を創出することが可能となると考えられる。
　本発明の組成物には、ＦＧＦ２、ＨＧＦ、ＶＥＧＦなどの組織血管化促進剤、移植に伴う止血用ゼラチンスポンジ（商品名：スポンゼル、アステラス株式会社）、および、移植組織の固定に用いるボルヒール（帝人ファーマ株式会社）・ベリプラスト（ＣＳＬベーリング株式会社）・タココンブ（ＣＳＬベーリング株式会社）、コラーゲン、マトリゲルなどの組織接着剤などを添加してもよい。
　以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
〔実施例１〕
実験方法
・ヒト誘導性多能性幹細胞(iPSC)の培養法
　細胞培養ディッシュあるいは細胞培養プレートをiMatrix-511 (Nippi, 0.7～0.9 μg/cm2)で37℃、１時間コーティングし、PBSで洗浄した。凍結保存ヒトiPSC（TkDA3株又は1231A3株,それぞれ東京大学、京都大学iPS細胞研究所より提供）を37℃のお湯に２分間浸漬し、手で振盪しながら融解させた。細胞保存液の９倍量のAK02培地 (Ajinomoto)に細胞保存液を懸濁し、150-200 x g, 5分間の遠心操作を行った。細胞上清を除き、AK02培地にY-27632 (WAKO, 10 uM)を加えた培地に細胞を懸濁し、0.36～1.8 x 103 cells/cm2の濃度でヒトiPSCを播種した。培養１日目にAK02培地に交換し、以降１日おきに培地交換を行った。継代に関しては、直径１０cmの細胞培養ディッシュで一週間培養したヒトiPSCをPBSで洗浄した後、Accutase (Innovative Cell Technology) 2 mlを加え37℃で5分から１０分間処理し、細胞を剥離した。AK02培地2 mlを加えて、15 mlのチューブに細胞を移し、150-200 x g, 5 minの遠心操作を行った。細胞上清を除き、AK02培地にY-27632 (10 uM)を加えた培地に細胞を懸濁し、0.36～1.8 x 103 cells/cm2の濃度でヒトiPSCを播種した。

・iPSCからの肝前駆細胞への分化誘導法
　細胞培養ディッシュあるいは細胞培養プレート（Thermo Fisher Scientific）をiMatrix-511 (Nippi, 0.4～0.6 μg/cm2)で37℃、１時間コーティングし、PBSで洗浄した。直径１０cmの細胞培養ディッシュで一週間培養したヒトiPSCをPBS洗浄後にAccutase 1 mlを加え37℃で5分から１０分間処理し、細胞を剥離した。1 mlのAK02培地を加えて、15 mlのチューブに細胞を移し、150-200 x g, 5分の遠心操作を行った。細胞上清を除き、RPMI培地 (WAKO)にペニシリン/ストレプトマイシン（Gibco, 1%）、B27 (Gibco, 2%)、Wnt3a (R&D, 50 ng/ml)、Activin A (100 ng/ml)、Y-27632 (10 uM)を加えた培地に細胞を懸濁し、ラミニンコートしたディッシュに8.4 x 104 cells/cm2の密度で播種した。培養１日目と３日目に、RPMI培地にペニシリン/ストレプトマイシン（1%）、B27 (2%)、Wnt3a (50 ng/ml)、Activin A (100 ng/ml)、Sodium Butyrate (0.5 mM)を加えた培地に交換した。培養４日目にRPMI培地にペニシリン/ストレプトマイシン（1%）、B27 (2%)、Wnt3a (50 ng/ml)、Activin A (100 ng/ml) を加えた培地に交換した。培養６日目の細胞を、内胚葉細胞Definitive Endoderm (DE)とした。培養６日目と培養８日目に、RPMI培地にペニシリン/ストレプトマイシン（1%）B27 (2%)、basic FGF (10 ng/ml)を加えた培地に交換した。培養１０日目の細胞を、肝前駆体細胞Hepatic Endoderm (HE)とした。

・ヒト間葉系幹細胞(MSC)の培養法
　MSCGM培地（Lonza）に懸濁したMesenchymal Stem cells (以下MSCと記載, Lonza, 3-5 x 105 cells)を、細胞培養ディッシュ (直径10ｃｍ)に播種した。3日に１回培地交換を行った。７日後にPBSで洗浄後、2 mlのTrypsin/EDTA (Gibco)を加え37℃で5分処理し、細胞剥離を行った。MSCGM培地を2 ml加えて、15 mlのチューブに細胞を移し、150-200 x g, 5 minの遠心操作を行った。細胞上清を除き、HCM (EGF不含)培地 (Lonza)にFBS Gold (MP Biomedicals) 5%、HGF 10 ng/ml、Oncostatin M (R&D) 20 ng/ml、Dexamethazon 100 nMを添加した培地とEGM培地を１：１の割合で混合した培地(HCM/EGM混合培地)に細胞を懸濁し、肝芽の作製に供した。

・ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（HUVEC）の培養法
　EGM培地(Lonza)又はEGM-2培地(Lonza)に懸濁したKusabira Orange標識Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECと記載, Lonza, 3-5 x 105 cells)を、細胞培養ディッシュ (直径10ｃｍ)に播種した。3日に１回培地交換を行った。７日後にPBSで洗浄後、2 mlのTrypsin/EDTA (Gibco)を加え37℃で5分処理し、細胞剥離を行った。EGM培地又はEGM-2培地を2 ml加えて、15 mlのチューブに細胞を移し、150-200 x g, 5分の遠心操作を行った。細胞上清を除き、HCM/EGM混合培地に細胞を懸濁し、肝芽の作製に供した。

・肝芽作製法
　iPSC肝芽の作製に関しては、マイクロパターンウェルプレートElplasia RB 500 400 NA (クラレ)24ウェルプレート１ウェル当たりヒトiPSC由来DE又はヒトiPSC由来DE又はHE 2.3 x 105 cellsとHUVEC 1.6 x 105 cellsとMSC 1.6 x 105 cellsをHCM/EGM混合培地に懸濁し播種した。

・肝芽-大血管/人工血管/胆管/腸管の融合体創出法
　肝芽作製24時間後、マイクロパターンウェルプレートElplasia RB 500 400 NA (クラレ)より小型肝芽を回収した。12ウェルセルカルチャーインサート（Thermo Fisher Scientific）または6ウェルセルカルチャーインサート（Thermo Fisher Scientific）上に、大血管（マウス大動脈、ラット大腿動脈、ラット大腿静脈、ヒト臍帯動脈）、ブタ胆管、マウス胎仔腸管、または人工血管（Triplex, テルモ; PTFE多孔質チューブ, 中興化成工業）を設置し、回収した肝芽同士を近接させて配置した。あるいは、小型肝芽を融合させた後に大血管/胆管/腸管や人工血管と融合することも可能である。試料は蛍光顕微鏡BZ-X710（Keyence）、共焦点顕微鏡SP5又はSP8を用いて写真撮影を行った。人工血管に融合した肝芽は、融合後９日目に回収し、定量的RT-PCRに供して機能評価を行った。

・定量的RT-PCRを用いた大血管付与肝芽の機能評価
　Elplasia RB 500 400 NA(クラレ)で作製した小型肝芽とCell culture insert（Corning）上で培養した融合肝芽を培養後１０日目に回収し、PureLink RNA mini kit (Thermo Fisher Scientific)を用いてRNAを精製した。cDNA合成はiScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad)を用いて行い、THUNDERBIRD Probe qPCR Mix（Takara）とLightCycler（登録商標） 480 (Roche Life Science)を用いて遺伝子の増幅・検出を行った。遺伝子発現の補正は、Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control (VICＴＭ/MGB probe, primer limited)を使用した。その他遺伝子のプライマー情報を以下に示す。hAlb, probe#27, forward primer: aatgttgccaagctgctga（配列番号１）; reverse primer: cttcccttcatcccgaagtt（配列番号２）, hAFP, probe#61, forward primer: TCCTTGTAAGTGGCTTCTTGAAC（配列番号３）; reverse primer: TGTACTGCAGAGATAAGTTTAGCTGAC（配列番号４）, hCD31, probe#46, forward primer: cattgttcccggtttcca（配列番号５）; reverse primer: cagagagaccggctgtgg（配列番号６）.

・ラット大腿動脈へのラット大腿血管付与肝芽移植
　免疫不全ラット（F344/NJcl-rnu/rnu）は、日本クレア株式会社より購入した。別のラットの大腿動脈を採取し、大血管付与肝芽を作製した。免疫不全ラットはイソフルラン吸入麻酔下、大腿動脈に大血管付与肝芽を端々吻合することにより移植した。移植後１週間ごとにラット頸動脈より血液を採取し、血中のヒトアルブミン濃度の測定を行った。移植３週間後に移植片を回収し、組織解析を行った。

・パラフィン切片作製法
　回収された組織は、4%パラホルムアルデヒド/リン酸緩衝液（PBS）中で１６時間固定を行った。固定組織をPBSで３回洗浄した後、70%エタノール、95%エタノール、100%エタノール（２回）にそれぞれ３０分以上振盪しながら浸漬することにより組織の脱水を行う。その後、50%エタノール/キシレン溶液、100%キシレン溶液、100%パラフィン溶液（２回）中それぞれ65℃で３０分以上振盪しながら浸漬した後、パラフィンに包埋した。包埋した組織サンプルは、ミクロトームで7～10 μmの厚さに薄切を行った。

・ヘマトキシリン・エオジン染色
　パラフィン切片をキシレン、100%エタノール、95%エタノール、70%エタノール、ミリQ水と段階を経て脱パラフィン、親水化を行う。流水で洗浄した後、ヘマトキシリン溶液で３～５分間染色し、流水で洗浄した後、エオジン溶液で２～５分間染色を行う。流水で洗浄した後、アルコールによる脱水を行い、キシレンで透徹した後にサンプルに非水溶性封入剤をのせ、カバーガラスで覆い封入を行った。

・免疫組織化学的解析
　パラフィン切片をキシレン、100%エタノール、95%エタノール、70%エタノール、ミリQ水と段階を経て脱パラフィン、親水化を行う。10 mMクエン酸緩衝液（pH 6.0）中、121℃、15分間の抗原賦活化処理を行った後、3% 過酸化水素水/メタノール液中１０分間処理し、内在性のペルオキシダーゼを不活性化した。Blocking One溶液（Nacalai Tesque）でブロッキングを室温１時間行った後、希釈した１次抗体と室温１時間または4℃一晩反応させた。PBSで３回洗浄した後、HRP標識あるいは蛍光標識された２次抗体と室温30分以上反応させた。PBSで3回洗浄後、蛍光標識された２次抗体の場合は、DAPIにより核染色を行った後に封入し、顕微鏡観察を行った。HRP標識された２次抗体の場合はDAB Reagent (Vector)で２～１０分間反応させ、発色を行った。精製水で洗浄した後、ヘマトキシリンで3分間染色し、10分間の流水で洗浄した後に0.1% Sodium Bicarbonateで5分間反応させ、アルコールによる脱水を行い、キシレンで透徹した後にサンプルに非水溶性封入剤をのせ、カバーガラスで覆い封入を行った。

・ELISA解析
　ラットより採取した血液を4℃, 1,500 x gで20分間遠心を行った上清、または回収した培養液をELISA解析に供する。Human Albumin ELISA Quantitation Set (Bethyl Laboratories, Inc.)のプロトコールに従って解析を行った。

結果
　結果を図１～４に示す。
・ヒトiPSC肝芽とマウス大血管の融合
　マウス大血管は、生後８週のマウスより調製した。ヒトiPSC肝芽（以下、hiPSC肝芽）をマウス大血管に貼り付け、経時的に観察した（図１A）。その結果、融合１５日後においてもマウス大血管周囲にhiPSC肝芽が融合している様子が観察された（図１A-D）。融合１５日後には、hiPSC肝芽由来血管網構造の形成が認められた（図１B、１G）。大血管付与hiPSC肝芽はHNF4A（図１E）やAFP（図１F）などの肝分化マーカーの発現が認められ、ヒトCD31陽性の血管形成も認められた（図１G）。

・ヒトiPSC肝芽と血管/胆管/腸管の融合
　ヒトiPSC肝芽はヒト臍帯動脈、ラット大腿動脈、ラット大腿静脈、ブタ胆管、マウス胎仔腸と融合可能であり、肝芽内に血管網が形成されることが示された（図２A-E）。ラット大腿静脈付与肝芽の組織解析により、肝芽内の細胞はヒト由来であることが示され、肝芽内の血管網は管状構造を形成していることが明らかとなった（図２F）。ラット大腿静脈付与肝芽は、大血管を付与していない肝芽と比較して分泌したヒトアルブミン値が2.36倍上昇していた（図２G, n = 4, p < 0.03, unpaired t-test）。

・ヒトiPSC肝芽と人工血管の融合
　人工血管（Triplex, テルモ；PTFE多孔質チューブ, 中興工業）と肝芽をセルカルチャーインサート上に近接させて配置し、肝芽の融合を経時的に観察した（図３A、３B）。その結果、融合３日後において人工血管周囲における肝芽の融合が観察され、血管網構造の形成が認められた（図３C）。培養１０日目の人工血管付与肝芽を回収して遺伝子発現解析を行ったところ、大血管を付与していない肝芽と比較して人工血管付与肝芽においてAFP、Alb、CD31の遺伝子発現上昇が認められた（図３D）。

・ラット大腿動脈付与肝芽のin vivo移植解析
　培養９-１１日目のラット大腿動脈付与肝芽を、免疫不全ラット（F344/NJcl-rnu/rnu）の大腿動脈に血管吻合により移植を行った（図４A）。血液灌流前の肝芽は白色を呈しているが、血液灌流後には肝芽内に血液が行き渡り、赤色を呈することが示された（図４A、４B）。移植３週間後にも組織の生着が認められた（図４C）。移植前のラット大腿動脈付与肝芽を組織学的解析に供した結果、動脈周囲に大量のヒト組織の存在が認められた（図４D）。移植後においても、動脈周囲に大量のヒト組織の存在が認められた（図４E）。ラット大腿動脈付与肝芽のin vivoにおける機能を測定するため、経時的に採血を行い、ラット血中におけるヒトアルブミン量を測定した（図４F）。その結果、移植後７日後、１４日後、２１日後共にヒトアルブミンが検出され、ラット大腿動脈付与肝芽が生体内で機能していることが示唆された。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
　本発明は、ヒューマン・バイオロジー、再生医療、薬剤評価などに利用できる。

Claims (17)

  1. 構造体と細胞塊を連結した構築物であって、前記構造体は立体構造を有する物体であって、生体の構造及び／又は機能を模倣もしくは類似しうるものである、生体に移植するための前記構築物。
  2. 構造体が管腔構造、非管腔構造又はそれらの組み合わせを有する請求項１記載の構築物。
  3. 構造体が、血管、胆管、食道、膵管、気管、気管支、細気管支、尿管、卵管、精管、汗腺、ワルトン管、ステノン管、涙腺、心臓、神経、大脳、中脳、小脳、視床、視床下部、脳下垂体、橋、延髄、眼、舌、歯、皮膚、咽頭、喉頭、胸腺、声帯、胃、十二指腸、小腸、大腸、直腸、肛門、肺、横隔膜、肝臓、胆嚢、膵臓、腎臓、副腎、甲状腺、副甲状腺、脾臓、膀胱、精巣、卵巣、子宮、骨、軟骨、腱、毛包、漿膜、大網、粘膜組織、筋組織及び靭帯からなる群より選択される少なくとも１つである請求項２記載の構築物。
  4. 構造体が生体に由来する請求項３記載の構築物。
  5. 構造体が人工物である請求項３記載の構築物。
  6. 構造体が、シート状構造体、チューブ状構造体及び糸状構造体からなる群より選択される少なくとも１つである請求項２記載の構築物。
  7. 細胞塊が１種類又は２種類以上の細胞を含む請求項１～６のいずれかに記載の構築物。
  8. 細胞塊が、器官芽、スフェロイド、セルアグリゲート及びセルスフェアからなる群より選択される少なくとも１つである請求項１～７のいずれかに記載の構築物。
  9. 構造体と細胞塊の組み合わせが、血管と器官芽、胆管と器官芽、食道と器官芽、膵管と器官芽、気管と器官芽、気管支と器官芽、細気管支と器官芽、尿管と器官芽、卵管と器官芽、精管と器官芽、汗腺と器官芽、ワルトン管と器官芽、ステノン管と器官芽、涙腺と器官芽、心臓と器官芽、神経と器官芽、大脳と器官芽、中脳と器官芽、小脳と器官芽、視床と器官芽、視床下部と器官芽、脳下垂体と器官芽、橋と器官芽、延髄と器官芽、眼と器官芽、舌と器官芽、歯と器官芽、皮膚と器官芽、咽頭と器官芽、喉頭と器官芽、胸腺と器官芽、声帯と器官芽、胃と器官芽、十二指腸と器官芽、小腸と器官芽、大腸と器官芽、直腸と器官芽、肛門と器官芽、肺と器官芽、横隔膜と器官芽、肝臓と器官芽、胆嚢と器官芽、膵臓と器官芽、腎臓と器官芽、副腎と器官芽、甲状腺と器官芽、副甲状腺と器官芽、脾臓と器官芽、膀胱と器官芽、精巣と器官芽、卵巣と器官芽、子宮と器官芽、骨と器官芽、軟骨と器官芽、腱と器官芽、毛包と器官芽、漿膜と器官芽、大網と器官芽、粘膜組織と器官芽、筋組織と器官芽及び靭帯と器官芽からなる群より選択される少なくとも１つの組み合わせである請求項１～８のいずれかに記載の構築物。
  10. 器官芽が、肝芽、肺オルガノイド、気道上皮オルガノイド、腸オルガノイド、膵臓オルガノイド、腎臓オルガノイド、脳オルガノイド、気道オルガノイド、胃オルガノイド、甲状腺オルガノイド、胸腺オルガノイド、精巣オルガノイド、食道オルガノイド、皮膚オルガノイド、神経オルガノイド、卵管オルガノイド、卵巣オルガノイド、唾液腺オルガノイド、眼胞オルガノイド、眼杯オルガノイド、膀胱オルガノイド、前立腺オルガノイド、軟骨オルガノイド、心臓オルガノイド、骨組織オルガノイド、筋組織オルガノイド及びがんオルガノイドからなる群より選択される少なくとも１つである請求項９記載の構築物。
  11. 請求項１～１０のいずれかに記載の構築物を非ヒト動物に移植することを含む、組織又は臓器の作製方法。
  12. 請求項１～１０のいずれかに記載の構築物をヒト又は非ヒト動物に移植することを含む、組織又は臓器の再生又は機能回復方法。
  13. 請求項１～１０のいずれかに記載の構築物を非ヒト動物に移植することを含む、非ヒトキメラ動物の作製方法。
  14. 請求項１～１０のいずれかに記載の構築物、請求項１１記載の方法で作製された組織及び臓器、並びに請求項１３記載の方法で作製された非ヒトキメラ動物からなる群より選択される少なくとも１つを用いて、薬剤を評価する方法。
  15. 請求項１～１０のいずれかに記載の構築物を含む、再生医療用組成物。
  16. 組織又は臓器を作製するために用いられる請求項１５記載の組成物。
  17. 組織及び／又は臓器の再生及び／又は機能回復を行うために用いられる請求項１５記載の組成物。
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