WO2021251312A1 - 細胞培養方法 - Google Patents

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貴則 武部
憲和 佐伯
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国立大学法人 東京医科歯科大学
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Definitions

  • the present invention relates to an organ organoid and / or a method for culturing cells constituting an organ. More specifically, the present invention relates to a method for culturing organ organoids and / or cells constituting an organ while perfusing a culture medium.
  • Organoids which can also be called "mini-organs" can be used as an evaluation system for evaluating drug efficacy or toxicity closer to the living body, as compared to conventional cells of organs cultured alone, and can be used for transplant surgery and transplant surgery. It is extremely valuable because it can also be used for the production of plasma proteins.
  • Non-Patent Document 1 describes that glomerular blood vessels are developed by perfusion culture of renal organoids.
  • Non-Patent Document 2 a microfluidic device is used, and a biological tissue section (suprachiasmatic nucleus (SCN) of brain tissue) is placed on a culture medium permeable membrane to speed the perfusion of the culture medium.
  • SCN sekunder nucleus
  • liver organoids are cultured for a long period of time in static culture, it is difficult to maintain mature hepatocytes, and after about 2 weeks of culture, cell death occurs, cell density decreases, and voids are formed between cells. I see a problem.
  • the present inventors intermittently increase the flow rate of the perfused culture medium (liquid medium), that is, intermittently increase the flow rate of the culture medium in the chamber, and for organ organoids and / or cells constituting the organ.
  • liquid medium liquid medium
  • organ organoids and / or cells constituting the organ we have found that by loading a transient "turbulent flow" in a transitional state, it is possible to produce a denser organ organoid or three-dimensional organ composed of mature cells, and completed the present invention. rice field.
  • the present invention provides the following [1] to [15] for solving the above problems.
  • [1] A method of culturing an organ organoid and / or a cell constituting an organ immobilized in a chamber while perfusing the culture medium.
  • Item 2. The culture according to Item 1, wherein the culture solution is perfused so as to include a time for transition from laminar flow to turbulence, a time for generating turbulence, and a time for transition from turbulence to laminar flow in the chamber. Method.
  • Item 1 or 2 The culture method according to Item 1 or 2, wherein the organ organoid and / or the cells constituting the organ are immobilized in a state of being embedded in a matrix.
  • Item 2 The culture according to any one of Items 1 to 3, wherein the matrix in which the organ organoid and / or the cells constituting the organ are embedded is immobilized in a chamber while being suspended from a breathable membrane. Method.
  • Item 6 The culture method according to any one of Items 1 to 4, wherein the organ organoid has a vasculature structure and / or the cells constituting the organ coexist with the vasculature cells. [6] Item 6.
  • Item 6a The culture method according to any one of Items 1 to 5, wherein the organ organoid is an organoid of liver, kidney, pancreas, thyroid gland, parathyroid gland, lung, brain or heart.
  • a method for producing a three-dimensional organ which comprises a step of carrying out the culture method according to any one of Items 1 to 6.
  • Item 6 The culture method according to any one of Items 1 to 6, wherein the culture solution contains a drug.
  • the culture method according to Item 8, wherein the drug is for treating a disease associated with ischemia.
  • Item 8 The culture method according to Item 8, wherein the drug is for treating an ischemic disease, an infarction / necrotic disease, or a hemorrhagic disease.
  • Item 8 The culture method according to Item 8, wherein the drug is for safety evaluation related to side effects associated with ischemia or bleeding.
  • a method for evaluating drug efficacy which comprises the step of carrying out the culture method according to Item 8 or 9.
  • a drug evaluation method comprising the step of carrying out the culture method according to Item 8, 9, 9a or 9b, and the step of evaluating the efficacy and / or safety of the drug against the organ organoid.
  • Item 12. A method for evaluating drug efficacy, which comprises a step of adding a drug to a medium of a three-dimensional organ according to Item 12 and a step of evaluating the drug efficacy of the drug on the three-dimensional organ.
  • a drug evaluation method comprising a step of adding a drug to a medium of a three-dimensional organ and a step of evaluating the efficacy and / or safety of the drug with respect to the three-dimensional organ.
  • a chamber capable of immobilizing and accommodating organ organoids and / or cells constituting the organ, and having an inlet and an outlet for perfusing the culture medium with respect to the organ organoid and / or cells constituting the organ.
  • the perfusion means is controlled to perfuse the culture solution so as to include a time of transition from laminar flow to turbulence, a time of generation of turbulence, and a time of transition from turbulence to laminar flow in the chamber. , Item 14.
  • the culture method of the present invention facilitates the production of organ organoids in which mature cells are distributed at a higher density than in the past, and facilitates the production of superior three-dimensional organs from such organ organoids.
  • the reproducibility of the action of the drug is higher than in the past in the organ organoids and three-dimensional organs obtained by the culture method of the present invention, artificial organs using the three-dimensional organs, or in regenerative medicine in which the three-dimensional organs are transplanted. Under the conditions, it becomes possible to evaluate the efficacy and safety of various drugs.
  • FIG. 1 is a schematic view of a culture apparatus (culture system of the present invention) constructed in Examples (common to 1 and 2).
  • FIG. 2 shows the liquid feeding conditions (20 mL / min, intermittent) in which turbulence occurs in Examples (common to 1 and 2) and the conventional laminar flow in which turbulence does not occur according to Non-Patent Document 1 as a reference example. It is an image showing the liquid medium in the culture chamber immediately before (top) and during (bottom) of liquid feeding for each of the liquid feeding conditions (4 mL / min, continuous). The liquid medium is stained with trypan blue dye.
  • FIG. 4 shows a matrix composition containing organoids obtained by perfusion culture (culture method of the present invention) in Example 2 (right) and a matrix composition containing organoids obtained by static culture in Comparative Example 2 as a control. (Left) Observation image.
  • FIG. 4 shows a matrix composition containing organoids obtained by perfusion culture (culture method of the present invention) in Example 2 (right) and a matrix composition containing organoids obtained by static culture in Comparative Example 2 as a control.
  • organ organoids immobilized in a chamber and / or cells or tissues constituting the organ are cultivated while perfusing a culture solution.
  • This is a culture method in which the culture solution is perfused so as to generate turbulence in the chamber.
  • the "chamber” refers to a site provided in a culture vessel (cell culture device) having a size capable of accommodating an organ organoid or the like to be cultured and a structure capable of immobilizing the organ organoid or the like.
  • the chamber is provided with an inlet and outlet for the culture medium to be perfused, and is configured as a site having a width and height larger than the flow path of the culture medium communicating with the inlet and outlet. ..
  • the culture solution flowing in from the inflow port comes into contact with the immobilized organ organoids and the like, and then flows out from the outflow port.
  • a culture vessel for perfusion culture of general cells is commercially available, and a similar culture vessel can be used in the present invention.
  • the flow of the culture solution in the chamber is almost uniform, and the organoids, etc., which are particularly immobilized in the chamber, are visually observed.
  • the matrix in which organoids, etc. are embedded, or near the inlet or the wall surface of the chamber only the generation of vortices lower than the predetermined standard can be confirmed, preferably vortices are generated in the culture medium. It means that you can hardly confirm that you are doing it.
  • the means for generating turbulence in the chamber is not particularly limited, but for example, the flow rate of the culture solution in the chamber (for example, a value expressed by the unit "mL / min" or the like) or the flow rate (the flow rate). / A value calculated from the cross-sectional area of the chamber, etc.) is set higher than a predetermined level, and the culture solution is made to collide with the wall surface of the chamber relatively strongly, whereby turbulence can be generated in the chamber. It is also possible to provide a structure (projection or the like) that causes turbulence in the chamber so that the culture solution collides with the structure to cause turbulence in the chamber.
  • turbulence may be generated without changing the conditions, or may be generated while changing the conditions. ..
  • the culture medium is (i) time to transition from laminar to turbulent in the chamber, (ii) time to generate turbulence, (iii) time to transition from turbulent to turbulent. Is perfused to include each of the.
  • the culture medium in the chamber is not always turbulent, but (i) in the process of transition from laminar flow to turbulent flow, (ii) turbulent flow, (i). iii) The state of transition from turbulent flow to laminar flow and (iv) the state of generating laminar flow (which may be stationary) are repeated.
  • the time for each of the above states (i) to (iv) is not particularly limited, but is adjusted by, for example, the flow rate or flow rate of the perfused culture solution (hereinafter, these are collectively referred to as “flow rate, etc.”). Can be done. That is, the time of the state (i) is referred to as a predetermined flow rate or the like that causes a turbulent flow (hereinafter referred to as “second flow rate or the like”) from a predetermined flow rate or the like that causes a laminar flow (hereinafter referred to as "first flow rate or the like”).
  • a liquid feeding means such as a pump that can automatically change the flow rate, etc., as described later, by switching to the setting of the first flow rate, etc., the setting of the first flow rate, etc. It can be adjusted by the time that the flow rate in the chamber changes with it.
  • the time of the state (ii) depends on the time for holding the second flow rate and the like
  • the time for the state (iii) depends on the time for reducing from the second flow rate and the like to the first flow rate and the like
  • the state (iv) shows the first flow rate. It can be adjusted by the time for holding the above, or by the setting in the liquid feeding means corresponding to each.
  • the present invention can also be applied to "cancer organoids" (see, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2018-110575) instead of "organ organoids". That is, in the case where the "cancer organoid” is immobilized in the chamber instead of the "organ organoid” according to the culture method of the present invention, and the cancer organoid is cultured in a culture medium perfused to cause turbulence in the chamber. It is possible to produce cancer organoids in which cancer cells are distributed at a higher density than in the past.
  • Organoids already include various types of organoids such as liver, pancreas, kidney, heart, lung, spleen, esophagus, stomach, thyroid gland, parathyroid gland, thymus, gonad, brain, spinal cord, skin, and inner ear. Is known (eg https://www.nejm.org/doi/pdf/10.1056/NEJMra1806175, https://www.nature.com/articles/s41568-018-0007-6, http: / See /www.amsbio.com/brochures/organoid-culture-handbook.pdf).
  • organ organoids can be used depending on the purpose of carrying out the culture method of the present invention, and for example, organoids such as liver, kidney, pancreas, thyroid gland, parathyroid gland, lung, brain, and heart are used in the present invention. Preferred organ organoids and the like. These organ organoids can be used in particular to carry out a method for evaluating the efficacy of a drug for treating an ischemic disease or the like, which will be described later.
  • the "cells or tissues constituting an organ” in the present invention refer to at least a part of organ organoids used for producing organ organoids (with other cells such as vascular endothelial cells and mesenchymal cells as necessary). Refers to the cells required to make up, or the tissue containing such cells.
  • the "cells or tissues that make up an organ” may be those at the stage of simple cell aggregates (spheroids) that do not have the structure or characteristics of organ organoids, or cells isolated from an individual. Or tissue (eg, patient-derived biopsy sample).
  • tissue eg, patient-derived biopsy sample.
  • Various "cells or tissues constituting an organ” are known, and cells can be selected according to the type of organ organoid.
  • the "cells constituting the organ” immobilized in the chamber can be read as "cells or tissues for producing an organ organoid, including at least the cells or tissues constituting the organ", if necessary. ..
  • the "cells constituting the organ” are preferably at least one type of cell selected from the group consisting of differentiated cells of parenchymal cells, undifferentiated cells of parenchymal cells, differentiated cells of non-parenchymal cells and undifferentiated cells of non-parenchymal cells.
  • non-parenchymal cells include, for example, sinus endothelial cells of the liver, hepatic stellate cells and cupper cells, pancreatic stellate cells and pancreatic microvascular endothelial cells of the pancreas, renal glomerular endothelial cells of the kidney, and pulmonary arterial endothelium of the lung.
  • Cells and pulmonary fibroblasts cardiac microvascular endothelial cells of the heart, aortic endothelial cells, coronary endothelial cells and cardiac fibroblasts, intestinal microvascular endothelial cells of the intestine, brain microvascular endothelial cells, vascular pericutaneous cells, choroid Examples include flora endothelial cells and cerebrovascular outer membrane fibroblasts.
  • Undifferentiated cells capable of differentiating into parenchymal or non-parenchymal cells include, for example, ectodermal organs such as brain, spinal cord, adrenal medulla, epidermis, hair / nail / skin gland, sensory organs, peripheral nerves, and crystalline body.
  • ectodermal organs such as brain, spinal cord, adrenal medulla, epidermis, hair / nail / skin gland, sensory organs, peripheral nerves, and crystalline body.
  • Cells that can differentiate into mesodermal organs such as kidney, urinary tract, heart, blood, gonads, adrenal cortex, muscles, skeleton, dermatitis, connective tissue, and messenger; liver, pancreas, intestine, lung, Cells that can differentiate into endoderm organs such as the thyroid, parathyroid, and urinary tract; and the like.
  • Organ organoids and / or cells constituting the organ may be derived from humans, or may be derived from non-human animals such as mammals such as mice, rats, dogs, pigs, and monkeys. It may be something to do. That is, the organ organoids and the like may be derived from humans or may be derived from animals other than humans. From the viewpoint of detecting a drug that causes drug addiction, which is difficult to find in conventional animal experiments or human cell tests in the development of human medicine, it is preferable that the organoid is derived from human. The same applies to other cells (vascular endothelial cells, mesenchymal cells, etc.) used together with the cells constituting the organ as needed to produce organ organoids.
  • other cells vascular endothelial cells, mesenchymal cells, etc.
  • organ or tissue of the organ organoid to which the culture method of the present invention is applied may be used according to the intended use, and is not particularly limited.
  • liver organoids and renal organoids are given below as specific examples, the present invention can be similarly applied to organoids of the pancreas, thyroid gland, parathyroid gland, lung, brain, heart, and other organs.
  • pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells, hepatic progenitor cells, and other cells having the ability to differentiate into hepatocytes are known.
  • iPS cells Hepatology, 2010 ; 51 (1): 297-305, Cell Rep. 2017; 21 (10): 2661-2670, etc.
  • a high-purity cell population of differentiated hepatocytes or a high-purity undifferentiated hepatocyte For both cell populations collected from living organisms and cell populations prepared by inducing differentiation of ES cells, iPS cells, etc. (especially for the latter), a high-purity cell population of differentiated hepatocytes or a high-purity undifferentiated hepatocyte.
  • a cell population may be used, or a cell mixture containing differentiated hepatocytes and undifferentiated hepatocytes in any proportion may be used.
  • a cell is a differentiated hepatocyte is a mature hepatocyte marker such as asialoglycoprotein receptor 1 (ASGR1), glutamine synthase (GS), E-cadherin, immature hepatocyte marker (early liver differentiation marker).
  • ASGR1 asialoglycoprotein receptor 1
  • GS glutamine synthase
  • E-cadherin immature hepatocyte marker
  • AFP alpha-fetoprotein
  • ALB early liver differentiation marker albumin
  • RBP4 retinol-binding protein
  • TTR glucose-6-phosphatase
  • G6PC glucose-6-phosphatase
  • a cell is an undifferentiated hepatocyte depends on whether the expression of one or more cell markers such as HHEX, SOX2, HNF4 ⁇ , AFP, and ALB is positive (weakly positive for ALB). It can be determined.
  • Vascular endothelial cell is a term that includes the concepts of both hematopoietic vascular endothelial cell (HEC) and non-hemogenic vascular endothelial cell (non-HEC).
  • HEC is a vascular endothelial cell capable of producing hematopoietic stem cells (having hematopoietic ability), and is also called a blood cell-producing vascular endothelial cell.
  • non-HEC is a vascular endothelial cell that does not have such hematopoietic capacity.
  • the vascular endothelial cells include vascular endothelial cells (for example, microvessel endothelial cells: MVEC), hepatic sinusoidal endothelial cells (LSEC), and umbilical venous endothelial cells (umbilical-) collected from the living body. It may be a cell population with high purity (veinendothelial cells: UVEC), etc.), or it may be obtained by differentiating cells having the ability to differentiate into pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells, and other vascular endothelial cells. It may be a highly pure cell population of the obtained vascular endothelial cells.
  • MVEC microvessel endothelial cells
  • LSEC hepatic sinusoidal endothelial cells
  • umbilical venous endothelial cells umbilical venous endothelial cells collected from the living body. It may be a cell population with high purity (veinendothelial cells: UVEC
  • Whether a cell is a vascular endothelial cell depends on whether one or more of the markers of the vascular endothelial cells such as TIE2, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, CD41 are positive. It can be determined (if positive, it is vascular endothelial cell). Whether or not a cell is a differentiated vascular endothelial cell further depends on whether or not one or more of the markers such as CD31 and CD144 are positive (if positive, it is a differentiated vascular endothelial cell). And) can be determined.
  • Mesenchymal cells refer to connective tissue cells that exist mainly in connective tissue derived from mesenchymal leaves and form a support structure for cells that function in the tissue, and are between differentiated cells (differentiated mesenchymal cells). It is a term that includes both the concepts of cells whose fate for differentiation into mesenchymal cells has been determined but have not yet differentiated into mesenchymal cells (undifferentiated mesenchymal cells), so-called mesenchymal stem cells.
  • vascular endothelial cells are a type of cells that differentiate from undifferentiated mesenchymal cells, they are excluded from the definition of "mesenchymal cells” in the present specification.
  • Mesenchymal cells further express cell markers specific to a specific organ (tissue) according to the organ organoids of the present invention and the "cells constituting the organ / tissue" used in combination. It may be a thing. Examples of such cell markers include FOXF1, COL4A and ALCAM, which are cell markers of septum transversum mesenchyme (STM).
  • STM septum transversum mesenchyme
  • the organ organoid is a renal organoid (preferably a renal primordia) and the cells constituting the organ are the cells constituting the kidney (parenchymal cells and / or non-parenchymal cells of the kidney).
  • Renal organoids and renal primordia are kidney or posterior kidney cells, vascular endothelial cells and mesenchymal cells (preferably mesenchymal stem cells) according to methods described, for example, WO2013 / 047639, WO2015 / 129822, etc. Can be produced by co-culturing.
  • the vascular endothelial cells and mesenchymal cells used for the production of renal organoids (renal primordium) are the same as those used for the production of the above-mentioned hepatic organoids (hepatic buds).
  • the parenchymal cells of the kidney differentiated into parenchymal cells. It includes the concepts of both cells (differentiated kidney cells) and cells whose fate for differentiation into parenchymal cells has been determined but have not yet differentiated (undifferentiated kidney cells), so-called renal precursor cells.
  • the differentiated renal cells may be cells collected from a living body (isolated from the kidneys in the living body), pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells, renal progenitor cells, and other kidneys.
  • the undifferentiated renal cells may be those collected from a living body, or may be those obtained by differentiating pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells, and other stem cells or progenitor cells. .. Cells that can differentiate into renal cells are, for example, Morizane et al., Nat Protoc 12: 195-207 (2017), Taguchi et al., Cell Stem Cell 14 (1): 53-67 (2014), Narayanan et al. ., Kidney Int. 83 (4): 593-603 (2013), etc. can be produced.
  • Whether or not a cell is a differentiated renal cell can be determined by whether or not the expression of one or more mature renal cell markers such as PODXL, LTL, and CDH1 is positive. On the other hand, whether or not a certain cell is an undifferentiated renal cell can be determined by whether or not the expression of one or more cell markers such as SIX2 and SALL1 is positive.
  • the organ organoid has a vasculature and / or the cells constituting the organ coexist with the vasculature.
  • Having a vasculature specifically means that in the production of organoids, by coexisting (co-culturing) the cells constituting the organ and the vasculature cells, a minute pulse is formed in the organ organoid. It means that a pipe structure is formed.
  • liver organoids or liver buds For example, in the case of liver organoids or liver buds, whether the expression of markers such as HHEX, SOX2, AFP, ALB, HNF4 ⁇ is positive, and / or whether albumin (ALB) is secreted in the culture supernatant. It can be used for judgment. If it is a renal organoid or renal primordium, it can be used for determination whether the expression of a marker such as SIX2, SALL1, PODXL, LTL, CDH1 is positive.
  • a marker such as SIX2, SALL1, PODXL, LTL, CDH1
  • organ organoids and / or cells constituting the organ are immobilized in a state of being embedded in a matrix.
  • the extracellular matrix for embedding organ organoids and the like, a general extracellular matrix that is solid at room temperature or higher and is used for cell culture, particularly three-dimensional cell culture, can be used.
  • the extracellular matrix is basically composed mainly of fibrous protein and proteoglycan, and such components include elastin, entactin, osteonectin, collagen (type IV collagen, etc.), tenascin, thrombospondin, perlecan, and vitronectin. , Fibrillin, fibronectin, heparin (sulfate), laminin and the like.
  • laminin for example, it contains laminin, collagen (type IV collagen) and entactin, known as the trade name "Matrigel” (Corning), and also contains growth factors such as EGF, IGF-1, PDGF and TGF- ⁇ .
  • the basement membrane matrix is an example of a preferred matrix in the present invention.
  • a self-assembling peptide known as a hydrogel such as a hydrogel containing arginine, glycine and asparagine, can also be used as the matrix in the present invention.
  • any one type may be used, or two or more types may be mixed or not mixed (so as to form different layers when solidified).
  • the matrix composition has an appropriate hardness. It can be adjusted as appropriate.
  • the matrix eg, Matrigel
  • the culture solution for mixing with the matrix in such an embodiment the same culture solution for culturing organ organoids and the like to be perfused in the culture method of the present invention can be used.
  • the matrix composition is generally prepared by adding an appropriate amount of a matrix containing an appropriate component to a culture solution containing an organ organoid or the like, and then solidifying the matrix (to solidify the hydrogel, if necessary). It can be prepared by adding an ionic solution or an ionic molecule of the above.
  • a matrix composition can be obtained by stirring and mixing a matrix (eg, Matrigel) in a liquid state at 4 ° C. or lower and an organ organoid or the like, and then allowing the matrix to stand at 37 ° C. or higher to solidify the matrix.
  • a matrix eg, Matrigel
  • the "breathable membrane” is a membrane having at least oxygen permeability and, if necessary, carbon dioxide and other desired gas permeability.
  • Various breathable membranes are known, and examples thereof include membranes made of fibers such as polyethylene terephthalate (PET), polydimethylsiloxane (PDMS), fluorocarbon, polytetrafluoroethylene (PTFE), and polyurethane. ..
  • PET polyethylene terephthalate
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • fluorocarbon fluorocarbon
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • polyurethane polyurethane.
  • the breathable membrane may be surface-treated to increase or decrease cell adhesion, if necessary, and may be coated with ECM such as collagen.
  • the aeration film formation may be a layered one (hybrid film) with a porous film (mesh) made of fibers different from the aeration film, if necessary.
  • an appropriate one may be selected according to the type of organ organoid and / or cells constituting the organ (organ organoid, etc.).
  • Mediums such as organ organoids are known, and in general, a medium for culturing cells constituting an organ (usually a cell population in which a plurality of types of cells are mixed) used for producing an organ organoid is mixed.
  • a mixed medium of a medium for hepatocytes and a medium for vascular endothelial cells can be used, and renal organoids and / or cells constituting the kidney can be used.
  • a mixed medium of a medium for renal cells and a medium for vascular endothelial cells can be used.
  • Additives for vascular endothelial cells include, for example, B27 Supplements (GIBCO), BMP4 (bone formation factor 4), GSK ⁇ inhibitor (eg, CHIR99021), VEGF (vascular endothelial cell growth factor), FGF2 (Fibroblast Growth Factor).
  • GBCO B27 Supplements
  • BMP4 bone formation factor 4
  • GSK ⁇ inhibitor eg, CHIR99021
  • VEGF vascular endothelial cell growth factor
  • FGF2 Fibroblast Growth Factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • Folskolin SCF (Stem Cell Factor), TGF ⁇ receptor inhibitor (eg SB431542), Flt-3L (Fms-related tyrosine kinase 3 ligand), IL-3 (Interleukin) 3), IL-6 (Interleukin 6), TPO (thrombopoietin), hEGF (recombinant human epithelial cell growth factor), hydrocortisone, ascorbic acid, IGF1, FBS (bovine fetal serum), antibiotics (eg, gentamycin, One or more selected from the group consisting of amphotericin B), heparin, L-glutamine, phenol red and BBE can be mentioned.
  • SCF Stems-related tyrosine kinase 3 ligand
  • IL-3 Interleukin 3
  • IL-6 Interleukin 6
  • TPO thrombopoietin
  • hEGF recombin
  • basal medium for hepatocytes examples include RPMI (Fujifilm) and HCM (Lonza).
  • As an additive for hepatocytes for example, one or more selected from the group consisting of Wnt3a, activin A, BMP4, FGF2, FBS, HGF (hepatocyte growth factor), oncostatin M (OSM) and dexamethasone (Dex). Can be mentioned. If necessary, at least one selected from ascorbic acid, BSA-FAF, insulin, hydrocortisone and GA-1000 can be added to the medium for hepatocytes.
  • the viscosity of the culture medium is not particularly limited as long as it can be perfused, but from the viewpoint of facilitating turbulence in the chamber, at a temperature under culture conditions (for example, at about 37 ° C.). For example, it is preferably 0.7 to 0.8 mPa ⁇ s.
  • ⁇ Culture conditions, etc.> Other conditions related to the culture method of the present invention, such as atmosphere, temperature, period, etc., can be appropriately adjusted according to the purpose of carrying out the culture method of the present invention and embodiments of organ organoids and the like.
  • atmosphere, temperature, period, etc. can be appropriately adjusted according to the purpose of carrying out the culture method of the present invention and embodiments of organ organoids and the like.
  • organ organoid such as a liver or a kidney or an organ bud (primordium) thereof from cells constituting an organ and other cells used as needed, 5% CO 2 .
  • It can be carried out at 30 to 40 ° C. (preferably about 37 ° C.) for 1 to 10 days (1 to 3 days for organ buds (primordium)).
  • the culture medium comprises a drug.
  • the "drug” is not particularly limited as long as it acts on organ organoids or the like, or is used for analyzing whether or not it acts, and can be selected according to the purpose.
  • the “drug” is not particularly limited as long as it can be used as an active ingredient of a drug such as a small molecule drug, an antibody drug, a peptide drug, and a nucleic acid drug.
  • substances used for embolizing blood vessels in transcatheter arterial chemoembolization are used as drugs to be contained in the culture medium, especially in the culture medium in the vasculature of organ organoids.
  • drug is not limited to a drug that is actually marketed as a drug, but is a drug used in a clinical trial or a non-clinical study, or a drug under development in the previous stage (a candidate for an active ingredient of a drug). There may be.
  • ischemic diseases diseases associated with ischemia
  • infarction / necrotizing diseases diseases associated with ischemia
  • hemorrhagic diseases diseases are collectively referred to as "ischemic diseases, etc.” in the present specification
  • the drug is one of the preferred drugs in the present invention.
  • a therapeutic agent for ischemic diseases and the like in the organ can be added to the culture solution of organoids and the like corresponding to each organ and cultured.
  • ischemic diseases in the liver include ischemic hepatic disorder (ischemic hepatitis), ischemic bile duct disorder, and hepatic rupture (secondary bleeding due to cancer, trauma, infection, etc.).
  • Examples of ischemic diseases in the kidney include ischemic nephropathy and idiopathic renal hemorrhage.
  • Examples of the therapeutic agent for ischemic nephropathy approved in Japan and the like include eculizumab.
  • Examples of ischemic diseases in the pancreas include ischemic acute pancreatitis and ischemic chronic pancreatitis.
  • Examples of ischemic diseases (decreased blood flow, etc.) in the thyroid gland or parathyroid gland include subacute thyroiditis and silent thyroiditis.
  • Examples of ischemic diseases in the heart include ischemic heart diseases.
  • Examples of the therapeutic agent for ischemic heart disease approved in Japan and the like include isosorbide dinitrate.
  • Examples of the rejection disease in the brain include cerebral ischemia.
  • a drug that may have side effects accompanied by ischemia or bleeding in each organ is also a preferable drug in the present invention as a drug for safety evaluation.
  • Drugs that may be accompanied by ischemia as a side effect include, for example, anticancer drugs, antiviral drugs, acetaminophen, etc. that cause serious drug-induced liver damage for the liver, and other antibacterial drugs (over multiple organs).
  • Drugs that may cause bleeding as side effects include cardiotonics, steroids (heart), diuretics, renin-angiotensin (RAS) inhibitors, contrast agents, SGLT2 inhibitors (kidneys), etc., for example, antiplatelet drugs. Examples include drugs and thrombolytic agents.
  • the culture conditions (atmosphere, temperature, period, etc.) in the drug-added culture step can be basically the same as the culture conditions in the culture method of the present invention, and may be appropriately adjusted as necessary, for example, depending on the drug.
  • the culture period can be sufficient for the evaluation.
  • the present invention also provides a drug evaluation method including a step of administering a drug to a non-human animal transplanted with a three-dimensional organ and a step of evaluating the efficacy and / or safety of the drug for the three-dimensional organ.
  • the method for producing a three-dimensional organ of the present invention includes a step of carrying out the method for culturing the organ organoid of the present invention as described above.
  • a "three-dimensional organ” is a structure containing a cell population or structure that is more mature than an organ organoid, which can be said to be a mature organ organoid.
  • liver is prepared as a three-dimensional organ, whether the acquisition of metabolic functions such as glutamine, citric acid production and gluconeogenesis, and the expression of markers such as ASGR1 and drug-metabolizing enzymes (CYP3A4, CYP7A1) are positive, for example. , Whether ASGR1-positive cells are present at a density of 70% or higher can be used for determination.
  • metabolic functions such as glutamine, citric acid production and gluconeogenesis
  • markers such as ASGR1 and drug-metabolizing enzymes (CYP3A4, CYP7A1) are positive, for example.
  • ASGR1-positive cells are present at a density of 70% or higher can be used for determination.
  • the culture system of the present invention can immobilize and contain organ organoids and / or cells constituting the organ (organ organoids, etc.), and is provided with an inlet and an outlet for perfusing the culture solution to the organ organoids, etc. It comprises a "chamber” and a “perfusion means” for perfusing the culture, which is a culture system controlled to cause turbulence in the culture in the chamber.
  • [4] Cell embedding in extracellular matrix and preparation of matrix composition A liver-inducing medium containing FBS, HGF, OSM and Dex added to HCM (manufactured by Lonza) and EGM (Lonza) in a 1: 1 ratio.
  • a medium mixed by volume (referred to as "organoid medium” in the present specification) was prepared.
  • a matrix (referred to as “organoid medium / Matrigel mixed matrix” in the present specification) was prepared by mixing an organoid medium and Matrigel (BD Pharmingen) in a volume ratio of 1: 1.
  • Immunostaining was performed using IgG (H + L) Secondary Antibody (invitrogen)) and a nuclear staining reagent (DAPI), and clearing treatment was performed with Visikol HISTO-M (Visikol Inc.).
  • the fluorescence image of the obtained stained sample was observed with an LSM880 confocal laser scanning microscope (Zeiss), and a binarized ASGR1 fluorescence region area was created from the obtained fluorescence image, and similarly binarized DAPI.
  • the ASGR1 positive rate was calculated by dividing by the fluorescence region area. The results are shown in FIG.

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Abstract

本発明は、臓器オルガノイドを長期間培養して成熟させることができ、立体臓器を作製するために適した培養方法を提供する。本発明の培養方法は、チャンバー内に固定化された臓器オルガノイドおよび／または臓器を構成する細胞を、培養液を灌流しながら培養する方法であって、前記培養液は、前記チャンバー内で乱流を生じるよう灌流されるものである。

Description

細胞培養方法
　本発明は、臓器オルガノイドおよび／または臓器を構成する細胞の培養方法に関する。より詳しくは、本発明は、臓器オルガノイドおよび／または臓器を構成する細胞を、培養液を潅流しながら培養する方法に関する。
［発明の背景］
　肝臓、腎臓などの各種の臓器の疾患に対する医薬品開発や再生医療の実現を目指すために、培養細胞を自己組織化させ、それぞれの臓器の三次元的な構造や、血管、胆管、その他の脈管の複雑な構造を再現した細胞構造体、すなわち臓器オルガノイドを作製するための研究開発が進められている。そのような臓器オルガノイドの発展的な細胞構造体として、未分化の細胞を含む特定の種類の細胞を組み合わせて培養することにより、発生の初期に形成される臓器の原基、すなわち器官芽（例えば肝臓の器官芽である肝芽）を作製することも可能となっている。このような「ミニ臓器」とも呼べるオルガノイドは、従来の単独で培養された臓器の細胞等に比べて、薬効または毒性の評価が生体により近い評価系として利用することができる上、移植手術や、血漿タンパク質の産生にも利用することができるなど、極めて利用価値が高い。
　各種の臓器オルガノイドは、一般的には培養液（液体培地）が静止した環境下での培養（静止培養）により作製されているが、培養液を潅流した環境下での培養（潅流培養）も提案されている。例えば、非特許文献１には、腎臓オルガノイドを潅流培養することにより、糸球体の血管が発達することなどが記載されている。また、非特許文献２には、マイクロ流体デバイスを使用し、培養液透過膜の上に生物組織切片（脳組織の視交叉上核（ＳＣＮ））を静置して、培養液の潅流のスピードを制御して組織を覆う液体を適切な量に保つことによって、栄養供給と呼吸のバランスを保ちながら長期培養することなどが記載されている。非特許文献３には、肺上皮細胞を気液インターフェース（ＡＬＩ）で潅流培養することにより、静止培養よりも細胞の成長および分化が促進されることなどが記載されている。なお、このような臓器オルガノイド、組織等の潅流培養においては、培養液を一定の速度で潅流させ「層流」とすること、また臓器オルガノイド、組織等に対してシェアストレスをなるべく掛けないようにすることが一般的であった。
Homan, K.A. et al., Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nat Methods 16, 255-262 (2019) doi:10.1038/s41592-019-0325-y Ota, N. et al., A Microfluidic Platform Based on Robust Gas and Liquid Exchange for Long term Culturing of Explanted Tissues. Analytical Sciences, Oct 2019, Vol.35 Long term Culturing of Explanted Tissues. Analytical Sciences, Oct 2019, Vol.35
　従来一般的であった静止培養によっては、長期間の培養により成熟した臓器オルガノイドを、さらに立体臓器を作製することは容易ではなかった。例えば、静止培養において肝臓オルガノイドを長期間培養すると、成熟した肝細胞を維持することが困難であり、およそ２週間の培養によって細胞死が生じ、細胞密度が低下して細胞間に空隙ができるという問題が見られる。
　本発明は、臓器オルガノイドを長期間培養して成熟させることができ、立体臓器を作製するために適した培養方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、潅流する培養液（液体培地）の流量を間欠的に上昇させる、つまりチャンバー内の培養液の流速を間欠的に上昇させ、臓器オルガノイドおよび／または臓器を構成する細胞に対して、一過的な遷移状態の「乱流」を負荷することにより、成熟した細胞で構成される、より密度の高い臓器オルガノイドまたは立体臓器を作製することができることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち本発明は、上記課題解決のため、以下の［１］～［１５］を提供する。
［１］
　チャンバー内に固定化された臓器オルガノイドおよび／または臓器を構成する細胞を、培養液を灌流しながら培養する方法であって、
　前記培養液は、前記チャンバー内で乱流を生じるよう灌流される、培養方法。
［２］
　前記培養液が、前記チャンバー内で層流から乱流へ移行する時間、乱流を生じる時間、乱流から層流へ移行する時間のそれぞれが含まれるよう灌流される、項１に記載の培養方法。
［３］
　前記臓器オルガノイドおよび／または臓器を構成する細胞が、マトリックス中に包埋された状態で固定化されている、項１または２に記載の培養方法。
［４］
　前記臓器オルガノイドおよび／または臓器を構成する細胞が包埋されたマトリックスが、通気性膜に懸架させた状態でチャンバー内に固定化されている、項１～３のいずれか一項に記載の培養方法。
［５］
　前記臓器オルガノイドが脈管構造を有している、および／または前記臓器を構成する細胞が脈管細胞と共存している、項１～４のいずれか一項に記載の培養方法。
［６］
　前記臓器オルガノイドが肝または腎オルガノイドである、および／または前記臓器が肝臓または腎臓である、項１～５のいずれか一項に記載の培養方法。
［６ａ］
　前記臓器オルガノイドが、肝臓、腎臓、膵臓、甲状腺、副甲状腺、肺、脳または心臓のオルガノイドである、項１～５のいずれか一項に記載の培養方法。
［７］
　項１～６のいずれか一項に記載の培養方法を実施する工程を含む、立体臓器の製造方法。
［８］
　前記培養液が薬物を含む、項１～６のいずれか一項に記載の培養方法。
［９］
　前記薬物が、虚血を伴う疾患の治療用である、項８に記載の培養方法。
［９ａ］
　前記薬物が、虚血性疾患、梗塞・壊死性疾患または出血性疾患の治療用である、項８に記載の培養方法。
［９ｂ］
　前記薬物が、虚血または出血を伴う副作用に係る安全性評価用である、項８に記載の培養方法。
［１０］
　項８または９に記載の培養方法を実施する工程を含む、薬効評価方法。
［１０ａ］
　項８、９、９ａまたは９ｂに記載の培養方法を実施する工程、および前記臓器オルガノイドに対する前記薬物の有効性および／または安全性を評価する工程を含む、薬物評価方法。
［１１］
　項１～６のいずれか一項の培養方法により得られた臓器オルガノイド。
［１２］
　項７に記載の製造方法により得られた立体臓器。
［１３］
　項１２に記載の立体臓器の培地に薬物を添加する工程、および前記立体臓器に対する前記薬物の薬効を評価する工程を含む、薬効評価方法。
［１３ａ］
　項１２に記載の立体臓器の培地に薬物を添加する工程、および前記立体臓器に対する前記薬物の有効性および／または安全性を評価する工程を含む、薬物評価方法。
［１４］
　臓器オルガノイドおよび／または臓器を構成する細胞を固定化して収容でき、前記臓器オルガノイドおよび／または臓器を構成する細胞に対して培養液を灌流するための流入口および流出口を備えたチャンバーと、
　培養液を灌流させるための灌流手段とを備えた培養システムであって、
　前記灌流手段は、前記チャンバー内で前記培養液に乱流を生じさせるよう制御される、培養システム。
［１５］
　前記灌流手段が、前記チャンバー内で層流から乱流へ移行する時間、乱流を生じる時間、乱流から層流へ移行する時間のそれぞれが含まれるよう前記培養液を灌流するよう制御される、項１４に記載のシステム。
　本発明の培養方法により、従来よりも成熟した細胞が高い密度で分布している臓器オルガノイドを作製しやすくなり、そのような臓器オルガノイドから従来よりも優れた立体臓器を作製しやすくなる。また、本発明の培養方法により得られる臓器オルガノイドや立体臓器、または立体臓器を利用した人工臓器において、あるいは立体臓器を移植した再生医療において、薬物の作用の再現性が従来よりも高いと考えられる条件下で、各種の薬物の有効性や安全性を評価することが可能となる。
図１は、実施例（１および２共通）において構築した培養装置（本発明の培養システム）の概略図である。 図２は、実施例（１および２共通）における乱流が生じる送液条件（20mL/min, intermittent）と、参考例として非特許文献１に準じた、従来の乱流が生じない層流の送液条件（4mL/min, continuous）それぞれについての、送液直前（上）および送液中（下）の培養チャンバー内の液体培地を示す画像である。液体培地はトリパンブルー色素によって染色されている。参考例の送液条件では、左側の流入口から液体培地が整った線状で（つまり層流として）チャンバー内に流入している。これに対して実施例の送液条件では、液体培地は渦巻きながら（つまり乱流として）チャンバー内に流入しており、また流入した液体培地はチャンバーの壁面にぶつかってチャンバー内全体に乱流が生じている。 図３は、実施例１における潅流培養（本発明の培養方法）によって得られたオルガノイド（右）と、対照として比較例１における静止培養によって得られたオルガノイド（左）それぞれの、光学顕微鏡画像（側面および上面）、核染色画像、ならびに免疫染色像（ASGR1、CD31の二重染色像。カラー画像ではそれぞれ赤および緑で表される。）の蛍光画像と、蛍光画像中の蛍光領域面積から算出したASGR1陽性率（平均±標準偏差、ｎ＝３の平均値）である。 図４は、実施例２における潅流培養（本発明の培養方法）によって得られたオルガノイドを含むマトリックス組成物（右）と、対照として比較例２における静止培養によって得られたオルガノイドを含むマトリックス組成物（左）の観察像である。 図５は、実施例２における潅流培養（本発明の培養方法）によって得られたオルガノイド（右）と、対照として比較例２における静止培養によって得られたオルガノイド（左）それぞれの免疫染色像（GS、E-カドヘリンおよびDAPIの三重染色像。カラー画像ではそれぞれ赤、緑および青で表される。）である。実施例２の免疫染色像（右）では、成熟幹細胞マーカーであるGSおよびE-カドヘリンの発現が認められ、また細胞密度が充実しているのに対し、比較例２の免疫染色像（左）では、それらのマーカーの発現は認められず、またオルガノイドの特に中央部において細胞の脱落が認められる。
－臓器オルガノイド等の培養方法－
　本発明の培養方法は、チャンバー内に固定化された臓器オルガノイドおよび／または臓器を構成する細胞もしくは組織（本明細書において「臓器オルガノイド等」と総称する。）を、培養液を灌流しながら培養する方法であって、前記培養液は、前記チャンバー内で乱流を生じるよう灌流される、培養方法である。
　「チャンバー」は、培養容器（細胞培養デバイス）内に設けられた、培養の対象とする臓器オルガノイド等を収容できるサイズと、臓器オルガノイド等を固定化できる構造とを有する部位を指す。一般的に、チャンバーは、潅流させる培養液の流入口および流出口を備えており、流入口および流出口と連通している培養液の流路よりも幅および高さの大きな部位として構成される。流入口から流入した培養液は、固定化されている臓器オルガノイド等と接触した後、流出口から流出する。一般的な細胞の潅流培養用の培養容器は市販されており、本発明においても同様の培養容器を使用することができる。
　＜乱流・層流＞
　本発明において、培養液がチャンバー内で「乱流」を生じるとは、チャンバー内における培養液の流れが一様ではなく、目視により、チャンバー内で、特に固定化された臓器オルガノイド等、または臓器オルガノイド等が包埋されたマトリックスの周囲で、あるいは流入口やチャンバーの壁面の近傍で、培養液に渦が発生していること、好ましくは所定の基準より高い程度（例えば、単位時間あたりの頻度や、大きさ等）の渦が発生していることが確認できることを指す。一方、後述するような本発明の好ましい一実施形態に関係する「層流」は、チャンバー内における培養液の流れがほぼ一様で、目視により、チャンバー内で、特に固定化された臓器オルガノイド等、または臓器オルガノイド等が包埋されたマトリックスの周囲で、あるいは流入口やチャンバーの壁面の近傍で、所定の基準より低い程度の渦の発生しか確認できないこと、好ましくは培養液に渦が発生していることが全くまたはほとんど確認できないことを指す。なお、チャンバー内の培養液の潅流を配管流れ、開水路流れ等によりモデル化し、代表長さ（水力直径、例えば、配管流れにおいて潅流方向に対する垂直断面を円形とみなしたときの直径）、代表流速、密度および粘性係数などからレイノルズ数を算出することが可能な場合は、そのレイノルズ数を所定の基準（一例として２３００）と比較して、それより大きければ乱流、小さければ層流、と判定することも可能である。
　チャンバー内で乱流を生じさせるための手段は特に限定されるものではないが、例えば、チャンバー内の培養液の流量（例えば単位「ｍＬ／分」等により表される値）または流速（前記流量／チャンバーの断面積等により算出される値）を所定の水準より高くし、培養液をチャンバーの壁面に比較的強く衝突させることにより、チャンバー内に乱流を生じさせることができる。また、チャンバー内に乱流を生じさせるような構造（突起等）を設け、培養液がその構造と衝突することによりチャンバー内に乱流を生じさせるようにすることも可能である。
　チャンバー内に固定化された臓器オルガノイド等を、培養液を灌流しながら培養する期間、乱流は条件を変えずに生じさせるようにしてもよいし、条件を変えながら生じさせるようにしてもよい。
　本発明の好ましい一実施形態において、培養液は、（i）チャンバー内で層流から乱流へ移行する時間、（ii）乱流を生じる時間、（iii）乱流から層流へ移行する時間のそれぞれが含まれるよう灌流される。この実施形態では、チャンバー内の培養液は、常に乱流を生じているわけではなく、（i）層流から乱流への移行途中の状態、（ii）乱流を生じている状態、（iii）乱流から層流への移行途中の状態、および（iv）層流を生じている（静止していてもよい）状態が繰り返される。上記状態（i）～（iv）それぞれの時間は特に限定されるものではないが、例えば、潅流される培養液の流量または流速（以下これらを「流量等」と総称する。）によって調節することができる。すなわち、状態（i）の時間は、層流を生じさせる所定の流量等（以下「第１流量等」と呼ぶ。）から乱流を生じさせる所定の流量等（以下「第２流量等」と呼ぶ。）まで上昇させる時間によって、あるいは後述するような流量等を自動的に変更できるポンプ等の送液手段において、第１流量等の設定から第２流量等の設定に切り替わり、流路内およびチャンバー内の流量がそれに伴い変化してゆく時間によって、調節することができる。同様に、状態（ii）の時間は第２流量等を保持する時間によって、状態（iii）の時間は第２流量等から第１流量等まで低下させる時間によって、状態（iv）は第１流量等を保持する時間によって、あるいはそれぞれに対応する送液手段における設定等によって、調節することができる。例えば、あるチャンバーを備えた培養容器において、通常はチャンバー内で「層流」が生じるよう設定される一般的な範囲の流量等を「第１流量等」として扱い、それよりも高い、従来は一般的ではない範囲の流量等を「第２流量等」として扱うことができる。
　＜臓器オルガノイド等＞
　「臓器オルガノイド」は、人為的に創出された臓器または組織に類似した組織体（三次元構造体）である。本発明における「臓器オルガノイド」は、各種の臓器または組織のオルガノイドの総称であり、臓器または組織のオルガノイドとして成熟した段階にあるもののみならず、複雑化の初期段階にある「器官芽」、「原基」などと呼ばれている構造体も包含される。
　なお、本発明は「臓器オルガノイド」ではなく「癌オルガノイド」（例えば特開２０１８－１１０５７５号公報参照）に対して適用することも可能である。すなわち、本発明の培養方法に準じて、「臓器オルガノイド」の代わりに「癌オルガノイド」をチャンバー内に固定化し、チャンバー内で乱流を生じるよう潅流される培養液でその癌オルガノイドを培養した場合、従来よりも癌細胞が高い密度で分布した癌オルガノイドを作製することが可能である。したがって、本明細書の「臓器オルガノイド」は、必要に応じて「癌オルガノイド」に読み替えることも可能であるし、「臓器オルガノイド」と「癌オルガノイド」の総称としての「オルガノイド」に読み替えることも可能である。また、「癌オルガノイド」を用いて、本発明の「薬物評価方法」を実施することも可能である。
　「臓器オルガノイド」としては、すでに様々な種類のもの、例えば肝臓、膵臓、腎臓、心臓、肺臓、脾臓、食道、胃、甲状腺、副甲状腺、胸腺、生殖腺、脳、脊髄、皮膚、内耳などのオルガノイドが公知になっている（例、https://www.nejm.org/doi/pdf/10.1056/NEJMra1806175、https://www.nature.com/articles/s41568-018-0007-6、http://www.amsbio.com/brochures/organoid-culture-handbook.pdf参照）。本発明の培養方法を実施する目的に応じて様々な臓器オルガノイドを用いることができるが、例えば、肝臓、腎臓、膵臓、甲状腺、副甲状腺、肺、脳、心臓などのオルガノイドなどは、本発明における好ましい臓器オルガノイド等である。これらの臓器オルガノイドは特に、後述するような虚血性疾患等を治療するための薬物の薬効評価方法を実施するために用いることができる。
　各種の臓器オルガノイドの作製方法の基本的な実施形態、例えば必要な細胞や培養条件は公知であり、本発明の培養方法の実施形態も基本的には、公知の臓器オルガノイドの作製方法に準じたものとすることができる。例えば、ＷＯ２０１３／０４７６３９、ＷＯ２０１５／１２９８２２などに記載されている、（Ａ）臓器を構成する細胞、（Ｂ）血管内皮細胞および（Ｃ）間葉系細胞（好ましくは間葉系幹細胞）を共培養する方法は、本発明の培養方法においても、臓器オルガノイドを作製するための方法として好ましい。
　本発明における「臓器を構成する細胞もしくは組織」は、臓器オルガノイドを作製するために（必要に応じて血管内皮細胞、間葉系細胞など他の細胞と共に）用いられる、臓器オルガノイドの少なくとも一部を構成するために必要な細胞、もしくはそのような細胞を含む組織を指す。「臓器を構成する細胞もしくは組織」は、臓器オルガノイドのような構造や特性を有さない、単純な細胞凝集体（スフェロイド）の段階にあるものであってもよいし、個体より分離された細胞や組織（例えば、患者由来生検サンプル）であってもよい。各種の「臓器を構成する細胞もしくは組織」が公知であり、臓器オルガノイドの種類に応じた細胞を選択することができる。なお、チャンバー内に固定化される「臓器を構成する細胞」は、必要に応じて「少なくとも臓器を構成する細胞もしくは組織を含む、臓器オルガノイドを作製するための細胞もしくは組織」と読み替えることができる。
　「臓器を構成する細胞」には、（Ａ１）臓器・組織を構成する実質細胞および（Ａ２）臓器・組織を構成する非実質細胞が包含される。また、（Ａ１）実質細胞および（Ａ２）非実質細胞には、それぞれ、（ｍ）分化し成熟した、または終末分化に達した、実質細胞または非実質細胞としての所定の機能性を有する細胞（本明細書において単に「分化細胞」と呼ぶ。）、および（ｎ）実質細胞または非実質細胞への分化能を有する、または分化が運命付けられている（コミットされている）が、未分化である、または幹細胞もしくは前駆細胞の段階であり、実質細胞または非実質細胞としての所定の機能性をまだ十分に有していない細胞（本明細書において単に「未分化細胞」と呼ぶ。）が包含される。
　「臓器を構成する細胞」としては、実質細胞の分化細胞、実質細胞の未分化細胞、非実質細胞の分化細胞および非実質細胞の未分化細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞、好ましくは臓器オルガノイド（好ましくは器官芽）の形成が可能な２種以上の細胞の組み合わせ、を用いることができる。
　分化した「実質細胞」としては、例えば、肝臓の肝細胞、膵臓の内分泌細胞（例、α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、ＰＰ細胞）および膵管上皮細胞、腎臓の尿細管上皮細胞および糸球体上皮細胞、肺の肺胞上皮細胞、心臓の心筋細胞、腸管の上皮細胞、脳の神経細胞およびグリア細胞、脊髄の神経細胞およびシュワン細胞などが挙げられる。
　分化した「非実質細胞」としては、例えば、肝臓の類洞内皮細胞、肝星細胞およびクッパー細胞、膵臓の膵星細胞および膵微小血管内皮細胞、腎臓の腎糸球体内皮細胞、肺の肺動脈内皮細胞および肺線維芽細胞、心臓の心微小血管内皮細胞、大動脈内皮細胞、冠動脈内皮細胞および心線維芽細胞、腸管の腸管微小血管内皮細胞、脳の脳微小血管内皮細胞、血管周皮細胞、脈絡叢内皮細胞および脳血管外膜線維芽細胞などが挙げられる。
　実質細胞または非実質細胞への分化能を有する「未分化細胞」としては、例えば、脳、脊髄、副腎髄質、表皮、毛髪・爪・皮膚腺、感覚器、末梢神経、水晶体などの外胚葉性器官に分化可能な細胞；腎臓、尿管、心臓、血液、生殖腺、副腎皮質、筋肉、骨格、真皮、結合組織、中皮などの中胚葉性器官に分化可能な細胞；肝臓、膵臓、腸管、肺、甲状腺、副甲状腺、尿路などの内胚葉性器官に分化可能な細胞；などが挙げられる。
　臓器を構成する細胞は、初代培養細胞であってもよいし、継代培養細胞（株化細胞）であってもよいし、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などを分化させて得られた細胞であってもよい。
　臓器オルガノイドおよび／または臓器を構成する細胞（臓器オルガノイド等）は、ヒトに由来するものであってもよいし、ヒト以外の動物、例えばマウス、ラット、イヌ、ブタ、サルなどの哺乳動物に由来するものであってもよい。すなわち、臓器オルガノイド等は、ヒトに由来するものであってもよいし、ヒト以外の動物に由来するものであってもよい。ヒトの医薬の開発において従来の動物実験やヒト細胞試験等では発見されにくい薬物中毒を引き起こす薬物を検出する観点からは、オルガノイドはヒトに由来するものであることが好ましい。臓器オルガノイドを作製するために、必要に応じて臓器を構成する細胞と共に用いられるその他の細胞（血管内皮細胞、間葉系細胞等）についても同様である。
　本発明の培養方法の適用対象とする臓器オルガノイドの、臓器または組織の種類は、用途に応じたものとすればよく、特に限定されるものではない。以下に、肝オルガノイドおよび腎オルガノイドを具体例として挙げるが、膵臓、甲状腺、副甲状腺、肺、脳、心臓、その他の臓器のオルガノイドについても同様に本発明を実施することが可能である。
　本発明の好ましい一実施形態において、臓器オルガノイドは、肝オルガノイド（好ましくは肝芽）であり、臓器を構成する細胞は、肝臓を構成する細胞（肝臓の実質細胞および／または非実質細胞）る。肝オルガノイド（肝芽）は、例えばＷＯ２０１３／０４７６３９、ＷＯ２０１５／１２９８２２などに記載されている方法に準じて、肝臓内胚葉細胞（肝臓の実質細胞の未分化細胞に相当）、血管内皮細胞および間葉系細胞（好ましくは間葉系幹細胞）を共培養することにより作製することができる。
　「肝臓を構成する細胞」のうち、肝臓の実質細胞（肝細胞）は、分化した肝細胞（分化肝細胞）と、肝細胞への分化運命が決定しているがまだ肝細胞へ分化していない細胞（未分化肝細胞）、いわゆる肝前駆細胞（例、肝臓内胚葉細胞）の両方の概念を包含する。分化肝細胞は、生体から採取された（生体内の肝臓から単離された）細胞であってもよいし、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞、肝前駆細胞、その他の肝細胞へ分化する能力を有する細胞を分化させて得られた細胞であってもよい。未分化肝細胞は、生体から採取されたものであってもよいし、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞、その他の幹細胞または前駆細胞を分化させて得られたものであってもよい。肝細胞に分化可能な細胞は、例えば、K.Si-Taiyeb, et al. Hepatology, 51(1):297-305 (2010)、T. Touboul, et al. Hepatology. 51(5):1754-65 (2010)に従って作製することができる。ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞、肝前駆細胞、その他の肝細胞へ分化する能力を有する細胞を、肝細胞へ分化させる方法は公知であり、例えば、ｉＰＳ細胞からは、Hepatology, 2010; 51(1):297-305、Cell Rep. 2017; 21(10):2661-2670などに記載の方法に準じて行うことができる。生体から採取した細胞集団、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の分化誘導により作製した細胞集団、いずれについても（特に後者については）、分化肝細胞の純度の高い細胞集団または未分化肝細胞の純度の高い細胞集団を用いてもよいし、分化肝細胞および未分化肝細胞を任意の割合で含む細胞混合物を用いてもよい。
　ある細胞が分化肝細胞であるかどうかは、成熟肝細胞マーカー、例えばアシアログリコプロテインレセプター1（ＡＳＧＲ１）、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）、Ｅ－カドヘリン、未成熟肝細胞マーカー（初期肝分化マーカー）であるαフェトプロテイン（ＡＦＰ）、初期肝分化マーカーであるアルブミン（ＡＬＢ）、レチノール結合プロテイン（ＲＢＰ４）、トランスチレチン（ＴＴＲ）、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ）などの１種または２種以上の発現が陽性かどうかにより判別することができる。一方、ある細胞が未分化肝細胞であるかどうかは、ＨＨＥＸ、ＳＯＸ２、ＨＮＦ４α、ＡＦＰ、ＡＬＢなどの１種または２種以上の細胞マーカーの発現が陽性か（ＡＬＢについては弱陽性か）どうかにより判別することができる。
　「血管内皮細胞」は、造血性血管内皮細胞（hemogenic endothelial cell；ＨＥＣ）および非造血性血管内皮細胞（non-hemogenic endothelial cell；ｎｏｎ－ＨＥＣ）の両方の概念を包含する用語である。ＨＥＣは、造血幹細胞を産生することのできる（造血能を有する）血管内皮細胞であり、血球産生型血管内皮細胞とも呼ばれる。一方で、ｎｏｎ－ＨＥＣは、そのような造血能を有さない血管内皮細胞である。血管内皮細胞を用いることにより、臓器オルガノイドに微細な血管網を賦与することができる。
　血管内皮細胞は、生体から採取された血管内皮細胞（例えば、微小血管内皮細胞（microvessel endothelial cells: MVEC）、肝類洞壁内皮細胞（liver sinusoidal endothelial cells: LSEC）、臍帯静脈内皮細胞（umbilical-vein endothelial cells: UVEC）など）の純度の高い細胞集団であってもよいし、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞、その他の血管内皮細胞へ分化する能力を有する細胞を分化させて得られた血管内皮細胞の純度の高い細胞集団であってもよい。
　ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞、その他の血管内皮細胞へ分化する能力を有する細胞を、造血性血管内皮細胞（ＨＥＣ）へ分化させる方法は公知であり、例えば、ｉＰＳ細胞からは、PLoS One, 2013; 8(4): e59243、Nat Biotechnol. 2014; 32(6): 554-61、Sci Rep. 2016; 6: 35680などに記載の方法に準じて行うことができる。
　ある細胞が血管内皮細胞であるかどうかは、例えば、ＴＩＥ２、ＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ－２、ＶＥＧＦＲ－３、ＣＤ４１などの血管内皮細胞のマーカーの１種または２種以上が陽性であるかどうかにより（陽性であれば血管内皮細胞であると）判別することができる。また、ある細胞が分化した血管内皮細胞であるかどうかは、さらに、ＣＤ３１、ＣＤ１４４などのマーカーの１種または２種以上が陽性であるかどうかにより（陽性であれば分化した血管内皮細胞であると）判別することができる。
　「間葉系細胞」は、主として中胚葉に由来する結合組織に存在し、組織で機能する細胞の支持構造を形成する結合組織細胞を指し、分化した細胞（分化間葉系細胞）と、間葉系細胞への分化運命が決定しているがまだ間葉系細胞へ分化していない細胞（未分化間葉系細胞）、いわゆる間葉系幹細胞の両方の概念を包含する用語である。ただし、「血管内皮細胞」は未分化間葉系細胞から分化する細胞の一種であるが、本明細書における「間葉系細胞」の定義から除外されるものとする。
　ある細胞が未分化間葉系細胞であるか分化間葉系細胞であるかは、例えば、Ｓｔｒｏ－１、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３３、ＣＤ２７１、Ｎｅｓｔｉｎなどの未分化間葉系細胞のマーカーの１種または２種以上が陽性であるかどうかにより（陽性であれば未分化間葉系細胞、陰性であれば分化間葉系細胞と）判別することができる。
　間葉系細胞はさらに、本発明において目的とされる臓器オルガノイドや、組み合わせて用いられる「臓器・組織を構成する細胞」に応じて、特定の臓器（組織）に特異的な細胞マーカーを発現するものであってもよい。そのような細胞マーカーとしては、例えば、septum transversum mesenchyme (STM)の細胞マーカーであるＦＯＸＦ１、ＣＯＬ４ＡおよびＡＬＣＡＭが挙げられる。
　本発明の好ましい一実施形態において、臓器オルガノイドは、腎オルガノイド（好ましくは腎臓原基）であり、臓器を構成する細胞は、腎臓を構成する細胞（腎臓の実質細胞および／または非実質細胞）である。腎オルガノイドおよび腎臓原基は、例えばＷＯ２０１３／０４７６３９、ＷＯ２０１５／１２９８２２などに記載されている方法に準じて、腎臓または後腎の細胞、血管内皮細胞および間葉系細胞（好ましくは間葉系幹細胞）を共培養することにより作製することができる。腎オルガノイド（腎臓原基）の作製に用いられる血管内皮細胞および間葉系細胞は、前述した肝オルガノイド（肝芽）の作製に用いられるものと同様である。
　「腎臓を構成する細胞」のうち、腎臓の実質細胞（腎糸球体内皮細胞、糸球体上皮細胞、近位尿細管細胞、ヘンレのループ細胞、遠位尿細管細胞）は、実質細胞に分化した細胞（分化腎細胞）と、実質細胞への分化運命が決定しているがまだ分化していない細胞（未分化腎細胞）、いわゆる腎前駆細胞の両方の概念を包含する。分化腎細胞は、生体から採取された（生体内の腎臓等から単離された）細胞であってもよいし、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞、腎前駆細胞、その他の腎臓の実質細胞へ分化する能力を有する細胞を分化させて得られた細胞であってもよい。未分化腎細胞は、生体から採取されたものであってもよいし、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞、その他の幹細胞または前駆細胞を分化させて得られたものであってもよい。腎細胞に分化可能な細胞は、例えば、Morizane et al., Nat Protoc 12:195-207 (2017)、Taguchi et al., Cell Stem Cell 14(1):53-67 (2014)、Narayanan et al., Kidney Int. 83(4):593-603 (2013)などに従って作製することができる。ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞、腎前駆細胞、その他の腎細胞へ分化する能力を有する細胞を、腎細胞へ分化させる方法は公知であり、例えば、ｉＰＳ細胞からは、上記と同じ、Morizane et al., Nat Protoc 12:195-207 (2017)、Taguchi et al., Cell Stem Cell 14(1):53-67 (2014)、Narayanan et al., Kidney Int. 83(4):593-603 (2013)などの記載に準じて行うことができる。生体から採取した細胞集団、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の分化誘導により作製した細胞集団、いずれについても（特に後者については）、分化腎細胞の純度の高い細胞集団または未分化腎細胞の純度の高い細胞集団を用いてもよいし、分化腎細胞および未分化腎細胞を任意の割合で含む細胞混合物を用いてもよい。
　ある細胞が分化腎細胞であるかどうかは、成熟腎細胞マーカー、例えばＰＯＤＸＬ、ＬＴＬ、ＣＤＨ１などの１種または２種以上の発現が陽性かどうかにより判別することができる。一方、ある細胞が未分化腎細胞であるかどうかは、ＳＩＸ２、ＳＡＬＬ１などの１種または２種以上の細胞マーカーの発現が陽性かどうかにより判別することができる。
　本発明の好ましい一実施形態において、臓器オルガノイドは脈管構造を有している、および／または前記臓器を構成する細胞は脈管細胞と共存している。「脈管構造を有している」とは、具体的には、オルガノイドの作製において、臓器を構成する細胞と脈管細胞とを共存させる（共培養する）ことにより、臓器オルガノイドに微小な脈管構造が形成されていることをいう。
　「脈管細胞」としては、例えば、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞および周皮細胞が挙げられる。例えば、肝臓内胚葉細胞（肝臓の実質細胞の未分化細胞に相当）、血管内皮細胞および間葉系細胞（好ましくは間葉系幹細胞）を共培養することにより、脈管構造を有している肝オルガノイドを作製することができる。また、腎臓または後腎の細胞、血管内皮細胞および間葉系細胞（好ましくは間葉系幹細胞）を共培養することにより、脈管構造を有している腎オルガノイドを作製することができる。
　臓器を構成する細胞および必要に応じて用いられるその他の細胞から臓器オルガノイドが得られたかは、例えば、肉眼または顕微鏡観察により立体構造（三次元構造）が形成されたかを確認することにより、判断することができる。また、臓器オルガノイドの作製は、そのような立体構造の形成に加えて、所定の細胞マーカー、特に臓器の実質細胞のマーカーが陽性であるか（例えば陽性細胞の比率が所定の基準を超えるか）によって、必要であればさらに培養上清中にそれらのマーカーのタンパク質が分泌されているか（例えば分泌量が所定の基準を超えるか）によって、判別することができる。例えば、肝オルガノイドまたは肝芽であれば、ＨＨＥＸ、ＳＯＸ２、ＡＦＰ、ＡＬＢ、ＨＮＦ４α等のマーカーの発現が陽性であるか、および／または培養上清中にアルブミン（ＡＬＢ）が分泌されているかを、判断のために用いることができる。腎オルガノイドまたは腎臓原基であれば、ＳＩＸ２、ＳＡＬＬ１、ＰＯＤＸＬ、ＬＴＬ、ＣＤＨ１等のマーカーの発現が陽性であるかを、判断のために用いることができる。
　＜固定化・マトリックス＞
　本発明の培養方法では、臓器オルガノイドおよび／または臓器を構成する細胞（臓器オルガノイド等）は、チャンバー内に固定化される。「固定化」のための手段は特に限定されるものではなく、チャンバー内で乱流を生じるよう潅流される培養液によって臓器オルガノイド等がチャンバー外に流亡しないようにできればよい。例えば、チャンバーの底部の全部または一部を、マトリックス（臓器オルガノイド等を包埋するためのものと同様であり、詳細は後述する。）またはこれに類する足場材料などで被覆し、その被覆物の上に臓器オルガノイド等（臓器オルガノイドを作製するための所定の細胞）を播種して平面培養することにより、臓器オルガノイド等をチャンバー内に固定化することができる。また、後述する本発明の好ましい実施形態におけるように、臓器オルガノイド等をマトリックス中に包埋すること、例えば臓器オルガノイド等が包埋されたマトリックスを通気性膜に懸下させることも、臓器オルガノイド等をチャンバー内に固定化するために好適な手段である。
　本発明の好ましい一実施形態において、臓器オルガノイドおよび／または臓器を構成する細胞（臓器オルガノイド等）は、マトリックス中に包埋された状態で固定化されている。
　臓器オルガノイド等を包埋するための「マトリックス」としては、室温以上で固体であり、細胞培養、特に三次元細胞培養に用いられている一般的な細胞外マトリックスを用いることができる。細胞外マトリックスは、基本的に繊維状タンパク質とプロテオグリカンを主成分としており、そのような成分としては、エラスチン、エンタクチン、オステオネクチン、コラーゲン（IV型コラーゲン等）、テネイシン、トロンボスポンジン、パールカン、ビトロネクチン、フィブリリン、フィブロネクチン、ヘパリン（硫酸塩）、ラミニンなどが挙げられる。例えば、商品名「マトリゲル」（Corning）として知られている、ラミニン、コラーゲン（IV型コラーゲン）およびエンタクチンを含有し、ＥＧＦ、ＩＧＦ－１、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ－βなどの増殖因子も併せて含有している基底膜マトリックスは、本発明における好ましいマトリックスの一例である。また、ハイドロゲルとして知られている自己組織化ペプチド、例えばアルギニン、グリシンおよびアスパラギンを含むハイドロゲルなども、本発明におけるマトリックスとして用いることができる。マトリックスは、いずれか１種を用いてもよいし、２種以上を混合して、または混合せずに（固化したときに異なる層を形成するように）用いてもよい。
　マトリックスの組成や濃度（原液か、希釈物か）は、当業者であれば、臓器オルガノイド等が包埋されたマトリックス（以下「マトリックス組成物」と呼ぶ。）が適度な固さを有するものとなるよう、適宜調整することができる。例えば、マトリックス（例、マトリゲル）は必要に応じて、取り扱い性を高めるとともに、固化したときに適度な固さを有するようにするために、培養液と混合して用いることができる。このような実施形態においてマトリックスと混合するための培養液としては、本発明の培養方法において潅流させる、臓器オルガノイド等を培養するための培養液と同じものを用いることができる。
　マトリックス組成物は、一般的には、臓器オルガノイド等を含む培養液に、適切な成分を含有する適量のマトリックスを添加した後、マトリックスを固化させること（必要に応じて、ハイドロゲルを固化させるためのイオン性溶液またはイオン性分子を添加すること）により作製することができる。例えば、４℃以下で液体状態であるマトリックス（例、マトリゲル）と臓器オルガノイド等を撹拌混合した後、３７℃以上で静置してマトリックスを固化させることにより、マトリックス組成物が得られる。臓器オルガノイド等が懸濁している比較的多量の培地にマトリックスを添加する場合は、十分な量のマトリックスを添加することにより、マトリックスの固さを十分なものとし、臓器オルガノイド等が底部に沈降せずマトリックス中に保持されるようにすることが適切である。
　マトリックス組成物は、例えば下記の（i）～（iii）のいずれであってもよい。
（i）所定の細胞から臓器オルガノイドを作製した後、そのオルガノイドを単離してマトリックスと混合することにより得られたもの。
（ii）三次元培養により所定の細胞から臓器オルガノイドを作製した後、その臓器オルガノイドをマトリックスと混合することにより得られたもの。
（iii）臓器オルガノイドを作製するための所定の細胞（臓器を構成する細胞）を含む細胞集団にマトリックスを添加して固化した後、マトリックス中に包埋された状態の細胞集団を培養して臓器オルガノイドを作製することにより得られたもの。
　マトリックス中に包埋された状態の臓器オルガノイドおよび／または臓器を構成する細胞（臓器オルガノイド等）、すなわちマトリックス組成物をチャンバー内に固定化する手段は特に限定されるものではない。潅流される培養液が臓器オルガノイド等包埋マトリックと乱流の状態で接触できるよう、チャンバー内の適切な場所に配置すればよい。本発明においては、例えば、固化させる前の臓器オルガノイド等とマトリックスとの混合物をチャンバー内の適切な場所に滴下し、マトリックスを固化することにより、臓器オルガノイド等を（マトリックス中に包埋された状態で）チャンバー内に固定化することができる。
　本発明の好ましい一実施形態において、臓器オルガノイドおよび／または臓器を構成する細胞が包埋されたマトリックス（マトリックス組成物）は、通気性膜に懸下させた状態でチャンバー内に固定化される。
　「通気性膜」は、少なくとも酸素透過性を有し、必要に応じてさらに二酸化炭素、その他の所望の気体透過性を有する膜である。様々な通気性膜が公知となっており、例えば、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、フルオロカーボン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリウレタンなどの繊維で作製された膜が挙げられる。通気性膜は、必要に応じて細胞付着性を高めるまたは低めるための表面処理、例えばコラーゲン等のＥＣＭでコーティングする処理がなされていてもよい。また、通気成膜は、必要に応じて通気性膜とは異なる繊維で作製された多孔質膜（メッシュ）と積層化されたもの（ハイブリッド膜）であってもよい。
　「通気性膜に懸架させた状態」のマトリックス組成物は、固化させる前のマトリックス組成物を通気性膜上に滴下し、固化させた後、通気性膜に付着した状態の固化したマトリックス組成物が下向き（下に凸）になるよう上下を反転させることにより作り出すことができる。マトリックス組成物が懸下した状態にある通気性膜を、保持具などの適切な部材を用いてチャンバー内（例えば天井部）に固定化することにより、マトリックス組成物は潅流する培養液に浸漬する一方、通気性膜は浸漬させずに大気中（または所望の培養雰囲気中）に置くことができ、それによりマトリックスに包埋された臓器オルガノイド等を、通気性膜を通じた気体交換を担保しつつ、培養することができる。
　＜培養液＞
　本発明において潅流される培養液（液体培地）は、臓器オルガノイドおよび／または臓器を構成する細胞（臓器オルガノイド等）の種類に応じた適切なものを選択すればよい。臓器オルガノイド等の培地は公知であり、一般的には、臓器オルガノイドの作製に用いられる臓器を構成する細胞（通常は複数の種類の細胞が混合した細胞集団）を培養するための培地を混合したものを用いることができる。例えば、肝オルガノイドおよび／または肝臓を構成する細胞を培養する場合は、肝細胞用の培地と血管内皮細胞用の培地の混合培地を用いることができ、腎オルガノイドおよび／または腎臓を構成する細胞を培養する場合は、腎細胞用の培地と血管内皮細胞用の培地の混合培地を用いることができる。
　血管内皮細胞用の基礎培地としては、例えば、DMEM/F-12（Gibco）、Stempro-34 SFM (Gibco)、Essential 6培地（Gibco）、Essential 8培地（Gibco）、EGM（Lonza）、BulletKit（Lonza）、EGM-2（Lonza）、BulletKit（Lonza）、EGM-2 MV（Lonza）、VascuLife EnGS Comp Kit（LCT）、Human Endothelial-SFM Basal Growth Medium（Invitrogen）、ヒト微小血管内皮細胞増殖培地（TOYOBO）などが挙げられる。血管内皮細胞用の添加物としては、例えば、B27 Supplements（GIBCO）、BMP4（骨形成因子４）、GSKβ阻害剤（例、CHIR99021）、VEGF（血管内皮細胞成長因子）、FGF2（Fibroblast Growth Factor（bFGF（basic fibroblast growth factor）ともいう））、Folskolin、SCF（Stem Cell Factor）、TGFβ受容体阻害剤（例、SB431542）、Flt-3L（Fms-related tyrosine kinase 3 ligand）、IL-3（Interleukin 3）、IL-6（Interleukin 6）、TPO（トロンボポイエチン）、hEGF（組換えヒト上皮細胞成長因子）、ヒドロコルチゾン、アスコルビン酸、IGF1、FBS（ウシ胎児血清）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシン、アンフォテリシンＢ）、ヘパリン、Ｌ－グルタミン、フェノールレッドおよびBBEからなる群より選ばれる１種以上が挙げられる。
　肝細胞用の基礎培地としては、例えば、RPMI（富士フイルム）、HCM（Lonza）などが挙げられる。肝細胞用の添加物としては、例えば、Wnt3a、アクチビンＡ、BMP4、FGF2、FBS、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、オンコスタチンＭ（OSM）およびデキサメタゾン（Dex）からなる群より選ばれる１種以上が挙げられる。肝細胞用の培地には必要に応じて、アスコルビン酸、ＢＳＡ－ＦＡＦ、インスリン、ヒドロコルチゾンおよびＧＡ－１０００から選ばれる少なくとも１種を添加することができる。より具体的には、肝細胞用の培地としては、例えば、HCM BulletKit（Lonza）からhEGF（組換えヒト上皮細胞成長因子）を除いた培地；RPMI1640（Sigma-Aldrich）に1% B27 Supplements（GIBCO）と10ng/mL hHGF（Sigma-Aldrich）を添加した培地が挙げられる。特に、肝芽を作製する場合は、例えば、EGM BulletKit（Lonza）とHCM BulletKit（Lonza）よりhEGF（組換えヒト上皮細胞成長因子）を除いたものとを１：１で混ぜた培地に、デキサメタゾン、オンコスタチンＭおよびHGFを添加した培地を用いることもできる。
　腎細胞用の基礎培地としては、例えば、ReproFF2 (REPROCELL)、StemFit Basic（味の素）などが挙げられる。腎細胞用の添加物としては、例えば、ＦＧＦ９が挙げられる。腎細胞用の培地には必要に応じて、ＣＨＩＲおよびヘパリンからなる群より選ばれる１種以上を添加することができる。より具体的には、腎細胞用の培地としては、例えば、ReproFF2に10ng/mL FGF9（R&D）を添加した培地が挙げられる。特に、腎臓原基を作製する場合は、例えば、ReproFF2に、3μM CHIRと10ng/mL FGF9（R&D）を添加した培地を用いることもできる。
　培養液（液体培地）の粘度は、潅流させることができれば特に限定されるものではないが、チャンバーにおいて乱流が生じやすくするという観点からは、培養条件下で（例えば約３７℃で）温度において、例えば０．７～０．８ｍＰａ・ｓであることが好ましい。
　＜培養条件等＞
　本発明の培養方法に関するその他の条件、例えば雰囲気、温度、期間等は、本発明の培養方法を実施する目的や臓器オルガノイド等の実施形態に応じて、適宜調節することができる。例えば、臓器を構成する細胞および必要に応じて用いられるその他の細胞から、肝臓、腎臓等の臓器オルガノイドとしての立体構造またはその器官芽（原基）を形成するためには、５％ＣＯ２、３０～４０℃（好ましくは約３７℃）で、１～１０日間（器官芽（原基）であれば１～３日間）行うことができる。
　＜薬物＞
　本発明の好ましい一実施形態において、培養液は薬物を含む。「薬物」は、臓器オルガノイド等に対して作用するもの、または作用するかどうかを分析するためのものであれば特に限定されず、目的に応じて選択することができる。「薬物」は、低分子医薬、抗体医薬、ペプチド医薬、核酸医薬など、医薬品の有効成分として使用できるものであれば特に限定されるものではない。また、肝動脈化学塞栓術において血管を栓塞するために用いられる物質（ゼラチンスポンジ、多孔質ゼラチン粒など）を、培養液に、特に臓器オルガノイドの脈管構造中の培養液に含ませる薬物とすることも、あるいは後述するような（非ヒト動物に移植されていてもよい）立体臓器を用いた薬物評価方法における薬物とすることも可能である。「薬物」は、実際に医薬品として市販されている薬物に限定されず、臨床試験または非臨床試験において用いられている薬物や、その前段階の開発途中の薬物（医薬品の有効成分の候補）であってもよい。
　例えば、各臓器における虚血性疾患（虚血を伴う疾患）、梗塞・壊死性疾患、または出血性疾患（本明細書において、これらの疾患を「虚血性疾患等」と総称する。）の治療用の薬物は、本発明における好ましい薬物の一つである。各臓器に対応するオルガノイド等の培養液に、その臓器における虚血性疾患等の治療薬を添加し、培養することができる。肝臓における虚血性疾患等としては、例えば、虚血性肝障害（虚血性肝炎）、虚血性胆管障害、肝破裂（がん、外傷、感染症などによる二次性出血）が挙げられる。腎臓における虚血性疾患等としては、例えば、虚血性腎障害、特発性腎出血が挙げられる。日本等において承認されている虚血性腎障害の治療薬としては、例えばエクリズマブが挙げられる。膵臓における虚血性疾患等としては、例えば、虚血性急性膵炎、虚血性慢性膵炎が挙げられる。甲状腺または副甲状腺における虚血性疾患等（血流の低下等）としては、例えば、亜急性甲状腺炎、無痛性甲状腺炎が挙げられる。心臓における虚血性疾患等としては、例えば、虚血性心疾患が挙げられる。日本等において承認されている虚血性心疾患の治療薬としては、例えば硝酸イソソルビドが挙げられる。脳における拒絶性疾患等としては、例えば、脳虚血が挙げられる。
　また、別の側面からは、各臓器において虚血または出血を伴う副作用のおそれがある薬物も、安全性評価用薬物として、本発明における好ましい薬物となる。副作用として虚血を伴うおそれがある薬物としては、例えば、肝臓については重篤な薬剤性肝障害を起こす抗癌剤、抗ウイルス薬、アセトアミノフェンなど、またその他にも抗菌薬（多臓器にわたる）、強心薬、ステロイド（心臓）、利尿薬、レニン・アンジオテンシン系（ＲＡＳ）阻害薬、造影剤、ＳＧＬＴ２阻害薬（腎臓）などが挙げられる副作用として出血を伴うおそれがある薬物としては、例えば、抗血小板薬、血栓溶解薬などが挙げられる。
－薬物評価方法－
　本発明の培養方法は、薬物を含む培養液を用いることにより、その薬物を評価するための方法に応用することができる。薬物をどのような観点から評価するかは特に限定されるものではないが、例えば、薬物が各臓器における虚血性疾患等の治療用のものである場合は、その治療における有効性を評価することができる。また、薬物が各臓器において虚血または出血を伴う副作用のおそれがあるものである場合は、薬物の安全性を評価することができる。
　すなわち、本発明による、臓器オルガノイド等を使用する薬物評価方法は、上述したような薬物を含む培養液を用いて、本発明の培養方法を実施する工程（以下「薬物添加培養工程」と呼ぶ。）を含み、さらに臓器オルガノイドに対する薬物の有効性および／または安全性を評価する工程を含む。
　より具体的には、本発明による薬物の有効性の評価方法（本明細書において「薬効評価方法」と呼ぶことがある。）として、例えば、肝臓、腎臓等における虚血性疾患等の治療用の薬物を含む培養液を用いて実施する薬物添加培養工程を含む、薬物評価方法が挙げられる。また、本発明による薬物の安全性の評価方法としては、例えば、各臓器において虚血または出血を伴う副作用のおそれがある薬物を用いて実施する薬物添加工程を含む、薬効評価方法が挙げられる。
　薬物添加培養工程における培養条件（雰囲気、温度、期間等）は、基本的に本発明の培養方法における培養条件と同様とすることができ、必要に応じて適宜調節すること、例えば薬物に応じた評価を行うために十分な培養期間とすることができる。
　本発明の薬物評価方法は、必要に応じて、薬物添加培養工程以外の工程を含んでいてもよい。例えば、薬物添加培養工程を経た臓器オルガノイド等に含まれる細胞について、（i）試薬（例えばヨウ化プロピジウム；ＰＩ）を用いて死細胞を検出し、細胞中の死細胞の比率（細胞死率）を測定する、および／または（ii）治療対象疾患の症状を反映するバイオマーカーの産生量（例えば培養上清中の特定の物質の濃度）を測定し、対照と比較するようにして、薬物の有効性および／または安全性を評価する工程を含むことができる。
　本発明の薬物評価方法において、臓器オルガノイド等は、薬物の治療対象となる疾患を発症した患者（ヒト）またはその他の対象に由来するものが好ましい。この実施形態において、臓器を構成する細胞および必要に応じて用いられるその他の細胞は、そのような患者または対象から採取された細胞（初代培養細胞）であってもよいし、それを用いて作製されたｉＰＳ細胞または継代培養細胞（株化細胞）であってもよい。例えば、虚血性疾患等の患者から採取された細胞を用いて作製されたｉＰＳ細胞株は、本発明の薬物評価方法を標準的なものとする上で、臓器オルガノイドを作製するために、すなわち臓器オルガノイドを作製するための臓器を構成する細胞および必要に応じて用いられるその他の細胞へと分化誘導するために、好適である。
　本発明の薬物評価方法は、臓器オルガノイド等（臓器オルガノイドおよび／または臓器を構成する細胞）に代えて、後述するような製造方法により得られる立体臓器を対象とする場合も、同様に行うことができる。例えば、本発明の好ましい一実施形態において、立体臓器を使用する本発明の薬物評価方法は、立体臓器の培地に薬物を添加する工程、および立体臓器に対する薬物の有効性（薬効）および／または安全性を評価する工程を含むものとすることができる。
　さらに、立体臓器が移植された非ヒト動物に薬物を投与する工程、およびその立体臓器に対する薬物の有効性および／または安全性を評価する工程を含む薬物評価方法も、本発明により提供される。
－立体臓器の製造方法－
　本発明の立体臓器の製造方法は、上述したような本発明の臓器オルガノイド等の培養方法を実施する工程を含む。「立体臓器」は、成熟臓器オルガノイドともいえる、臓器オルガノイドよりも一層成熟した細胞集団または構造を含む構造体である。
　本発明の立体臓器の製造方法における培養条件（雰囲気、温度、期間等）は、基本的に本発明の培養方法における培養条件と同様とすることができ、必要に応じて適宜調節すること、例えば立体臓器が形成されるのに十分な培養期間とすることができる。例えば、肝臓、腎臓等の立体臓器を製造する場合は、それぞれの臓器オルガノイドを作製するための所定の細胞の培養を開始した日から２０～３０日間培養すること、またはそれらの臓器オルガノイドとしての立体構造の形成が確認できた日から成熟のためにさらに１０～２０日間培養すること、などが挙げられる。
　臓器オルガノイドから立体臓器が得られたかどうかは、例えば、構造体中の細胞の密度（所定の基準を超えるか等）、構造体の立体的な形状（一定水準より立体的であるか等）、機能や形質（代謝機能等の所定の機能または形質を獲得しているか等）、細胞マーカー（細胞マーカーの遺伝子またはタンパク質の発現が陽性であるか、陽性細胞の密度が所定の基準を超えるか、培養上清中のマーカータンパク質分泌量が所定の基準を超えるか等）などの一つまたは複数の観点から判定することができる。上記の細胞の密度、立体的な形状、機能や形質、細胞マ－カーなどは、臓器オルガノイドおよび立体臓器に応じて、適宜設定することができるが、例えば、生体内の臓器と同程度の、またはそれに近似した水準を達成しているかどうかを、上記のような判定の基達とすることができる。
　例えば、立体臓器として肝臓を作製する場合は、グルタミン、クエン酸産生や糖新生等の代謝機能の獲得や、ＡＳＧＲ１や薬剤代謝酵素（ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ７Ａ１）等のマーカーの発現が陽性であるか、例えば、ＡＳＧＲ１陽性細胞が７０％以上の密度で存在するかを、判断のために用いることができる。立体臓器として腎臓を作製する場合はＰＯＤＸＬ、ＬＴＬ、ＣＤＨ１等のマーカー、繊毛タンパク（ＰＫＤ１、ＰＫＤ２、ＮＰＨＰ１、ＮＰＨＰ６、ＰＫＨＤ１）、輸送タンパク（ＳＬＣ３４Ａ１、ＡＴＰ１Ａ１、ＳＬＣ６Ａ１９、ＳＬＣ９Ａ３、ＳＬＣ２Ａ２、ＡＢＣＢ１、ＬＲＰ２）等の発現の一部または複数が陽性であるかを、判断のために用いることができる。
　立体臓器からは、体外循環と連結することで、人工臓器を作製することができる。このような人工臓器は、臓器不全モデルとして利用したり、臓器の機能を評価するために利用したりすることができる。このような用途については、例えばＷＯ２０１３／０４７７２０などを参照することができる。
－培養システム－
　本発明の培養システムは、臓器オルガノイドおよび／または臓器を構成する細胞（臓器オルガノイド等）を固定化して収容でき、臓器オルガノイド等に対して培養液を灌流するための流入口および流出口を備えた「チャンバー」と、培養液を灌流させるための「灌流手段」とを備え、灌流手段は、チャンバー内で培養液に乱流を生じさせるよう制御される、培養システムである。
　チャンバーについては、本発明の「臓器オルガノイド等の培養方法」との関係で前述した通りであり、本発明の培養システムは、そのようなチャンバーまたはそれを設けた培養容器（細胞培養デバイス）を使用するものである。
　本発明の培養システムにおける潅流手段としては、オルガノイド等またはその他の組織、細胞等を潅流培養するために用いられている、一般的または公知の手段を採用することができる。潅流手段は、典型的には、培養液を送液するためのポンプ（蠕動ポンプ等）またはその他の送液手段、培養液を貯留するためのリザーバー、およびリザーバーとポンプ等、ポンプ等とチャンバーの流入口；チャンバーの流出口とリザーバー、それぞれを連結する流路（チューブ等）などを基本的な構成として含む。
　潅流手段、特にポンプ等の送液手段は、流量等を自動的に任意の（あらかじめ設定された）タイミングで変更できるよう制御されることが好ましい。例えば、本発明の好ましい一実施形態において、潅流手段は、（i）チャンバー内で層流から乱流へ移行する時間、（ii）乱流を生じる時間、（iii）乱流から層流へ移行する時間のそれぞれが含まれるよう培養液を灌流するよう制御される。この実施形態では、上記（i）～（iii）の時間に、（iv）層流を生じる（静止していてもよい）時間を加えて、これらの時間が連続的に繰り返されるよう制御することができる。例えば、第１流量等で所定の時間送液すること、あるいは所定の時間、送液しないこと（第１流量等がゼロである場合に相当）、続いて第２流量等で所定の時間送液すること、を１サイクルとして、これを所定のサイクル数（所定の時間にわたって）繰り返すようにすることができる。なお、潅流手段、特にポンプ等の送液手段の制御プログラムも、本発明の培養システムの一部を構成しうる。
　本発明の培養システムは、必要に応じて、一般的または公知の潅流培養用の培養システムで用いられている、その他の手段、構成等を備えていてもよい。そのような手段、構成等としては、例えば、培養環境を適切な温度および雰囲気に保つための手段（温度制御装置・機構、雰囲気制御装置・機構等）が挙げられる。
［実施例１］
　［１］ヒト非造血性血管内皮細胞の作製
　ヒトiPS細胞（1383D2；京都大学iPS研究所）を、DMEM/F-12（Gibco）（10mL）に1% B-27 Supplements（GIBCO）、BMP4（25ng/mL）およびCHIR99021（8μM）を添加した培地中、5％CO２、37℃で3日間培養することで中胚葉系細胞を誘導した。得られた中胚葉細胞をさらに、Stempro-34 SFM（Gibco)（10ml）にVEGF（200ng/mL）およびFolskolin（2μM）を添加した培地中、5％CO２、37℃で7日間培養することで、CD31陽性、CD73陽性およびCD144陽性のヒト非造血性血管内皮細胞集団を得た。
　［２］ヒト肝臓内胚葉細胞の作製
　ヒトiPS細胞（1383D2；京都大学iPS研究所）を、基礎培地RPMI（富士フイルム）（2ml）にWnt3a (50ng/mL)およびアクチビンＡ（100ng/mL）を添加した培地中、5%CO2、37℃で5日間培養することで、内胚葉系細胞を誘導した。得られた内胚葉系細胞を、前記基礎培地に1% B27 Supplements（GIBCO）およびFGF2（10ng/mL）を添加して、5%CO2、37℃でさらに5日間培養することで、AFP、ALBおよびHNF4αが陽性のヒト肝臓内胚葉細胞集団を得た。
　［３］ヒト間葉系細胞の作製
　ヒトiPS細胞（1383D2；京都大学iPS研究所）を、基礎培地DMEM/F-12（Gibco）（10mL）に1% B-27 Supplements（GIBCO）、BMP4（25ng/mL）およびCHIR99021（8μM）を添加した培地中、5%CO2、37℃で3日間培養することで中胚葉系細胞を誘導した。得られた中胚葉系前駆細胞を、同培地にPDGFBBおよびアクチビンAを添加して、5%CO2、37℃でさらに3日間培養した。培養後の細胞を回収し、新たなゼラチンコートプレートに再播種し、前記基礎培地に、bFGFおよびBMP4を添加して、5%CO2、37℃でさらに4日間培養することで、FOXF1、COL4A、ALCAMおよびCD73が陽性のヒト間葉系細胞集団を得た。
　［４］細胞外マトリックスへの細胞包埋およびマトリックス組成物の作製
　HCM（Lonza社製）にFBS、HGF、OSMおよびDexを加えた肝誘導培地と、EGM（Lonza）とを、1:1の体積割合で混合した培地（本明細書中「オルガノイド用培地」という）を調製した。さらに、オルガノイド用培地とマトリゲル（BD Pharmingen）とを1:1の体積割合で混合したマトリックス（本明細書中「オルガノイド用培地/マトリゲル混合マトリックス」という）を調製した。
　オルガノイド用培地/マトリゲル混合マトリックスを、反転させたhanging drop insert（Millipore）上に5μL滴下し、37℃まで温度を上げることにより固化させ、「第三のマトリックス層」を形成した。
　上記のように作製したヒト肝臓内胚葉細胞、ヒト非造血性内皮細胞およびヒト間葉系細胞を10:7:1の割合で、オルガノイド用培地/マトリゲル混合マトリックス内に4℃にて混合した。得られた混合液を、上記のように形成した第三のマトリックス層上に3μL滴下し、37℃まで温度を上げることにより固化させ、「第二のマトリックス層」を形成させた。
　さらに、オルガノイド培地/マトリゲル混合液を、上記のように形成した第二のマトリックス層上に8μL滴下し、37℃まで温度を上げることにより固化させ、「第一のマトリックス層」を形成した。
　低吸着24-well plateに、Rock (Rho-associated coiled-coil forming kinase） inhibitor（10ng/mL）を添加したオルガノイド培地を600μL加えた。上記のようにしてhanging drop insert上に形成した、第一～第三のマトリックス層からなるマトリックス組成物を、ウェル内の培地方向に向けて挿入した。24時間後にRock inhibitor（10ng/mL）を除いたオルガノイド培地にて半量交換を行い、以降の培地交換は培養開始後3日目まで毎日半量交換にて実施した。
　［５］潅流培養
　培養開始後3日目にオルガノイドを含むマトリックス組成物が接着したhanging drop insertを取り出し、培養チャンバーおよび供給培地タンクを含む、QuasiVivo QV600 Barrier Sys. Starter Kit（Kirkstall社）を用いて灌流培養を開始した。培養液を送液するポンプにはワトソンマーロー社製チュービングポンプ（530SN/313D）を用い、ポンプ側チューブはタイゴンチューブ LMT-55（内径8mm×外径11mm）を接続した。20mL/minによる送液を30秒おきに30秒間実施することで、間欠的に灌流を実施した。装置の概略図を図１に示す。上記の潅流において、培養チャンバー内に乱流の渦が発生することを目視で確認した（図２参照）。オルガノイド培地にて5%CO2、37℃で11日間培養を行い、3日に一度供給培地タンク内のオルガノイド培地を入れ替えることで培地交換を実施した。
　灌流培養開始後11日目にオルガノイドを含むマトリックス組成物が接着したhanging drop insertを取り出し、セルスクレーパーによりオルガノイドを剥離した。オルガノイドを4%パラホルムアルデヒド/PBS固定溶液を含む2mLチューブに入れ、固定した。
　［６］静止培養（対照）
　対照として、上記と同様のオルガノイドを含むマトリックス組成物およびオルガノイド培地を用いて、従来の一般的な静止培養により、すなわち培養開始後3日目からの潅流培養を行わず、引き続き低吸着24-well plate中で上記と同じ期間培養を行った後、同様に固定した。
　［７］免疫染色（ASGR1等）
　固定溶液を取り除いたのち、PBSにて洗浄を行い（15分×2回）、20% DMSO/エタノール、80%エタノール、50%エタノールでそれぞれ15分処理する透過処理を行った。さらに抗ASGR1抗体（R&D, MAB4394）、抗CD31抗体（Abcam,AB28364）とこれらの抗体に結合する蛍光標識二次抗体（Novex Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Novex Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody（invitrogen））および核染色試薬（DAPI）を用いて免疫染色を行い、Visikol HISTO-M（Visikol Inc.）により透明化処理を行った。得られた染色検体の蛍光像観察をLSM880共焦点レーザー顕微鏡（Zeiss）により実施し、得られた蛍光画像から、二値化されたASGR1蛍光領域面積を作成し、同様に二値化されたDAPI蛍光領域面積で割ることで、ASGR1陽性率を算出した。結果を図３に示す。
［実施例２］
　実施例１の［１］～［３］と同様に作製したヒト肝臓内胚葉細胞、ヒト非造血性内皮細胞およびヒト間葉系細胞を用いて、実施例１の［４］および［５］と同様にして、マトリックス組成物の潅流培養によりオルガノイドを得た後、固定した。また対照として、実施例１の［６］と同様にして、マトリックス組成物の静止培養によりオルガノイドを得た後、固定した。潅流培養および静止培養それぞれで得られた、オルガノイドを含むマトリックス組成物の観察像（立体構造）を図４に示す。
　［８］免疫染色（GS、E-カドヘリン等）
　固定溶液を取り除いたのち、PBSにて洗浄を行い（15分×2回）、20% DMSO/エタノール、80%エタノール、50%エタノールでそれぞれ15分処理する透過処理を行った。さらに抗グルタミンシンターゼ（GS）抗体（Abcam, ab73593）、抗E-カドヘリン抗体（Abcam, ab76055）とこれらの抗体に結合する蛍光標識二次抗体（Novex Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Novex Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody（invitrogen））および核染色試薬（DAPI）を用いて免疫染色を行い、Visikol HISTO-M（Visikol Inc.）により透明化処理を行った。得られた染色検体の蛍光像観察をLSM880共焦点レーザー顕微鏡（Zeiss）により実施し、蛍光観察像を得た。結果を図５に示す。

 

Claims (15)

  1. 　チャンバー内に固定化された臓器オルガノイドおよび／または臓器を構成する細胞を、培養液を灌流しながら培養する方法であって、
    　前記培養液は、前記チャンバー内で乱流を生じるよう灌流される、培養方法。
  2. 　前記培養液が、前記チャンバー内で層流から乱流へ移行する時間、乱流を生じる時間、乱流から層流へ移行する時間のそれぞれが含まれるよう灌流される、請求項１に記載の培養方法。
  3. 　前記臓器オルガノイドおよび／または臓器を構成する細胞が、マトリックス中に包埋された状態で固定化されている、請求項１に記載の培養方法。
  4. 　前記臓器オルガノイドおよび／または臓器を構成する細胞が包埋されたマトリックスが、通気性膜に懸架させた状態でチャンバー内に固定化されている、請求項１に記載の培養方法。
  5. 　前記臓器オルガノイドが脈管構造を有している、および／または前記臓器を構成する細胞が脈管細胞と共存している、請求項１に記載の培養方法。
  6. 　前記臓器オルガノイドが肝または腎オルガノイドである、および／または前記臓器が肝臓または腎臓である、請求項１に記載の培養方法。
  7. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の培養方法を実施する工程を含む、立体臓器の製造方法。
  8. 　前記培養液が薬物を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の培養方法。
  9. 　前記薬物が、虚血を伴う疾患の治療用である、請求項８に記載の培養方法。
  10. 　請求項８または９に記載の培養方法を実施する工程を含む、薬効評価方法。
  11. 　請求項１～６のいずれか一項の培養方法により得られた臓器オルガノイド。
  12. 　請求項７に記載の製造方法により得られた立体臓器。
  13. 　請求項１２に記載の立体臓器の培地に薬物を添加する工程、および前記立体臓器に対する前記薬物の薬効を評価する工程を含む、薬効評価方法。
  14. 　臓器オルガノイドおよび／または臓器を構成する細胞を固定化して収容でき、前記臓器オルガノイドおよび／または臓器を構成する細胞に対して培養液を灌流するための流入口および流出口を備えたチャンバーと、
    　培養液を灌流させるための灌流手段とを備えた培養システムであって、
    　前記灌流手段は、前記チャンバー内で前記培養液に乱流を生じさせるよう制御される、培養システム。
  15. 　前記灌流手段が、前記チャンバー内で層流から乱流へ移行する時間、乱流を生じる時間、乱流から層流へ移行する時間のそれぞれが含まれるよう前記培養液を灌流するよう制御される、請求項１４に記載のシステム。

     
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