TW202214836A - 細胞培養方法 - Google Patents

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國立大學法人東京醫科齒科大學
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Abstract

本發明提供一種培養方法，係可長期培養臟器類器官並使之成熟，而適合用於製作立體臟器。本發明之培養方法係將被固定於腔室內的臟器類器官及/或構成臟器之細胞於灌流培養液同時進行培養的方法，其中，前述培養液係以在前述腔室內產生紊流的方式被灌流者。

Description

細胞培養方法
本發明係關於臟器類器官(organoid)及/或構成臟器之細胞的培養方法。更詳細而言，本發明係關於將臟器類器官及/或構成臟器之細胞於灌流培養液同時進行培養的方法。
以針對肝臟、腎臟等各種臟器之疾病的醫藥品開發和再生醫療的實現為目標，正在進行「使培養細胞自組織化，以製造出再現各臟器之三維結構和血管、膽管、其他脈管之複雜結構的細胞結構體(亦即，臟器類器官)」的研究開發。就此種臟器類器官之發展細胞結構體而言，藉由將包含未分化細胞的特定種類細胞加以組合並培養，亦能夠製作於發育初期所形成之臟器的原基，亦即器官芽(organ bud)(例如為肝臟之器官芽的肝芽)。此種亦被稱為「迷你臟器」之類器官，與傳統之單獨培養的臟器之細胞等相比，除了可以利用作為藥效或毒性的評估更接近於活體的評估系統外，亦可利用於移殖手術、和血漿蛋白質之產生等，利用價值極高。
一般而言，各種臟器類器官係藉由在培養液(液體培養基)為靜止的環境下之培養(靜態培養)而製作，惟亦有提案係在灌流有培養液的環境下之培養(灌流培養)。例如，在非專利文獻1中，係記載藉由將腎臟類器官進行灌 流培養，絲球體之血管變得發達等。又，在非專利文獻2中，係記載使用微流體裝置，將生物組織切片[腦組織之視交叉上核(SCN)]靜置於培養液滲透膜之上，並藉由控制培養液之灌流速度來將覆蓋組織之液體保持於適當量，以保持營養供給與呼吸之平衡，同時進行長期培養等。在非專利文獻3中，係記載藉由將肺上皮細胞以氣液界面(Air Liquid Interface ALI)灌流培養，能夠較靜態培養更為促進細胞之成長及分化等。再者，在此種臟器類器官、組織等之灌流培養中，一般而言，係使培養液以一定之速度灌流而形成「層流」，而且係以不要對臟器類器官、組織等施加剪應力(shear stress)之方式進行。
[先前技術文獻]
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Homan, K.A. et al.，「體外腎類器官的流動增強血管化及成熟」(Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro). Nat Methods 16, 255-262 (2019) doi:10.1038/s41592-019-0325-y
[非專利文獻2]Ota, N. et al.，「基於穩健之氣液交換的微流體平台，用於移殖組織之長期培養」(A Microfluidic Platform Based on Robust Gas and Liquid Exchange for Long term Culturing of Explanted Tissues). Analytical Sciences, Oct 2019, Vol.35
[非專利文獻3]「移殖組織之長期培養」(Long term Culturing of Explanted Tissues). Analytical Sciences, Oct 2019, Vol.35
依照傳統一般之靜態培養，並不容易將藉由長時間之培養而成熟的臟器類器官進一步製作為立體臟器。例如，若在靜態培養中將肝臟類器官進行長時間培養，係可見到難以維持成熟之肝細胞，約培養2週後發生細胞死亡，細胞密度降低，於細胞間產生空隙的問題。
本發明之課題在於提供一種培養方法，係可將臟器類器官進行長時間培養並使其成熟，而適合用於製作立體臟器。
本發明人等發現：藉由間歇地使灌流之培養液(液體培養基)的流量上升，亦即間歇地使腔室(chamber)內之培養液之流速間歇地上升，而對臟器類器官及/或構成臟器之細胞施加暫時性之過渡狀態的「紊流」，可製作由已成熟之細胞所構成的更高密度之臟器類器官或立體臟器，遂完成本發明。
亦即，本發明係為了解決上述課題而提供以下之[1]至[15]項者。
[1]
一種培養方法，係將被固定於腔室內之臟器類器官及/或構成臟器之細胞於灌流培養液同時進行培養的方法；
其中，前述培養液係以在前述腔室內產生紊流的方式被灌流。
[2]
如第1項所記載之培養方法，其中，前述培養液係在包含於前述腔室內從層流過渡至紊流之時間、產生紊流之時間、從紊流過渡至層流之時間之各段時間灌流。
[3]
如第1或2項所記載之培養方法，其中，前述臟器類器官及/或構成臟器之細胞係以被包埋於基質中的狀態被固定。
[4]
如第1至3項中任一項所記載之培養方法，其中，前述包埋有臟器類器官及/或構成臟器之細胞的基質係以被懸垂於通氣性膜之狀態固定於腔室內。
[5]
如第1至4項中任一項所記載之培養方法，其中，前述臟器類器官係具有脈管結構，及/或前述構成臟器之細胞係與脈管細胞共存。
[6]
如第1至5項中任一項所記載之培養方法，其中，前述臟器類器官為肝類器官或腎類器官，及/或前述臟器為肝臟或腎臟。
[6a]
如第1至5項中任一項所記載之培養方法，其中，前述臟器類器官為肝臟、腎臟、胰臟、甲狀腺、副甲狀腺、肺、腦或心臟之類器官。
[7]
一種立體臟器之製造方法，係包含實施第1至6項中任一項所記載之培養方法的步驟。
[8]
如第1至6項中任一項所記載之培養方法，其中，前述培養液包含藥物。
[9]
如第8項所記載之培養方法，其中，前述藥物為用於治療伴隨缺血之疾病。
[9a]
如第8項所記載之培養方法，其中，前述藥物係用於治療缺血性疾病、梗塞/壞死性疾病或出血性疾病。
[9b]
如第8項所記載之培養方法，其中，前述藥物係用於評估伴隨缺血或出血之副作用的安全性。
[10]
一種藥效評估方法，係包含實施第8或9項所記載之培養方法的步驟。
[10a]
一種藥物評估方法，係包含實施第8、9、9a或9b項所記載之培養方法的步驟，及評估前述藥物對於前述臟器類器官之有效性及/或安全性的步驟。
[11]
一種臟器類器官，係藉由第1至6項中任一項之培養方法所得到者。
[12]
一種立體臟器，係藉由第7項所記載之製造方法所得到者。
[13]
一種藥效評估方法，係包含在第12項所記載之立體臟器之培養基中添加藥物的步驟，及評估前述藥物對於前述立體臟器之藥效的步驟。
[13a]
一種藥物評估方法，係包含在第12項所記載之立體臟器之培養基中添加藥物的步驟，及評估前述藥物對於前述立體臟器之有效性及/或安全性的步驟。
[14]
一種培養系統，係具備：
腔室，該腔室可將臟器類器官及/或構成臟器之細胞固定並收容，且具備對前述臟器類器官及/或構成臟器之細胞灌流培養液用之流入口及流出口；以及
灌流培養液用之灌流手段；
其中，前述灌流手段係以使前述培養液於前述腔室內產生紊流之方式來控制。
[15]
如第14項所記載之系統，其中，前述灌流手段係將前述培養液控制成在包含於前述腔室內從層流過渡至紊流之時間、產生紊流之時間、從紊流過渡至層流之時間的各段時間進行灌流。
藉由本發明之培養方法，變得容易製作已成熟細胞的分布密度較以往高之臟器類器官，並變得容易由此種臟器類器官製作較以往優異的立體臟器。又，考量在藉由本發明之培養方法所得到的臟器類器官或立體臟器、或者利用該立體臟器之人工臟器中，或是在移殖了該立體臟器之再生醫療中，藥物作用之再現性係教以往高的條件下，係能夠進行各種藥物之有效性和安全性的評估。
[圖1]為在實施例(1及2共通)中所建構之培養裝置(本發明之培養系統)的概略圖。
[圖2]為表示在實施例(1及2共通)中產生紊流之送液條件(20mL/分鐘，間歇)，及在參考例中以非專利文獻1為基準之以往的不產生紊流的層流之送液條件(4mL/分鐘，連續)下，分別於送液前(圖2的上部)及送液中(圖2的下部)的培養腔室內之液體培養基的影像。液體培養基係藉由台盼藍(trypan blue)色素染色。在參考例之送液條件下，液體培養基係以整齊之線性狀態(亦即為層流)由左側之流入口流入至腔室內。相對於此，在實施例之送液條件下，液體培養基係於渦旋(亦即為紊流)同時流入至腔室內，又，已流入之液體培養基係撞上腔室之壁面而在腔室整體內產生紊流。
[圖3]為實施例1中之藉由灌流培養(本發明之培養方法)所得到的類器官(圖3的右部)及作為對照的比較例1中之藉由靜態培養所得到的類器官(圖3的左部)分別之光學顯微鏡圖像(側面及上面)、核染色圖像、及免疫染色圖像(ASGR1、CD31之雙重染色圖像。在彩色影像中分別係以紅色及綠色表示)之螢光圖像，以及從螢光圖像中之螢光區域面積所算出的ASGR1陽性率(平均±標準偏差，n=3之平均值)。
[圖4]為實施例2中之包含藉由灌流培養(本發明之培養方法)所得到的類器官之基質組成物(圖4的右部)，及作為對照的比較例2中之包含藉由靜態培養所得到的類器官之基質組成物(圖4的左部)的觀察圖像。
[圖5]為實施例2中之藉由灌流培養(本發明之培養方法)所得的類器官(圖5的右部)及作為對照的比較例2中之藉由靜態培養所得到的類器官(圖5的左部)之分別的免疫染色圖像(GS、上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)及DAPI之三重染色圖像。在彩色圖像中係分別以紅、綠及藍表示)。在實施例2之免疫染色圖像(右)中，係能夠確認到屬於成熟幹細胞標記的GS及上皮鈣黏蛋 白之表現，而且細胞密度充實；相對於此，在比較例2之免疫染色圖像(左)中，則未見到該等標記之表現，且特別是在類器官之中央部分可見到細胞之脫落。
[用於實施發明之型態]
臟器類器官等之培養方法
本發明之培養方法係將被固定在腔室內的臟器類器官及/或構成臟器之細胞或是組織(在本說明書中統稱為「臟器類器官等」)於灌流培養液同時進行培養的方法，其中，前述培養液以在前述腔室內可產生紊流的方式被灌流。
「腔室」意指被設置在培養容器(細胞培養裝置)內的部位，其係具有可收容培養對象的臟器類器官等的尺寸，以及可固定臟器類器官等的結構。一般而言，腔室係具備灌流培養液的流入口及流出口，而由寬度及高度較連通流入口及流出口之培養液流道更大的部位所構成。從流入口所流入之培養液，在與被固定之臟器類器官等接觸後，係從流出口流出。一般而言，細胞之灌流培養用的培養容器有在市面販售，而在本發明中，亦可使用相同之培養容器。
<紊流/層流>
在本發明中，所謂培養液於腔室內產生「紊流」，係意指腔室內之培養液的流動不均，而藉由目視可確認到於腔室內(尤其於被固定的臟器類器官等、或 包埋有臟器類器官等之基質的周圍，或於流入口或腔室之壁面的附近)係於培養液產生渦流，較佳係意指可確認到產生比既定之基準更高之程度(例如每單位時間之頻率或大小等)的渦流。另一方面，與後述本發明之一較佳實施型態相關的「層流」，係意指於腔室內之培養液的流動幾乎一致，藉由目視可確認到在腔室內(尤其是在經固定的臟器類器官等、或包埋有臟器類器官等之基質的周圍，或於流入口或腔室之壁面的附近)只產生比既定基準低之程度的渦流，較佳為在培養液中完全未能確認到產生渦流或幾乎未能確認到產生渦流。再者，當藉由配管流、明渠流等將腔室內之培養液灌流模組化，並能夠從代表長度(水力直徑，例如在將配管流中垂直於灌流方向之截面視為圓形時之直徑)、代表流速、密度及黏性係數等算出雷諾數(Reynolds number)的情況，亦可將該雷諾數與既定基準(一個例子為2300)比較，若較該既定基準大，則判定為紊流，若較該既定基準小，則判定為層流。
用以在腔室內使紊流產生之手段無特別限定，例如可為：藉由將腔室內之培養液之流量(例如藉由單位「毫升/分鐘」等所表示之值)或流速(藉由前述流量/腔室之截面積等所算出的值)調至比設定水準更高，以使培養液與腔室之壁面較強烈地碰撞，而使腔室內產生紊流。又，亦能夠是於腔室內設置使紊流產生之結構(突起等)，藉由培養液與該結構碰撞而使腔室內產生紊流。
在將被固定於腔室內之臟器類器官等於灌流培養液同時進行培養的期間，可在不改變條件而產生紊流之情形下進行培養，亦可在改變條件而產生紊流之情形下進行培養。
在本發明之一較佳實施型態中，培養液係在包含(i)於腔室內從層流過渡至紊流之時間、(ii)產生紊流之時間、(iii)從紊流過渡至層流之時間的各 段時間進行灌流。在此實施型態中，腔室內之培養液並非常時產生紊流，而是重覆進行下述狀態：(i)從層流過渡至紊流中途的狀態，(ii)產生紊流的狀態，(iii)從紊流過渡至層流中途的狀態，及(iv)產生層流(亦可為靜止)的狀態。上述狀態(i)至(iv)各者的時間並無特別限定，例如可依據灌流之培養液的流量或流速(以下將此等統稱為「流量等」。)而調節。亦即，狀態(i)之時間，可藉由從產生層流之既定流量等(以下稱為「第1流量等」)上升至產生紊流之既定流量等(以下稱為「第2流量等」)的時間來調節，或者可藉由在如後述之可自動變更流量等之泵浦等送液手段中，從第1流量等之設定切換為第2流量等之設定，而流道內及腔室內之流量隨之改變的時間來調節。同樣地，狀態(ii)之時間可藉由保持第2流量等之時間來調節，狀態(iii)之時間可藉由從第2流量等至降低為第1流量等的時間來調節，狀態(iv)可藉由保持第1流量等之時間來調節，或者，藉由對應各個送液手段的設定等來調節。例如，在某具備腔室之培養容器中，通常可以是將腔室內設定成產生「層流」之一般範圍的流量等作為「第1流量等」，而將比「第1流量等」更高、於以往非屬一般範圍之流量等作為「第2流量等」。
<臟器類器官等>
「臟器類器官」係以人為方式創造出之類似於臟器或組織的組織體(三維結構體)。本發明中的「臟器類器官」為各種臟器或組織之類器官的統稱，不僅包含就臟器或組織之類器官而言呈已成熟之階段者，亦包含在分化之初期階段被稱為「器官芽」、「原基」等的結構體。
再者，本發明亦可應用於非屬「臟器類器官」之「癌類器官」(例如參照日本特開2018-110575號公報)。亦即，依據本發明之培養方法，在以「癌類器官」取代「臟器類器官」而固定於腔室內，並以使腔室內產生紊流之方式灌流培養液來培養該癌類器官之情況下，能夠製作癌細胞以較以往更高的密度分布之癌類器官。因此，本說明書之「臟器類器官」能夠視需要而改稱為「癌類器官」，也能夠改稱為「臟器類器官」及「癌類器官」之統稱的「類器官」。又，亦可使用「癌類器官」來實施本發明之「藥物評估方法」。
就「臟器類器官」而言，已知有各式各樣之種類者，例如肝臟、胰臟、腎臟、心臟、肺臟、脾臟、食道、胃、甲狀腺、副甲狀腺、胸腺、生殖腺、腦、脊髓、皮膚、內耳等之類器官(例如參照https：//www.nejm.org/doi/pdf/10.1056/NEJMra1806175、https：//www.nature.com/articles/s41568-018-0007-6、http：//www.amsbio.com/brochures/organoid-culture-handbook.pdf)。因應實施本發明之培養方法的目的，係可使用各種臟器類器官，而例如肝臟、腎臟、胰臟、甲狀腺、副甲狀腺、肺、腦、心臟等之類器官等為本發明中較佳的臟器類器官等。此等臟器類器官特別是可以使用於實施如後所述缺血性疾病等的治療用之藥物的藥效評估方法。
各種臟器類器官之製作方法的基本實施型態，例如必要之細胞和培養條件係屬周知，而本發明之培養方法的實施型態亦為基本上可依據周知之臟器類器官的製作方法者。例如，WO2013/047639、WO2015/129822等所記載的將(A)構成臟器之細胞、(B)血管內皮細胞及(C)間葉系細胞(較佳為間葉系幹細 胞)共培養之方法，在本發明之培養方法中亦為用於製作臟器類器官的較佳方法。
本發明中「構成臟器之細胞或組織」，意指用於製作臟器類器官(視需要而與血管內皮細胞、間葉系細胞等其他細胞一起)使用的構成臟器類器官之至少一部分的必要細胞，或是包含這樣的細胞之組織。「構成臟器之細胞或組織」可以是不具有如臟器類器官之結構或特性之單純處於細胞聚集體[球狀體(spheroid)]之階段者，亦可為從個體分離出的細胞或組織(例如，來自患者之生物檢體樣本)。各種「構成臟器之細胞或組織」為周知，可依臟器類器官之種類來選擇細胞。再者，固定在腔室內之「構成臟器之細胞」可視需要而稱為「至少包含構成臟器之細胞或組織、用於製作臟器類器官的細胞或組織」。
就「構成臟器之細胞」而言，係包含(A1)構成臟器/組織之實質細胞、及(A2)構成臟器/組織之非實質細胞。又，就(A1)實質細胞及(A2)非實質細胞而言，，係分別包含：(m)分化成熟，或達到分化末期，具有作為實質細胞或非實質細胞之預定的功能性的細胞(在本說明書中簡稱為「分化細胞」)；及(n)具有成為實質細胞或非實質細胞之分化能力，或雖然註定要分化(被制約)但尚未分化，或者處於幹細胞或前驅細胞之階段，而尚未充分地具有作為實質細胞或非實質細胞之預定的功能性的細胞(在本說明書中簡稱為「未分化細胞」)。
就「構成臟器之細胞」而言，可使用選自實質細胞之分化細胞、實質細胞之未分化細胞、非實質細胞之分化細胞及非實質細胞之未分化細胞所組成之群組中的至少1種之細胞，較佳係使用能夠形成臟器類器官(較佳為器官芽)之2種以上細胞的組合。
就已分化之「實質細胞」而言，例如可列舉：肝臟之肝細胞、胰臟之內分泌細胞(例如α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、PP細胞)及胰管上皮細胞、腎臟之腎小管上皮細胞及絲球體上皮細胞、肺之肺泡上皮細胞、心臟之心肌細胞、腸道之上皮細胞、腦之神經細胞及膠質細胞、脊髓之神經細胞及神經鞘細胞(Schwann cell)等。
就已分化之「非實質細胞」而言，例如可列舉：肝臟之肝竇內皮細胞、肝星狀細胞及庫弗氏細胞(Kupffer cell)、胰臟之胰星狀細胞及胰微血管內皮細胞、腎臟之腎絲球體內皮細胞、肺之肺動脈內皮細胞及肺纖維母細胞、心臟之心微血管內皮細胞、大動脈內皮細胞、冠狀動脈內皮細胞及心纖維母細胞、腸道之腸管微血管內皮細胞、腦之腦微血管內皮細胞、血管周細胞、脈絡叢內皮細胞及腦血管外膜纖維母細胞等。
就具有分化成實質細胞或非實質細胞之能力的「未分化細胞」而言，例如可列舉：能夠分化為腦、脊髓、副腎髓質、表皮、毛髪/指甲/皮膚腺、感覺器官、末梢神經、水晶體等外胚層器官的細胞；能夠分化為腎臟、輸尿管、心臟、血液、生殖腺、副腎皮質、肌肉、骨骼、真皮、結締組織、間皮等中胚層器官的細胞；能夠分化為肝臟、胰臟、腸道、肺、甲狀腺、副甲狀腺、泌尿道等內胚層器官的細胞；等。
構成臟器之細胞可為初代培養細胞，亦可為繼代培養細胞(株化細胞)，亦可為使ES細胞、iPS細胞等分化所得到的細胞。
臟器類器官及/或構成臟器之細胞(臟器類器官等)可為源自人類者，亦可為源自人類以外之動物(例如小鼠、大鼠、狗、豬、猴等哺乳動物)者。亦即，臟器類器官等可為源自人類者，亦可為源自人類以外之動物者。從 在人類之醫藥開發中檢測出在以往之動物實驗或人類細胞試驗等中所難以發現的引起藥物中毒之藥物的觀點而言，類器官以源自人類者為較佳。就為了製作臟器類器官而視需要與構成臟器之細胞一起使用的其他細胞(血管內皮細胞、間葉系細胞等)而言亦同。
作為本發明之培養方法為應用對象的臟器類器官之臟器或組織的種類，只要是對應於用途者即可，無特別限定。以下係以肝類器官及腎類器官作為具體例來舉例說明，惟對於胰臟、甲狀腺、副甲狀腺、肺、腦、心臟、其他臟器之類器官，亦可同樣地實施本發明。
在本發明之一較佳實施型態中，臟器類器官為肝類器官(較佳為肝芽)，構成臟器之細胞為構成肝臟之細胞(肝臟之實質細胞及/或非實質細胞)。肝類器官(肝芽)可依據例如在WO2013/047639、WO2015/129822等中所記載的方法，藉由將肝臟內胚層細胞(相當於肝臟之實質細胞的未分化細胞)、血管內皮細胞及間葉系細胞(較佳為間葉系幹細胞)進行共培養而製作。
在「構成肝臟之細胞」中，肝臟之實質細胞(肝細胞)係包括已分化的肝細胞(分化肝細胞)、以及雖然註定要分化成肝細胞但尚未分化成為肝細胞的細胞(未分化肝細胞)之所謂的肝前驅細胞(例如肝臟內胚層細胞)這兩者之概念。分化肝細胞可為從活體採集(從活體內之肝臟單離出)之細胞，亦可為從ES細胞或iPS細胞等多潛能幹細胞、肝前驅細胞、其他具有分化成肝細胞之能力的細胞所分化得到的細胞。未分化肝細胞可為從活體採集者，亦可為使ES細胞或iPS細胞等多潛能幹細胞、其他幹細胞或前驅細胞分化而得到者。可分化為肝細胞之細胞，例如可依照K.Si-Taiyeb,et al.Hepatology,51(1)：297-305(2010)、T.Touboul,et al.Hepatology.51(5)：1754-65(2010)製作。使ES細胞或 iPS細胞等多潛能幹細胞、肝前驅細胞、其他具有分化為肝細胞之能力的細胞分化為肝細胞之方法為周知，例如可依據Hepatology,2010；51(1)：297-305、Cell Rep.2017；21(10)：2661-2670等所記載之方法從iPS細胞進行。關於從活體採集之細胞團、藉由ES細胞或iPS細胞等之分化誘導所製作出的細胞團，其中任一者(尤其是後者)都可以使用分化肝細胞之純度高的細胞團或未分化肝細胞之純度高的細胞團，亦可使用以任意比率包含分化肝細胞及未分化肝細胞之細胞混合物。
某細胞是否為分化肝細胞，係可藉由成熟肝細胞標記[例如以去唾液酸糖蛋白受體1(ASGR1)、麩醯胺合成酶(GS)、上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)；屬於未成熟肝細胞標記(初期肝分化標記)之α胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)；屬於初期肝分化標記之白蛋白(ALB)、視黃醇結合蛋白質(RBP4)、運甲狀腺素蛋白(transthyretin)(TTR)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)等之中的1種或2種以上]的表現是否為陽性來判別。另一方面，某細胞是否為未分化肝細胞，係可藉由以HHEX、SOX2、HNF4α、AFP、ALB等之中的1種或2種以上之細胞標記的表現是否為陽性(就ALB而言係是否為弱陽性)來判別。
「血管內皮細胞」為包括造血性血管內皮細胞(hemogenic endothelial cell；HEC)及非造血性血管內皮細胞(non-hemogenic endothelial cell；non-HEC)這兩者之概念的用語。HEC為可產生造血幹細胞(具有造血能力)的血管內皮細胞，亦被稱為血球產生型血管內皮細胞。另一方面，non-HEC為不具有該種造血能力的血管內皮細胞。藉由使用血管內皮細胞，可賦予臟器類器官微細的血管網。
血管內皮細胞可為從活體採集之血管內皮細胞[例如，微血管內皮細胞(microvessel endothelial cells，MVEC)、肝竇內皮細胞(liver sinusoidal endothelial cells，LSEC)、臍靜脈內皮細胞(umbilical-vein endothelial cells，UVEC)等]之純度高的細胞團，亦可為使ES細胞和iPS細胞等多潛能幹細胞、其他具有分化成血管內皮細胞之能力的細胞分化而得到之血管內皮細胞之純度高的細胞團。
使ES細胞或iPS細胞等多潛能幹細胞、其他具有分化成血管內皮細胞之能力之細胞分化成為造血性血管內皮細胞(HEC)的方法為周知，例如可依據PLoS One,2013；8(4)：e59243、Nat Biotechnol.2014；32(6)：554-61、Sci Rep.2016；6：35680等記載之方法而由iPS細胞進行。
某細胞是否為血管內皮細胞，係可藉由以例如TIE2、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、CD41等血管內皮細胞之標記中的1種或2種以上是否為陽性(若為陽性，則為血管內皮細胞)來判別。又，某細胞是否為已分化之血管內皮細胞，可進一步藉由CD31、CD144等標記中的1種或2種以上是否為陽性(若為陽性則為已分化之血管內皮細胞)來判別。
「間葉系細胞」意指主要存在於源自中胚層之結締組織，形成於組織中發揮功能的細胞之支持結構的結締組織細胞，其係包括已分化之細胞(分化間葉系細胞)，以及雖然註定要分化成間葉系細胞之但尚未分化成間葉系細胞的細胞(未分化間葉系細胞)之所謂的間葉系幹細胞這兩者之概念的用語。不過，「血管內皮細胞」雖為由未分化間葉系細胞所分化之細胞的一種，但是被本說明書中所定義的「間葉系細胞」排除於外。
某細胞為未分化間葉系細胞或分化間葉系細胞，係可藉由例如Stro-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD133、CD271、Nestin等未分化間葉系細胞之標記中的1種或2種以上是否為陽性(若為陽性，則為未分化間葉系細胞；若為陰性，則為分化間葉系細胞)來判別。
間葉系細胞可為視本發明中作為目標之臟器類器官和組合使用的「構成臟器/組織之細胞」而進一步對特定臟器(組織)表現特異性之細胞標記者。就該種細胞標記而言，例如可列舉：屬於橫膈間葉(septum transversum mesenchyme)(STM)之細胞標記的FOXF1、COL4A及ALCAM。
在本發明之一較佳實施型態中，臟器類器官為腎類器官(較佳為腎臟原基)，構成臟器之細胞為構成腎臟的細胞(腎臟之實質細胞及/或非實質細胞)。腎類器官及腎臟原基係可依據例如於WO2013/047639、WO2015/129822等所記載之方法，而藉由將腎臟或後腎之細胞、血管內皮細胞及間葉系細胞(較佳為間葉系幹細胞)進行共培養而製作。於腎類器官(腎臟原基)之製作所使用的血管內皮細胞及間葉系細胞，係與於前述肝類器官(肝芽)之製作所使用者相同。
「構成腎臟之細胞」中，腎臟之實質細胞(腎絲球體內皮細胞、絲球體上皮細胞、近曲小管細胞、亨耳氏環(Henle’s loop)細胞、遠曲小管細胞)，係包括已分化為實質細胞的細胞(分化腎細胞)、以及雖然註定要分化成實質細胞但尚未分化的細胞(未分化腎細胞)之所謂的腎前驅細胞這兩者的概念。分化腎細胞可為從活體採集(從活體內之腎臟等單離出)之細胞，亦可為使ES細胞或iPS細胞等多潛能幹細胞、腎前驅細胞、其他可具有分化成腎臟之實質細胞之能力的細胞分化所得到的細胞。未分化腎細胞可為從活體採集者，亦可為使ES 細胞或iPS細胞等多潛能幹細胞、其他幹細胞或前驅細胞分化而得到者。可分化為腎細胞之細胞，係例如可依照Morizane et al.,Nat Protoc 12：195-207(2017)、Taguchi et al.,Cell Stem Cell 14(1)：53-67(2014)、Narayanan et al.,Kidney Int.83(4)：593-603(2013)等而製作。使ES細胞或iPS細胞等多潛能幹細胞、腎前驅細胞、其他具有分化為腎細胞之能力之細胞分化為腎細胞的方法為周知，例如可與上述同樣地依照Morizane et al.,Nat Protoc 12：195-207(2017)、Taguchi et al.,Cell Stem Cell 14(1)：53-67(2014)、Narayanan et al.,Kidney Int.83(4)：593-603(2013)等之記載而由iPS細胞進行。關於從活體採集之細胞團、藉由ES細胞或iPS細胞等之分化誘導而製作的細胞團之任一者(尤其關於後者)，均可使用分化腎細胞之純度高的細胞團或未分化腎細胞之純度高的細胞團，也可以使用以任意比率包含分化腎細胞及未分化腎細胞的細胞混合物。
某細胞是否為分化腎細胞，係可藉由成熟腎細胞標記，例如PODXL、LTL、CDH1等之中的1種或2種以上的表現是否為陽性來判別。另一方面，某細胞是否為未分化腎細胞，則可藉由SIX2、SALL1等之中的1種或2種以上之細胞標記的表現是否為陽性來判別。
在本發明之一較佳實施型態中，臟器類器官係具有脈管結構，及/或前述構成臟器之細胞係與脈管細胞共存。所謂之「具有脈管結構」，具體上係意指在類器官之製作中，藉由使構成臟器之細胞與脈管細胞共存(共培養)，而在臟器類器官形成微細的脈管結構。
就「脈管細胞」而言，例如可列舉：血管內皮細胞、血管平滑肌細胞及周細胞。例如，藉由將肝臟內胚層細胞(相當於肝臟之實質細胞的未分化細胞)、血管內皮細胞及間葉系細胞(較佳為間葉系幹細胞)進行共培養，可製作 具有脈管結構之肝類器官。又，藉由將腎臟或後腎之細胞、血管內皮細胞及間葉系細胞(較佳為間葉系幹細胞)共培養，可製作具有脈管結構的腎類器官。
從構成臟器之細胞及視需要使用之其他細胞是否得到臟器類器官一事，係例如可藉由以肉眼或顯微鏡觀察，而確認是否形成立體結構(三維結構)來判斷。又，臟器類器官之製作，除此種立體結構之形成外，還可以藉由就既定之細胞標記，尤其是臟器之實質細胞的標記是否為陽性(例如陽性細胞之比率是否超過既定基準)，並視需要而進一步藉由培養上清液中是否有該等標記之蛋白質分泌(例如分泌量是否超過既定基準)來判別。例如，若為肝類器官或肝芽，則可將「HHEX、SOX2、AFP、ALB、HNF4α等標記之表現是否為陽性」及/或「培養上清液中是否分泌白蛋白(ALB)」用於判斷。若為腎類器官或腎臟原基，則可將「SIX2、SALL1、PODXL、LTL、CDH1等之標記之表現是否為陽性」用於判斷。
<固定/基質>
在本發明之培養方法中，臟器類器官及/或構成臟器之細胞(臟器類器官等)係固定於腔室內。用於「固定」之手段無特別限定，只要能夠使臟器類器官等不會因為以在腔室內產生紊流之方式灌流的培養液而流失至腔室外即可。例如，可以藉由將腔室底部之全部或一部分以基質(與用於包埋臟器類器官等者相同，詳述於後)或與類似於該基質之支架材料(scaffolding)等被覆，並在該被覆物上接種臟器類器官等(用於製作臟器類器官的既定細胞)進行平面培養，而將臟器類器官等固定於腔室內。又，如後述之本發明的較佳實施型態般地將臟器類器官等包埋於基質中，例如將包埋有臟器類器官等之基質懸垂於通氣性膜，亦為用於將臟器類器官等固定在腔室內的合適手段。
在本發明之一較佳實施型態中，臟器類器官及/或構成臟器之細胞(臟器類器官等)係以已被包埋在基質中的狀態被固定。
就用以包埋臟器類器官等之「基質」而言，可使用一般的細胞外基質，其係在室溫以上為固體，而能夠用於細胞培養，尤其是能夠用於三維細胞培養者。細胞外基質基本上是以纖維狀蛋白質及蛋白多糖(proteoglycan)為主成分，如此之成分可列舉：彈性蛋白、巢蛋白(entactin)、黏骨素(osteonectin)、膠原蛋白(IV型膠原蛋白等)、生腱蛋白(tenascin)、凝血酶敏感蛋白(thrombospondin)、珍珠素(perlecan)、玻連蛋白(vitronectin)、小纖維蛋白(fibrillin)、纖網蛋白(fibronectin)、肝素(硫酸鹽)、層連結蛋白(laminin)等。例如，本發明中較佳基質之一例為已知商品名為「Matrigel」(Corning)之含有層連結蛋白、膠原蛋白(IV型膠原蛋白)及巢蛋白，且一併含有EGF、IGF-1、PDGF、TGF-β等生長因子的基底膜基質。又，已知為水凝膠(hydrogel)之自組裝肽(self-assembled peptides)，例如包括精胺酸、甘胺酸及天冬醯胺酸(asparagine)的水凝膠等亦可使用作為本發明之基質。基質可係使用任一種，亦可係將2種以上混合，或者是不混合(而以在固化時形成相異之層的方式)使用。
若為所屬技術領域中具有通常知識者，自當可以使包埋有臟器類器官等的基質(以下稱為「基質組成物」)成為具有適當的固化度之方式，就基質之組成或濃度(原液、或稀釋物)進行適當調整。例如，為了提高操作性，同時使固化時具有適當的固化度，基質(例如Matrigel)係可視需要而與培養液混合使用。就此種實施型態中用於與基質混合之培養液而言，可使用與本發明之培養方法中用於灌流、培養臟器類器官等的培養液相同者。
一般而言，基質組成物可藉由在包含臟器類器官等之培養液中添加含有適當成分的適量基質後，使基質固化(視需要而添加用於使水凝膠固化之離子性溶液或離子性分子)而製作。例如，藉由將在4℃以下呈液體狀態之基質(例如Matrigel)與臟器類器官等攪拌混合後，於37℃以上靜置使基質固化，而能夠得到基質組成物。在懸浮較多量的臟器類器官等之培養基中添加基質的情況下，係以藉由添加充分量之基質，令基質之固化度充分，而適當地使臟器類器官等不沉澱至底部地保持於基質中為宜。
基質組成物可為例如下述之(i)至(iii)的任一種。
(i)藉由從既定的細胞製作出臟器類器官之後，將該類器官單離，與基質混合而得到者。
(ii)藉由以三維培養而從既定的細胞製作出臟器類器官之後，將該臟器類器官與基質混合而得到者。
(iii)藉由在包含製作臟器類器官用之既定的細胞(構成臟器之細胞)的細胞團中添加基質並固化之後，將被包埋於基質中的狀態之細胞團進行培養並製作臟器類器官而得到者。
將被包埋於基質中之狀態的臟器類器官及/或構成臟器之細胞(臟器類器官等)，亦即，基質組成物，固定於腔室內的手段並無特別限定。只要是灌流之培養液可以紊流之狀態與包埋臟器類器官等之基質接觸之方式來配置於腔室內之適當場所即可。在本發明中，例如可藉由將固定前之臟器類器官等與基質之混合物滴入至腔室內之適當場所，並將基質固化，而使臟器類器官等(以包埋在基質中的狀態)固定於腔室內。
在本發明之一較佳實施型態中，包埋有臟器類器官及/或構成臟器之細胞的基質(基質組成物)，係以懸垂於通氣性膜之狀態固定於腔室內。
「通氣性膜」為至少具有氧穿透性，並視需要而進一步具有二氧化碳、其他期望的氣體之穿透性的膜。各種通氣性膜為周知，例如可列舉：以聚對苯二甲酸乙二酯(PET)、聚二甲基矽氧烷(PDMS)、氟碳化物、聚四氟乙烯(PTFE)、聚胺酯等的纖維所製作的膜。通氣性膜可視需要而進行提高或降低細胞附著性之表面處理，例如以膠原蛋白等細胞外基質(extracellular matrix，ECM)塗覆之處理。又，通氣性膜亦可為視需要而與以和通氣性膜相異之纖維製成的多孔質膜(網膜(mesh))所積層而成者[混成膜(hybrid film)]。
「懸垂於通氣性膜之狀態」之基質組成物，係可藉由將固化前之基質組成物滴於通氣性膜上，使其固化後，將呈附著於通氣性膜之狀態的已固化基質組成物以成為向下(朝下凸出)的方式令其上下顛倒而製作出。藉由將基質組成物呈懸垂狀態的通氣性膜用保持具等適當的構件而固定在腔室內(例如頂部)，可使基質組成物浸漬於灌流之培養液中，而且通氣性膜可不浸漬培養液地置於大氣中(或期望之培養氣體環境中)，藉此，可以確保被包埋於基質中的臟器類器官等經由通氣性膜進行氣體交換，並進行培養。
<培養液>
在本發明中所灌流之培養液(液體培養基)，只要是選擇對應於臟器類器官及/或構成臟器之細胞(臟器類器官等)的種類之適當者即可。臟器類器官等之培養基為周知，一般而言，係可使用混合有用於培養製作臟器類器官用之構成臟器之細胞(通常為混合有複數種細胞的細胞團)的培養基者。例如，在培養肝類 器官及/或構成肝臟之細胞的情況下，係可使用肝細胞用之培養基與血管內皮細胞用之培養基的混合培養基，在培養腎類器官及/或構成腎臟之細胞的情況下，係可使用腎細胞用之培養基及血管內皮細胞用之培養基的混合培養基。
就血管內皮細胞用之基礎培養基而言，例如可列舉：DMEM/F-12(Gibco)、Stempro-34 SFM(Gibco)、Essential 6培養基(Gibco)、Essential 8培養基(Gibco)、EGM(Lonza)、BulletKit(Lonza)、EGM-2(Lonza)、BulletKit(Lonza)、EGM-2 MV(Lonza)、VascuLife EnGS Comp Kit(LCT)、人類內皮-SFM基本生長培養基(Human Endothelial-SFM Basal Growth Medium)(Invitrogen)、人類微血管內皮細胞增殖培養基(TOYOBO)等。就血管內皮細胞用之添加物而言，例如可列舉：選自由B27補充劑(GIBCO)、BMP4(骨成形因子4)、GSKβ抑制劑(例如CHIR99021)、VEGF(血管內皮細胞生長因子)、FGF2(纖維母細胞生長因子(Fibroblast Growth Factor){亦稱為bFGF[鹼性纖維母細胞生長因子(basic fibroblast growth factor)]}、毛喉素(Folskolin)、SCF(幹細胞因子)、TGFβ受體抑制劑(例如SB431542)、Flt-3L[Fms-相關酪胺酸激酶3配體(Fms-related tyrosine kinase 3 ligand)]、IL-3(介白素3)、IL-6(介白素6)、TPO[促血小板生成素(thrombopoietin)]、hEGF(重組人類上皮細胞生長因子)、氫化可體松(hydrocortisone)、抗壞血酸、IGF1、FBS(胎牛血清)、抗生素[例如，建它黴素(gentamicin)、雙性殺黴素B(amphotericin B)]、肝素、L-麩醯胺、酚紅及BBE所組成之群組中的1種以上。
就肝細胞用之基礎培養基而言，例如可列舉RPMI(FUJIFILM)、HCM(Lonza)等。就肝細胞用之添加物而言，例如可列舉選自Wnt3a、活化素A(activin A)、BMP4、FGF2、FBS、HGF(肝細胞生長因子)、抑癌蛋白 M(oncostatin M，OSM)及地塞米松(dexamethasone，Dex)所組成之群組中的1種以上。肝細胞用之培養基中，可視需要而添加選自抗壞血酸、BSA-FAF、胰島素、氫化可體松及GA-1000中的至少1種。更具體而言，作為肝細胞用之培養基，係例如可列舉：從HCM BulletKit(Lonza)除去了hEGF(重組人類上皮細胞生長因子)之培養基；在RPMI1640(Sigma-Aldrich)中添加有1% B27補充劑(GIBCO)及10ng/mL hHGF(Sigma-Aldrich)的培養基。尤其，在製作肝芽之情況，例如亦可使用在將EGM BulletKit(Lonza)及從HCM BulletKit(Lonza)除去了hEGF(重組人類上皮細胞生長因子)者以1：1混合而成之培養基中，添加有地塞米松、抑癌蛋白M及HGF的培養基。
就腎細胞用之基礎培養基而言，例如可列舉ReproFF2(REPROCELL)、StemFit Basic(味之素)等。就腎細胞用之添加物而言，例如可列舉FGF9。在腎細胞用之培養基中，係可視需要而添加選自由CHIR及肝素所組成之群組中的1種以上。更具體而言，作為腎細胞用之培養基，例如可列舉在ReproFF2中添加有10ng/mL FGF9(R&D)之培養基。尤其，在製作腎臟原基時，例如亦可使用在ReproFF2中添加有3μM CHIR及10ng/mL FGF9(R&D)之培養基。
培養液(液體培養基)之黏度，只要能進行灌流即無特別限定，惟從在腔室中容易產生紊流的觀點來看，在培養條件下(例如約37℃)的溫度中，係例如以0.7至0.8mPa‧s為較佳。
<培養條件等>
關於本發明之培養方法的其他條件，例如氣體環境、溫度、時間等，可因應實施本發明之培養方法的目的或臟器類器官等之實施型態而適當進行調整。例如，為了從構成臟器之細胞及視需要而使用的其他細胞來形成作為肝臟、腎臟等臟器類器官的立體結構或其器官芽(原基)，係可於5%CO2、30至40℃(較佳為約37℃)進行1至10日[若為器官芽(原基)，則為1至3日]。
<藥物>
在本發明之一較佳實施型態中，培養液係包含藥物。「藥物」若為對臟器類器官等作用者、或用於分析是否作用者，即無特別限定，可依目的而進行選擇。「藥物」只要是可使用作為小分子藥物、抗體藥物、胜肽藥物(peptide-drug)、核酸藥物等醫藥品之有效成分者，即無特別限定。再者，亦可將在肝動脈化學塞栓術中用於栓塞血管之物質(明膠海綿、多孔質明膠粒等)作為培養液(尤其是臟器類器官之脈管結構之培養液)中的藥物，或者可以作為如後所述之(可移殖至非人類動物)之立體臟器用的藥物評估方法中的藥物。「藥物」並不限定於實際上作為醫藥品而於市面販售的藥物，亦可為在臨床試驗或非臨床試驗中所用的藥物，或於試驗前之階段的開發中藥物(醫藥品之候選有效成分)。
本發明之較佳藥物之一係例如為各臟器的缺血性疾病(伴隨缺血之疾病)、梗塞/壞死性疾病、或出血性疾病(在本說明書中，將此等疾病統稱為「缺血性疾病等」)之治療用的藥物。在對應於各臟器之類器官等的培養液中，可添加該臟器之缺血性疾病等的治療藥而進行培養。就肝臟之缺血性疾病等而言，可列舉如：缺血性肝損害(缺血性肝炎)、缺血性膽管損害、肝破裂(由於癌、外傷、感染症等造成之二次性出血)。就腎臟之缺血性疾病等而言，例如可 列舉缺血性腎損害、特發性腎出血(Idiopathic renal hemorrhage)。就於日本等國核准的缺血性腎損害之治療藥而言，可列舉如依庫珠單抗(eculizumab)。就胰臟之缺血性疾病等而言，例如可列舉缺血性急性胰臟炎、缺血性慢性胰臟炎。就甲狀腺或副甲狀腺之缺血性疾病等(血流量減少等)而言，例如可列舉亞急性甲狀腺炎、無痛性甲狀腺炎。就心臟之缺血性疾病等而言，例如可列舉缺血性心臟疾病。就日本等國所承認的缺血性心臟疾病之治療藥而言，可列舉例如異山梨醇硝醇脂(isosorbide dinitrate)。就腦之排斥性疾病等而言，例如可列舉腦缺血。
又，從其他方面來看，就安全性評估用藥物而言，在各臟器有伴隨缺血或出血之副作用之疑慮的藥物亦成為本發明的較佳藥物。就副作用有伴隨缺血之疑慮的藥物而言，例如可列舉對肝臟造成嚴重的藥物性肝損傷(drug-induced liver injury)之抗癌劑、抗病毒藥、乙醯胺酚(acetaminophen)等，此外還可列舉抗菌藥物(涵蓋多種臟器)、強心藥物、類固醇(心臟)、利尿藥、腎素-血管收縮素系統(Renin-Angiotensin System，RAS)抑制藥物、造影劑、SGLT2抑制藥物(腎臟)等；就副作用有伴隨出血之疑慮的藥物而言，例如可列舉抗血小板藥、血栓溶解藥等。
藥物評估方法
本發明之培養方法係可藉由使用包含藥物之培養液，而應用於用以評估該藥物的方法。就以何種觀點來評估藥物而言，並無特別限定，例如當藥物為用於治療各臟器之缺血性疾病等者的情況下，可評估其治療的有效性。又，當藥 物為於各臟器有伴隨缺血或出血之副作用的疑慮者的情況下，可評估藥物之安全性。
亦即，依據本發明的使用臟器類器官等之藥物評估方法，係包括使用含有如上所述之藥物的培養液來實施本發明之培養方法的步驟(以下稱為「藥物添加培養步驟」)，並進一步包括對於臟器類器官之藥物之有效性及/或安全性進行評估的步驟。
更具體而言，就依據本發明的藥物有效性之評估方法(在本說明書中有時稱為「藥效評估方法」)而言，例如可列舉包括藥物添加培養步驟的藥物評估方法，前述藥物添加培養步驟係使用包含肝臟、腎臟等缺血性疾病等之治療用藥物的培養液來實施。又，就依據本發明之藥物安全性的評估方法而言，例如可列舉包括藥物添加步驟的藥效評估方法，前述藥物添加步驟係使用在各臟器有伴隨缺血或出血之副作用的疑慮之藥物來實施。
藥物添加培養步驟中之培養條件(氣體環境、溫度、時間等)，基本上可與本發明之培養方法中的培養條件相同，並可視需要而適宜調節，例如可因應藥物而調整成充分進行評估用的培養時間。
本發明之藥物評估方法亦可視需要而包含藥物添加培養步驟以外之步驟。例如，可包含評估藥物之有效性及/或安全性的步驟，該步驟係：對於經過藥物添加培養步驟之包含於臟器類器官等中之細胞(i)使用試劑[例如碘化丙啶(propidium iodite)；PI]以檢測死細胞，並測定細胞中的死細胞之比率(細胞死亡率)，及/或(ii)測定反映出治療對象的疾病之症狀之生物標記的產生量(例如培養上清液中的特定物質之濃度)，並與對照組比較。
在本發明之藥物評估方法中，臟器類器官等較佳為源自身為藥物之治療對象之疾病的已發病的患者(人類)或其他對象。在此實施型態中，構成臟器之細胞及視需要而使用的其他細胞可為從如此之患者或對象採集之細胞(初代培養細胞)，亦可為使用該初代培養細胞所製作出的iPS細胞或繼代培養細胞(株化細胞)。例如，就用於製作臟器類器官，亦即，就用於分化誘導成製作臟器類器官用之構成臟器的細胞及視需要使用的其他細胞而言，係以使用從缺血性疾病等之患者採集之細胞所製作的iPS細胞株來作為本發明之藥物評估方法的標準品為宜。
本發明之藥物評估方法，在以如後述之製造方法所得到之立體臟器來取代臟器類器官等(臟器類器官及/或構成臟器之細胞)作為對象的情況下，亦可以同樣方式進行。例如，在本發明之一較佳實施型態中，使用立體臟器的本發明之藥物評估方法係可設為包括在立體臟器之培養基中添加藥物的步驟、及評估藥物對於立體臟器之有效性(藥效)及/或安全性的步驟者。
再者，本發明亦提供一種藥物評估方法，其係包括對移殖有立體臟器之非人類動物投予藥物之步驟、及評估藥物對於該立體臟器之有效性及/或安全性之步驟。
立體臟器之製造方法
本發明之立體臟器的製造方法係包括實施如上所述之本發明之臟器類器官等的培養方法的步驟。「立體臟器」亦被稱為成熟臟器類器官，其係包含比臟器類器官更進一步成熟之細胞團或結構的結構體。
本發明之立體臟器之製造方法中的培養條件(氣體環境、溫度、時間等)，基本上係可設為與本發明之培養方法中之培養條件相同，並可視需要而適宜調節，例如設為形成立體臟器的充分之培養時間。例如，在製造肝臟、腎臟等立體臟器的情況下，可列舉：從開始培養製作各臟器類器官用之既定細胞之日算起，進行20至30日的培養；或從可確認形成該等臟器類器官之立體結構之日算起，為了使其成熟而進一步培養10至20日等。
就是否從臟器類器官得到立體臟器而言，係例如可從結構體中細胞之密度(是否超過既定基準等)、結構體之立體形狀(是否較一定水準更為立體等)、功能或性狀(是否獲得代謝功能等預定的功能性或性狀等)、細胞標記(細胞標記之基因或蛋白質之表現是否為陽性，陽性細胞之密度是否超過既定基準，培養上清液中之標記蛋白質分泌量是否超過既定基準等)等中之一個或複數個觀點來判定。上述之細胞密度、立體形狀、功能或性狀、細胞標記等，係可因應臟器類器官及立體臟器而適宜設定，例如，可以將是否達成活體內之臟器相同的程度、或與活體內之臟器的程度近似之水準來作為如上述的判定之基準。
例如，在製作為立體臟器之肝臟時，係例如可用ASGR1陽性細胞是否以70%以上之密度存在來判斷麩醯胺、檸檬酸產生或糖質新生(gluconeogenesis)等代謝功能的獲得與否，或ASGR1和藥劑代謝酵素(CYP3A4、CYP7A1)等標記的表現是否為陽性。在製作為立體臟器之腎臟的情況，係可使用PODXL、LTL、CDH1等標記；纖毛蛋白(PKD1、PKD2、NPHP1、NPHP6、PKHD1)、運輸蛋白(SLC34A1、ATP1A1、SLC6A19、SLC9A3、SLC2A2、ABCB1、LRP2)等之表現係一部分或複數個為陽性來判斷。
從立體臟器，可藉由與體外循環連結，而製作人工臟器。此種人工臟器係可利用作為器官衰竭模型、或用於評估臟器之功能。此種用途可參照例如WO2013/047720等。
培養系統
本發明之培養系統，係可固定並收容臟器類器官及/或構成臟器之細胞(臟器類器官等)，其中，該培養系統具備：備有對臟器類器官等灌流培養液用之流入口及流出口的「腔室」、與用於灌流培養液之「灌流手段」；灌流手段係以使培養液於腔室內產生紊流之方式進行控制。
關於腔室，其與本發明之「臟器類器官等之培養方法」的關係如前所述，本發明之培養系統係使用此種腔室或設置有該種腔室之培養容器(細胞培養裝置)者。
就本發明之培養系統中的灌流手段而言，可採用將類器官等或其他組織、細胞等灌流培養所用的一般或周知之手段。灌流手段就典型而言，基本構成係包含：用於輸送培養液之泵浦(蠕動泵浦等)或其他送液手段、用於貯留培養液之貯液槽(reservoir)、及分別將貯液槽與泵浦等、泵浦等與腔室之流入口，腔室之流出口與貯液槽予以連結的流道(管路等)等。
灌流手段，尤其是泵浦等送液手段，較佳係將流量等以可自動地於任意(預先設定之)時機變更之方式來進行控制。例如，在本發明之一較佳實施型態中，灌流手段係將前述培養液控制成在包含(i)腔室內從層流過渡至紊流之時間、(ii)產生紊流之時間、(iii)從紊流過渡至層流之時間的各段時間灌流。在此實施型態中，可以是在上述(i)至(iii)之時間再加上(iv)產生層流(亦可靜態) 之時間，並連續重覆此等時間來進行控制。例如，可將「以第1流量等進行送液既定時間，或不送液既定時間(相當於第1流量等為零之情況)，繼而，以第2流量等進行送液既定時間」設為1循環，並重覆進行既定循環數(經過既定時間)。再者，灌流手段，尤其是泵浦等送液手段的控制程式，亦可作為構成本發明之培養系統的一部分。
本發明之培養系統，亦可視需要而具備一般或周知之灌流培養用之培養系統所用的其他手段、構成等。就此種手段、構成等而言，例如可列舉將培養環境保持於適當溫度及氣體環境的手段(溫度控制裝置/機構、氣體環境控制裝置/機構等)。
[實施例]
[實施例1]
[1]人類非造血性血管內皮細胞之製作
藉由將人類iPS細胞(1383D2；京都大學iPS研究所)在添加有1% B-27補充劑(GIBCO)、BMP4(25ng/mL)及CHIR99021(8μM)之DMEM/F-12(Gibco)(10mL)培養基中，於5%CO2、37℃下進行培養3日，誘導為中胚層系細胞。藉由將所得到之中胚層細胞進一步在添加有VEGF(200ng/mL)及毛喉素(2μM)的Stempro-34 SFM培養基(Gibco)(10ml)中，於5%CO2、37℃進行培養7日，而得到CD31陽性、CD73陽性及CD144陽性之人類非造血性血管內皮細胞團。
[2]人類肝臟內胚層細胞之製作
藉由將人類iPS細胞(1383D2；京都大學iPS研究所)在添加有Wnt3a(50ng/mL)及活化素A(100ng/mL)之基礎培養基RPMI(FUJIFILM)(2ml)中，於5%CO2、37℃進行培養5日，誘導為胚層系細胞。將所得到之內胚層系細胞，在添加有1% B27補充劑(GIBCO)及FGF2(10ng/mL)之前述基礎培養基中，於5%CO2、37℃進一步培養5日，而得到AFP、ALB及HNF4α為陽性之人類肝臟內胚層細胞團。
[3]人類間葉系細胞之製作
藉由將人類iPS細胞(1383D2；京都大學iPS研究所)在添加有1% B-27補充劑(GIBCO)、BMP4(25ng/mL)及CHIR99021(8μM)之基礎培養基DMEM/F-12(Gibco)(10mL)中，於5%CO2、37℃進行培養3日，而誘導為中胚層系細胞。將所得到之中胚層系前驅細胞於添加有PDGFBB及活化素A之相同培養基中，於5%CO2、37℃進一步培養3日。回收培養後之細胞，並再接種於新的塗覆有明膠之培養盤中，在前述基礎培養基中添加bFGF及BMP4，並於5%CO2、37℃進一步培養4日，藉此得到FOXF1、COL4A、ALCAM及CD73為陽性之人類間葉系細胞團。
[4]對細胞外基質之細胞包埋及基質組成物之製作
調製將在HCM(Lonza公司製)中添加有FBS、HGF、OSM及Dex之肝誘導培養基與EGM(Lonza)以1：1之體積比率混合成的培養基(本說明書中稱為「類器官用培養基」)。再者，調製將類器官用培養基與Matrigel(BD Pharmingen)以 1：1之體積比率混合成的基質(於本說明書中係稱為「類器官用培養基/Matrigel混合基質」。
將類器官用培養基/Matrigel混合基質5μL滴於經反轉之懸滴插件(hanging drop insert)(Millipore)上，並藉由提高溫度至37℃而使其固化，形成「第三基質層」。
將以如上述方式製作出之人類肝臟內胚層細胞、人類非造血性內皮細胞及人類間葉系細胞以10：7：1之比例在類器官用培養基/Matrigel混合基質內於4℃進行混合。將所得到之混合液3μL滴在以如上述方式形成之第三基質層上，並藉由提高溫度至37℃使其固化，而形成「第二基質層」。
再者，將類器官培養基/Matrigel混合液8μL滴在以如上述方式形成之第二基質層上，並藉由提高溫度至37℃使其固化，形成「第一基質層」。
在低吸附24-孔培養盤中，加入600μL之添加有Rock(Rho-相關卷曲螺旋形成激酶)抑制劑[Rock(Rho-associated coiled-coil forming kinase)inhibitor](10ng/mL)之類器官培養基。將以如上述方式形成於懸滴插件(hanging drop insert)上的包含第一至第三基質層之基質組成物，以朝向孔內的培養基之方向插入。24小時後，用經除去Rock抑制劑(10ng/mL)的類器官培養基進行交換一半量之培養基，後續之培養基交換係以每日交換一半量直到培養開始後的第3日為止來實施。
[5]灌流培養
在培養開始後第3日，將接著有包含類器官的基質組成物之懸滴插件(hanging drop insert)取出，並使用包含培養腔室及供給培養基貯槽的QuasiVivo QV600 Barrier Sys.Starter Kit(Kirkstall公司)開始灌流培養。輸送培養液之泵浦係使用Watson Marlow公司製之管式泵浦(tubing pump)(530SN/313D)，泵浦側管接續於泰貢管(Tygon tube)LMT-55(內徑8mm×外徑11mm)。藉由每30秒實施30秒鐘之20mL/分鐘速率之送液的方式來實施間歇式灌流。將裝置之概略圖示於圖1。在上述之灌流中，係以目視確認到在培養腔室內產生紊流之漩渦(參照圖2)。用類器官培養基於5%CO2、37℃進行培養11日，藉由每3日更換為培養基槽內之類器官培養基一次而實施培養基交換。
在灌流培養開始後第11日，將接著有包含類器官之基質組成物的懸滴插件(hanging drop insert)取出，並藉由細胞刮刀(cell scraper)將類器官剝離。將類器官放入包含4%三聚甲醛(paraformaldehyde)/PBS固定溶液的2mL試管中，加以固定。
[6]靜態培養(對照)
就對照組而言，係使用與上述相同之包含類器官的基質組成物及類器官培養基，藉由以往之一般的靜態培養，亦即，不進行從培養開始後第3日之灌流培養，繼而於低吸附24-孔培養盤中進行與上述相同時間培養後，以同樣方式固定。
[7]免疫染色(ASGR1等)
去除固定溶液後，用PBS進行洗淨(15分鐘×2次)，並分別進行以20% DMSO/乙醇、80%乙醇、50%乙醇處理15分鐘之穿透處理。再者，使用抗ASGR1抗體(R&D,MAB4394)、抗CD31抗體(Abcam,AB28364)及與此等抗體 結合的螢光標示二級抗體(Novex Donkey anti-Mouse IgG(H+L)Secondary Antibody,Novex Donkey anti-Rabbit IgG(H+L)Secondary Antibody(invitrogen))及核染色試劑(DAPI)進行免疫染色，並藉由Visikol HISTO-M(Visikol Inc.)進行透明化處理。將所得到的染色檢體藉由LSM880共焦雷射顯微鏡(Zeiss)實施螢光影像觀察，從所得到之螢光圖像作成二值化的ASGR1螢光區域面積，藉由除以同樣經二值化之DAPI螢光區域面積來算出ASGR1陽性率。將結果示於圖3。
[實施例2]
使用以與實施例1之[1]至[3]相同的方法所製作的人類肝臟內胚層細胞、人類非造血性內皮細胞及人類間葉系細胞，而以與實施例1之[4]及[5]同樣作法，藉由基質組成物之灌流培養得到類器官後，加以固定。又，作為對照組，係以與實施例1之[6]同樣地藉由基質組成物之靜態培養而得到類器官後，加以固定。將分別藉由灌流培養及靜態培養所得到的包含類器官之基質組成物的觀察影像(立體結構)示於圖4。
[8]免疫染色(GS、上皮鈣黏蛋白等)
去除固定溶液後，用PBS進行洗淨(15分鐘×2次)，並分別進行以20% DMSO/乙醇、80%乙醇、50%乙醇處理15分鐘之穿透處理。再者，使用抗麩醯胺合成酶(GS)抗體(Abcam,ab73593)、抗上皮鈣黏蛋白抗體(Abcam,ab76055)及與此等抗體結合的螢光標示二級抗體(Novex Donkey anti-Mouse IgG(H+L)Secondary Antibody,Novex Donkey anti-Rabbit IgG(H+L)Secondary Antibody(invitrogen))及核染色試劑(DAPI)進行免疫染色，並藉由Visikol HISTO-M(Visikol Inc.)進行透明化處理。將所得到的染色檢體藉由LSM880共焦雷射顯微鏡(Zeiss)實施之螢光影像觀察，得到螢光觀察影像。將結果示於圖5。

Claims (15)

  1. 一種培養方法，係將被固定於腔室內之臟器類器官及/或構成臟器之細胞於灌流培養液同時進行培養的方法；
    其中，前述培養液係以在前述腔室內產生紊流的方式被灌流。
  2. 如請求項1所述之培養方法，其中，前述培養液係在包含於前述腔室內從層流向紊流過渡之時間、產生紊流之時間、從紊流向層流過渡之時間之各段時間灌流。
  3. 如請求項1所述之培養方法，其中，前述臟器類器官及/或構成臟器之細胞係以包埋在基質中的狀態被固定。
  4. 如請求項1所述之培養方法，其中，前述包埋有臟器類器官及/或構成臟器之細胞的基質，係以被懸垂於通氣性膜之狀態固定於腔室內。
  5. 如請求項1所述之培養方法，其中，前述臟器類器官係具有脈管結構，及/或前述構成臟器之細胞係與脈管細胞共存。
  6. 如請求項1所述之培養方法，其中，前述臟器類器官為肝類器官或腎類器官，及/或該臟器為肝臟或腎臟。
  7. 一種立體臟器之製造方法，係包含實施請求項1至6中任一項所述之培養方法的步驟。
  8. 如請求項1至6中任一項所述之培養方法，其中，前述培養液包含藥物。
  9. 如請求項8所述之培養方法，其中，前述藥物係用於治療伴隨缺血之疾病。
  10. 一種藥效評估方法，係包含實施請求項8或9所述之培養方 法的步驟。
  11. 一種臟器類器官，係藉由請求項1至6中任一項所述之培養方法所得到者。
  12. 一種立體臟器，其係藉由請求項7所述之製造方法所得到者。
  13. 一種藥效評估方法，其包含在請求項12所述之立體臟器之培養基中添加藥物的步驟、及評估前述藥物對於前述立體臟器之藥效的步驟。
  14. 一種培養系統，係具備：
    腔室，該腔室可將臟器類器官及/或構成臟器之細胞固定並收容，且具備對前述臟器類器官及/或構成臟器之細胞灌流培養液用之流入口及流出口；以及
    灌流培養液用之灌流手段；
    其中，前述灌流手段係以使前述培養液於前述腔室內產生紊流之方式來控制。
  15. 如請求項14所述之系統，其中，前述灌流手段係將前述培養液在包含於該腔室內從層流過渡至紊流之時間、產生紊流之時間、從紊流過渡至層流之時間的各段時間進行灌流。
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