CN103599569A - 钛合金表面生长因子复合涂层的制备方法 - Google Patents

钛合金表面生长因子复合涂层的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及钛合金表面生长因子复合涂层的制备方法，将生长因子纳米凝胶和靶向因子Biotin-PEG-NHS相连，然后将钛合金表面用多巴胺处理，通过多巴胺的自聚作用将亲和素Avidin耦合到钛合金表面，再通过生物素Biotin和Avidin的特异性的生物亲和作用将生长因子纳米凝胶固定到钛合金表面生长因子包括：骨形态发生蛋白、转化生长因子、血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子或成纤维细胞生长因子。本发明的优点是利用简单的一锅反应将生长因子纳米凝胶偶联到钛合金表面，反应操作简单，反应条件温和，对于BMP-2具有良好的活性保持。

Description

钛合金表面生长因子复合涂层的制备方法
技术领域
本发明涉及领域为生物医用金属复合材料，将生长因子纳米凝胶和靶向因子Biotin-PEG-NHS相连，然后将钛合金表面用多巴胺处理，通过多巴胺的自由基诱导的自聚作用将亲和素Avidin耦合到钛合金表面，再通过生物素Biotin和Avidin的特异性的生物亲和作用将生长因子纳米凝胶固定到钛合金表面，从而实现一种新的生物医用骨替代材料的制备 
背景技术
随着人口老龄化和老年退行性疾病年轻化的趋势，各种脊柱和关节疾患的发病率逐年增加，需要进行脊柱融合手术和关节置换手术的数量也随之递增。钛合金具有优异的力学性能和良好的生物相容性，其作为主体材料已被广泛应用于此类手术，市场需求日益增加。但是，由于治疗对象为患骨质疏松症的老年人，他们体内的骨代谢失衡，其骨吸收胜过骨生成。而钛合金为生物惰性，其与植入部位骨组织整合性差，易于周围宿主组织分离而引起松动。因此，改善钛合金的生物活性，提升植入部位骨组织的修复能力、缩短愈合时间成为目前医用钛合金的研究焦点，而钛合金与骨的整合速率和植入后的稳定性主要取决于表面涂层的生物活性和骨诱导性。 
基于对骨整合过程中分子时间的认识，在骨重建的不同阶段起关键作用的生长因子或基因的作用逐渐明确。在钛合金表面负载生长因子可增加植入部位生长因子浓度，提高骨组织的形成速度。早在1989年，Aspenberg就将胰岛素生长因子与钛组合用于骨的修复，从此以后，国内外一些课题组也陆续开展了类似的研究，目前针对骨科的应用，研究最多的骨形态发生蛋白2（BMP-2）。解放军总医院的李众利等采用三维连通多孔钛结构复合BMP-2，肌肉植入实验发现BMP-2能促使纤维组织长入孔隙结构内部，刺激血管生成，且30天后发现有钙化骨组织形成。 
但是对于生长因子，其实际应用都面临着投递方式和活性保持两个主要问题。已经报导的钛合金表面生长因子投递技术包括：表面直接共价偶联、通过天然大分子共价结合、可生物降解合成聚合物物理包埋涂覆、羟基磷灰石和二氧化钛纳米管储库式承载等。虽然生长因子应用于钛合金表面促进骨整合与修复已有大量的研究，但在活性保持和持续投递等方面还难以满足临床需求。最近，卢云峰课题组以Nanogel技术成功投递生长因子，该技术通过自由基反应，以高分子单分子膜包覆蛋白，形成粒径40-80nm的微粒，可有效提高蛋白的稳定性。从而解决了生长因子稳定性的问题。但是在对钛合金材料改性时，由于钛合金本身的惰 性和生长因子Nanogel的大尺寸造成的空间位阻效应，很难实现生长因子Nanogel在钛合金表面的直接固定化。因此必须选择合适的媒介来实现这种固定化。 
本发明基于将生长因子纳米凝胶表面处理出靶向因子Biotin-PEG-NHS，然后将亲和素Avidin通过多巴胺自聚合的方式固定在钛合金表面上，通过Biotin和Avidin的生物亲和作用实现生长因子纳米凝胶在钛合金表面的固定化，实现生物医用复合材料的功能 
发明内容
本发明的目的是将具有高稳定性的生长因子纳米凝胶通过自由基诱导的多巴胺自聚合反应和Biotin和Avidin的生物识别作用偶联到钛合金表面，实现植入钛合金部位骨组织的快速修复。 
本发明的原理是生长因子纳米凝胶表面处理出靶向因子Biotin-PEG-NHS，然后将亲和素Avidin通过多巴胺自聚合的方式固定在钛合金表面上，通过Biotin和Avidin的生物亲和作用实现生长因子纳米凝胶在钛合金表面的固定化，实现生物医用复合材料的功能 
本发明的制备方法如下： 
钛合金表面生长因子复合涂层的制备方法，将生长因子纳米凝胶和靶向因子Biotin-PEG-NHS相连，然后将钛合金表面用多巴胺处理，通过多巴胺的自聚作用将亲和素Avidin耦合到钛合金表面，再通过生物素Biotin和Avidin的特异性的生物亲和作用将生长因子纳米凝胶固定到钛合金表面 
所述的生长因子包括：骨形态发生蛋白（BMP）、转化生长因子（TGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）或成纤维细胞生长因子（FGF）。 
所述的靶向因子Biotin-PEG-NHS为Biotin-PEG4-NHS和Biotin-PEG20-NHS。 
所述的多巴胺在钛合金表面的自聚作用为过硫酸铵（APS）诱导的自由基聚合。 
构建钛合金表面生长因子复合涂层的制备方法，步骤如下： 
a.将多巴胺溶解于20mM pH=7.4的PBS溶液中配成浓度为1-4mg/ml的多巴胺溶液，将上述溶液中冲入氮气流处理1-4h；将Ti片表面进行抛光处理，然后分别在正己烷和1-6mol/LNaOH中浸泡30-60min，然后用超纯水洗涤至洗脱液呈中性；将所得的Ti片真空烘干；将处理好的钛片加入到上述多巴胺溶液中，然后加入1-4mg过硫酸铵（APS），30-60℃条件下反应2-6h； 
b.将a中所得到的钛片用超纯水洗涤，然后浸泡于1-4mg/ml的亲和素Avidin水溶液中，20-40℃条件下反应1-24h； 
c.将生长因子纳米凝胶溶解于50mM pH=8.0的硼酸缓冲液中，制备成0.1-1mg/ml的溶液，取上述溶液1ml加入1-10ul10mg/ml的Biotin-PEG-NHS溶液，磁力搅拌反应2-6h； 
d.将b中处理所得的钛片用超纯水洗涤，在氮气流下自然干燥；取c中所得溶液10-100ul滴到钛合金表面，20-40℃下反应6-12h。 
本发明的优点是利用简单的一锅反应将生长因子纳米凝胶偶联到钛合金表面，反应操作简单，反应条件温和，对于BMP-2具有良好的活性保持。 
说明书附图 
图1是钛合金表面生长因子复合涂层的制备方法示意图； 
具体实施方式
下面通过例子对本发明进行进一步的阐述。 
实施例1： 
a.将多巴胺溶解于20mM pH=7.4的PBS溶液中配成浓度为1mg/ml的多巴胺溶液，将上述溶液中冲入氮气流处理1h；将Ti片表面进行抛光处理，然后分别在正己烷和1-6mol/LNaOH中浸泡30min，然后用超纯水洗涤至洗脱液呈中性；将所得的Ti片真空烘干；将处理好的钛片加入到上述多巴胺溶液中，然后加入1mg过硫酸铵（APS），30℃条件下反应2h； 
b.将a中所得到的钛片用超纯水洗涤，然后浸泡于1mg/ml的亲和素Avidin水溶液中，20℃条件下反应1h； 
c.将生长因子纳米凝胶溶解于50mM pH=8.0的硼酸缓冲液中，制备成0.1mg/ml的溶液，取上述溶液1ml加入1ul10mg/ml的Biotin-PEG-NHS溶液，磁力搅拌反应2h； 
d.将b中处理所得的钛片用超纯水洗涤，在氮气流下自然干燥。取c中所得溶液10ul滴到钛合金表面，20℃下反应6h； 
使用ELISA试剂盒测定固定在钛片表面的生长因子的量为1.4ug。钛片经伽马射线消毒后，生长因子仍保持52%的相对活性。 
实施例2： 
a.将多巴胺溶解于20mM pH=7.4的PBS溶液中配成浓度为2mg/ml的多巴胺溶液，将上述溶液中冲入氮气流处理2h；将Ti片表面进行抛光处理，然后分别在正己烷和3mol/L NaOH中浸泡40min，然后用超纯水洗涤至洗脱液呈中性；将所得的Ti片真空烘干；将处理好的钛片加入到上述多巴胺溶液中，然后加入2mg过硫酸铵（APS），40℃条件下反应4h； 
b.将a中所得到的钛片用超纯水洗涤，然后浸泡于2mg/ml的亲和素Avidin水溶液中，30℃条件下反应12h； 
c.将生长因子纳米凝胶溶解于50mM pH=8.0的硼酸缓冲液中，制备成0.5mg/ml的溶液，取上述溶液1ml加入5ul10mg/ml的Biotin-PEG-NHS溶液，磁力搅拌反应4h； 
d.将b中处理所得的钛片用超纯水洗涤，在氮气流下自然干燥。取c中所得溶液50ul滴到钛合金表面，30℃下反应9h； 
使用ELISA试剂盒测定固定在钛片表面的生长因子的量为3.2ug。钛片经伽马射线消毒后，生长因子仍保持36%的相对活性。 
实施例3： 
a.将多巴胺溶解于20mM pH=7.4的PBS溶液中配成浓度为4mg/ml的多巴胺溶液，将上述溶液中冲入氮气流处理4h；将Ti片表面进行抛光处理，然后分别在正己烷和6mol/L NaOH中浸泡60min，然后用超纯水洗涤至洗脱液呈中性；将所得的Ti片真空烘干；将处理好的钛片加入到上述多巴胺溶液中，然后加入4mg过硫酸铵（APS），30-60℃条件下反应6h； 
b.将a中所得到的钛片用超纯水洗涤，然后浸泡于4mg/ml的亲和素Avidin水溶液中，40℃条件下反应24h； 
c.将生长因子纳米凝胶溶解于50mM pH=8.0的硼酸缓冲液中，制备成1mg/ml的溶液，取上述溶液1ml加入10ul10mg/ml的Biotin-PEG-NHS溶液，磁力搅拌反应6h； 
d.将b中处理所得的钛片用超纯水洗涤，在氮气流下自然干燥。取c中所得溶液100ul滴到钛合金表面，40℃下反应12h； 
使用ELISA试剂盒测定固定在钛片表面的生长因子的量为2.3ug。钛片经伽马射线消毒后，生长因子仍保持73%的相对活性。 
实施例4： 
a.将多巴胺溶解于20mM pH=7.4的PBS溶液中配成浓度为2mg/ml的多巴胺溶液，将上述溶液中冲入氮气流处理4h；将Ti片表面进行抛光处理，然后分别在正己烷和6mol/L NaOH中浸泡60min，然后用超纯水洗涤至洗脱液呈中性；将所得的Ti片真空烘干；将处理好的钛片加入到上述多巴胺溶液中，然后加入4mg过硫酸铵（APS），60℃条件下反应6h； 
b.将a中所得到的钛片用超纯水洗涤，然后浸泡于4mg/ml的亲和素Avidin水溶液中，37℃条件下反应24h； 
c.将生长因子纳米凝胶溶解于50mM pH=8.0的硼酸缓冲液中，制备成0.1mg/ml的溶液，取上述溶液1ml加入10ul10mg/ml的Biotin-PEG-NHS溶液，磁力搅拌反应2h； 
d.将b中处理所得的钛片用超纯水洗涤，在氮气流下自然干燥。取c中所得溶液100ul滴到钛合金表面，37℃下反应6h； 
使用ELISA试剂盒测定固定在钛片表面的生长因子的量为12.1ug。钛片经伽马射线消毒后，生长因子仍保持46%的相对活性。 
实施例5： 
a.将多巴胺溶解于20mM pH=7.4的PBS溶液中配成浓度为4mg/ml的多巴胺溶液，将上述溶液中冲入氮气流处理1h；将Ti片表面进行抛光处理，然后分别在正己烷和2mol/L NaOH中浸泡30min，然后超纯水洗涤至洗脱液呈中性；将所得的Ti片真空烘干；将处理好的钛片加入到上述多巴胺溶液中，然后加入1mg过硫酸铵（APS），30℃条件下反应2h； 
b.将a中所得到的钛片用超纯水洗涤，然后浸泡于1mg/ml的亲和素Avidin水溶液中，40℃条件下反应24h； 
c.将生长因子纳米凝胶溶解于50mM pH=8.0的硼酸缓冲液中，制备成0.8mg/ml的溶液，取上述溶液1ml加入8ul10mg/ml的Biotin-PEG-NHS溶液，磁力搅拌反应6h； 
d.将b中处理所得的钛片用超纯水洗涤，在氮气流下自然干燥。取c中所得溶液100ul滴到钛合金表面，40℃下反应12h； 
使用ELISA试剂盒测定固定在钛片表面的生长因子的量为1.7ug。钛片经伽马射线消毒后，生长因子仍保持64%的相对活性。 

Claims (5)

1.钛合金表面生长因子复合涂层的制备方法，其特征是：将生长因子纳米凝胶和靶向因子Biotin-PEG-NHS相连，然后将钛合金表面用多巴胺处理，通过多巴胺的自聚作用将亲和素Avidin耦合到钛合金表面，再通过生物素Biotin和Avidin的特异性的生物亲和作用将生长因子纳米凝胶固定到钛合金表面 。
2.如权利要求1所述方法，其特征是所述的生长因子包括：骨形态发生蛋白（BMP）、转化生长因子（TGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）或成纤维细胞生长因子（FGF）。 
3.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的靶向因子Biotin-PEG-NHS为Biotin-PEG4-NHS和Biotin-PEG20-NHS。 
4.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的多巴胺在钛合金表面的自聚作用为过硫酸铵（APS）诱导的自由基聚合。 
5.构建权利要求1的钛合金表面生长因子复合涂层的制备方法，其特征是步骤如下： 
a.将多巴胺溶解于20mM pH=7.4的PBS溶液中配成浓度为1-4mg/ml的多巴胺溶液，将上述溶液中冲入氮气流处理1-4h；将Ti片表面进行抛光处理，然后分别在正己烷和1-6mol/L NaOH中浸泡30-60min，然后用超纯水洗涤至洗脱液呈中性；将所得的Ti片真空烘干；将处理好的钛片加入到上述多巴胺溶液中，然后加入1-4mg过硫酸铵（APS），30-60℃条件下反应2-6h； 
b.将a中所得到的钛片用超纯水洗涤，然后浸泡于1-4mg/ml的亲和素Avidin水溶液中，20-40℃条件下反应1-24h； 
c.将生长因子纳米凝胶溶解于50mM pH=8.0的硼酸缓冲液中，制备成0.1-1mg/ml的溶液，取上述溶液1ml加入1-10ul10mg/ml的Biotin-PEG-NHS溶液，磁力搅拌反应2-6h； 
d.将b中处理所得的钛片用超纯水洗涤，在氮气流下自然干燥；取c中所得溶液10-100ul滴到钛合金表面，20-40℃下反应6-12h。 
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