CN1397354A - 组织工程支架用多孔材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学材料领域，特别涉及一种组织工程支架用多孔材料及其制备方法。它以从家蚕丝、柞蚕丝中分别溶解、提纯得到的丝胶和丝素为主要原料，按适当比例混合、在一定温度下快速搅拌、冷冻后，采用冷冻干燥法加工成块状或膜状多孔体，并在其孔内注入细胞生长因子缓释微胶囊。它不仅具备良好的生物相容性，还能引导、促进细胞的粘附和生长，可调节生物降解速度，适用于细胞培养基质及皮肤、硬脑膜、软骨等组织修复材料。
Description
技术领域
本发明属于生物医学材料领域，特别涉及一种适用于组织工程支架的多孔材料及其制备方法。
背景技术
目前已开发应用于组织工程的生物可降解多孔材料，主要有聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)和胶原蛋白等。但合成材料(PLA、PGA等)在生物相容性、理化性能、降解速率的控制及缓释性等方面尚有许多问题未得到解决，且合成工艺较复杂。天然材料中的胶原蛋白虽然自身就包含着许多生物信息，能够使细胞维持或产生许多功能，但特定种类的胶原蛋白提纯工作较烦琐，质量控制较困难，且能否完全避免抗原的影响和疾病的传播尚待观察。
研究表明，蚕丝中含有约75％的丝素和25％的丝胶，它们是蚕在绢丝腺内分泌出的天然蛋白质，由18种氨基酸残基所组成，各项试验结果显示，蚕丝蛋白无毒性、无刺激性，具有良好的生物相容性，是制造生物医用材料的较理想原料。在本发明作出之前，中国专利CN1260363A“一种多孔丝素膜及其制备方法”公开了一种以家蚕丝素蛋白为原料，采用冷冻干燥法制备多孔丝素膜的技术。该方法是：先将家蚕丝经脱胶、溶解、透析、提纯后得到纯丝素蛋白溶液；在上述溶液中加入添加剂，其中含10～60％的CH2CH(OH)CH2OH等、10～60％的CH3CH2(OH)CH(NH2)COOH等，其余为环氧化物等作为交联剂，制成制备用混合溶液，将其注入到模具内，在-4～-85℃的温度下冷冻10min～24h，再进行真空干燥，真空干燥的前5～24h温度设定在-4～-40℃范围内，其后的真空干燥过程中，每小时升温1～10℃至室温，即可得到该发明所述的丝素蛋白多孔膜。从结构上来看，由于丝素为纤维状蛋白，因此，用丝素制备的多孔膜在作为组织工程支架材料使用时，其生物降解的速度较慢。当组织再生速度较快时，要求支架材料较快地被降解吸收，否则可能影响新生组织的形态和功能，而当组织再生速度较慢时，支架材料应该具有积极引导、促进细胞生长成规范组织的能力，从而加快组织修复速度，此时，支架材料被降解吸收的速度也需同时加快，以便与组织再生速度相适应，因此，单纯用丝素制备的多孔材料，其生物降解速度就很难适应组织再生速度。
发明内容
本发明的目的就是针对已有技术的不足，提供一种可控制生物降解速度、并能促进细胞粘附和生长的组织工程支架用多孔材料及其制备方法。
本发明所述的组织工程支架用多孔材料，是含有家蚕丝素蛋白的块状或膜状物，内部平均孔密度为1～3000个/mm2，平均孔径为1～500μm，其特征在于：它还含有家蚕丝胶蛋白、柞蚕丝素蛋白；孔内含有以丝胶蛋白为壁材的细胞生长因子缓释微胶囊。
制备本发明所述的组织工程支架用多孔材料的方法，将家蚕丝脱胶、溶解、提纯后得到家蚕丝素水溶液，在浓缩的丝素溶液中加入添加剂后成为制备用混合原液，将该原液冷冻干燥，其特征在于还包括如下步骤：
(1)制备家蚕丝胶蛋白、柞蚕丝素蛋白加入到制备用混合原液中，在30～90℃温度条件下以大于500转/分的速度搅拌均匀后，立即在-15～-85℃温度条件下冷冻，再经冷冻干燥后制成蚕丝蛋白多孔体；
(2)制备以丝胶蛋白为壁材的细胞生长因子缓释微胶囊，注入上述多孔体的孔内制成组织工程支架用蚕丝蛋白多孔材料。
以上所述的柞蚕丝素蛋白制备方法是：用浓度为5～12M的硫氰化锂，浴比为1∶5～1∶500，在20～100℃的温度条件下溶解柞蚕丝素纤维，经透析后制得分子量为0.35～1.50万的柞蚕丝素蛋白水溶液。
以上所述的制备以丝胶蛋白为壁材的细胞生长因子缓释微胶囊的方法是：
(1)将浓度为0.01～0.20g/ml的丝胶水溶液预热至40～80℃，逐滴滴入已预热至40～80℃的植物油中，边滴边以200～2000转/分的速度搅拌，冷却后以100～1500转/分的速度搅拌待丝胶凝胶；再在上述溶液中加入有机溶剂，经离心分离、交联、干燥后得到丝胶蛋白微球；
(2)将细胞生长因子溶液滴入干燥的丝胶蛋白微球，制得以丝胶蛋白为壁材的细胞生长因子缓释微胶囊。
与现有技术相比，本发明所述的组织工程用多孔材料具有以下显著优点：
(1)柞蚕丝素蛋白的一级结构中含Arg-Gly-Asp序列等生物信息，与细胞有特异相互作用，故在多孔材料中加入了柞蚕丝素蛋白后能促进细胞的粘附；
(2)多孔材料内注入了细胞生长因子缓释微胶囊，所以，能引导、促进细胞沿支架增殖、生长；
(3)丝胶蛋白为球状结构，较易被生物降解，因而，可通过调节材料内丝胶与丝素蛋白的质量比，来实现控制其降解速度与新生组织的再生速度相适应的目的。
(4)由于采用了对制备用混合原液快速搅拌、快速冷冻的方法，使溶液中无规线团结构的丝素、丝胶大分子充分伸展，混合均匀，并将此状态快速固定，解决了蚕丝蛋白多孔材料内丝素相与丝胶相分离的问题，使材料的形态、结构和性能均匀化。
具体实施方式
实施例一：
1.家蚕茧经剥茧、切剖、去蛹得到茧层，将1公斤清洁的家蚕茧层用自来水充分洗涤后，再用去离子水洗涤3次，放入20升去离子水中，于98～100℃处理40分钟使丝胶溶解，过滤后得到浓度为1.5％丝胶水溶液，并取部分丝胶水溶液冷冻干燥后得到固体丝胶。
2.将1公斤家蚕丝放入10升浓度为0.025％的碳酸钠水溶液中，煮沸0.5小时，重复处理三次，脱尽蚕丝外围的丝胶，得到纯丝素纤维；将晾干后的丝素纤维，用10升摩尔比为1∶8∶2的氯化钙、水、乙醇溶液，在78±2℃下加热溶解成丝素蛋白混合溶液；用纤维素膜为透析材料，将所得的丝素蛋白混合溶液用水进行透析，以去除氯化钙，乙醇等杂质，再用多层脱脂纱布过滤，得到纯的丝素蛋白溶液；纯丝素溶液维持在35℃下，边搅拌边使其蒸发浓缩。
3.向铝合金模具内注入浓度为3％的添加剂，在-16℃下预冻2小时。
4.将丝胶水溶液、丝素水溶液按80∶20的比例混合，加入添加剂后制成制备用混合原液，将该混合原液在75±2℃的温度条件下以1700转/分的速度搅拌均匀后，立即注入上述铝合金模具内，厚度为10mm，于-16℃温度下快速冷冻2小时。
5.将上述冷冻体连同模具，置于冷冻干燥机内减压干燥，干燥过程的前24小时，温度恒定于-16℃，其后每小时升温2℃直至室温，干燥完成后从铝合金模具内取出即为块状的家蚕丝蛋白多孔体。
6.制备浓度为0.025g/ml的丝胶水溶液，预热至70℃后，逐滴滴入2000ml已预热至70℃的橄榄油中，边滴边以1000转/分的速度搅拌15分钟，温度维持在70℃，得到油包水乳液。将乳液冷却至30℃，以300转/分的速度搅拌60分钟，使丝胶凝胶化。在上述溶液中加入700ml丙酮，继续以300转/分的速度搅拌60分钟，离心分离，用异丙醇洗涤，在浓度为1％的戊二醛溶液中浸渍1小时使其交联，冷冻干燥后得到丝胶蛋白微球。将碱性成纤维细胞生长因子bFGF溶液滴入干燥的丝胶蛋白微球，室温放置60分钟，使bFGF渗入微球内，制得以丝胶蛋白为壁材的bFGF缓释微胶囊。
7.适量的生理盐水使bFGF缓释微胶囊膨润后，注入家蚕丝蛋白多孔体内，制得含bFGF缓释微胶囊的家蚕丝蛋白多孔材料。
在本实施例的制备用混合原液中，也可加入适量的柞蚕丝素蛋白溶液(柞蚕丝素蛋白溶液的制备方法参见实施例二步骤1、2)。柞蚕丝素、家蚕丝胶、家蚕丝素三者可以任意比例混合后制成制备用混合原液，其比例可根据该多孔材料用于组织工程支架时所要求的对细胞的粘附性、降解速度及物理性能来决定。柞蚕丝素蛋白的比例越高，材料对细胞的粘附性越好；丝胶蛋白的比例越高，生物降解速度越快；家蚕丝素蛋白的比例越高，材料的形态稳定性等物理性能越好。因此，改变多孔材料内丝胶、柞蚕丝素、家蚕丝素的比例，可达到控制其生物降解速度、对细胞的粘附性及材料的物理性能的目的，使其适应于不同组织再生的需要。按本实施例方法制备的蚕丝蛋白多孔材料，其主要结构、性能见表一。
实施例二：
1.将0.5公斤中国柞蚕丝放入10升浓度为0.5％的碳酸钠水溶液中，煮沸0.5小时，重复处理三次，脱尽柞蚕丝外围的丝胶，得到柞蚕丝素纤维。
2.用浓度为9M的硫氰化锂，于温度40℃，浴比1∶20溶解柞蚕丝得到混合溶液；将上述溶液对水透析4昼夜，透析材料为截留分子量为1.10万的纤维素膜，得到纯柞蚕丝素蛋白水溶液；将上述纯柞蚕丝素溶液维持在40℃下，边搅拌边进行蒸发浓缩，使溶液含固率达到10.0％。
3.0.5公斤清洁的茧层用水充分洗涤后，放入12升去离子水中，于98～100℃温度条件下处理60分钟，使丝胶溶解，过滤后得到浓度为丝胶水溶液。
4.向不锈钢模具内注入浓度为1.5％的添加剂，在-40℃下预冻6小时。
5.将浓缩的柞蚕丝素溶液与丝胶水溶液按50∶50的比例混合，加入添加剂后制成制备用混合原液，使混合溶液的温度维持在40±2℃的同时，以1000转/分的速度快速搅拌溶液60分钟，随后注入上述不锈钢模具内，厚度为0.5mm，于-40℃温度下快速冷冻6小时。
6.将上述冷冻体连同不锈钢模具，置于冷冻干燥机内真空干燥，干燥过程的前18小时，温度恒定于-20℃，其后每小时升温2℃，直至室温，取出即为膜状的蚕丝蛋白多孔体。
7.制备浓度为0.05g/ml的丝胶水溶液，将其预热至60℃后，逐滴滴入已预热至60℃的橄榄油中，边滴边以400转/分的速度搅拌15分钟，温度维持在60℃，得到油包水乳液。将该水乳液冷却至20℃，以250转/分的速度搅拌60分钟，使丝胶凝胶化。在上述溶液中加入500ml丙酮，继续以250转/分的速度搅拌60分钟，离心分离，用异丙醇洗涤8次，在浓度为75％的乙醇溶液中浸渍1小时使其交联，冷冻干燥后得到丝胶蛋白微球。将碱性成纤维细胞生长因子bFGF溶液滴入干燥的丝胶蛋白微球，室温放置60分钟，使bFGF渗入微球内，制得以丝胶蛋白为壁材的bFGF缓释微胶囊。
8.适量的生理盐水使bFGF缓释微胶囊膨润后，注入蚕丝蛋白多孔膜内，制得含bFGF缓释微胶囊的蚕丝蛋白多孔材料。
在本实施例的制备用混合原液中，也可根据需要按比例加入如实施例一的方法制备的家蚕丝素蛋白。按本实施例方法制备的蚕丝蛋白多孔膜的主要结构、性能见表二。
表一： 家蚕丝蛋白多孔材料的主要结构、性能
| 外观 | 内部丝蛋白结构 | 内部孔隙的平均孔径(μm) | 内部孔隙的孔密度(个/mm2) | 微胶囊的平均粒径(μm) | 水中溶失率(％) | 拉伸断裂强度(N/cm2) | 断裂伸长率(％) |
| 白色、海绵状、不开裂 | 无定形结构为主 | 152.0 | 16.8 | 20.5 | 13.0 | 20.2 | 17.5 |
表二：柞蚕丝蛋白多孔材料的主要结构、性能
| 外观 | 内部丝蛋白结构 | 内部孔隙的平均孔径(μm) | 内部孔隙的孔密度(个/mm2) | 微胶囊的平均粒径(μm) | 水中溶失率(％) | 拉伸断裂强度(N/cm2) | 断裂伸长率(％) |
| 浅黄、海绵状、不开裂 | 无定形结构为主 | 52.4 | 487 | 30.8 | 15.4 | 42.6 | 53.7 |
Claims (4)
1.一种组织工程支架用多孔材料，是含有家蚕丝素蛋白的块状或膜状物，内部平均孔密度为1～3000个/mm2，平均孔径为1～500μm，其特征在于：它还含有家蚕丝胶蛋白、柞蚕丝素蛋白；孔内含有以丝胶蛋白为壁材的细胞生长因子缓释微胶囊。
2.一种制备组织工程支架用多孔材料的方法，将家蚕丝脱胶、溶解、提纯后得到家蚕丝素水溶液，在浓缩的丝素溶液中加入添加剂后成为制备用混合原液，将该原液冷冻干燥，其特征在于还包括如下步骤：
(1)制备家蚕丝胶蛋白、柞蚕丝素蛋白加入到制备用混合原液中，在30～90℃温度条件下以大于500转/分的速度搅拌均匀后，立即在-15～-85℃温度条件下冷冻，再经冷冻干燥后制成蚕丝蛋白多孔体；
(2)制备以丝胶蛋白为壁材的细胞生长因子缓释微胶囊，注入上述多孔体的孔内，制成组织工程支架用蚕丝蛋白多孔材料。
3.如权利要求2所述的一种制备组织工程支架用多孔材料的方法，其特征在于：所述的柞蚕丝素蛋白制备方法是：用浓度为5～12M的硫氰化锂，浴比为1∶5～1∶500，在20～100℃的温度条件下溶解柞蚕丝素纤维，经透析后制得分子量为0.35～1.50万的柞蚕丝素蛋白水溶液。
4.如权利要求2所述的一种制备组织工程支架用多孔材料的方法，其特征在于：所述的制备以丝胶蛋白为壁材的细胞生长因子缓释微胶囊的方法是：
(1)将浓度为0.01～0.20g/ml的丝胶水溶液预热至40～80℃，逐滴滴入已预热至40～80℃的植物油中，边滴边以200～2000转/分的速度搅拌，冷却后以100～1500转/分的速度搅拌待丝胶凝胶；再在上述溶液中加入有机溶剂，经离心分离、交联、干燥后得到丝胶蛋白微球；
(2)将细胞生长因子溶液滴入干燥的丝胶蛋白微球，制得以丝胶蛋白为壁材的细胞生长因子缓释微胶囊。
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