CN101445546B - 野蚕丝素蛋白溶液的制备及其浓缩方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种野蚕丝素蛋白溶液的制备及其浓缩方法，将除杂脱胶后的柞蚕、天蚕、蓖麻蚕、柳蚕等野蚕丝素纤维浸渍于含中性盐和醇类物质的溶解液中，超声波处理5～120分钟，再于30-98℃溶解，得到丝素溶解液。将丝素溶解液透析除盐，得到野蚕丝素水溶液，再用高吸水物质经半透膜脱水浓缩得到分子量15～250kDa、浓度6～35％的高浓度野蚕丝素溶液。由于使用中性盐，避免了酸或碱对丝素蛋白的大幅度水解，因此，获得的野蚕丝素蛋白分子量较大，可用于制取野蚕丝素蛋白凝胶、粉末、薄膜、多孔海绵、再生纤维等，为生物医用、药品、化妆品、食品、保健品等领域提供新材料。

Description

野蚕丝素蛋白溶液的制备及其浓缩方法

技术领域

本发明涉及一种天然蛋白溶液的制备与浓缩方法，特别涉及一种从野蚕丝的丝素纤维中获得蛋白溶液的方法。该溶液可用于制取野蚕丝素蛋白凝胶、粉末、薄膜、多孔海绵、再生纤维等，为生物医用、药品、化妆品、食品、保健品等领域提供新材料。

背景技术

由于从熟蚕体内后部绢丝腺获得的丝素蛋白只能满足实验室少量的需要，不能满足工业化生产的要求，所以，需先将蚕丝丝素纤维提取、溶解、纯化后获得柞蚕丝素蛋白水溶液，再根据应用目的的要求制备得到凝胶、粉末、薄膜、多孔海绵等，用作生物医用材料、药品、化妆品、食品、保健品等的原料。

蚕分为家蚕(桑蚕)和野蚕(天蚕、柞蚕、蓖麻蚕、柳蚕、樗蚕等)两大类。所有种类的蚕丝都主要由丝素和丝胶两类蛋白质所组成，其中丝素蛋白约占70-85％，其余为丝胶蛋白及少量的茧丝蜡、灰分、碳水化合物等。由于种属基因和生活环境的差异，不仅各种蚕丝中丝素蛋白的含量不同，而且丝素蛋白的结构有很大的差别。例如，每个家蚕丝素蛋白复合体的分子量约为2,280kDa，由重链(H链，分子量350kDa)、轻链(L链，分子量26kDa)及糖蛋白P₂₅(分子量30kDa)组成，三者比例为H∶L∶P₂₅＝6∶6∶1，H链由富甘氨酸序列-(Gly-X)_n-与非富甘氨酸序列间隔排列而成；而柞蚕丝素蛋白仅由H链组成，每条H链含有2639个氨基酸残基，分子量约216kDa，除了头部155个氨基酸外，柞蚕丝素由78个聚丙氨酸序列-(Ala)_n-与非聚丙氨酸序列间隔排列而成。各种丝素蛋白化学结构的差别，造成了他们的聚集态结构及物理、化学性质有很大的差异。

在本发明作出前，国内外许多文献曾报道了家蚕丝素纤维的溶解、纯化方法，例如：采用CaCl₂、LiBr的浓溶液可以溶解家蚕丝素纤维(A.Azizawa，NipponSanshi Gakkaishi，1959，38，340；公开号为CN1121836的中国发明专利“一种创面保护膜及其制备方法”)。虽然CaCl₂、LiBr、Ca(SCN)₂等许多中性盐的浓溶液能顺利地溶解家蚕丝素纤维，但是却不能将天蚕、柞蚕、蓖麻蚕、柳蚕等野蚕的丝素纤维完全溶解。

在本发明作出前，公开号为CN1415626的中国发明专利例“柞蚕丝素肽制取方法”中，报道了柞蚕丝素纤维的水解方法；“盐酸水解法制作水溶性丝粉及其物性”[日蚕杂，1991，60(5)：358-362.]一文中，公开了用盐酸水解柞蚕丝素纤维盐酸水解法制作水溶性丝粉及其物性的方法；“应用微波技术水解柞蚕丝的研究”[沈阳农业大学学报，2004，35(3)：280-282.]一文中，用微波配合盐酸水解柞蚕丝素纤维。这些方法使用强酸溶解柞蚕丝素，由于强酸对丝素蛋白的强烈水解作用大量切断了柞蚕丝素蛋白的分子链，得到的是分子量较小的柞蚕丝素肽或游离氨基酸，不能得到分子量较大的柞蚕丝素蛋白。对于天蚕、蓖麻蚕、柳蚕等野蚕丝素的溶解方法，国内外还未见公开报道。

发明内容

本发明的目的就是针对已有技术存在的不足，提供一种能获得分子量较大的野蚕丝素蛋白溶液，以及浓缩野蚕丝素蛋白的方法。

本发明的技术方案是：提供一种野蚕丝素蛋白溶液的制备方法，将野蚕丝进行除杂、脱胶处理后得到野蚕丝素纤维，再进行如下步骤处理：

(1)将野蚕丝素纤维浸渍于溶解液中，所述的溶解液中，含有浓度为2.0～12.0mol/L的中性盐，浓度为0～12.0mol/L的醇，其余为水；所述的中性盐为硫氰酸胍、硝酸钙、硝酸镁、氯化钙、氯化锌、硫氰酸锂、硫氰酸钠、溴化锂和硫氰酸钙中的一种或它们的任意组合；醇为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和异丙醇中的一种或它们的任意组合；野蚕丝素纤维与溶解液的质量比为1∶5～1000；在功率为0.2～2.0kW的超声波条件下处理5～120分钟，再在30～98℃的温度条件下处理15～360分钟，得到野蚕丝素溶解液；

(2)将上述步骤得到的野蚕丝素溶解液灌注于袋壁为半透膜的透析袋内，截留分子量为0.3～20kDa，用去离子水或纯水进行透析处理，得到野蚕丝素蛋白分子量为15～250kDa、浓度为6.0wt％以下的野蚕丝素蛋白溶液。

本发明还提供一种野蚕丝素蛋白溶液的浓缩方法，将浓度为6.0wt％以下的野蚕丝素蛋白溶液灌注于袋壁为半透膜的透析袋内，截留分子量为0.3～20kDa，将上述透析袋置于盛有高吸水材料的容器内，室温条件下放置1～3天，得到丝素蛋白分子量为15～250kDa、浓度为6.0～30wt％的野蚕丝素蛋白浓缩溶液。

上述技术方案中，所述野蚕为柞蚕、天蚕、蓖麻蚕或柳蚕。高吸水材料为硅胶、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯酸盐、醋酸乙烯共聚物、聚氨酯、聚环氧乙烷或淀粉接枝共聚物。

采用本发明所提供的技术方案，具有以下明显的优点：

1.由于使用中性盐，不使用酸性或碱性物质溶解脱胶后的野蚕丝素纤维，避免了酸或碱对丝素蛋白的大幅度水解，所以获得的野蚕丝素蛋白分子量较大。

2.由于在溶解液中含有醇类物质，加快了中性盐向浸渍于溶解液中的野蚕丝素纤维内部的扩散、渗透。

3.由于同时使用超声波处理，使溶解液中的中性盐加速向浸渍于溶解液中的野蚕丝素纤维内部迁移，进一步增进了中性盐对野蚕丝素纤维的溶解作用，从而可以在避免对野蚕丝素蛋白大幅度水解的同时，在较低温度、较温和的条件下将野蚕丝素纤维溶解。

4.由于使用半透膜在常温下透析提纯，避免了采用盐析或等电点法提纯对野蚕丝素蛋白分子构象的影响，防止丝素蛋白变性。

5.由于在室温下用高吸水物质捕获从半透膜的孔隙中渗透出的水分而使野蚕丝素蛋白溶液得到浓缩，避免了采用其他方法浓缩对野蚕丝素蛋白分子构象的影响，且操作简便、成本低。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例1

1.去除天蚕茧内的蚕蛹，用自来水反复清洗茧壳，去除茧壳中的灰尘等杂质，然后将茧壳置于60℃烘箱内干燥，得到除杂后的天蚕茧壳。

2.配置脱胶液，脱胶液中含有0.25％的碳酸钠和0.1％的马赛皂，其余为水。将1千克除杂后的天蚕茧壳放入50升脱胶液中，于98～100℃处理两次，每次处理60分钟。然后用水将天蚕茧壳充分清洗干净，拉松，室温晾干，得到脱胶后的天蚕丝素纤维。

3.配置每升含9.0mol硫氰酸锂和1.0mol乙醇，其余为水的溶解液。取1000ml溶解液置于锥形瓶中。称取100克脱胶后的天蚕丝素纤维，剪碎后加入锥形瓶中。锥形瓶放入超声波处理机内，超声波功率0.4kW，超声波处理时间100分钟。

4.从超声波处理机内取出锥形瓶，锥形瓶置于35℃的水浴中，搅拌溶解天蚕丝素纤维2小时，得到天蚕丝素溶解液。

5.将天蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为9.0～12.0kDa，将灌注了天蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析5天，得到纯化后的天蚕丝素蛋白水溶液，溶液中天蚕丝素蛋白的浓度为2.7wt％，分子量分布范围40～220kDa。

6.浓缩天蚕丝素蛋白溶液：将浓度为2.7wt％的天蚕丝素蛋白溶液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为9～12kDa，将灌注了野蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有聚乙二醇的容器内，密封后在室温持续放置3昼夜，每24小时用新的聚乙二醇更换已经吸水的聚乙二醇，得到浓度为25wt％的天蚕丝素蛋白溶液，溶液中天蚕丝素蛋白的分子量分布范围40～220kDa。

实施例2

1.将0.2千克柞蚕生丝放入10升浓度为0.25％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次。前两次用自来水，每次处理30分钟。第三次用去离子水，处理45分钟。然后用水将茧壳充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的柞蚕丝素纤维。

2.配置柞蚕丝素纤维溶解液，每升溶解液中含10.0mol硝酸钙、1.0mol甲醇和2.0mol丙醇，其余为水。取500ml溶解液置于锥形瓶中。称取25克脱胶后的柞蚕丝素纤维，剪碎后加入锥形瓶中。锥形瓶放入超声波处理机内，超声波功率1.5kW，超声波处理时间60分钟。

3.从超声波处理机内取出锥形瓶，锥形瓶置于98℃的水浴中，搅拌溶解柞蚕丝素纤维5小时，得到柞蚕丝素溶解液。

4.将柞蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为6.0～9.0kDa，将灌注了柞蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析5天，得到纯化后的柞蚕丝素蛋白水溶液，溶液中柞蚕丝素蛋白的浓度为1.2wt％，分子量分布范围45～245kDa。

5.浓缩柞蚕丝素蛋白溶液：将浓度为1.2wt％的柞蚕丝素蛋白溶液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为9～12kDa，将灌注了柞蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有干燥的硅胶的容器内，密封后在室温持续放置3昼夜，每24小时用新的干燥的硅胶更换已经吸水的硅胶，得到浓度为25.0wt％的柞蚕丝素蛋白溶液，溶液中柞蚕丝素蛋白的分子量分布范围45～245kDa。

实施例3

1.去除蓖麻蚕茧内的蚕蛹，用自来水反复清洗茧壳，去除茧壳中的灰尘等杂质，然后将茧壳置于60℃烘箱内干燥，得到除杂后的蓖麻蚕茧壳。

2.配置脱胶液，脱胶液中含有0.45％的碳酸钠和0.2％的马赛皂，其余为水。将0.1千克除杂后的蓖麻蚕茧壳放入5升脱胶液中，于98～100℃处理两次，每次处理60分钟。然后用水将蓖麻蚕茧壳充分清洗干净，拉松，室温晾干，得到脱胶后的蓖麻蚕丝素纤维。

3.配置每升含9.0mol硫氰酸胍、2.0mol氯化锌和2.0mol异丙醇，其余为水的溶解液。取1000ml溶解液置于锥形瓶中。称取50克脱胶后的蓖麻蚕丝素纤维，剪碎后加入锥形瓶中。锥形瓶放入超声波处理机内，超声波功率1.2kW，超声波处理时间80分钟。

4.从超声波处理机内取出锥形瓶，锥形瓶置于75℃的水浴中，搅拌溶解蓖麻蚕丝素纤维4小时，得到蓖麻蚕丝素溶解液。

5.将天蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为3.0～9.0kDa，将灌注了蓖麻蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析5天，得到纯化后的蓖麻蚕丝素蛋白水溶液，溶液中蓖麻蚕丝素蛋白的浓度为1.4wt％，分子量分布范围20～240kDa。

6.浓缩蓖麻蚕丝素蛋白溶液：将浓度为1.4wt％的蓖麻蚕丝素蛋白溶液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为3.0～9.0kDa，将灌注了蓖麻蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有聚乙烯醇的容器内，密封后在室温持续放置2昼夜，中途满24小时时用新的聚乙烯醇更换已经吸水的聚乙烯醇1次，得到浓度为18.0wt％的蓖麻蚕丝素蛋白溶液，溶液中蓖麻蚕丝素蛋白的分子量分布范围20～240kDa。

实施例4

1.去除柳蚕茧内的蚕蛹，用自来水反复清洗茧壳，去除茧壳中的灰尘等杂质，然后将茧壳置于60℃烘箱内干燥，得到除杂后的柳蚕茧壳。

2.配置脱胶液，脱胶液中含有0.50％的碳酸钠，其余为水。将0.2千克除杂后的柳蚕茧壳放入5升脱胶液中，于98～100℃处理两次，每次处理60分钟。然后用水将柳蚕茧壳充分清洗干净，拉松，室温晾干，得到脱胶后的柳蚕丝素纤维。

3.配置每升含10.0mol硫氰酸钙和1.0mol甲醇，其余为水的溶解液。取1000ml溶解液置于锥形瓶中。称取200克脱胶后的柳蚕丝素纤维，剪碎后加入锥形瓶中。锥形瓶放入超声波处理机内，超声波功率0.8kW，超声波处理时间60分钟。

4.从超声波处理机内取出锥形瓶，锥形瓶置于40℃的水浴中，搅拌溶解柳蚕丝素纤维3小时，得到柳蚕丝素溶解液。

5.将柳蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为9.0～12.0kDa，将灌注了柳蚕蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析5天，得到纯化后的柳蚕丝素蛋白水溶液，溶液中柳蚕丝素蛋白的浓度为4.5wt％，分子量分布范围20～250kDa。

6.浓缩柳蚕丝素蛋白溶液：将浓度为4.5wt％的柳蚕丝素蛋白溶液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为3.0～9.0kDa，将灌注了柳蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有聚丙烯酸的容器内，密封后在室温持续放置3昼夜，中途满24小时时用新的聚丙烯酸更换已经吸水的聚丙烯酸，得到浓度为30.2wt％的柳蚕丝素蛋白溶液，溶液中柳蚕丝素蛋白的分子量分布范围20～250kDa。

Claims (2)

1.一种野蚕丝素蛋白溶液的制备方法，将野蚕丝进行除杂、脱胶处理后得到野蚕丝素纤维，其特征在于再进行如下步骤处理：

(1)将野蚕丝素纤维浸渍于溶解液中，所述的溶解液中，含有浓度为2.0～12.0mol/L的中性盐，浓度为0～12.0mol/L的醇，其余为水；所述的中性盐为硫氰酸胍、硝酸钙、氯化锌、硫氰酸锂和硫氰酸钙中的一种或它们的任意组合；醇为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和异丙醇中的一种或它们的任意组合；野蚕丝素纤维与溶解液的质量比为1∶5～1000；在功率为0.2～2.0kW的超声波条件下处理5～120分钟，再在30～98℃的温度条件下处理15～360分钟，得到野蚕丝素溶解液；

(2)将上述步骤得到的野蚕丝素溶解液灌注于袋壁为半透膜的透析袋内，截留分子量为0.3～20kDa，用去离子水或纯水进行透析处理，得到野蚕丝素蛋白分子量为15～250kDa、浓度为6.0wt％以下的野蚕丝素蛋白溶液。

2.根据权利要求1所述的一种野蚕丝素蛋白溶液的制备方法，其特征在于：所述的野蚕为柞蚕、天蚕、蓖麻蚕或柳蚕。