CN102112161A - 具有潜在形式的生长因子的生物材料 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及其上固定有潜在形式的生长因子的生物材料，和涉及制备所述生物材料的方法，其包括将潜在形式的生长因子固定在生物材料上。所述生物材料可用于医学上，例如组织再生或修复。

Description

具有潜在形式的生长因子的生物材料
技术领域
本发明主要涉及生物材料领域，其可用于例如组织工程。尤其是，本发明涉及用于组织工程或修复的产品和方法，例如用于骨(bone)和软骨组织工程或修复。本发明主要涉及潜在形式的生长因子在生物材料表面上的固定，涉及制备这种生物材料的工艺，以及涉及使用这种生物材料的方法。
背景技术
先天性异常或疾病和损伤引起的软骨退变(cartilage degeneration)由于使组织内源性愈合潜能受限，因而具有重要的临床地位。软骨是无血管组织(缺乏血液供应)，而它的伤口愈合反应意味着，特别是在成人中，没有或几乎没有对受损的关节软骨进行自我修复的能力。因此，对软骨的损害(例如软骨损伤)可能会造成局部软骨细胞不完善的修复尝试。尽管全关节置换术的相对成功，修复软骨损伤的治疗总是不尽如人意，很少能恢复全部功能或回复至组织的天然正常状态。因为这些分子的毒性和多效性以及功效所需的非生理性的高剂量，全身性给药生长因子以帮助软骨组织修复并非可任意实施的(Prud’homme & Piccirillo，2000.J.Autoimmun.，14，23-42)。对于关节软骨损伤，一些帮助修复的技术包括用骨膜(软骨膜)移植再建缺陷的表面或使用骨膜瓣(periosteal flap)或生物材料瓣与自体软骨细胞植入的组合。两种方法主要限于很小的局部损害，且重生软骨的特性(纤维对透明)仍不明确。自体骨软骨镶嵌移植成形术(Mosaicplasty)是另一种常见方法，它是从非承重表面(通常在股骨)取出软骨栓子(osteo-chondral plugs)并将其移植到缺陷处，但该技术伴随患病率，可能在移植的栓子之间形成纤维软骨。对于由损伤造成的大的软骨缺损或骨关节炎造成的软骨损伤(其可能是大的且无限制的)，现有的治疗都是不适宜的，通常会实施全部或部分关节置换术。
在最近十年间，新的组织工程观念给功能性组织代用品的产生赋予了希望，包括软骨(Ng et al.，2007.Ann Biomed Eng.35，11，1914-23)，骨(Fedorovich et al.，Tissue Eng Part A.2008，14，1，127-33；Yefang et al.，2007.Int J Oral Maxillofac Surg.36，2，37-45)和许多其他组织例如皮肤(Priya et al.，2008.Tissue Eng Part B Rev.，14，1，105-18)，神经元，肝脏等(参照Lee et al.，2008.Tissue Eng Part B Rev.，14，1，61-86)，它是通过在体外构建三维组织结构体(constructs)，用于随后在体内植入或直接在体内注射/植入。基本原理是使用生物相容性的，结构和机械性上适宜的，接种了适宜的细胞源的支架，并在支架中填入生物活性分子以促进细胞分化和/或成熟。有许多方法可构建组织，使用天然和合成的生物材料支架结合异源的和自体来源的成熟的，祖细胞或干细胞(Kim & Recum，2008，Tissue Eng Part B Rev.，14，1，133-47)，加上特定的诱导生长因子(诸如骨诱导性，软骨诱导性等)和它们的组合，以驱动例如骨发生(osteoinductive)和软骨发生(chondrogenesis)。
三维支架为更高水平的组织架构和重塑提供了结构支持，在接种的细胞合成新的天然组织时提供了临时结构。另一方面，细胞因子和生长因子在控制细胞行为包括增殖，移动，基质形成和不同细胞类型分化在内的许多方面发挥关键作用(Polizzotti et al.，2008.Biomacromolecules.9，4，1084-7，Franzesi et al.，2006.J.Am.Chem.Soc.，128，47，15064-5)。在含有不同生长因子的培养基的支架中的细胞培养诱导细胞分化成软骨和骨等组织。但是，这些外源生长因子通常是直接加入培养基中(即，不由支架直接提供)，因为需要体外分化步骤，因此，在这个体系中细胞的体外分化是不能直接转化为体内状况的。为克服这个问题，已经尝试在支架内引入游离形式的生物活性分子例如生长因子，主要是在可注射水凝胶内，用于在体内递送这些试剂以实现一些增殖/分化过程的原位时空控制(Levenberg et al.，2003，PNAS，100，22，12741-12746)。因为游离形式的生长因子半衰期很短，短时期之后它们将失效(对于TGFβ1是2-3分钟)(Coffey et al.，1987.J.Clin Inv.，80，750-757；Wakefield et al.，1990.J Clin Inv.，86，1976-84)。
因此，为了控制生长因子在特定位置的持续长久的释放并减缓它们较差的药物代谢动力学特性(pharmacokinetics profiles)，已经尝试将一种或多种生物活性分子包封在载体内(主要是基于PLA和PGA的共聚物)，随后将其引入支架制剂/制品中(Chen et al.，2007.J.Control Release.，12，118，1，65-77)。在文献中发现的实例有使用释放一种，两种或甚至多种生长因子的，例如用于软骨(Park et al.，2005.Biomaterials，26，7095-7103)，骨(Lu et al.，2001.J Bone Joint Surg Am.，83，S82-91)以促进血管发生等(Steffens et al.，2004.Tissue Eng.，10，1502-1509)。但是，该方法需要费力且累赘的设计和优化过程以实现被引入的生物活性分子随着其载体分子(通常制剂成微粒)的降解而在体内依据时间释放。包封过程本身，例如如果涉及有机溶剂，也可能降低生长因子的生物活性。还应该注意的是多种生长因子的组合效果并不总是有利地，例如会对软骨产率有一些消极影响(Veilleux et al.，2005.Osteoarthritis Cartilage，13，278-286)。再现所有这些信号分子在体内的调控作用是困难的，因为这不仅取决于生长因子本身的化学特性，还取决于它的呈递(presentation)，给药的剂量和时间。
发明内容
本发明涉及更简单且更拟生态的策略，其中根据细胞周期的所需阶段、增殖或分化，以及根据细胞类型和来源，通过细胞相互作用和细胞特定需求来介导一种或多种生长因子从支架中释放。这种方式中细胞本身可根据多种细胞行为的要求“激活”固定的潜在形式(latent form)的生长因子，生长因子会保持被保护状态直至其需要被激活。
已知细胞因子和其他的细胞生长因子通常会调控细胞和组织的生长和功能。它们是细胞信使，并通过与细胞受体结合在低浓度(纳摩尔到飞摩尔)下发挥作用，引发激素样作用(hormone-like action)。这些分子是诸如细胞增殖，分化和基质形成等的关键调控者(Alsberg et al.，2006.Expert Opin Biol Ther.6，9，847-66)。大部分细胞因子和生长因子都在严密控制机制下被表达。它们的基因表达是通过环境刺激，例如感染，细胞间相互作用，细胞外基质组成和与粘附分子的相互作用或经其他细胞因子的刺激来调控的。但是，在一些情况中，细胞因子活性调控涉及潜在形式分子的分泌，当发炎，伤口愈合和组织修复的过程发生时，该潜在形式的分子通过释放细胞因子部分而被“激活”(Khalil N，1999.Microbes and Infection，1，1255-1263)。许多细胞产生潜在形式的生长因子并将其存储在细胞外基质中(ECM)。并在后来将其激活，作用于作为自分泌因子的原始细胞或作为旁分泌因子的邻近细胞。在这方面，转化生长因子β(TGFβ)家族由于可调控宽范围的生物过程而得到最多的关注。
我们已经使用潜在形式的生长因子转化生长因子-β1(TGFβ1)论证了本发明思想的证据。该思想仍然可应用于其他潜在形式的生长因子(latent form of the growth factor)，例如TGFβ超家族的成员，或以潜在融合蛋白形式所提供的生长因子。
在第一方面，本发明提供了其上固定有潜在形式的生长因子的生物材料。所述生物材料可以是能够植入宿主生物体内的任何材料。所述生物材料可以是天然的或合成产生的。生物材料(本文也称为支架)在再生医学应用中发挥关键作用，且几个基本要求已被确认(降解时间，孔径大小和孔隙率)。支架由一系列天然和合成材料构成(为生物可降解材料，以期避免二次手术程序)。
能够在其上固定潜在形式的生长因子的任何已知材料都可用于本发明。例如，不同材料可用于固定潜在的生长因子，例如合成的聚合物和共聚物(例如聚L-乳酸(PLLA)，聚(乳酸-羟基乙酸)(PLGA)，聚乙二醇(PEG)，聚(乙烯-醋酸乙烯酯)，和其他)，天然聚合物(例如多糖，蛋白质，蛋白聚糖，所有类型的胶原，透明质酸，淀粉，壳聚糖，几丁质，葡聚糖，支链淀粉，和本领域已知的其他)或它们的组合，或可降解的或不可降解的，但不限于这些。例如，所述生物材料可包括聚酯，例如PLLA，PLGA，聚己内酯(poly caprol lactone)，聚羟基脂肪酸酯(poly hydroxyl alkanoates)，和其他聚酯。所述生物材料可以是凝胶，溶胶-凝胶，水凝胶，膜，纤维结构，纳米纤维或微纤维，微米线或纳米线(micro or nanowires)，多孔海绵，纺织或无纺布片(non-woven meshes)的形式，其他已知形式，或它们的组合。可使用不同程序制备所述生物材料，例如气体发泡/造粒、冻干、电纺丝(electrospinning)、热诱导相分离、可注射性支架，但不限于这些。同样也可在用于植入体内的任何其他类型材料上实施固定，例如陶瓷材料，例如羟磷灰石，可溶性玻璃和陶瓷制品，金属材料或复合材料，和它们的组合，包括与之前所述可能性的组合。
在以下提供的实施例中，选择电纺(electrospun)L-乳酸(PLLA)纤维作为支架论证思想的证据，因为它们的生物可降解性和美国食品药品管理局(US FDA)批准在一些装置中的临床应用。此外，使用聚(乳酸)基支架的体内和体外研究已论证了软骨细胞表型的维持(Mouw et al.，2005.Osteoarthritis Cartilage，13，828-836)主要是因为纳米纤维与天然ECM的形态类似性。因而，所述生物材料优选电纺聚L-乳酸纤维。但是，应该注意到以上所述的任何生物材料都可用于本发明。
以潜在形式提供的任何生长因子都可用于本发明。所述生长因子可以是任何能够刺激细胞生长，移动，去分化，再分化或分化的分子。例如生长因子可以是但不限于TGFβ，表皮生长因子(EGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，神经生长因子(NGF)，集落刺激因子(CSF)，肝细胞生长因子，胰岛素样生长因子，胎盘生长因子)；分化因子；细胞因子，例如白介素(如IL1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，IL-19，IL-20或IL-21，每种或α或β)，干扰素(例如IFN-α，IFN-β和IFN-γ)，肿瘤坏死因子(TNF)，IFN-γ诱导因子(IGIF)，骨形成蛋白(BMP)；趋化因子(如MIPs(巨噬细胞炎性蛋白)，例如MIP1α和MIP1β；MCPs(单核细胞趋化蛋白)，例如MCP1，2或3；RANTES(调控正常T-细胞表达和分泌的激活))和营养因子。例如，生长因子可选自TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β4，TGF-β5或TGF-β超家族的任何其他成员包括激活素类，抑制素类，以及骨形成蛋白包括BMP1，BMP2，BMP3，BMP4，BMP5，BMP6，BMP7组成的组。优选地，所述生物活性分子来源于待治疗的物种，例如用于人类治疗的人源。
在此特别参照了TGFβ的应用来解释本发明，尽管以潜在形式提供的任何生长因子都可使用。因为许多细胞类型表达并响应TGFβ因子，存在确保ECM中TGF-β水平被严密控制的复杂机制，其涉及(除基因转录调控)将生长因子作为潜在分子存储。在大部分细胞类型中，TGFβs以潜在形式分泌，其由TGFβ和它的潜在相关肽(LAP)组成前肽二聚体，并与潜在TGFβ结合蛋白(LTBPs)共价连接。TGF-βs是从细胞中分泌出的潜在二聚体复合物，其含有C端成熟的TGF-β和它的N-端前结构域(pro-domain)，LAP(TGF-β潜在相关蛋白)(Roberts and Sporn，1996.Springer-Verlag，419-472；Roth-Eicchorn et al.，1998.Hepatology，28 1588-1596)。这种前体结构显然是TGFβ超家族中除TGFβ4之外所有已知成员所共有的。前TGF-β的两条多肽链连接形成二硫键合的二聚体。TGF-β是通过弗林样(furin-like)内切蛋白酶在分泌期间从它的前肽的RRXR序列处切断的。LAP前肽二聚体通过非共价相互作用保持与TGF-β二聚体相连，而成熟的TGF-β二聚体和LAP二聚体都是二硫键合的。含有LAP和TGF-β的潜在TGF-β复合物被称为小潜在TGF-β复合物(SLC)。活性TGF-β和它的LAP前肽之间的连接是可逆的并涉及LAP中大幅的结构变化。LAP除了保护TGFβ之外，还含有与其他分子，即细胞膜整合素，相互作用所必需的重要残基(RGD)。在大部分细胞中，LAP是与附加蛋白，含有几个蛋白酶敏感位点的潜在TGF-β结合蛋白(LTBP)共价连接的，其为从ECM结构上溶解大的潜在复合物(LLC)提供了一种方式。LTBP对于复合物的分泌，TGFβ的折叠，靶向与ECM的结合(主要是弹性蛋白原纤维和富含纤连蛋白的细胞外周纤维(pericellular fibers))和预防TGFβ1与局部基质蛋白的相互作用是很重要的。LAP并非LTBP足以负责TGF-β的潜伏(latency)(Saharinen et al.，1999.Cytokine Growth Factor Rev.11，2691-2704)。
潜在TGFβ的激活涉及LAP和TGFβ之间的非共价相互作用的破坏/解离，以便实现成熟肽与其信号受体的相互作用。已提出了几个机制描述TGFβ的释放(Saharinen，1999.Cytokine Growth Factor Rev，10，99-117)，但该过程是复杂的且是组织依赖性的，因此仍未完全弄清楚。所有机制都涉及在可溶性SLC和/或ECM结合的LLC中TGF-β1从LAP-β1上的解离。尽管LTGFβ可在试管中、在体内，通过瞬时酸(transient acid)，碱，加热，或离液剂例如尿素被激活，蛋白酶切割显然是涉及不同蛋白酶(诸如骨形成蛋白(BMPs)，基质金属蛋白酶(MMPs)，纤溶酶，凝血酶敏感蛋白1，白细胞弹性蛋白酶，肥大细胞胰凝乳蛋白酶等)的TGF-β激活中最突出的步骤，这些酶在蛋白酶敏感的铰链区切断LTBP，并且切下的复合物靶向细胞表面(Taipale et al.，1992.J Biol Chem.，267，25378-25384)。然后截短的LLC和SLC可进行不同的体内激活机制：a)LAP被蛋白酶降解；b)通过与整合素和凝血酶敏感蛋白的相互作用诱导LAP的构象变化；和c)LAP与成熟TGF-β1之间非共价键的断裂(Annes et al.，2003.J Cell Sci.116，217-224)。一旦释放出来，TGFβs可与它们特异性的细胞表面受体结合(三种成分(components)，I型，II型和III型)以便通过下游效应子(如Smad蛋白)诱导发出信号。
因为许多机制都可刺激细胞激活潜在TGFβ，潜在TGFβs的激活机制和时间对于每种细胞和组织类型似乎是特定的。事实上，编码功能相似的蛋白，且由不同调控启动子控制的不同的基因的存在(Roberts et al.，1991.Ciba Found.Symp.，157，7-28)为确保不同的TGFβs同工型(isoforms)的组织特异和时空表达模式，并实现适当的细胞和组织行为提供了重要机制(Piek et al.，1999.FASEB J.，13，2105-2124)。因此，本发明可用于通过固定适当的潜在生长因子或潜在生长因子的组合影响特定组织中的特定细胞类型。
在哺乳动物中，存在三种TGFβ的同工型，即TGFβ1，-β2和-β3(Li et al.，2006.Annu Rev.Immunol.，24，99-146)，它们参与了众多的体内功能(参照Katrien et al.，2005.Endocrine Reviews，26，6，743-774)。几乎所有细胞都有TGF-βs的受体并产生这些同工型中的至少一种。
TGFβ1是普遍存在的(血小板和骨中含量最高)，它是一种牵涉许多细胞过程的多功能生长因子(移动，增殖，分化，存活，产生ECM)(Moses HL，Serra R.，1996.Curr Opin Genet Dev.，6，581-586)，会影响例如胚胎发生，血管发生，血管新生(vascuologenesis)，发炎(主要是依赖环境的抗炎症效果)，免疫调节(通常是免疫抑制剂)，伤口愈合和在生命周期内维持组织的动态平衡的过程(Gorelik & Flavell，2002.Nat Rev Immunol.2，46-53；ten Dijke & Arthur，2007.Nat.Rev Mol Cell Biol.，8，857-869；Roberts AB，1998.Miner Electrolyte Metab.，24，111-119)。在骨骼组织(skeletal tissue)中，TGFβ1在发生和维持，影响软骨(Mehlhom et al.，2007.Cell Prolif.，40，6，809-23)和骨(Ripamonti et al.，2006.J Anat.，209，4，447-68)的新陈代谢中发挥主要作用。它在维持骨吸收和骨形成的动态过程之间的平衡中具有关键作用。骨形成是由TGFβ1，通过成骨细胞的趋向吸引力(chemotactic attraction)，成骨细胞增殖和产生ECM蛋白的早期分化的增强，II型胶原表达的刺激和通过软骨细胞前体细胞的蛋白多糖合成和造血前体细胞增殖的抑制来启动的。生长板软骨细胞对TGF-β1特别敏感，其响应水平比在相似条件下调节成骨细胞样细胞要低10倍(Dallas et al.，1994.J.Biol.Chem.，269，6815-6822)。在软骨内分化(endochondral differentiation)的后期，TGF-β1抑制软骨细胞肥大和基质钙化(Ballock et al.，1993，Dev Biol.，158，414-429，1993)。与其他生长因子(IGFs，FGFs，PDGFs，和EGFs)相比，TGFβs是最有效的软骨细胞中软骨发生和软骨ECM合成增强的诱导剂(Vunjak-Novakovic et al.，2005.Orthod Craniofac Res.，8，209-218)，如以下例举的，潜在形式的TGFβ1被固定在纳米纤维支架上，并使用人软骨细胞在体外论证思想的证据。
此外，除骨和软骨之外，TGF-β1还直接或间接参与其他细胞类型的调控，例如肝细胞(Chia et al.，2005.Biotechnol Bioeng.，5，89，5，565-73)，血管内皮细胞(Sales et al.，2006.Circulation，114(1Suppl)：I193-9)，心肌成纤维细胞(Caraci et al.，2008.Pharmacol Res.，57，4，274-82；Lim et al.，2007.Mol Cells，31，24，3，431-6)，来自人视神经的视乳头筛板细胞(Kirwan et al.，2004.J Glaucoma.13，4，327-34)，视网膜上皮细胞(Uchida et al.，2008.Curr Eye Res.，33，2，199-203)，肾系膜细胞(Huang et al.，2008.Am J Physiol Renal Physiol.，Mar 26-epub)，眼外肌细胞(Anderson et al.，2008.Invest Ophthalmol Vis Sci.，49，1，221-9)，小鼠中脑前体(Roussa et al.，2006.Stem Cells，24，9，2120-9)，肠道上皮细胞(Kurokowa et.Al.，1987.Biochem Biophys Res Commun.，142，775-782)，支气管上皮细胞(Masui et al.，1986.PNAS，83，2483-42)，并控制或影响分化，转分化，移动，ECM产生或避免基质降解等在内的其他细胞行为。因此，根据TGFβs对不同组织过剩的和潜在的影响，本发明可用于靶向不同类型组织中的几种疾病，例如在骨(骨发生)，软骨(软骨发生)，心脏病(如LTGF修饰的主动脉瓣(aortic valves))，眼科疾病(如由LTGF修饰的纳米纤维片制成的可移植的视网膜上皮细胞)或肾病，但并不限于这些。对于在肾病治疗中的应用，要注意已报导潜在TGF-β1可预防新月体性肾小球肾炎中的肾脏发炎(Huang et al.，2008.J Am.Soc.Nephrol.，19，2，233-42)。
TGFβ同工型被认为具有相似的功能。一些研究报导了TGFβ2和TGFβ3对细胞功能的潜在影响。例如TGF-β2已成功地用于治疗最频繁和严重的儿童期癌症患者化疗的副作用的一种(粘膜炎)(Koning et al.，2007，Pediatr.Blood Cancer，48，5，532-9)，并局部用于矫形外科以增大种植体周围骨体积(peri-implant bone volume)和骨植体接触(bone-implant contact)(Ranieri et al.，2005.Bone，37，1，55-62)。TGF-β3已公开可预防CNS的炎性脱髓鞘病，实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)(Agata et al.，2003.Cytokine，25，2，45-51)。因为所有三种TGF-β同工型都在许多组织中被检测到，本发明可用于固定潜在TGF-β1，潜在TGF-β2和潜在TGF-β3，或它们的任意组合。
此外，潜在TGF-β1，潜在TGF-β2和潜在TGF-β3可按照不同比例和组合进行固定以实现不同的细胞应答，例如恢复三种同工型在骨(对矿化的影响)和软骨，以及其他组织中的精确作用。
如上所述，本发明可应用于固定其他已知或未知的潜在形式的任何生长因子或细胞因子。除了TGFβ1，TGFβ2和TGFβ3之外，属于TGFβ超家族的其他细胞因子也可生成潜在形式，例如激活素和抑制素，骨形成蛋白(BMPs)例如BMP7，(Gregory et al.，2005.J Biol Chem.29，280，30.27970-80)，生长分化因子(GDFs)(Gaoxiang et al.，2005.Mol.Cel.Biol.，25，14，5846-5858)。通过生长因子与潜在相关蛋白例如TGFβLAP的连接可实现生长因子的潜伏。通过本领域已知的方法可提供与潜在相关蛋白连接的生长因子。因此本发明可应用于这些或它们的组合。
因此，本发明可用于制备提供一种或多种潜在生长因子的生物材料，用作有效的生物活性支架。
本发明可与其他可选生物活性分子一起使用作为连接了含有潜在相关肽(LAP)和特定蛋白水解切割位点(如可被MMPs切割)的融合蛋白的重组生长因子，以便实现这些生物活性分子的潜伏。因此，潜在形式的生长因子可包括与潜在相关肽相连的生长因子。
潜在形式的生长因子可含有与一种或多种潜在相关肽融合在一起的活性形式，如以上TGFβ实施例中所述的。可选地，潜在相关肽可通过任何共价或非共价相互作用与活性形式的生长因子相连接。任何生长因子，以生长因子活性被压制直至通过细胞信号激活的形式被提供的，都可用于本发明。
潜在形式的生长因子可通过任何适宜方式固定在生物材料上。潜在形式的生长因子可直接固定在生物材料表面，例如通过共价连接或通过非共价相互作用的方式，例如离子键，疏水相互作用，氢键，范德华尔力，偶极-偶极键，和π-π相互作用。特定的固定方式取决于所用生物材料的类型。
可选地，潜在形式的生长因子可通过一种或多种中间分子(intermediate molecular)固定在生物材料上。例如，潜在形式的生长因子的特异的任何抗体可通过本文所述任何固定方法固定在生物材料表面，而潜在形式的生长因子可与抗体结合。抗体可以是多克隆，单克隆或重组抗体。除了完整抗体之外，也可使用能够与潜在形式的生长因子结合的抗体片段或衍生物。因此，中间分子可以是能够与潜在形式的生长因子结合的抗体片段或合成结构体。Dougall与其合作者(Dougall et al.，Tibtec，12：372-379，1994)给出了抗体片段和合成的结构体的实施例。抗体片段包括，例如Fab，F(ab′)2和Fv片段。在Roitt et al，Immunology第二版(1989)，Churchill Livingstone，伦敦中讨论了Fab片段。Fv片段可被修饰生成合成的结构体，称为单链Fv(scFv)分子。包括共价连接Vh和V1区域的肽连接体(linker)，其有利于分子的稳定性。其他可用的合成的结构体包括互补决定区(CDR)肽。这些是含有抗原结合决定簇的合成肽。其他可用的合成的结构体包括嵌合分子，其包括来自非人哺乳动物(如小鼠或大鼠)的可变区和人恒定区。此外，合成的结构体包括人源化(或primatised)抗体或其衍生物，其中抗体除了互补决定区之外是人类的，该互补决定区取自非人哺乳动物。Morrison等在PNAS上(81：6851-6855，1984)和Takeda等在Nature上(314：452-454，1985)举例讨论了产生嵌合/人源化抗体的方式。还可使用肽模拟物。这些分子通常是模拟CDR环结构的构象限制的有机环，其包括抗原交互侧链(antigen-interactive side chain)。
可以使用已知与潜在形式的生长因子特异性结合的商业可供抗体或其片段。可选地，抗体可通过本领域已知方法形成潜在形式的生长因子。产生与肽/蛋白结合的单克隆和多克隆抗体的技术目前已经发展成熟(Roitt et al.，Roitt’s Essential Immunology，2006)。多克隆抗体可通过在适宜动物宿主(如小鼠，大鼠，荷兰猪，兔子，绵羊，山羊，猴子，马，猪)中用适宜免疫偶联物免疫之后刺激产生。单克隆抗体可用适宜免疫偶联物免疫之后产生，其是通过融合脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞(如P3-X63/Ag 8.653)然后筛选出存在能识别潜在形式的生长因子的抗体的融合细胞(Kohler & Milstein，Nature，1975，256，52-55)。选择的杂交瘤细胞可以克隆并扩增，抗体通过亲和色谱法纯化(Nowinski et al.，Virology 1979，93，111-126)。
可通过本领域已知的任何适宜方式将一种或多种中间分子固定在生物材料上。
潜在形式的生长因子可通过潜在生长因子分子上的特定位点(或中间分子)固定在生物材料上，以确保按特定方向提供潜在生长因子。潜在生长因子如果按特定方向固定在生物材料上则可能会更有效。可选地，潜在形式的生长因子可通过潜在生长因子分子(或中间分子)上的非特定位点固定在生物材料上(即随机地)。使用涉及潜在生长因子随机固定在生物材料上的方法可将更大量的潜在生长因子固定在生物材料上。
根据生物材料/支架上可用的功能基团，可使用偶联化学(conjugation chemistry)(或通过本领域已知的任何其他方式)来实施潜在TGFβ或其他任何潜在生长因子的固定。例如，可使用适宜等离子体技术(在以下实施例中更具体地描述了它的一个实例)修饰生物材料，以便将氨基，羧基，羟基，乙烯基，和其他反应性基团引入其表面。如果是氨基，可使用Sulfo-SMCC(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐)与生物材料表面的氨基形成共价键，也可与潜在形式的生长因子(如TGFβ)上存在的巯基形成共价键。因此，潜在形式的TGFβ可通过潜在形式的TGFβ上存在的末端巯基固定在生物材料上。末端巯基可与生物材料或与应用在生物材料上的功能基团直接共价或非共价键合。可选地，末端巯基可通过中间分子与生物材料间接共价或非共价键合。
优选地，若生长因子是TGFβ，生物材料可以用氨基修饰并用马来酰亚胺基进一步功能化，其可与SLC分子上的末端巯基特异性反应(参见图7)。通过该方式，一旦固定在材料表面，SLC将维持定向，模拟在正常体内ECM生理条件下激活之前所存在的构象。因此，潜在生长因子如果按特定方向固定在生物材料上在体内会更有效。通过使用例如Sulfo-SMCC(参见以下实施例)可实施化学偶联，但其他类似的试剂也是可用的(如Sulfo-EMCS([N-e-马来酰亚胺乙酰基氧]硫代琥珀酰亚胺酯)，GMBS(N-[g-马来酰亚胺丁酰基氧]琥珀酰亚胺酯)，和本领域已知的其他的)。然而，可以遵循其他化学偶联策略包括，例如可进一步与SLC上的自由的SH基团互换的含有NHS末端和吡啶基双硫基末端基团的分子(如Sulfo-LC-SPDP，磺基琥珀酰-2-吡啶二硫-3-丙酰氨基-6-己酸盐；Sulfo-LC-SMPT(4-磺基琥珀酰-6-甲基-a-(2-吡啶二硫)苯酰胺己酸盐(4-Sulfosuccinimidyl-6-methyl-a-(2-pyridyldithio)toluamido]hexanoate)；和商业可供的任何其他适宜的偶联试剂)。
可选地，用SLC的N末端的特异性抗体预功能化的生物材料可固定SLC。
而且，可使用来自LTBP1，LTBP2或LTBP3或它们的混合物中的潜在TGFβ结合蛋白的特定肽固定SLC。
可选地，使用除了SLC末端的硫醇之外的功能基团可将SLC随机固定在整个支架上。
可选地，如上所述，还设想了简单牢固的物理吸附到支架上，其涉及疏水相互作用或其他。
此外，特定的潜在形式的生长因子的固定可定向于支架内的特定部位，以促进不同的细胞应答或触发不同细胞类型的激活/由不同细胞类型激活。
可选地，可将含有不同潜在形式或不同表面密度的潜在形式的不同材料混合以实现更佳的细胞应答。
因而，在另一方面，本发明提供了制备本发明所述生物材料的方法，其包括将潜在形式的生长因子固定在生物材料上。该方法包括以下步骤：
-修饰生物材料以便提供能够与潜在形式的生长因子上的功能基团结合的功能基团；和
-在允许潜在形式的生长因子与生物材料上功能基团结合的条件下将修饰的生物材料与潜在形式的生长因子接触。
功能基团可以是能够实现与潜在形式的生长因子的特定结合作用的任何化合物。所述方法可包括本文所述的任何固定技术。
其上固定有潜在形式的生长因子的生物材料的上面还可含有一种或多种细胞。细胞可固定或接种在生物材料上。例如，细胞可制成水性悬浮液，然后将其加至生物材料上。因此，细胞可与生物材料形成强或弱的附着，可保持在生物材料的固定位置上或能够相对于生物材料表面移动。所述细胞可以是祖细胞。所述祖细胞可以是胚胎干细胞，胎儿干细胞，脐带或胎盘干细胞，或成人干细胞(例如间质或造血细胞)，或其他干细胞。细胞可来源于骨髓，或脂肪组织(但不限于这些)，还可以使其他原始细胞。例如，细胞可以是软骨细胞(例如鼻或关节软骨细胞)或人骨膜源细胞。特定细胞取决于生物材料的预期用途。细胞可来源于欲植入生物材料的任何动物物种。优选地，所述细胞是人细胞。
而且，本发明可与伴随使用其他固定或游离的溶液形式的生长因子组合，因为在存在其他细胞因子时，许多TGFβ的作用会增强(如IL-2对于T细胞分化)。
也可使用任何共调节TGFβ超家族的作用的其他分子，例如激素(地塞米松)，维生素(维生素D)和本领域已知的其他。
此外，生物材料或支架可含有经修饰具有例如特定的骨诱导性，软骨诱导性，血管生长素肽(angiogenic peptide)，但不限于这些的材料(如不同纤维)和单种或多种生长因子修饰材料的混合物。
固定的潜在生长因子的激活可通过添加特定激活抑制剂，例如肽，共同控制。
因此，本发明描述了利用潜在形式的生长因子来影响和管理细胞行为的新策略(以存储在小潜在TGF-β1内的TGF-β1为例)。该工艺涉及潜在形式的生长因子在生物材料的表面(如纳纤维)的固定/累积，作为待使用的但仍是失活形式的生物活性分子库。相关肽或LAP，赋予TGF-β1同工型的成熟肽的潜伏，屏蔽与受体相互作用的表面，预防即时(immediate)下游信号。此外，LAP作为稳定剂，保护TGF-β1免于降解和失活，其拥有与其他分子相互作用的重要残基。当潜在形式的TGFβ1存在于支架表面时，细胞可与它相互作用并根据细胞需求调控潜在TGF-β1存储库的激活，在局部完全或部分(仍然保留在支架内的百分比)释放活性形式的生长因子。可溶性生长因子(GF)的生物活性可用于细胞受体相互作用，触发细胞内级联信号。本发明提供了比其他受控生长因子递送尝试更密切地接近于体内的状态。在骨中，细胞有效地分泌大量的SLC(确实这是骨中生长因子的主要形式)(Bonewald et al.，1999.Mol.Endocrinol.，5，741-751)。环境中其他生长因子的存在，细胞分化阶段和如此的环境决定了可用潜在形式的激活与否。这种方式，细胞本身调节生长因子在适当时间以适当浓度激活和释放，决定了生长因子对于细胞活性的准确结果。如上所述，本发明覆盖了其他潜在形式的生长因子以及潜在融合蛋白。
在另一方面，本发明提供了本发明生物材料在体外的应用。本发明的体外方法可用于在生物材料植入患者之前促使原始细胞分化和/或生长。此外，本发明可用于生成生物活性材料作为细胞支持物用于体外细胞培养和分化(例如对于骨或软骨生长和/或分化)。而且，本发明可与生物反应器体系(如水动力生物反应器)组合使用，以便通过例如营养供应和/或机械刺激来增强细胞结构体的生长。
本发明也可使用固定在生物材料上的潜在生长因子(例如TGFβ)，用于研究动力传导信号途径。
在另一方面，本发明提供了本发明的生物材料在医学上的应用。例如，本发明提供了本发明的生物材料在组织再生或修复上的应用。例如，在其上固定有潜在形式的TGFβ的生物材料可用于骨和/或软骨的修复或再生。
在另一方面，本发明提供了治疗患者组织损伤的方法，其包括将本发明的生物材料植入患者中。
本发明的生物材料可用于动物，例如哺乳动物，优选人的治疗。可使用本发明的生物材料治疗的其他动物包括驯养动物例如狗，猫，兔子，马，荷兰猪等，和牲畜例如绵羊，母牛，猪，山羊，鸡等和其他。
本发明的生物材料可用于被疾病或伤害损伤的组织的修复(即，诱导再生和生长)。
若生长因子是TGFβ，本发明的生物材料可用于几种组织类型的几种疾病的治疗，例如骨(骨发生)，软骨(软骨发生)，心脏病(如LTGF修饰的主动脉瓣)，眼科疾病(如LTGF修饰的纳米纤维片制成的可移植的视网膜上皮细胞)或肾病，但并不限于这些。
因为来自免疫系统的细胞(如巨噬细胞)可从其潜在形式释放出生物活性的TGFβ，本发明可以用于在某些特定疾病中发挥有力的抗炎症作用，这取决于环境，因为TGF-β在一些自免疫疾病中会是供不应求的，但在许多病理状态例如肺纤维化，克罗恩病等中又是供过于求的。
本申请的另一重要领域是伤口愈合修复，因为TGFβ与其他生长因子合作刺激该过程(Hyytiainen et al.，2004，Crit Rev Clin Lab.Sci.，4，233-264)。也因为存在TGF-β1可保护心肌细胞免于缺血性损伤的最新证据，因此，本发明可用于缺血性损伤之后的心脏重塑(Bujak & Frangogiannis，2007.Cardiovasc.Res.，74，184-195)。
本发明每个方面的优选特征都可针对每个其他方面进行必要修正。本文提及的现有技术文献在法律许可范围内最大程度地引入本文。
附图说明
现在参照附图讨论本发明的具体实施方式，其中：
图1-显示电纺产生的PLLA纤维的形态的典型SEM照片。
图2-A-未处理的和使用不同曝光功率(W)和时间(分钟)的氨等离子体处理的PLLA纤维的X射线光电子能谱；
B-支架表面上N 1s原子百分数的计算值；
C-支架表面上NH2基团(nmol/mg PLLA)的计算值。
图3-未处理的PLLA和等离子体处理的PLLA的ATR-FTIR光谱。
图4-基于存活/死亡试验(Live/Dead assay)的人关节软骨细胞的细胞活力(viability)。pLTGF＝与等离子体处理的PLLA(ptPLLA)随机相连的LTGF；sLTGF＝定向固定在用Sulfo-SMCC修饰的ptPLLA上的LTGF。
图5-使用MTS试验评估在支架上的人关节软骨细胞的细胞生存/增殖能力。结果表示来自两个实验的三个平行培养的平均值±SD。pLTGF＝与等离子体处理的PLLA(ptPLLA)随机相连的LTGF；sLTGF＝定向固定在用Sulfo-SMCC修饰的ptPLLA上的LTGF。
图6-人关节软骨细胞在用Sulfo-SMCC和LTGF(sLTGF)修饰的等离子体处理的PLLA上培养7天之后的SEM照片。
图7-解释可能的用于产生与潜在生长因子共价连接的修饰的PLLA纤维的方法。PLLA电纺纤维进行NH3等离子体处理并使用异双功能的Sulfo-SMCC进一步功能化。潜在生长因子复合物通过它的巯基进一步共价固定。
图8-实时RT-PCR数据，显示了初级人鼻软骨细胞在不同支架类型中培养14天的mRNA表达曲线(profile)。所选软骨发生(Sox9)和分化(Col1 A1)标记的表达水平通过18S管家基因和0天表达水平归一化。提供了重复实验(n＝3)的平均变化±标准差。与其他组各自的基因相比，TGF组的Col1 A1和pLTGF组的Sox9明显更高(*p＜0.05)(初始＝未处理的电纺支架(electrospun scaffolds)；等离子体＝等离子体处理的电纺支架；TGF＝等离子体处理的电纺支架，该电纺支架用10ng/mL活性人重组TGF-β1进行长达7天的介质补充；pLTGF＝与等离子体处理的PLLA(ptPLLA)随机相连的LTGF；sLTGF＝定向固定在用Sulfo-SMCC修饰的ptPLLA上的LTGF)。
图9-每纳克TGF-β1诱导人鼻软骨发生分化的效率。用存在的或实验期间补充的TGF-β1的量除以各个组的相对基因的表达结果。获得平均值和标准差。
具体实施方式
实施例
用重组的潜在TGFβ1制备和修饰聚L-乳酸(PLLA)纤维和接种的人软骨细胞的活性评估。
材料和方法
使用自制的电纺设备将PLLA纤维制成约4mm厚的10×15cm的薄片(图1)。采用10kV电压和1mL/min的流速，将3wt％的PLLA(Mw约为300KDa，Purac)的二氯甲烷/二甲基甲酰胺(70∶30，w∶w)溶液纺成无纺支架(nonwoven scaffold)。在旋转铝芯轴上收集纤维。
等离子体处理
因为在PLLA的骨架上没有容易被修饰的反应性功能基团，所以难以通过普通化学方法修饰表面。利用等离子体的技术被广泛用于在材料表面上引入所需化学基团(Flavia & D’Agostino，Surf Coat Technol.，98，1102-06，1998)，包括PLLA。因而，为了在PLLA电纺纤维上引入氨基功能基团，使用常规NH3等离子体处理来修饰PLLA样品(Yang et al.，J Biom.Mater Res.，67A，1139-47，2003)。之前将样品切成1×1cm的方块，并均匀分布在无菌玻璃皮氏培养皿中。样品用UV杀菌30分钟，再在乙醇中浸泡1小时。晾干之后，将样品置于等离子体箱中，在充入NH3气之前将压力降至约10Pa。箱内压力稳定之后，通过在预定时间(2.5min，5min和10min；样品的每侧处理一半时间)内，将电力控制在13.56MHz的无线电频率，建立辉光放电等离子体。等离子体处理的样品再暴露于氨气中10分钟，之后取出样品(按照Yang et al.，2002.Biomaterials，2607-2614)。等离子体处理的样品被立即密封在无菌皮氏培养皿中并送至细胞培养柜用于进一步修饰。
扫描电子显微镜(SEM)分析
SEM分析用于监测细胞贴壁(attachment)和形态。在不同的时间点，将含有细胞的支架用2.5％的戊二醛甲次砷酸缓冲液(pH 7.4)在4℃固定2小时，通过梯度增强乙醇浓度进行脱水，并通过浸泡在100％六甲基二硅氮烷(HMDS)中进行最后的干燥。干燥之后，将样品固定在铝夹具(stub)上，用铬喷射包被，并采用5kV的加速电压用扫描电子显微镜观察(FEGSEM，Leo 1525)。
使用X射线光电子能谱(XPS)和茚三酮检测进行表面化学分析
为了分析通过NH3等离子体处理而成功修饰的表面，在修饰之前和之后在Kratos-Axis ULTRA DLD XPS装置上，在10mA发射和10KV阳极电位(100W)，真空度(＜3x10-9Torr)条件下操作，通过X射线光电子能谱(XPS)分析样品。使用带Kratos敏感度系数的CASAXPS软件分析数据，从峰面积中确定原子百分数值(％)。对高分辨率光谱Cls进行去卷积和曲线拟合以便使用适当对照(control)分析化学键状态。
茚三酮检测用于定量检测氨等离子体表面修饰的PLLA支架上氨基的数量。按之前描述的进行检测(Zhu et al.，2002，Biomacromolecules，11，3，1312-1319；Zhu et al.，2004，Tissue Eng.，1，10，53-61)。
ATR-FTIR分析
用Perkin Elmer 2000 FTIR在650-4000cm-1的区间以4cm-1的分辨率每个样品扫描16次，由此获得未处理和NH3处理的PLLA的ATR-FTIR光谱。
重组的潜在TGFβ1的固定
图7显示了将LTGFβ1固定在PLLA支架上的示意图。为了通过SLC的两个自由巯基将其定向共价固定在LAP的N末端，将经等离子体处理的PLLA上的氨基用Sulfo-SMCC(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐)修饰。异双功能交联剂是水溶性的并含有氨基反应性的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS酯)和巯基反应性的马来酰亚胺基团。NHS酯在pH 7会与PLLA纤维上的伯胺基反应形成稳定的酰胺键，而马来酰亚胺基团在pH 6.5-7.5会与SLC上的自由巯基反应形成稳定的硫醚键。因为间隔臂的环己烷桥，Sulfo-SMCC和SMCC的马来酰亚胺基团在pH高达7.5时仍十分稳定。由于其含有亲水性的磺酰部分，Sulfo-SMCC可溶于水，因而可避免使用会扰乱纤维PLLA结构的有机溶剂。将刚经过氨等离子体处理的PLLA样品在无菌PBS中浸泡30分钟，然后浸泡在刚制备的3mg/ml的Sulfo-SMCC PBS溶液中，并在无菌细胞培养安全柜内搅拌(定轨摇床)反应2小时。弃去上清液并用无菌PBS清洗支架三次。然后将功能化支架在重组的潜在TGFβ1(0.75μg/mL)的无菌PBS溶液中(刚制备的)浸泡2小时。去除上清液，用无菌PBS清洗支架三次，并将其分别置于细胞培养板上用于细胞接种。
为了将重组的潜在TGFβ1随机固定在PLLA上，将刚制备的NH3等离子体处理的PLLA样品立即浸泡在0.75μg/mL的SLC的PBS溶液(刚制备)中2小时。去除上清液，用无菌PBS清洗支架三次，并将其分别置于细胞培养板上用于细胞接种。
使用免疫测定法定量支架上的潜在TGF-β1
使用之前描述的修饰程序(Pedrozo et al.，1998，J Cell Physiol.，177，343-354)实施固定的LTGF-β1的测量。开始先将修饰的支架和适当对照在37℃，0.3U/mL胞浆素(Sigma-Aldrich，UK)的DMEM溶液中消化3小时，以便从支架上释放LTGF-β1。通过添加终浓度为5μg/mL的抑肽酶(Sigma-Aldrich，UK)来终止反应。收集上清液，通过在室温下给每100μL上清液中加入20μL的1M的HCl来酸化上清液10分钟，从LTGF-β1复合物上释放免疫反应性的TGF-β1。用1.2N的NaOH/0.5M的HEPES中和酸化的上清液至pH～7.3，并立即按照生产商的方案使用Quantikine Human TGF-β1免疫测定法(R&D Systems，UK)进行TGF-β1的定量。
细胞的培养和接种
在这个实施例中，我们采用从45岁健康患者(healthy patient)的人鼻中隔软骨(septal cartilage)分离的软骨细胞(拥有完全的伦理许可)和从Lonza(Lonza Walkersville，MD)获得的成人关节软骨细胞。细胞在含基本软骨细胞生长培养基(bCGM)的组织培养塑料(TCP)瓶中扩增培养，该培养基是在之前报导基础上补充了10％(v∶v)的FBS，2mM的L-谷氨酸(GIBCO)，0.1mM的非必需氨基酸(GIBCO)，100U/ml的青霉素，100μg/mL的链霉素，50μg/mL的抗坏血酸-2-磷酸盐的不含酚红的DMEM(Gibco 41966)。将所有细胞培养物保持在37℃含95％空气和5％CO2的培养箱中。每三天给培养物补充37℃的新鲜培养基。
为接种支架，将培养细胞经胰蛋白酶作用，收获，计数并重悬在小体积bCGM中，之后再均匀逐滴接种在支架上，该支架之前在37℃下在DMEM中处理30分钟。之后将结构体在细胞培养箱中37℃孵育4小时以使得细胞扩散至并附着在支架上，之后添加新鲜的无血清培养基(见下文)。支架接种为在1.5×1.5cm2支架上接种9000细胞/cm2。对于基因表达研究，样品接种为在4×4cm2支架上接种3.5×104细胞/cm2。将含有5×105细胞的沉淀速冻并用作基因表达分析的0天样本。
为了评估固定在支架上的LTGFβ1对于细胞培养软骨细胞的影响，整个实验使用无血清的限定化学成分的分化培养基。无血清培养基是由不含FBS的bCGM组成的，并补充了ITS+预混液(BD Bioscience)(6.25μg/ml胰岛素，6.25μg/ml转铁蛋白，6.25μg/ml硒，1.25mg/ml牛血清蛋白，5.33μg/ml亚油酸；Sigma)和100nM地塞米松(Li et al.，2005.Biomaterials，26，599-609)。每三天更换培养基。
细胞活力
通过存活/死亡试验检查支架中培养的软骨细胞的活力(Molecular Probes，Eugene，OR)。简而言之，用PBS清洗接种了软骨细胞的支架，避光并在室温下在含2μM calcein AM(染色活细胞)和4μM EthD-1(染色死细胞)的PBS溶液中孵育30-45分钟。然后，用PBS清洗每个样品之后，使用配置有数码摄像机和适宜图像分析软件的倒置荧光显微镜进行评估。在不同区域和两面都摄制图像，以便评估细胞分布。对活细胞(绿色)和死细胞(红色)进行计数，细胞活力表示为细胞总数(绿+红)中活细胞(绿色)的数量。
细胞增殖
按照生产商的说明，使用CellTiter 96Aqueous单溶液细胞增殖试验(Promega)对细胞代谢活性进行测量，来评估支架上的细胞增殖。简而言之，接种了细胞的支架被转移至新的孔板并用无菌PBS轻轻地清洗。然后用400μL无苯酚培养基加80μL CellTiter 96试剂孵育样品，并在温度为37℃，潮湿的5％的CO2的环境中保持反应4小时。使用微孔板读数仪(Anthos Biotech)在490nm测量上清液的光密度。以相同条件下无细胞的培养样品作为空白。结果表示为两个单独实验，每个三次平行的平均值。
实时逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)
通过在1mL RLT-缓冲液(QIAGEN，UK)中添加10μL β-巯基乙醇，从软骨细胞中提取总RNA。按照生产商的方案，使用RNeasy迷你试剂盒分离总RNA，并用无RNase的DNase I(均为QIAGEN)进行处理，并使用ND-1000UV-Vis分光光度计(Nanodrop
Figure BPA00001306734900241
，USA)进行定量。将一微克总RNA逆转录成cDNA，为每种反应制成的混合液(mastermix)含有：10μL TaqmanTM通用混合液(Applied Biosystems，USA)，7μL 0.1％(v/v)的焦碳酸二乙酯(DEPC)水(Invitrogen Ltd，UK)，2μL提取的cDNA和1μL Taqman探针(Applied Biosystems，USA)。TaqMan
Figure BPA00001306734900242
基因表达检测试剂盒用于扩增软骨相关基因，包括I型胶原(Col1A1-I，NM_000088)，Sox9(NM_000346)和II型胶原(NM_001844.4)。每个样品做三次平行分析。PCR反应通过50℃，2分钟和95℃，10分钟的步骤启动，以便优化用于基因表达的相对定量检测的ABI Prism 7700序列检测系统(Applied Biosystems，USA)的热循环条件。之后实施PCR扩增，在Corbett Rotor-Gene 6000(Corbett Life Science，Australia)中95℃，15秒和60℃，1分钟，循环40次。将靶信号对循环数作图，阈值水平设定为0.05。比较所有的截距值，此时样品反应进行到扩增阶段。使用比较CT方法校正我们的结果(Wang et al.，2006，J.Assoc.Lab.Aut.，11，314-318)。基因表达的倍数变化表示为相对于0天细胞变化的平均值±标准差。每个靶基因的相对表达水平通过管家基因18S(X03205)的Ct值归一化。
统计分析
使用SPSS 12.0软件包(SPSS Inc.，Chicago，USA)计算结果的平均值和标准差。对两个独立样品实施曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U Test)以确定不同支架之间的统计显著性。p值＜0.05被认为在统计上是显著的。
结果和讨论
图1显示了本发明所用的典型纤维性支架。电纺纤维类似于来自软骨细胞外基质的纳米级别的纤维。纤维直径分布相当窄，平均纤维直径是242nm，是由每个样品图像中40根纤维的测量计算得到的(三次平行)。
采用不同NH3气体曝光时间的等离子体处理的PLLA电纺样品的表面原子组成(碳，氧，氮)如图2-A所示。光谱显示了对应C 1s(285eV)、O 1s(532eV)和N 1s(400eV)的三个主要信号。由不同样品XPS光谱的相对面积计算得到的校正后的化学组成显示了表面的氮数量增加至5.2原子％，与100W和10分钟曝光的功率供应(power supply)相符(图2-B)。在399.7eV的峰归属于-N-H-(Yang et al.，2002.Biomaterials，2607-2614)。此外，通过ATR-FITR分析未处理的PLLA和NH3等离子体处理的PLLA(图3)以评估氨基的存在。在两种样品中，都观察到在1754cm-1(vC＝O)，1450cm-1(δasC-H)和1085cm-1(vsC-O-C)的典型峰值，这与其他作者的发现是一致的(Paragkumar et al.，2006.Appl.Surf.Sci.，253，2758-2764；Kister et al.，1999.Polymer，39，2，267-273)。等离子体处理的PLLA光谱也显示了在3400-3200cm-1区域的弱宽谱带和在1650-1550cm-1区域的弱肩峰，这指示了N-H拉伸振动和N-H弯曲振动的存在。使用茚三酮检测的化学定量显示了在氨等离子体处理的PLLA表面上的伯胺基团密度随着曝光时间延长和功率提高而增长(图2-C)。修饰的支架表面上的氨基密度是从具有对应100W，10分钟等离子体处理的最高密度的标准曲线推导而出的(66.42nmol/mg PLLA)。
由XPS分析结合ATR-FTIR显示了等离子体处理的PLLA表面上氮的存在，茚三酮证实了在等离子体处理的PLLA表面上引入了氨基。这些氨基可用于随后的偶联步骤。
TGF-β1免疫测定法的结果显示了LTGF-β1复合物已使用随机或定向方式成功地固定在电纺支架的表面，尽管总量不同。平均195.4±34pg/cm2的TGF-β1从pt-LTGF支架上激活，而14.1±1.7pg/cm2是从sLTGF基团恢复而得。在剩余基团中未检测到TGF-β1。
图4显示了细胞接种的支架培养1、7和14天之后存活/死亡试验的结果。细胞在支架上良好的保持力对于临床应用/移植是至关重要问题。14天之后，在等离子体处理的PLLA(ptPLLA)上的人关节软骨细胞的细胞活力从100％降至约65％，而在用重组LTGF修饰的支架上，细胞活力保持在90％以上。
MTS试验基于检测代谢活性，用于比较不同修饰支架上的细胞增殖。图5显示了接种支架在培养1、7和14天之后MTS增殖检测的结果。pLTGF(与等离子体处理的PLLA随机连接的LTGF)和sLTGF(定向固定在用Sulfo-SMCC修饰的ptPLLA上的LTGF)支架上培养的细胞代谢活性(p＜0.01)明显高于在等离子体处理的ptPLLA(p＜0.012)上的。而且，在随机固定LTGF的支架上培养的细胞与使用Sulfo-SMCC以定向方式固定LTGF的支架上培养的细胞相比，在培养7和14天时，存在明显的统计学差异(p＜0.015)。
图6显示了与sLTGF修饰的PLLA纤维相互作用的关节软骨细胞的SEM图像。可观察到附着和扩散在支架上的细胞。
使用实时RT-PCR分析了在不同支架类型上培养的鼻软骨细胞的软骨特异性去分化标记的mRNA的表达(图8)。现存的生成软骨代用品的问题是软骨发生表型的保持。软骨细胞快速去分化，表达成纤维细胞标记(如CollA)，同时不再表达软骨特异性基因例如Sox9。本文所示结果证实了，与第0天相比，潜在TGF-β1功能化的支架(pLTGF)将Sox9的表达显著上调了大约10倍，表明了分化的软骨细胞表型的保持。潜在TGF-β1在生物材料上的随机定向显然并不减弱TGF对接种和新生细胞的生物利用度。这个表达水平也显著高于本实验中的所有其他支架组。在TGF组中，作为软骨细胞去分化标记的Col1A1显著高于其他支架组。
我们还考虑了每组中每纳克生长因子TGF-β1诱导分化的效率，即通过将培养基中补充的(TGF组)或功能化支架上存在(pLTGF和sLTGF组)的TGF-β1数量除以基因表达数据(图9)。如果我们考虑每纳克TGF-β1的效率，则sLTGF组在诱导软骨细胞(chondrocytic)分化上更为有效。因而，本发明的生物材料的效率可通过优化将潜在TGF-β特异性的定向固定在生物材料上的以便固定更多的潜在TGF-β的方法得到进一步改善。这种优化可包括，例如使用更长的连接潜在TGF-β复合物和生物材料的中间分子，SLC分子的巯基特异性修饰和连接到支架之前的纯化，和本领域已知的其他方法。更特异性的定向固定潜在TGF-β的生物材料会具有更高更持久地将细胞分化成软骨细胞的水平。
综上所述，我们的发现证实了LTGF修饰的纤维影响了从关节和鼻软骨分离的在体外接种了人软骨细胞的细胞行为。结果提供了固定的LTGF在细胞培养基中14天之后仍保持其生物活性的证据。这些结果显示了这种向细胞递送潜在形式的TGF-β1的新方法在体外和体内的软骨再生以及骨和TGF-β1在其中具有重要作用的许多其他组织(如上所示)中具有重要的应用价值。

Claims (12)

1.一种生物材料，其特征在于，该生物材料上固定有潜在形式的生长因子。
2.根据权利要求1所述的生物材料，其中，所述潜在形式的生长因子包括与潜在相关肽相连的生长因子。
3.根据权利要求1或2所述的生物材料，其中，所述生长因子是TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β4，TGF-β5或TGF-β超家族的任何其他成员，所述TGF-β超家族的任何其他成员包括激活素类，抑制素类和骨形成蛋白，所述骨形成蛋白包括BMP1，BMP2，BMP3，BMP4，BMP5，BMP6，BMP7。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的生物材料，其中，所述生物材料上还含有细胞。
5.权利要求1-4中任意一项所述的生物材料的制备方法，其特征在于，该方法包括将潜在形式的生长因子固定在生物材料上。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
-修饰生物材料以便提供能够与潜在形式的生长因子上的功能基团结合的功能基团；和
-在允许潜在形式的生长因子与生物材料上的功能基团结合的条件下，使修饰的生物材料与潜在形式的生长因子接触。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述生物材料是用能够与潜在形式的生长因子上的功能基团结合的氨基和/或马来酰亚胺基修饰的。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述生物材料是用潜在形式的生长因子的特异性的抗体修饰的。
9.根据权利要求1-4中任意一项所述的生物材料，用于医学上。
10.根据权利要求9所述的生物材料，用于组织再生或修复。
11.权利要求1-4中任意一项所述的生物材料在体外的应用。
12.一种治疗患者组织损伤的方法，其特征在于，该方法包括将权利要求1-4中任意一项所述的生物材料植入患者中。
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