KR20110037973A

KR20110037973A - 잠재형 형태의 성장인자를 가지는 생체물질

Info

Publication number: KR20110037973A
Application number: KR1020107029346A
Authority: KR
Inventors: 몰리 스티븐; 호세 사르디냐; 얼-흐수인 림
Original assignee: 임페리얼 이노베이션스 리미티드
Priority date: 2008-05-27
Filing date: 2009-05-27
Publication date: 2011-04-13
Also published as: CN102112161A; JP2011521692A; GB0809592D0; BRPI0909563A2; AU2009252997A1; EP2300064A2; WO2009144457A2; WO2009144457A3; US20110123592A1; CA2726014A1

Abstract

상기 발명은 성장인자의 잠재형 형태가 생체물질에 고정된 형태를 가지는 생체물질에 관한 것이며, 성장인자를 생체물질에 고정하는 단계를 포함하는 상기 생체물질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 상기 생체물질은 조직 재생 및 복구와 같은 의약 용도로 사용될 수 있다.

Description

생체물질{BIOMATARIAL}

본 발명은 성장인자의 잠재형 형태가 생체물질에 고정된 형태를 가지는 생체물질 및 성장인자를 생체물질에 고정하는 단계를 포함하는 상기 생체물질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 일반적으로 예컨대 조직공학 분야에서 사용되는 생체물질에 관한 것이다. 예컨대 골 또는 연골조직의 엔지니어링이나 복구와 같이 조직 엔지니어링 또는 복구에 사용되는 물질 또는 방법과 관련된 것이다. 본 발명은 일반적으로 생체물질의 표면에 있는 성장인자를 잠재형 형태로 고정화하는 기술, 생체물질을 준비하는 과정 및 생체물질의 사용방법에 관한 것이다.

선천적 장애 또는 질환 및 손상에 의해 야기되는 연골 퇴화는 조직의 제한된 본질적 치료 잠재력을 고려해 볼 때, 임상적으로 매우 중요하다. 연골은 무혈관성 조직이고(혈액의 공급이 부족) 이것은 특히 성인의 연골의 경우 악화된 관절에 대한 상처치료반응에서 자가 치료능력이 매우 적거나 없다는 것을 의미한다. 따라서 인체의 일부인 연골세포에 의해 연골의 손상(예컨대 연골병변)을 치료하기 위한 시도는 불완전한 결과를 초래할 것으로 생각된다. 전체 관절 이식은 상대적으로 성공적이라고 볼 수 있으나 손상된 연골을 복구하기 위한 치료는 만족스러운 결과를 낳지 못하고 있으며, 완전한 기능회복 및 손상 전의 정상상태로 조직의 복구는 어렵다. 연골조직 치료를 돕기 위해 전신에 영향을 주는 성장인자를 투여하는 것은 대안이 될 수 없다. 이는 독성, 다면발현효과 및 효능 발휘를 위한 비생리학적으로 높은 양이 요구되는 점(Prud’homme & Piccirillo, 2000. J. Autoimmun., 14, 23-42) 때문이다. 관절의 연골 손상의 복구를 돕기 위한 몇몇 기술로는 골막(periosteum 또는 perichondrium) 이식으로 손상부위를 재표면 처리하는 방법 또는 자기유래 연골세포 이식과 함께 골막판 또는 생체물질판을 사용하는 방법이 있다. 이러한 두가지 접근방식은 대개 매우 작은 국부적인 병변에 한정되고 재생된 연골(fibrous versus hyaline)의 특성은 아직까지 확인되지 않고 있다. 자가 골연골 이식술은 골연골 플러그들을 적재되지 않은 베어링 표면[보통 페무르(femur)]으로부터 옮겨와 손상부위로 이식하는 또 다른 통상의 접근방식이나, 이 기술은 사망률과 관련되어 있고, 섬유연골이 이식된 플러그들 사이에서 형성될 수 있다. 외상 또는 퇴행성 관절염(이는 크고 비제한적일 수 있다)에 의해 야기되는 연골 손상으로 인한 연골의 큰 손상의 경우 현재의 치료방법들은 적합하지 않고 전체 또는 부분적인 관절 이식만이 자주 수행된다.

지난 10년간, 새로운 조직공학 개념들은 연골((Ng et al., 2007. Ann Biomed Eng. 35, 11, 1914-23), 뼈(Fedorovich et al., Tissue Eng Part A. 2008,14, 1, 127-33; Yefang et al., 2007. Int J Oral Maxillofac Surg. 36, 2, 37-45), 많은 다른 조직들 예컨대 피부(Priya et al., 2008. Tissue Eng Part B Rev., 14, 1, 105-18), 특히 뉴런, 간(Leeet al., 2008. Tissue Eng Part B Rev., 14, 1, 61-86 참조)을 포함하는 기능적인 조직 대체물들의 생성을 위한 몇 가지 가능성을 보여주었다. 이는 차후 생체 내 이식하기 위해 또는 생체에 직접 주입 또는 이식하기 위해 in vitro 상에서 3차원적 조직 구성들의 엔지니어링에 의해 생성된다. 기본 원리는 적합한 세포원으로 자라난 생체적합성이 있으면서도, 구조적, 기계적으로 적합한 스캐폴드를 사용하고, 세포성 분화 및/또는 성숙을 촉진시키기 위하여 스캐폴드를 생물체에 작용하는 분자와 함께 로딩하는 것이다. 예컨대 골형성 및 연골형성을 유도하기 위해 특이적 유도 성장인자들(특히, 골유도, 연골유도) 및 이들의 조합물을 첨가한 자연적 또는 합성 생체물질 스캐폴드들을 동종이계 및 자가유래의 성숙한 세포, 간세포 또는 줄기세포들(Kim & Recum, 2008, Tissue Eng Part B Rev., 14, 1, 133-47)과 함께 사용하는 조직들의 엔지니어링을 위한 다수의 접근방식이 있다.

3차구조의 스캐폴드는 높은 레벨의 조직을 구성 및 리모델링 위해 하기 위해 구조적 지지를 제공하고, 씨딩된 세포들이 새로운 자연 조직을 합성할 때 일시적 구조를 제공한다. 한편, 사이토카인 및 성장인자는 확산, 이동, 다른 세포타입들의 분화를 포함하는 여러 가지 세포의 활동 조절에 있어서 결정적인 역할을 한다(Polizzotti et al., 2008. Biomacromolecules. 9, 4, 1084-7; Franzesi et al., 2006. J.Am.Chem.Soc., 128, 47, 15064-5). 배지의 스캐폴드내 세포들의 배양에서 각각 다른 성장인자들이 세포들이 특히, 연골 및 뼈로 분화하도록 유도한다. 그러나, 외인성 성장 팩터가 전형적으로 배양 배지에 직접 첨가되며 (즉, 스캐폴드로부터 직점 공급되지 않음), 따라서 in vitro 분화 단계가 요구되기 때문에 이러한 시스템 내에서의 in vitro 세포의 분화는 직접 in vivo 상황으로 변환가능하지 않다. 이를 극복하기 위해서 in situ 상황에서 확산/분화 과정의 공간적, 시간적 조절을 달성하기 위해 주로 주입 가능한 형태의 하이드로젤들을 통해 스캐폴드들 내에 있는 성장인자들과 같이 생체물질을 통합한 자유로운 형태들을 만들기 위한 시도가 행해졌다(Levenberg et al., 2003, PNAS, 100, 22, 12741-12746). 상기 성장인자들의 자유로운 형태들은 짧은 반갑기를 가지기 때문에 이들은 짧은 시간이 지나면 효과를 상실한다(TGFβ1, 2-3분) (Coffey et al., 1987. J. Clin Inv., 80, 750-757; Wakefield et al., 1990. J Clin Inv., 86, 1976-84).

이러한 이유로 특정한 위치들에서 장시간동안 성장인자들의 배출을 컨트롤하고 부족한 약물동력학적 프로파일을 향상시키기 위해 하나 또는 그 이상의 생체활성 분자들을 케리어들(주로 PLA 및 PGA의 공중합체)내에 켑슐화하려는 시도가 행해졌고 그것은 이후 스캐폴드로 정제/조제된다(Chen et al., 2007. J. Control Release., 12, 118, 1, 65-77). 성장 인자들의 하나, 둘 또는 다수의 배출을 사용한 예는 문헌에서 찾을 수 있다. 특히, 연골(Park et al., 2005. Biomaterials, 26, 7095-7103), 뼈(Luet al., 2001. J Bone Joint Surg Am., 83, S82-91) 및 혈관형성촉진(Steffens et al., 2004. Tissue Eng., 10, 1502-1509) 참조. 그러나 상기의 접근들은 어렵고 부담이 되는 디자인 및 in vivo 상 분해되는 케리어 분자들로서 생물학적 활성 분자들의 통합된 시간-의존 방출을 달성하기 위한 최적화된 과정을 요구한다. 켑슐화 단계는 예컨대 만약 유기용매들을 포함하는 경우 성장인자들의 생물학적 활성이 저해된다. 다수의 성장인자들을 조합하는 것이 항상 유리한 효과를 가져다 주는 것은 아니라는 것에 주목할 필요가 있으며, 예컨대 연골 수율에 대하여 부정적으로 영향을 미친다(Veilleux et al., 2005. Osteoarthritis Cartilage, 13, 278-286). 모든 신호화 분자들의 in vivo 조절효과를 리크리에이팅(recreating)하는 것은 어려우며, 그 이유는 상기 조절효과가 성장인자 자체의 화학적 속성뿐만 아니라 하는 성장인자의 프리젠테이션(presentation), 투여량 및 투여 타이밍에 의존하기 때문이다.

본 발명의 목적은 생체물질에 고정화된 성장인자의 잠재형 형태(latent form)를 가지는 생체물질을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 생체물질 상에 성장인자의 잠재형 형태를 고정화시키는 단계를 포함하는 생체물질을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명은 세포주기의 필요 단계, 증식 또는 분화, 세포 종류 및 세포원에 따른 세포 상호작용 및 세포 특이적 요구에 의해 스캐폴드로부터의 하나 또는 그 이상의 성장인자들의 방출이 매개된다는 보다 간단하고 생체모방적인 전략과 관련되어 있다. 이러한 방식으로 세포 그 자체는 다수의 세포 활동들을 위해 요구되는 성장인자의 고정된 잠재형 형태를 “활성화” 시킬 수 있고 성장인자는 필요 활성시까지 보호된다.

사이토카인 및 다른 세포성장인자들은 일반적으로 세포 및 조직의 성장과 기능을 조절하는 것으로 알려져 있다. 이들은 세포 메신저들이고 세포의 리셉터들에 결합하고, 호르몬-유사 활동을 일으킴으로써 낮은 농도(나노몰에서 펨토몰)에서 활동한다. 이러한 분자들은 특히, 증식, 분화 및 기질 생성에 있어서 중요한 조절자이다(Alsberg et al., 2006. Expert Opin Biol Ther. 6, 9, 847-66). 대부분의 사이토카인 및 성장인자들은 철저한 조절 메카니즘하에 발현된다. 이들의 유전자 발현은 감염, 세포-세포 상호작용, 세포외 기질 구성 및 접합분자들과의 상호작용과 같은 환경적 자극 또는 다른 사이토카인의 자극에 의해 조절된다. 그러나 몇몇의 경우에 있어서 사이토카인의 활성 조절은 잠재형 분자들의 분비를 수반한다. 이러한 분자들은 염증작용, 상처치유 및 조직 치료시에 사이토카인의 일부분의 배출에 의해 활성화 상태가 된다(KhalilN, 1999. Microbes and Infection, 1, 1255-1263). 많은 세포들은 잠재형 성장인자들을 생성하고 이들을 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)에 저장한다. 이후 활성화가 일어나고 원 세포에서 오토크라인 인자 또는 인접 세포들에 파라크라인 인자로서 활동한다. 이러한 면에서, 전환성장인자-베타(TGF-β) 그룹은 광범위한 생물학적 프로세스를 조절 할 수 있기 때문에 가장 큰 주목을 받고 있다. TGF-β1의 잠재형태를 이용하여 본 발명의 원리를 증명했다. 그러나 본 발명의 원리는 TGF-β 슈퍼페밀리 또는 잠재적 형태의 융합 단백질에서 제공되는 성장인자들과 같은 다른 잠재형 성장인자들에도 적용될 수 있다.

본 발명의 첫 번째 양태로서 생체물질내에서 고정된 성장인자의 잠재적 형태를 가지는 생체물질을 제공한다. 상기 생체물질은 숙주개체로 이식될 수 있는 형태의 물질일 수 있다. 상기 생체물질은 자연적으로 또는 합성에 의해 생성될 수 있다. 생체물질(본 명세서에서 스캐폴트로도 언급됨)은 재생의약 응용분야에서 중심적인 역할을 할 것이며 몇몇 기초적인 요건들이 해명되었다. 스캐폴드는 2차적인 수술과정을 피하기 위해 생분해성물질로서 자연물질 및 합성물질로부터 제조될 수 있다.

본 발명에서 잠재형 형태의 성장인자가 고정된 생체물질이 사용될 수 있다. 예컨대 합성폴리머 및 공중합체들(예컨대 폴리-L-락티산(PLLA), 폴리(락티-코-글리콜산)(PLGA), 폴리데틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌-코-비닐아세테이트 등), 자연성분의 폴리머들(예컨대 폴리사카라이드, 단백질, 프로테오글리칸, 모든 타입의 콜라겐, 히알루론산, 전분, 시토산, 키틴, 덱스트란, 풀루란 및 당업계에 알려는 것들을 포함한다) 또는 이들의 조합, 분해성 또는 비분해성일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

예컨대, 생체물질은 PLLA, PLGA, 폴리카프롤락톤, 폴리하이드록실알카노에이트 및 그밖에 폴리에스테르들과 같은 폴리에스테르를 포함할 수 있다. 생체물질은 젤, 졸-젤, 하이드로젤, 막, 섬유구조, 나노 또는 마이크로섬유, 마이크로 또는 나노선, 다공성스폰지, 직물그물구조 또는 부직포 그물구조, 공지된 다른 형태 또는 상기의 어떠한 조합일 수 있다.

생체물질은 가스 거품발생/입자화, 동결-건조, 전기방사, 열식법(thermal induced phase separation), 주입가능한 스캐폴드 과정과 같은 다른 과정들을 사용하여 제조될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 고정은 하이드록시아파타이트, 가용성 유리 및 세라믹 형태들, 금속물질 또는 합성물 및 이들의 조합과 같은 세라믹 물질과 같이 신체에 이식하기 위한 어떤 종류의 다른 물질로도 성공적으로 수행할 수 있고 상기 언급한 가능한 것들의 조합을 포함한다.

아래에 제시된 예와 같이, 전기방사된 폴리-L-락티산(PLLA) 섬유는 이들의 생분해성 및 몇몇 방법에서 치료적 용도로의 사용을 FDA(US Food and Drug Administration)가 승인했기 때문에 개념을 증명하기 위해 스캐폴드로서 선택 되었었다. 또한, 폴리(락트산)-기반 스캐폴드를 사용한 in vivo 및 invitro 연구에서는 연골세포 표현형의 유지(Mouw et al., 2005. Osteoarthritis Cartilage, 13, 828-836)를 증명하였으며, 이는 주로 내생 ECM과의 나노섬유의 형태학적 유사성 때문인 것으로 보인다. 따라서, 바람직하게는 생체물질은 전기방사된 폴리-L-락티산 섬유이다. 그러나 상기 언급된 어떠한 생체물질도 본 발명에서 사용될 수 있다는 것에 특히 주의해야 한다. 본 발명에서 잠재형 형태의 어떠한 성장인자도 사용될 수 있다. 성장인자는 세포성장, 이동, 탈분화, 재분화 또는 분화를 촉진할 수 있는 어떠한 분자일 수 있다.

예컨대, 성장인자는 TGFβ, 상피성장인자(EGF), 혈소판 유래 성장인자(PDGF), 신경성장인자(NGF), 집락자극인자(CSF), 간세포성장인자, 인슐린-유사 성장인자, 태반 성장인자; 분화인자; 인터루킨(예컨대, IL1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20 또는 IL-21 및 각각의 α 또는 β형)과 같은 사이토카인, 인터페론(예컨대, IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ), 종양괴사인자(TNF), IFN-γ 유도인자(IGIF), 골형성단백질(BMP); 케포카인(예컨대, MCP1, 2 또는 3와 같은 MCPs(Macrophage Inflammatory Proteins), RANTES (regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted) 및 영양인자일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 성장인자는 예컨대 TGF-β1; TGF-β2; TGF-β3; TGF-β4; TGF-β5; 또는 엑티빈, 인히빈과 BMP1, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6 및 BMP7을 포함하는 골형성단백질을 포함하는 TGF-β 슈퍼패밀리의 다른 멤버인 것일 수 있다. 바람직하게는 생체물질은 인간의 치료를 위해서는 인간에서 유래된 것과 같이 치료될 종에서 유래된 것이다.

본 발명에는 비록 잠재형 형태로 제공된 성장인자가 사용될 수 있긴 하지만 TGFβ의 사용에 대한 특정한 참조와 더불어 본 문서에서 도면으로 나타내어 진다. 많은 세포 유형이 TGFβ 인자를 발현하고 이에 반응하므로 ECM 내부의 TGF-β 레벨이 엄밀하게 관리되도록 하기 위한 복잡한 매커니즘이 존재한다. 여기에는 잠재형인자로서 성장인자의 저장이 포함된다(유전자 복제 규칙은 별도로). 대부분의 세포 형태에서 TGF는 잠재형 TGF와 공유적으로 연결되며 단백질을 결합하는(LTBPs) TGF와 그 잠재형 관련 펩타이드(LAP) 프로펩타이드 이합체로 구성된 잠재형 형태로 분비된다. TGF-β는 C-말단 성숙 TGF-β 와 그 N-말단 프로-도메인, LAP(TGF-잠재형 관련 단백질)을 포함하는 잠재형 이합 합성체 내부의 세포로부터 분비된다(Roberts and Sporn, 1996. Springer-Verlag, 419-472; Roth-Eicchorn et al., 1998. Hepatology, 281588-1596). 이러한 전조 구조는 TGFβ4를 예외로 하여 TGFβ 슈퍼페밀리의 모두 알려진 인자로 공유되는 것으로 보인다. proTGF-β의 두 폴리펩타이드 체인은 이황화물 결합 이합체를 형성하기 위하여 결합된다. TGF-β는 RRXR 시퀀스로 분비될 때 퓨린-유사 엔도프로티나아제에 의해 그 프로펩타이드로부터 절단된다. LAP 프로펩타이드 이합체는 비공유적인 상호작용으로 TFG-Β 이형체와 결합이 유지되는데 여기에서 성숙 TFG-β 이형체와 LAP이형체가 이황화 결합된다. LAP와 TGF-β로 구성된 잠재형 TGF-β 복합체는 소형 TGF-β복합체(SLC)로 언급된다. 활성 TGF-Β와 그 LAP 프로펩타이드 사이의 결합은 복구가 가능하며 LAP에서 광범위한 구조적 변경이 수반된다. TGFβ 보호와 더불어 LAP는 세포막 인테그린(cell membrane integrins)이라고 하는 다른 분자와의 상호작용에 필요한 중요한 잔기(RGD)를 함유한다. 대부분의 세포에서 LAP는 ECM구조로부터 대형 잠재형 합성물(LLC)을 용해시키는 방법을 제공하며 여러 프로테이나제 민감 사이트를 가지고 있는 잠재형 TGF-β 결합 단백질(LTBP)인 추가적인 단백질과 공유결합이 이루어진다. LTBP는 상기 복합체의 분비, TGFβ의 폴딩, ECM(주로 엘라스틴 피브릴 및 피프로넥틴-풍부 연골주위 피브린)으로의 결합을 타겟팅, 그리고 TGFβ1이 로컬 세포기질 단백질과의 상호작용을 방해하는 데 중요하다. LTBP가 아닌 LAP는 TGFβ의 잠재성에 필요충분 조건이다(Saharinen et al., 1999. Cytokine Growth Factor Rev. 11, 2691-2704). 잠재형 TFFβ의 활성화에는 LAP와 TGFβ 사이의 비공유적 상호작용의 분열/분리를 수반하여 시그날링 리셉터를 가진 성숙 펩타이드의 상호작용이 가능케 한다. 여러 매커니즘이 TGFβ의 방출을 설명하기 위하여 제안되었지만(Saharinen, 1999. Cytokine Growth Factor Rev, 10, 99-117) 그 프로세스는 복잡하고 조직에 의존적이어서 아직 전체적인 프로세스가 규명되지는 않고 있다. 모든 매커니즘은 가용성 SLC와 ECM결합 LLC에서 LAP- β1으로부터 TGF-β1의 분리를 수반한다. LTGFβ는 일시적 산, 염기, 열 또는 요소와 같은 무질서유발제(chaotrophic agent)에 의해 시험관에서 활성화 될 수 있지만, in vivo에서는, 단백질 절단이 TGF-β 활성에서 가장 중요한 과정이며 이는 단백질분해효소-민감 힌지부위에서 LTBP를 절단하고 절단된 복합체를 세포표면으로 타겟팅 하는 여러 다른 단백질 분해효소(특히, 골형성단백질(BMPs), 기질단백분해효소(MMPs), 플라스민, 트롬보스폰딘 1, 백혈구 엘라스타아제, 비만세포 키마제)를 포함한다(Taipale et al., 1992. J Biol Chem., 267,25378-25384). 절단된 LLC와 SLC는 이어서 다른 in vivo 활성 매커니즘에 관여한다: a) 프로테아제에 의한 LAP의 저하; b) 인테그린과 트롬보스폰딘 사이의 상호작용에 의한 LAP의 순응적 변화의 유도; 및 c) LAP와 성숙 TGF-β1 사이의 비공유적인 결합의 파괴(Annes et al., 2003. J Cell Sci. 116, 217-224). 일단, 방출이 되면 TGFβ들은 다운스트림 이펙터(예컨대 Smad 단백질들)를 통한 시그널링을 유도하기 위하여 그 특정 세포표면의 수용체(세가지 성분, 타입 I, II 및 III)에 결합될 수 있다.

많은 메커니즘이 활성 잠재형 TGFβ를 활성화시키기 위해 세포를 자극할 수 있으므로 잠재형 TGFβ의 메커니즘과 활성화 시기는 각 세포와 조직 유형에 따라 특성화 되는 것으로 보인다. 실제, 기능적으로 유사한 단백질을 인코딩하며 분별적으로 조절되는 프로모터에 의해 조절되는 서로 다른 유전자들의 존재(Roberts et al., 1991. Ciba Found. Symp., 157, 7-28)는, 상기 서로 다른 TGFβ 아형(isoforms)의 조직 특이적이고 시공간적인(spatio-temporal) 발현 패턴을 가능하게 하는 중요한 기전을 제공하며, 이는 결국 적절한 세포 및 조직 행동을 초래한다(Piek et al., 1999. FASEB J., 13, 2105-2124). 따라서 본 발명은 적절한 잠재형 성장인자 또는 잠재형 성장인자의 조합을 고정시켜 특정 조직에서 특정 세포 유형에 영향을 주는데 사용될 수 있다.

포유류에 있어서 다수의 생체 내 기능과 관련되는 TGFβ1, -β2 및 -β3 (Li et al., 2006. Annu Rev. Immunol., 24, 99-146) 세 가지의 TGFβ 아형들(isoforms)이 있다(Katrien et al., 2005. Endocrine Reviews, 26, 6, 743-774을 참조). 거의 모든 세포들은 TGF-β에 대한 수용기를 갖고 있으며 최소 이들 아형들 중의 하나를 생성한다.

TGFβ1는 곳곳에 존재하며(혈소판과 뼈가 가장 많이 함유) 생존 중에 배형성, 혈관형성, 맥관형성, 염증(상황에 따라서 주로 소염제 효과), 면역조정(일반적으로 면역억제), 부상치유 및 조직 동질화 유지와 같은 과정에 영향을 주며 많은 세포 프로세스와(ECM의 이동, 증식, 분화, 생존, 생산) (Moses HL, Serra R., 1996. Curr Opin Genet Dev., 6, 581586) 관련된 다기능 성장인자이다(Gorelik & Flavell, 2002. Nat Rev Immunol. 2, 4653; ten Dijke & Arthur, 2007. Nat. Rev Mol Cell Biol., 8, 857-869; Roberts AB, 1998. Miner Electrolyte Metab., 24, 111119). 골 조직에서 TGFβ1는 연골(Mehlhom et al., 2007. Cell Prolif., 40, 6, 809-23) 및 골(Ripamonti et al., 2006. J Anat., 209, 4, 447-68) 대사 모두에 영향을 주며 발달 및 유지에 중대한 역할을 한다. 이는 골 재흡수 및 골형성의 동적 과정 사이의 균형을 유지하는 중대한 역할을 한다. 골형성은 조골세포(osteoblasts)의 주화성 유도, 조골세포의 증식의 강화 및 ECM 단백질의 생성을 포함하는 분화 초기단계, type II 콜라겐의 발현 자극 및 조혈전구세포 증식의 억제 및 뉴런전구세포에 의한 성장판 연골세포는 유사한 조건에서 조골세포형의 세포를 조절하는 것들 보다 10 배 적은 정도에 반응하며 TFG- β1에 특히 민감하다(Ballock et al., 1993, Dev Biol., 158, 414-429, 1993). 연골성뼈 분화의 후기 단계에서 TGF-β1은 연골세포의 비대화 및 세포기질의 석회침착(calcification)을 억제한다(Ballock et al., 1993, Dev Biol., 158, 414-429, 1993). 다른 성장인자들(IGFs, FGFs, PDGFs, 및 EGFs) 중에 TGFβ는 연골세포들 내부에서 연골형성과 연골 ECM 합성의 향상에 있어서 가장 강한 유도물질이다(Vunjak-NF-akF-βc et al., 2005. OrthoetCraniofac Res., 8, 209-218). 하기에서 예시되듯이 TGFβ1의 잠재형 형태는 나노섬유 스캐폴드에 고정 되었으며 인간의 연골세포들은 in vitro 상의 개념을 증명하는데 사용되었다. 두불어, 뼈 및 연골부와는 별개로 TGF-β1은 간세포들(Chia et al., 2005. Biotechnol Bioeng., 5, 89, 5, 565-73), 혈관내피세포들(Sales et al., 2006. Circulation, 114(1 Suppl):I193-9), 심장섬유아세포들(Caraci et al., 2008. Pharmacol Res., 57, 4, 274-82; Lim et al., 2007. Mol Cells, 31, 24, 3, 431-6), 인간 시신경의 사상판 세포들(Kirwan et al., 2004. J Glaucoma. 13, 4, 327-34), 망막상피세포들(Uchida et al., 2008 .Curr Eye Res., 33, 2, 199-203), 신장혈관사이세포들(Huang et al., 2008. Am J Physiol Renal Physiol., Mar 26 - epub), 안외근세포들(Anderson et al., 2008. Invest Ophthalmol Vis Sci., 49, 1, 221-9), 마우스 중뇌 전구세포(Roussa et al., 2006. Stem Cells, 24, 9, 2120-9), 장상피세포들(Kurokowa et. Al., 1987. Biochem Biophys Res Commun., 142, 775-782) 및 기관지 상피세포들(Masui et al., 1986. PNAS, 83, 2483-42)과 같은 여타의 세포유형을 직접 또는 간접적으로 조절하거나 분화, 전환분화, 이주 및 ECM 생성을 조절하거나 영향을 주거나 또는 여타 세포의 활동에 의한 세포기질의 변성을 피하도록 한다. 따라서, 다른 조직에서 TGFβ의 과잉(plethora) 및 잠재적 영향에 기초하여, 본 발명은 다른 유형들의 조직에서의 질환들을 타겟팅하는 데 이용될 수 있으며, 예를 들어, 골(골형성), 연골(연골형성), 심장질환(예컨대, LTGF로 변형된 대동맥판막), 안질환(예컨대, LTFG로 변형된 나노섬유 시트들로부터 준비된 이식가능 망막상피 조직) 또는 신장질환을 타겟팅하는 데 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 신장질환의 치료에 적용함에 있어서 잠재형 TGF-β1가 초승달토리콩팥염(Crescentic Glomerulonephritis)에서 신장의 염증으로부터 보호한다는 것이 보고되었다는 점이 주목할 만한 점이다(Huang et al., 2008. J Am. Soc.Nephrol., 19, 2, 233-42). TGFβ의 아형들(isoforms)은 유사한 기능을 갖는 것으로 생각된 일부 연구에서 세포 기능에 대해 TGFβ2 및 TGFβ3의 잠재적 영향을 보고하고 있다. 예컨대, TGF-β2는 소아암환자에서 화학요법에 의한 심각하고)가장 빈번한 부작용들을 성공적으로 치료하고, (Mucositis) (Koning et al., 2007, Pediatr. Blood Cancer, 48, 5, 532-9) 국부적으로 페리-이식 골량과 골이식 접촉부를 향상시키기 위하여 정형외과 이식에 적용되었다는 것이 주목할 만한 점이다(Huang et one과 이7, 1, 55-62). TGF-β3는 CNS의 염증성 탈수초성 질환, 실험적 자가면역성 뇌척수염 (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis)(EAE)(Agata et al., 2003. Cytokine, 25, 2, 45-51)으로부터 보호하는 것으로 알려져있다. 세 가지 유형의 TGF-β 아형들 모두 많은 조직들에서 발견되므로 본 발명은 잠재형 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3 또는 이들의 조합을 고정시키는데 사용될 수 있다. 아울러 잠재형 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3는 다른 조직들뿐 아니라, 골(무기화 작용에 영향) 및 연골에서 세 가지 아형들이 정확한 역할을 재현하는 것과 같은, 다른 세포 반응을 얻어내기 위하여 다른 비율 및 조합으로 고정될 수 있다.

또한, 잠재형 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3는 다른 조직들뿐 아니라, 골(무기화 작용에 영향) 및 연골에서 세 가지 아형들의 정확한 역할을 재현하는 것과 같이, 다른 세포 반응을 얻어내기 위하여 다른 비율 및 조합으로 고정될 수 있다.

상기 언급한 바와 같이 본 발명은 성장인자나 사이토카인의 알려지거나 알려지지 않은 잠재형 형태의 고정에 적용될 수 있다. TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3외에 엑티빈 및 인히빈, BMP7과 같은 골형성 단백질(BMPs) (Gregory et al., 2005. J Biol Chem. 29, 280, 30, 27970-80) 성장분화인자(GDFs) (Gaoxiang et al., 2005. Mol. Cel. Biol., 25, 14, 5846-5858)와 같은 TGFβ 슈퍼페밀리에 속하는 다른 사이토카인이 잠재형 형태로 생성된다(Gaoxiang et al., 2005. Mol. Cel. Biol., 25, 14, 5846-5858). 성장인자의 잠재적 형태는 TGFβ LAP과 같은 잠재형 관련 단백질과 성장인자와의 결합에 의해 제공될 수 있다. 성장인자는 공지된 기법에 의해서 잠복관련 단백질과 결합하여 제공될 수 있다. 그에 따라 본 발명은 이들 또는 이들의 조합에 해당할 수 있다.

따라서 본 발명은 효과적인 생체활성 스캐폴드로 사용 될 하나 이상의 잠재형 성장인자를 가지는 생체물질을 만드는데 사용될 수 있다.

본 발명은 이러한 생체활성 분자들에 잠재성을 부여하기 위하여 잠재성 관련 펩타이드(LAP)와 특정한 단백질 절단 자리(예, MMP에 의해서 분할될 수 있는)를 포함하는 융합단백질과 관련된 재조합 성장인자들로서 얻어진 대체적 생체활성 분자들과 함께 사용될 수 있다. 따라서 이 성장인자의 잠재형 형태는 잠재형 펩타이드와 결합된 성장인자를 포함할 수 있다.

성장인자의 잠재형 형태는 상기 TGFβ의 예에서 설명한 것과 같이 하나 이상의 잠재형 펩타이드와 함께 융합된 활성형태를 포함할 수 있다. 선택적으로 잠재형 펩타이드는 공유 혹은 비공유 상호작용에 의해서 성장인자의 활성형태와 결합할 수 있다. 본 발명에서 세포신호에 의한 활성화까지 성장인자의 활성화가 억제되는 형태로 제공되는 모든 성장인자가 사용될 수 있다.

성장인자의 잠재형 형태는 적절한 방법으로 생체물질에 고정될 소수성 상호작용, 수소결합, 반데르발스힘, 쌍극자-쌍극자 결합 및 π-π 상호작용과 같은 비공유 상호작용의 방식으로 생체적합물질의 표면에 직접 고정될 수 있다. 고정의 특정한 수단은 사용되는 생체물질의 종류에 의존할 것이다. 선택적으로 성장인자의 잠재형 형태는 하나 그 이상의 중간 분자들을 통해 생체물질로 고정 될 수 있다. 예컨대, 성장인자의 잠재적 형태에 특이적 항체가 본 문헌에 설명된 고정화 기법 중 어느 하나에 의해 생체물질표면에 고정될 수 있으며 성장인자의 잠재적 형태가 항체에 결합될 수 있다. 항체는 다클론성, 단일클론성 또는 재조합형일 수 있다. 전체 항체들에 추가하여 성장인자의 잠재형 형태에 결합할 수 있는 일부 그 파생물 또한 사용될 수 있다. 따라서 중간 분자는 성장인자의 잠재적 형태에 결합할 수 있는 항체단편이나 합성물 일 수 있다. 항체단편 및 합성물의 예는 Dougall와 공동연구자들이 제시한다(Dougall et al., Tibtec, 12: 372-379, 1994). 예컨대, 항체단편에는 , Fab, F(ab')₂ 및 Fv가 포함된다. Fab 단편은 (1989), Churchill Livingstone, London의 Roitt 등의 면역학 2차 개정본(1989)에서 다루어진다. 여기에는 분자의 안정성에 기여하는 V_h 및 V_l 영역에 C공유결합하는 펩타이드 링커가 포함된다. 그밖에 사용될 수 있는 합성물에는 상보성결정영역(CDR) 펩타이드가 포함된다. 이들은 항원-결합 결정기를 포함하는 합성 펩타이드이다. 그 밖에 사용될 수 있는 합성 물에는 인간을 제외한 포유류(마우스 또는 쥐와 같은)의 가변영역(variable region) 및 인간의 불변영역(constant region)을 포함하는 키메릭 분자가 포함된다. 추가적으로, 합성물은 인간화 (또는 영장류화) 항체 또는 그의 유도체를 포함하며, 이는 인간을 제외한 포유류에서 유래된 상보성 결정영역을 제외하고 나머지는 인간 서열이다. 키메릭/인간화된 항체를 생산하는 방법은 예컨대, PNAS(81: 6851-6855, 1984)에서 Morrison 및 네이쳐에서 Takeda(314: 452-454, 1985)에 의해 논의된 바 있다. 펩타이드 유사체 또한 사용이 가능하다. 이러한 분자들은 일반적으로 CDR루프의 구조를 모방하고, 항원-상호작용 곁사슬을 포함하는 형태적으로 제한된 유기링들(organic rings)이다.

상업적으로 활용이 가능한 성장인자의 잠재형 형태에 특정하게 결합하는 것으로 알려진 항체나 그 단편들이 사용될 수 있다. 선택적으로 항체들은 당업계에 알려진 방법에 의해 성장인자의 잠재형 형태로 형성될 수 있다. 펩타이드/단백질에 결합하는 단일클론성 및 다클론성 항체를 생산하는 기법은 현재 잘 개발되어 있다(Roitt et al., Roitt’s Essential Immunology, 2006). 다클론성 항체는 적절한 면역접합체와 면역화(immunization) 한 후 적절한 동물호스트(예, 마우스, 쥐, 기니피그, 토끼, 양, 염소, 원숭이, 말, 돼지)에서 그 생산을 자극하여 얻어 질 수 있다. 단일클론성 항체들은 골수세포와 비장림프구를 융합하고(e.g. P3-X63/Ag 8.653) 성장인자의 잠재형 형태를 인식하는 항체의 발현을 위해 융합 세포들을 추가적으로 스크리닝하여 적절한 면역접합체와 면역화 한 후에 생성될 수 있다(Kohler&Milstein,Nature,1975,256,52-55). 선택된 융합세포(hybridomas)는 무성생식 및 확장 될 수 있으며 친화-크로마토그래피로(affinity chromatography) 항체가 정제 될 수 있다(Nowinski et al., Virology 1979, 93, 111-126).

하나 이상의 중간 분자는 당업계에 공지된 적절한 방법으로 생체적합물질로 고정될 수 있다.

성장인자의 잠복형태는 잠재형 성장인자가 특정 위치로 제공되도록 잠재형 성장인자 분자(또는 중간 분자)의 특정 부분을 통해서 생체적합물질에 고정될 수 있다. 잠복성장인자는 특정 위치에서 생체적합물질에 고정될 때 더욱 효율성이 높을 수 있다. 선택적으로 성장인자의 잠복형태는 잠재형 성장인자분자의(또는 중간 분자) (즉, 무작위적으로) 비특정 부분을 통해 생체적합물질에 고정될 수 있다.

잠재형 성장인자의 무작위적인 고정을 야기하는 방법을 이용하여 더 많은 양의 잠복성장인자를 생체적합물질로 고정시킬 수 있다. 생체물질/스캐폴드에서 이용가능한 작용기에 의존하여 표준 접합 화학(또는 당해 분야 에서 인정된 기타 수단)을 이용하여 잠재형 TGFβ 또는 기타 잠재형 성장인자를 고정할 수 있다. 예컨대, 아민, 카르복실, 하이드록실, 비닐 및 기타 반응기를 해당 표면에 도입하기 위한 적절한 플라즈마 기술(이에 대한 상세한 예가 하기에 나타나 있다)을 이용하여 생체물질을 변형할 수 있다. 아민기의 경우, 생체물질 표면의 아민기 및 성장인자의 잠재형 형태(예, TGF)상에 존재하는 티올기와 공유 결합을 형성하기 위해 술포-SMCC (술포숙시니미딜-4-(N-말레이디도메틸) 싸이클로헥산-1-카르복실레이트)가 사용될 수 있다(예컨대, TGFβ). 따라서, TGFβ의 잠재형 형태는 잠재형 형태의 TGFβ 상에 존재하는 말단 티올기를 통해 생체물질로 고정될 수 있다. 말단 티올기는 공유적 혹은 비공유적으로 생체물질 또는 생체물질에 도입된 작용기에 직접 결합될 수 있다. 또는, 말단 티올기는 중간 분자를 통해 공유적 혹은 비공유적으로 생체물질에 간접적으로 결합될 수 있다.

바람직하게는, 성장인자가 TGFβ일 때, 생체물질은 아민기로 변형되며 특히 SLC 분자상의 말단 티올기에 반응하는 말레이미드기들과 함께 보다 기능화된다(도 7 참조). 활성화 되기 전에 일반적인 in vivo상의 ECM 생체조건에서의 형태를 모방하는 물질의 표면에 고정되면, SLC는 이러한 방법으로 위치성을 유지한다. 따라서, 특정 위치에서 생체물질상에 고정 되었을 때, 잠재형 성장인자는 생체 내에서 더욱 효율성을 가진다. 화학 결합은 술포-SMCC(아래의 예시 참조) 또는 기타 유사한 시약들을 사용하여 수행될 수 있다. (예컨대, 술포-EMCS ([N-e-말레이미도카프롤록시]술포숙신이미드에스테르), GMBS (N-[g-말레이미도부티릴록시]숙신이미드 에스테르) 및 당업계에 알려진 다른 것들) 그러나, SLC 상의 프리 SH기와 함께 추가적으로 교환될 수 있는 NHS 말단 및 피리딜 이황화물기(예컨대, 술포-LC-SPDP, 술포석신이미딜 6-(3'-[2-피리딜디티오]-프로피오나미도) 헥사노에이트; 술포-LC-SMPT (4-술포석신이미딜-6-메틸-a-(2-피리딜디티오) 톨루아미도] 헥사노에이트; 및 기타 적절한 상업용 결합 시약)을 포함하는 분자 등을 포함한 기타 화학 결합 방식을 따를 수도 있다.

선택적으로, SLC는 특정 항체로 SLC의 N-말단에 특이적으로 상기 생체물질을 사전에 기능화하여 고정할 수 있다. 또한, 상기 SLC는 LTBP1, LTBP2 또는 LTBP3 또는 이들의 혼합에 의해 선택되는 잠재성 TGFβ 결합 단백질의 특정 펩타이드를 이용하여 고정화할 수 있다.

선택적으로, SLC는 SLC 말단의 티올이 아닌 다른 작용기를 사용하는 스캐폴드를 통해 무작위적으로 고정할 수 있다.

선택적으로, 상기 언급한 바와 같이, 소수성 상호작용을 포함하는 스캐폴드에 단순하고 강력한 물리적 흡착을 이용할 수도 있다.

또한, 성장인자의 특정한 잠재형 형태의 고정은 스캐폴드 내의 특정 위치로 할 수 있으며, 이는 서로 다른 세포 반응을 촉진하거나 또는 서로 다른 세포 유형에 의해 활성화되는 것을 촉발하거나 또는 서로 다른 세포 유형의 활성화를 촉발한다.

선택적으로, 보다 우수한 세포반응들을 위해 다른 잠재형 형태 또는 다른 밀도의 잠재형 형태를 포함하는 다른 물질들이 혼합 될 수 있다.

따라서 본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 성장인자의 잠재형 형태를 생체물질에 고정하는 단계를 포함하는 상기 생체물질을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다.

- 상기 성장인자의 잠재형 형태에 있는 작용기에 결합할 수 있는 작용기를 제공하도록 생체물질을 변형하는 단계; 및

- 상기 성장인자의 잠재형 형태가 상기 생체물질의 작용기에 결합하도록 하는 조건 하에서, 상기 변형된 생체물질을 상기 성장인자의 잠재형 형태와 접촉시키는 단계.

작용기들은 성장인자의 잠재형 형태와 특이적 결합 상호작용을 할 수 있는 모든 화합물일 수 있다. 이러한 방법은 본 문헌에 개시된 모든 고정기법들을 포함한다. 예컨대, 세포를 수성현탁액(aqueous suspension)내에 준비하여 생체로 첨가시킬 수 있다. 따라서 세포는 생체물질과 강한 또는 약한 결합을 형성할 수 있으며, 생체물질의 고정된 위치에 포함되거나 생체물질의 표면을 따라 이동할 수도 있다. 상기 세포들은 간세포일 수 있다. 간세포는 배아줄기세포, 태아줄기세포, 탯줄 또는 태반줄기세포이거나 성인의 줄기세포(예컨대, 간충직세포나 조혈성 줄기세포와 같은) 또는 다른 줄기세포들일 수 있다. 세포는 골수 또는 지방조직(이에 한정되지는 않는다) 및 다른 1차 세포로부터 발생할 수 있다. 예컨대, 세포는 연골세포(예컨대, 코나 관절의 연골) 또는 인간의 골막에서 유래된 세포일 수 있다. 특정한 세포는 사용의 대상이 되는 생체물질에 의존한다. 세포들은 생체재료 이식을 위한 모든 동물의 종족으로부터 유래된 것일 수 있으나 바람직하게는 인간의 세포들이다. 또한 본 발명은 다른 고정된 또는 용액 내에서 자유로운 형태를 가지는 성장인자의 부수물과 함께 조합될 수 있다. 이것은 많은 TGFβ의 효능이 다른 사이토카인의 존재에 의해 향상되기 때문이다(예컨대 T-cell들의 분화를 위해서는 IL-2). TGFβ 슈퍼페밀리의 역할을 공동-조절하는 어떠한 분자들도 사용될 수 있다. 예컨대 호르몬(덱사메타손), 비타민(비타민 D) 및 다른 당업계에 알려진 것들일 수 있다. 또한, 상기 생체물질 또는 스캐폴드는 단일 또는 다중 성장인자 변형 물질들과 함께, 예컨대 특정의 골형성, 연골형성, 혈관신생 펩타이드(그러나 이에 제한되는 것은 아니다)에 의해 변형된 물질들(예컨대, 서로 다른 파이버)의 혼합물을 포함할 수 있다.

고정된 잠재형 성장 요소의 활성은 펩타이드와 같은 특정 활성 억제제의 첨가를 통해 함께 제어될 수 있다.

이와 같이, 본 발명은 성장인자의 잠재형의 이점을 이용하여 세포의 행위에 영향을 주거나 제어하는 새로운 전략을 제시한다.(예컨대 작은 잠재형 TGF-β1내부에 저장된 TGF-β1). 상기 과정은 사용될 준비가 되었으나 여전히 비활성적 상태에 있는 생체활성 분자의 풀(pool)로서 생체물질 표면에 잠재형 성장인자 형태(예컨대, 나노섬유)의 고정/축적을 포함한다. 상기 관련 펩타이드 또는 LAP은 TGF-β1 아형의 성숙 펩타이드에 잠재성을 제공하고, 수용체와 상호작용하는 에피토프를 감추며, 즉각적인 다운스트림 신호 유발을 억제한다. 아울러, LAP는 안정화제 역할을 하며, TGF-β1이 파쇄되고 비활성화 되는 것을 억제하며, 다른 분자와의 상호작용을 위한 중요한 잔기를 보유한다. TGFβ1의 잠복형태가 스캐폴드 표면에서 나타나면, 세포는 이와 상호작용을 하며, 세포 요구에 따른 잠재형 TGF-β1 저장소의 활성을 중재하고, 성장요소의 활성형태를 전부 또는 일부(스캐폴드 남아있는 비율)를 국지적으로 배출한다. 가용성 성장인자(GF)의 생물학적 활성은 이후 세포리셉터의 상호작용에 사용될 수 있으며, 세포내 단계적 신호발생을 유도한다. 본 발명은 다른 조절성 성장인자 전달 시도들 보다 더욱 in vitro 상황에 가까운 근접성을 제공한다. 뼈에서, 세포는 많은 양의 SLC를 효율적으로 분비한다(사실 이는 뼈 내의 성장인자의 주요한 형태이다)(Bonewaldet al., 1999. Mol. Endocrinol., 5, 741-751). 환경에 따른 다른 성장요소의 존재, 세포의 분화 단계 및 환경 등은 상기 이용가능한 잠재형 형태의 활성 여부를 결정한다. 이러한 방식으로 상기세포는 자신을 조절하고 세포활동에서의 정확한 성장인자의 배출을 결정하며 적절한 시간 및 농도의 성장인자를 배출한다. 상기 언급한 바와 같이, 본 발명은 성장인자의 다른 잠복형태와 잠재형 융합 단백질을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 in vitro 상에서 본 발명의 생체물질의 사용방법을 제공한다. 본 발명의 in vitro 방법들은 환자에 대한 생체물질의 이식되기 전의 성장 및/또는 초기 세포의 분화에 영향을 주기 위해 사용될 수 있다. 더불어, 본 발명은 in vitro 분화를 위한 세포 스캐폴드로서 생체 활성 물질을 생성하는데 사용될 수 있다(뼈나 연골의 성장 및 분화와 같은). 아울러 본 발명은 예컨대 영양물질의 공급이나 물리적 자극을 통하여 세포 구조의 성장을 강화하기 위한 생물반응기 시스템(예컨대, 유체역학적 생물반응기)와 조합하여 사용될 수도 있다.

본 발명은 생체적합물질에 고정된 잠재형 성장인자(TGFβ와 같은)를 이용하여 메카노트렌스덕션(mechanotransduction) 시그날링 경로 연구를 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 의약품 분야에서 이용될 수 있는 생체물질을 제공한다. 예컨대 본 발명의 생체물질은 조직 재생 및 복구에 사용될 수 있다. 뼈와 연골의 재생 및 복구에 있어서 생체물질에 고정된 TGFβ의 잠재형 형태를 포함하는 생체물질이 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 환자에게 본 발명의 생체물질을 이식하여 환자의 조직손상을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 생체물질은 포유류 및 인간과 같은 동물의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 생체물질을 이용하여 치료할 수 있는 다른 동물들에는 개, 고양이, 토끼, 말, 기니피그 및 양, 소, 돼지, 염소, 닭 등의 가축들이 포함된다.

본 발명의 생체물질은 질병이나 부상에 의해서 손상된 조직의 회복(즉, 재생 및 성장을 유도하여)에 사용될 수 있다.

성장인자가 TGFβ 인 경우 본 발명의 생체물질은 뼈(osteogenesis), 연골(chondrogenesis), 심장병(예, LTGF로 변형된 대동맥판), 안질환(예, LTFG로 변형된 나노섬유 시트로 준비된 이식가능 망막상피 조직) 또는 신장병 등과 같은 여러 조직 유형에서 다양한 질병의 치료에서 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

면역계로부터 세포(예컨대 대식세포)가 TGFβ의 잠재형 형태로부터 생체활성 TGFβ를 방출할 수 있으므로, 본 발명은 특정한 상황에 있어서 강력한 항 염증효과를 발휘하는 데 사용될 수 있으며, 이는 컨텍스트(context)에 의존적이며, TGF-β가 일부 자가면역진환에서 불충분하게 생성될 수 있기는 하나 크론병, 폐섬유증과 같은 많은 병리학적 조건에서 과다 생성 되기 때문이다.

그밖에 중요한 적용분야는 TGFβ가 다른 성장인자와의 협력을 통해서 이러한 과정을 촉진하기 때문에 상처치유 복구분야이다(Hyytiainen et al., 2004, Crit Rev Clin Lab. Sci., 4, 233-264). 따라서 본 발명은 허혈손상 이후 심장 리모델링에서 유용한데 이 역시 허혈손상으로부터 심근세포들을TGF-β1이 방어할 수 있다는 최근의 증거를 바탕으로 하고 있다(Bujak & Frangogiannis, 2007. Cardiovasc. Res., 74, 184-195).

본 발명의 바람직한 각 양태는 필요한 부분만 수정한 다른 양태 각각에 관한 것이다. 본 명세서에 언급된 문헌은 법에 허용되는 정도로 모두 본 발명에 포함되어 있다. 본 발명의 특정 구현예는 다음 도면에 준거하여 논의될 것이다:

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.

(a) 본 발명은 성장인자의 잠재형 형태가 생체물질에 고정된 형태를 가지는 생체물질 및 성장인자를 생체물질에 고정하는 단계를 포함하는 상기 생체물질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

(b) 본 발명의 생체물질은 조직 재생 및 복구와 같은 의약 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1 - 전기방사법으로 제조된 PLLA 섬유의 형태를 보여주는 대표적 SEM 사진이다.
도 2 - A - 전압(W) 및 시간(min)에 따른 미처리 및 암모니아 플라즈마 처리한 PLLA 피브리수싱(fibresusing) X선 광전자 스펙트라
B - 스캐폴드 표면상 측정된 N 1s의 원자의 퍼센트 양
C - 스캐폴드 표면상 NH₂기의 측정양 (nmol/mg PLLA)
도 3은 미처리된 PLLA 및 플라즈마 처리된 PLLA의 ATR-FTIR 스펙트로스코피이다.
도 4 - 생존/사멸 어세이(Live/Dead assay)에 기초한 인간 관절의 연골세포의 세포생존. pLTGF = LTGF는 플라즈마 처리된 PLLA (ptPLLA)에 랜덤하게 결합; sLTGF = LTGF는 설포-SMCC로 변형된 ptPLLA 특정 위치상에 고정.
도 5 - MTS 어세이를 사용한 스캐폴드상 인간 관절의 연골세포의 세포 생존/분화의 측정. 결과는 2개의 실험으로부터의 세 번 배양한 것의 평균치±SD를 나타낸다. pLTGF =LTGF는 플라즈마 처리된 PLLA (ptPLLA)에 랜덤하게 결합; sLTGF = LTGF는 설포-SMCC로 변형된 ptPLLA상 특정위치상에 고정.
도 6 7일동안 배양한 후 설포-SMCC 및 LTGF(sLTGF)로 변형된 플라즈마 처리된 PLLA에 대한 인간 관절의 연골세포의 SEM 사진
도 7 - 잠재형 성장인자가 공유적으로 결합된 변형된 PLLA 피브리의 가능한 제조방법을 도시한 것이다. 의 가능된 PLLA 피브리는 NH₃ 플라즈마 처리되고 이형이중기능성(heterobifunctional) 술포-SMCC를 사용하여 더욱 기능화된다. 잠재형 성장요소 콤플렉스는 티올기를 통해 더욱 공유적으로 고정화된다.
도 8 - 다양한 스캐폴드 타입에서 14일 동안 배양된 제1차(primary) 인간 코 연골세포의 mRNA 발현 프로파일을 보여주는 리얼-타임 RT-PCR 데이터. 선별된 연골원(Sox9) 및 탈분화(Col1A1) 마커들의 발현 레벨은 18S 하우스키핑 유전자 및 0일째 발현 레벨에 의해 표준화되었다. 반복된 실험(n=3)의 평균 변화 ± 표준편차로 나타내었다. TGF 그룹의 Col1A1 및 pLTGF 그룹의 Sox9은 각 유전자의 나머지 그룹과 비교할 때 현저히 높았다 (p<0.05).
[버진(virgin)=미처리 전기방사된 스캐폴드; 플라즈마=플라즈마 처리된 전기방사된 스캐폴드; TGF=7일간 동안 10ng/mL의 활성화 인간 재조합 TGF-β1을 배지에 공급한 플라즈마 처리된 전기방사된 스캐폴드; pLTGF =LTGF는 플라즈마 처리된 PLLA (ptPLLA)에 랜덤하게 결합; sLTGF = LTGF는 설포-SMCC로 변형된 ptPLLA 특정위치상에 고정화됨.]
도 9 - TGF-β1 나노그램 당 인간 코 연골원 분화 유도 효능. 각 그룹의 상대적 유전자 발현 결과는 실험과정동안 존재하거나 공급된 TGF-β1의 양에 의해 나뉘었다. 평균 및 표준 편차가 존재한다.

실시예

재조합 잠재형 TGFβ1으로의 폴리-L-락트산(PLLA) 섬유의 제조 및 변형 및 씨딩된 인간 연골세포 활성의 측정

실험재료 및 방법

홈메이드 전기방사 시스템을 이용한 PLLA 섬유들이 ~ 4mm 두께를 가지는 10 x 15 cm 시트들(도 1)에 준비하였다. 부직포 스캐폴드는 10 kV의 전압과 1 mL/min의 전달율(rate delivery) 적용하에 디클로로메탄/디메틸포름아미드 (70:30, w:w)중의 3 wt% PLLA (Mw~300 kDa, Purac) 용액으로부터 짜여졌다. 섬유는 회전하는 알루미늄 맨드릴(mandrel)상에 수집되었다.

플라즈마 처리

쉽게 변형되는 반응성 작용기가 PLLA의 백본(backbone)에 결여되어 있기 때문에 표면을 통상적인 화학적 방법에 의해 변형시키기는 어렵다. 플라즈마 기법이 원하는 화학 그룹을 PLLA를 포함하는 물질들(Flavia & D’Agostino, Surf Coat Technol., 98, 1102-06, 1998) 표면에 넣기 위해 광범위하게 사용된다.

따라서, 아민작용기들을 PLLA 전기방사된 섬유들에 넣기 위해서는, PLLA 기존의 NH3 플라즈마 처리를 이용하여 샘플들을 변환해야 한다(Yang et al., J Biom. Mater Res., 67A, 1139-47, 2003). 샘플들은 1 x 1 cm 정사각형 모양으로 잘라 준비하고 무균 글라스 페트리 접시에 고르게 배분한다. 샘플들을 UV로 30분간 멸균하였다. 그리고 나서 에탄올에 1시간 동안 담가두었다. 일단 건조시킨 후, 샘플을 플라즈마 챔버에 넣고 NH₃ 가스를 채우기 전에 압력을 ~10Pa까지 감소시켰다. 챔버의 압력이 안정화된 후, 기정시간(2.5분, 5분 및 10분; 샘플의 각 면에 대하여 그 기간의 절반)동안 무선주파수 13.56 MHz의 전력 조절에 의해 글로방전 플라즈마가 생성되었다. 상기 플라즈마-처리 샘플들을 제거하기 전에 암모니아 가스에 10분 더 노출시켰다(Yanget al., 2002. Biomaterials, 2607-2614에 따라). 상기 플라즈마 처리 샘플들을 즉시, 무균 페트리 접시에 동봉하고 추가적인 변환을 위해 세포 배양대에 놓았다.

주사전자현미경법 분석( SEM )

세포의 부착 및 형태를 관찰하기 위해 SEM 분석을 사용하였다. 각기 다른 시점들에서 스캐폴드 함유 세포들을 에탄올의 농도를 연속적으로 증가시키고 최종적으로 100%의 헥사메틸디실라잔(HMDS)에 담가 건조시키는 과정에 의해 4℃, pH 7.4의 카코딜레이트 버퍼내에 글루터랄하이드레이트(gluteraldehyde) 2.5 %로 고정하였다. 건조시킨 뒤, 시료를 알루미늄 스터브 상에 마운팅하고, 크롬으로 스퍼터 코팅한 다음, 5 kV의 가속전압으로 가속화하여 주사전자현미경(FEGSEM, Leo 1525)으로 관찰하였다.

X선 광전자 분광법( XPS ) 및 닌하이드린 분석법을 통한 표면 화학분석

NH₃ 플라즈마 처리에 의한 성공적 표면의 변형을 분석하기 위하여, 샘플의 전후 변형도를 X-선 광전자현미경(photoelectron spectroscopy, XPS)으로 분석하되 조건은 진공(< 3x10^-9Torr)하 Kratos-Axis ULTRA DLD XPS 기구로, 10mA 방출 및 10KV 음극전위 (100W) 조건이었다. 피이크넓이들(peak areas)로부터 원자비율(atomic percentage, %)값을 결정하기 위해 카라토스 감도인자들(Kratos sensitivity factors)와 함께 CASAXPS 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석했다. 적절한 컨트롤을 사용하여 화학적 결합 상태를 분석하기 위하여 고해상도 스펙트럼 C1s를 디콘볼루션(deconvoluted)시켰고, 곡선을 적정화하였다. 닌히드린을 실시하여 암모니아 플라즈마 표면 변형 PLLA 스캐폴드 상의 아민기의 양을 정량 하였다. 상기 분석을 공지된 방법에 따라 실시하였다(Zhu et al., 2002, Biomacromolecules, 11, 3, 1312-1319; Zhu et al., 2004, Tissue Eng., 1, 10, 53-61).

ATR - FTIR 분석

미처리된 및 플라즈마-처리 PLLA의 ATR-FTIR 스펙트라는 650-4000 cm^-1 범위에서 샘플당 4 cm^-1 및 16스켄 해상도로 Perkin Elmer 2000 FTIR로 얻었다.

재조합 잠재형 TGF β1의 고정화

LTGFβ1을 PLLA 스캐폴드에 고정하는 도식적인 그림은 도 7에서 볼 수 있다. LAP의 N-말단상 두 개의 자유 티올을 통해 SLC을 방향성 있는 공유 고정을 시키기 위하여, 플라즈마 처리된 PLLA 섬유상의 아민기를 술포-SMCC(술포-석신이미딜-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)로 변형시켰다. 이러한 이형 이중기능(heterobifunctional)의 가교제는 수용성이고 아민-반응성 N-하이드록시석신이미드(NHS 에스테르) 및 설프히드릴-반응성 말레이미드 기를 포함한다. 상기 NHS 에스테르는 안정한 아마이드 결합의 형태를 형성하기 위해 pH 7에서 PLLA 섬유들 위해 일차아민과 반응할 것이고, 반면 상기 말레이미드 그룹은 안정한 티오에테르 결합들을 형성하기 위해 SLC, pH 6.5-7.5에서 프리 설프히드릴기와 반응할 것이다.

상기 술포-SMCC 및 SMCC의 말레이미드기는 일반적으로 pH 7.5까지 안정하다. 이는 스페이서암(spacer arm)에서 싸이클로핵산 교상결합(cyclohexane bridge) 때문이다. 술포-SMCC는 친수성 술포닐 모이티(moiety)를 함유하므로 수용성이고, 따라서 섬유 PLLA의 구조를 불안정하게 할 수 있는 유기용제의 사용을 피할 수 있다.

새로이 준비한 암모니아 플라즈마 처리된 PLLA 샘플을 30분간 멸균 PBS에 담그고 그 후 PBS 중에 새로이 제조된 용액 3 mg/ml 술포-SMCC에 담그고, 멸균 세포 배양 안전 캐비닛 안에서 교반(오비탈 쉐이커)하면서 2시간 동안 반응시켰다. 상기 상청액을 폐기하고 스캐폴드를 멸균 PBS로 세 번 세척했다. 그 후, 상기 기능화된 스캐폴드들을 멸균 PBS내에 재조합 잠재형 TGFβ1 (0.75 μg/mL)(새롭게 준비)에 2 시간동안 담가두었다. 상청액을 제거하고, 스캐폴트들을 멸균 PBS 로 세 번 세척하고 세포 씨딩을 위해 세포배양플레이트들에 각각 따로 배치했다. 재조합 잠재형 TGFβ1를 상기 PLLA에 고정하기 위해, 새로 준비한 NH₃ 플라즈마-처리된 PLLA 샘플들을 즉각적으로 PBS내의 0.75 μg/mL SLC(새롭게 준비)안에 담갔다. 상청액을 제거하고 스캐폴드는 3회 멸균 PBS로 세척했고 세포 씨딩을 위해 세포배양플레이트에 각각 따로 배치했다.

면역분석법을 이용한 스캐폴트의 잠재형 TGF -β1의 정량

고정된 LTGF-β1의 정량은 공지의 과정을 변형하여 실시하였다(Pedrozoet al., 1998, J Cell Physiol., 177, 343-354). 우선, 변형된 스캐폴드 및 적절한 컨드롤들을 0.3 U/mL 플라스민(Sigma-Aldrich, UK)으로 DMEM에서 3시간동안 37℃에서 절단하여 스캐폴드로부터 LTGF-β1을 방출시켰다. 아프로티닌(Sigma-Aldrich, UK)의 첨가에 의해 최종적으로 5 μg/mL의 농도에서 반응을 중단시켰다. 상청액을 골라내고 상청액을100μL 당 1M의 HCl 20μL로 산성화 시켜 상온에서 10분간 면역반응성 TGF-β1를 LTGF-β1 복합체로부터 유리시켰다. 산성화된 상청액을 1.2 N NaOH/0.5 M HEPES로 pH ~7.3까지 중화시켰고 즉각적으로, Quantikine Human TGF-β1 면역분석법(R&D Systems, UK)을 제조자의 프로토콜에 따라 사용하여 TGF-β1을 정량분석했다.

세포배양 및 씨딩

본 실시예에서 45세의 건강한 환자의 인간 코중격연골(nasal septal cartilage)로부터 분리한 연골세포를 사용했고, 성인의 관절 연골세포는 Lonza (Lonza Walkersville, MD)로부터 입수하였다. 세포들을 조직배양플라스틱(TCP)플라스크들의 기저연골세포성장배지(bCGM)에서 배양확장 하였다. bCGM는 종래 보고된 바에 따라 페놀-레드 프리 DMEM(Gibco 41966)에 10% (v:v) FBS 2 mM L-굴루타민(GIBCO), 0.1 mM 비필수아미노산들(GIBCO), 100 U/ml 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 50 μg/mL 아스코르브산-2-포스페이트를 첨가한 것이다. 모든 세포 배양은 95%의 공기 및 5%의 CO₂의 인큐베이터에서 37℃를 유지하는 상태에서 행해졌다. 3일마다 37℃의 새로운 배지로 다시 채웠다. DMEM중에서 30분간 37℃ 조건하에 사전에 조정된 스캐폴드상에 균등하게 적하하여 씨딩하기 전에 스캐폴드 씨딩을 위하여, bCGM 적은 양 중에서 배양된 세포를 트립신화하고, 수확한 후, 세포수를 세고, 재부유(resuspended)시켰다. 새로운 혈청-프리 배지가 첨가되기 전에 세포가 스캐폴드 내로 증식되고, 세포를 스캐폴드에 부착시키기 위해 생성물을 37℃에서 4시간동안 세포배양기에서 배양하였다(아래를 참조)

스캐폴드들은 1.5 x 1.5 cm² 스캐폴드들 상에 9000 cells/cm² 이 씨딩되었다. 유전자 발현 연구를 위하여, 4 x 4 cm² 스캐폴드 상에 시료를 3.5 x 10⁴cells/cm²로 씨딩하였다.

5 x 10⁵ 의 세포들을 함유하고 있는 펠렛들은 재빨리 동결되었고 유전자 발현 분석에 있어, day-0 시료로 사용되었다. 스캐폴드-고정화된 LTGFβ1의 연골세포로 배양된 세포에 대한 효과를 평가하기 위해 분별 배지(differentiation medium)라 정의되는 화학적으로 혈청-프리한 배지가 실험에 사용되었다. 혈청-프리배지는 FBS가 없는 bCGM로 구성되고, ITS+ 프리믹스(BD Bioscience) (6.25 μg/ml 인슐린, 6.25 μg/ml 트렌스퍼린, 6.25 μg/ml 셀레늄, 1.25 μg/ml 보빈 혈청 알부민, 5.33 μg/ml 리놀레산; 시그마) 및 100 nM 덱사메타손(Li et al., 2005. Biomaterials, 26, 599-609)이 첨가된다. 배지는 3일마다 교체해 주었다.

세포 생존능력

스캐폴드 내에서 배양된 연골세포의 생존능력을 생존/사멸 어세이(Live/Dead assay)에 의해 측정했다(Molecular Probes, Eugene, OR). 요컨대, 연골로 씨딩된 스캐폴드를 PBS로 세척하고, 빛으로부터 보호하고, 실온에서 PBS 중의 2 μM 칼세인 AM(생존 세포 염색) 및 4 μM EthD-1 (사멸 세포 염색) 중에서 30 내지 45분간 배양하였다. 그 후, 이미지 분석을 위한 디지털 카메라 및 적절한 소프트웨어가 장착된 도립형광현미경(inverted fluorescence microscope)을 사용해서 측정하기 전에 각각의 샘플을 PBS로 세척하였다. 세포의 분배를 측정하기 위해 다른 영역들 및 다른 면들에서 사진을 촬영했다. 생존한 세포들의 수(녹색) 및 죽은 세포들의 수(적색)를 측정했고 생존능력은 총세포수(녹색 + 적색) 당 생존세포수를 나타낸다.

세포 증식

CellTiter 96Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega)으로 제조자의 설명서에 따라 세포 대사 활동을 측정함으로써 스캐폴드들 상의 세포 증식을 평가하였다. 요컨대, 세포들로 씨딩된 스캐폴드들을 새로운 웰-플레이트로 옮기고 PBS로 서서히 세척했다. 그 후 샘플들을 80 μL CellTiter 96 반응제를 첨가한 400 μL 페놀프리 배지에서 배양하고, 습기있는 5% CO₂ 환경 하, 37℃에 4시간동안 반응을 위하여 방치하였다. 상청액의 광학밀도는 490 nm에서 마이크로플레이트리더(Anthos Biotech)를 이용하여 측정했다. 세포가 없는 상태로 동일한 조건에서 배양한 샘플을 블랭크로 사용하였다. 그 결과는 각각 세 번 측정하여 두개의 각각의 실험결과의 평균값으로 나타냈다.

실시간 역전사중합효소연쇄반응( RT - PCR )

10 μL의 β메타켑토에탄올을 1 mL RLT-버퍼(QIAGEN, UK)에 첨가하는 것에 의해 총 RNA를 연골세포들로부터 추출 하였다. 총 RNA는 RNeasy mini kit를 사용하여 분리하였고, RNase-free DNase 1(둘 다 QIAGEN)로 제조자의 설명서에 따라 처리하였으며, ND-1000 UV-Vis 분광 광도계 (Nanodrop, USA)를 사용하여 정량분석을 하였다. 총 RNA중 1μg을 cDNA로 역전사 시키고 각 반응을 위해 다음을 포함하는 마스터믹스를 준비했다 : 10 μL 테크맨 유니버셜 마스터믹스(Taqman universal mastermix)(Applied Biosystems, USA), 7 μL 0.1 % (v/v) 다이에틸파이로카르보네이트(DEPC) 물(water) (Invitrogen Ltd, UK), 2 μL cDNA 추출물 및 1 μL 테크만 프로브(Taqman probe) (Applied Biosystems, USA). TaqMan 유전자 발현 분석 키트들(TaqManGene Expression Assay kits)이 콜라겐 타입-I(Col1A1-I, NM_000088), Sox9 (NM_000346) 및 콜라겐 타입II(NM 001844.4)를 포함하는 연골-관련 유전자들의 증폭에 사용되었다. 각 샘플을 3회 분석했다. 유전자 발현의 상대량을 검출하기 위하여 사용한 ABI 프리즘 7700 서열 검출 시스템(ABI Prism 7700 sequence detection system, Applied Biosystems, USA)에 최적화하기 위하여 열 사이클 조건을 50℃ 2분 및 95℃ 10분 단계로 하여 PCR 반응이 시작되었다. 95 ℃에서 15초 및 60 ℃에서 1분간 Corbett Rotor-Gene 6000(Corbett Life Science, Australia)에서 40 주기로 PCR 중폭 과정을 뒤따라 수행했다. 목표 신호를 사이클 수에 대하여 플라팅했으며, 한계점(threshold level)은 0.05로 세팅하였다. 우리의 결과들은 비교 C_T 기법(comparative CTmethod)을 사용했을 때와 연관되었다(Wang et al., 2006, J.Assoc.Lab.Aut., 11, 314-318)). 유전자 발현에 있어 폴드 체인지(fold changes)는 0일째 날의 세포에 대한 평균값± 표준편차 변화로 나타내졌다. 각 목표 유전자에 대한 상대적 발현 정도는 Ct 값으로 항존유전자(housekeeping gene) 18S (X03205)에 대해 정상화되었다.

통계적 분석

상기 결과의 평균 및 표준편차는 SPSS 12.0 소프트웨어 페키지(SPSS Inc., Chicago, USA)를 사용하여 계산하였다.

두 개의 독립적인 샘플들에 대한 Mann-Whitney U 테스트가 다양한 스캐폴드들 사이의 통계적 유의도(statistical significance)를 결정하기 위해 행해졌다. P 값 <0.05가 통계학적으로 유의한 것으로 고려되었다.

결과 및 토의

도 1은 본 발명의 전형적인 섬유 스캐폴드를 보여준다. 전기방사된 섬유는 연골 세포외 기질로부터 유래한 섬유의 나노사이즈 스케일과 유사하다. 상기 섬유의 직경분포는 상당히 좁고 샘플의 이미지당 40개 섬유들로부터 측정한 평균 섬유의 직경은 242 nm 였다(3 회). 플라즈마 처리된 PLLA 전기방사처리된 플라즈마의 화합물 샘플들은 각기 다른 NH₃ 가스 노출시간하에 플라즈마 처리한 PLLA 전기방사처리 샘플들의 표면 원자 화합물(예컨대 탄소, 산소, 질소)은 도 2-A에서 보여준다. 스펙트럼들은 C 1s (285 eV), O 1s (532 eV) 및 N 1s (400 eV)에 일치하는 세가지 주요 시그날들을 보여준다. 각기 다른 샘플들의 XPS 스펙트럼들의 상대영역들로부터 계산된 수집된 화학적 물질은 표면의 질소원의 양이 100 W의 전력공급 및 10 분의 노출에 따라 5.2 원자 % 까지 증가하는 것으로 나타났다(도 2-B). 399.7 eV에서 최대점은 N-H- 에 해당한다(Yang et al., 2002. Biomaterials, 2607-2614). 더불어, 미처리된 PLLA 및 NH₃ 플라즈마 처리된 PLLA를 아민기들의 존재도 측정을 위해 ATR-FITR에 의해 분석했다(도 3). 각각의 샘플들에서 전형적인 PLLA 의 최대값은 각기 다른 저자들의 연구에 의해 1754 cm^-1 (nC=O), 1450 cm^-1 (d_asC-H) 및 1085 cm^-1 (n_sC-O-C) 으로 밝혀졌다(Paragkumar et al., 2006. Appl. Surf. Sci., 253, 2758-2764; Kister et al., 1999. Polymer, 39, 2, 267-273). 상기 플라즈마 처리된 PLLA 스펙트럼들은 3400-3200 cm^-1 영역에서 약한 브로드밴드(weak broad band)를 보이고 1650-1550 cm^-1 영역에서 약한 쇼울더(shoulder) 를 보여주는데, 이는 N-H스트레칭 및 N-H 결합 진동들을 나타낸다. 닌하이드린 분석법을 사용한 화학적 정량결과 보다 긴 노출시간 및 보다 높은 전력에서 암모니아 플라즈마 처리된 PLLA 표면에서 1차 아민기들의 밀도가 증가함을 보여준다(도 2-C). 표면이 변형된 스캐폴드에서 아민기들의 밀도는 100 W에서 10분 동안의 플라즈마 처리에 대응하는 가장 높은 밀도의 표준곡선으로부터 추론했다. XPS 분석에 의해 나타낸 플라즈마 처리된 PLLA의 표면상 질소종의 존재는 ATR-FTIR로부터의 결과와 결합되었고, 닌히드린은 플라즈마 처리된 PLAA의 표면상에 아민그룹이 내포되었음을 증명해주었다. 이러한 아민기들은 뒤따르는 접합 단계(conjugation step)에 이용할 수 있었다. TGF-β1의 면역분석법의 결과는 비록 그 양의 차이는 있으나 무작위과 목표지향적 접근 모두를 이용하여 LTGF-β1 복합체가 전기방사처리 스캐폴드 표면에 성공적으로 고정되었다는 것을 보여준다.

pt-LTGF 스캐폴드로부터 TGF-β1는 평균 195.4 ± 34 pg/cm² 가 활성화 되었고, 반면 sLTGF 그룹으로부터는 14.1 ± 1.7 pg/cm² 가 회복되었다. TGF-β1은 남은 그룹들에서는 관찰되지 않았다. 도 4는 세포에 스캐폴드를 시드(seeded)하고 배양 후 1, 7 및 14일 라이브/데드 분석(Live/Dead assay)의 결과를 보여준다. 스캐폴드에 세포들을 유지시키는 것은 임상적 응용/이식에서 중요한 쟁점이다(Good retention of cells on the scaffold is a critical issue for clinical application/transplantation). 14일이 지난 후, 플라스마 처리된 PLLA(ptPLLA)에서 인간의 관절 연골세포들의 세포 생존능력은 100%에서 65%로 떨어진 반면, 재조합 LTGF 세포로 변형된 스캐폴드에서 생존능력은 90 % 이상으로 유지되었다. 대사활동의 측정에 기반하여 MTS 분석을 달리 변형된 스캐폴드들의 세포의 증식을 비교하는데 사용하였다. 도 5는 스캐폴드들을 배지에 씨딩한 후 1,7 및 14 일 뒤의 MTS 증식 분석법의 결과를 보여준다. 대사 활성은 pLTGF (LTGF는 플라즈마 처리 PLLA에 랜덤하게 결합했다) 및 sLTGF (LTGF 는 Sulfo-SMCC로 변형된 ptPLLA에 작위적으로 고정 되었다) 스캐폴드에서 배양된 세포들에서 플라즈마 처리 ptPLLA (p<0.012) 의 경우보다 현저히 높았다. (p<0.01) 뿐만 아니라 7일 및 14일 시점에서 무작위적으로 스캐폴드들에 고정된 LTGF에서 배양된 세포들은 술포-SMCC를 사용하여 작위적 환경에서 스캐폴드들에 고정된 LTGF와 비교할 때 현저한 (p<0.015) 통계학적 차이가 있었다. 도 6은 관절연골세포와 sLTGF 변형 PLLA 섬유들 사이의 상호작용을 보여주는 SEM 이미지이다. 세포들이 스캐폴드위에 부착 및 퍼져있는 것을 볼 수 있다. 연골-특이적 mRNA 발현 및 다양한 스캐폴드 유형들에서 배양된 코 연골세포들을 위한 탈분화 마커들은 실시간 RT-PCR을 사용하여 분석하였다(도 8). 연골대체물의 형성에 있어서 현존하는 문제점은 연골의 형질(phenotype)을 유지하는 것이다. 연골세포들은 급속히 탈분화하고, 섬유 마커들(fibroblastic markers)(예컨대 Col1A)를 발현하는 반면 Sox9 같은 연골-특이 유전자들의 발현을 저해한다. 상기 실험결과는 잠재형 TGF-β1 기능화된 스캐폴드들(pLTGF)은 day-0과 비교할 때 Sox9의 발현을 10배 가까이 현저하게 높인다는 점을 증명하며, 이는 분화된 연골세포의 표현형이 유지된다는 것을 나타낸다. 생체물질 상에 잠재형 TGF-β의 무작위적 방향성은, 씨딩되어 새로이 성장하는 세포에 대한 TGF 생체이용률을 명확하게 손상시키지는 않았다.

이는 또한, 본 실험의 어떠한 스캐폴드 그룹들 보다 현저하게 높은 발현 정도이다. 연골세포들을 위한 탈분화 마커인 Col1A1은 다른 스캐폴드 그룹들과 비교할 때 TGF 그룹에서 현저히 높다. 배지에 첨가된 TGF-β1의 양 또는 기능화된 스캐폴드들의 존재(pLTGF 및 sLTGF 그룹)(도 9)에 대한 유전자 발현 데이터 의한 유전자 발현 데이터에 의해 나눔으로써 각 그룹내의 성장인자의 나노그램당 분화 유도에 있어서의 상기 TGF-β1의 효능을 고려했다. TGF-β1의 나노그램당 효과를 고려한다면 연골세포의 분화를 유도함에 있어서 sLTGF 그룹은 보다 효과적이다. 따라서, 본 발명의 생체물질의 유효성은 지향화된(oriented) 잠재형 TGF-β 의 생체물질상에의 특이적 고정화 방법을 최적화하여 더욱 많은 잠재형 TGF-β 를 고정화함으로써 더욱 향상될 수 있다. 이같은 최적화는 예컨대, 생체물질에 잠재형 TGF-β 복합체를 결합시키는 보다 긴 중간분자(intermediate molecule)의 사용, SLC 분자의 티올-특이적 변형 및 스캐폴드에 결합하기 전에 정제 및 다른 당업계에 알려진 방법들을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 보다 특정적위치에 고정화된 TGF-β를 갖는 생체물질은 더 커질 것이고, 연골세포로의 세포분화 레벨이 지속될 것이다. 종합하건대, 본 연구결과 LTGF-변형 섬유가 관절 또는 코연골로부터 분리되어 in vitro 에 씨딩된 인간의 연골세포의 행동에 영향을 준다는 것을 증명하였다. 상기 실험결과는 TGFβ1 의 잠재형 형태를 세포에 도입하는 상기 새로운 방법이 in vitro 및 in vivo에서 연골 재생 뿐만 아니라 TGFβ1이 중요한 역할을 담당하는 뼈 및 많은 다른 조직에 있어서도 유용한 응용법이 된다는 점을 보여준다(상기 참조).

Claims

생체물질에 고정화된 성장인자의 잠재형 형태(latent form)를 가지는 생체물질.
제 1 항에 있어서, 상기 성장인자의 상기 잠재형 형태는 잠재 관련 펩타이드(LAP)와 연관된 성장인자를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체물질.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 성장인자는 TGF-β1; TGF-β2; TGF-β3; TGF-β4; TGF-β5; 또는 엑티빈, 인히빈과 BMP1, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6 및 BMP7을 포함하는 골형성단백질을 포함하는 TGF-β 슈퍼패밀리의 다른 멤버인 것을 특징으로 하는 생체물질.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체물질은 세포들을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 생체물질.
생체물질 상에 성장인자의 잠재형 형태를 고정화시키는 단계를 포함하는 상기 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 생체물질을 제조하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 방법은 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
- 상기 성장인자의 잠재형 형태에 있는 작용기에 결합할 수 있는 작용기를 제공하도록 생체물질을 변형하는 단계; 및
- 상기 성장인자의 잠재형 형태가 상기 생체물질의 작용기에 결합하도록 하는 조건 하에서, 상기 변형된 생체물질을 상기 성장인자의 잠재형 형태와 접촉시키는 단계.
제 6 항에 있어서, 상기 성장인자의 잠재형 형태에 있는 작용기와 결합할 수 있는 아민그룹 및/또는 말레이미드 그룹으로 상기 생체물질을 변형시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 생체물질은 상기 성장인자의 잠재형 형태에 특이적인 항체로 변형된 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체물질은 의약에 이용되는 것을 특징으로 하는 생체물질.
제 9 항에 있어서, 상기 생체물질은 조직 재생 또는 복구에 사용되는 것을 특징으로 하는 생체물질.
상기 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 생체물질을 in vitro 에서 사용하는 방법.
상기 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 생체물질을 환자에게 이식하는 단계를 포함하는 환자의 조직 손상의 치료방법.