TWI690332B

TWI690332B - 複合水膠及其製備方法

Info

Publication number: TWI690332B
Application number: TW107133096A
Authority: TW
Inventors: 王子威; 簡維宏
Original assignee: 國立清華大學
Priority date: 2018-09-20
Filing date: 2018-09-20
Publication date: 2020-04-11
Also published as: TW202011939A; US20200093752A1; US10772844B2

Abstract

本發明提供一種複合水膠。複合水膠包括水膠材料以及多個第一複合奈米粒子。多個第一複合奈米粒子接合於水膠材料上，其中每個第一複合奈米粒子包括第一帶正電多醣以及第一帶負電多醣。第一帶正電多醣位於第一複合奈米粒子的內核。第一帶負電多醣位於第一複合奈米粒子的外殼且負載多個第一生長因子，其中第一帶負電多醣以及第一帶正電多醣以靜電作用吸引而形成第一複合奈米粒子。本發明亦提供一種複合水膠的製備方法。

Description

複合水膠及其製備方法

本發明是有關於一種水膠及其製備方法，且特別是有關於一種複合水膠及其製備方法。

無論是創傷性的（traumatic）或血管性的（vascular）腦部損傷，通常會造成最初受損處的神經組織受損，並導致永久性的神經功能缺損（neurologic deficit）。目前，腦部損傷的治療方法仍有許多需改善的部分。舉例來說，在藥物治療上，美國食品藥物管理局（Food and Drug Administration，FDA）核准的血栓溶解劑（thrombolytic agent，tPA），其具有治療視窗（therapeutic window）窄且不會主動促使腦組織再生的缺點。而在細胞治療上，使用幹細胞移植取代或修復功能失調的細胞或死細胞的治療方式中，除了需克服細胞來源、供體細胞的純度（donor cell maturity）等問題，免疫微環境（inflammatory microenvironment）、結構支持（structural support）、生長因子（trophic factor）、細胞存活率或殖入率（engraftment rate）也是需考量的條件。因此，如何改善在治療上昂貴且複雜的離體製程（ ex vivoprocess）技術是目前此領域技術人員所欲解決的問題之一。

本發明提供一種複合水膠，可用於藥物治療或細胞治療，且可依據需求選擇適合的水膠材料和複合奈米粒子的組合以達到較佳的治療效果。

本發明的複合水膠包括水膠材料以及多個第一複合奈米粒子。第一複合奈米粒子接合於水膠材料上，其中每個第一複合奈米粒子包括第一帶正電多醣以及第一帶負電多醣。第一帶正電多醣位於第一複合奈米粒子的內核。第一帶負電多醣位於第一複合奈米粒子的外殼且負載多個第一生長因子，其中第一帶負電多醣以及第一帶正電多醣以靜電作用吸引而形成第一複合奈米粒子。

在本發明的一實施例中，上述的複合水膠更包括多個第二複合奈米粒子接合於水膠材料上，其中每個第二複合奈米粒子包括第二帶正電多醣以及第二帶負電多醣。第二帶正電多醣位於第二複合奈米粒子的內核。第二帶負電多醣位於第二複合奈米粒子的外殼且負載多個第二生長因子，其中第二帶負電多醣以及第二帶正電多醣以靜電作用吸引而形成第二複合奈米粒子。

在本發明的一實施例中，上述的多個第一複合奈米粒子以及多個第二複合奈米粒子以酵素敏感性鍵結或非酵素敏感性鍵結接合於水膠材料上。

在本發明的一實施例中，上述的多個第一複合奈米粒子以酵素敏感性鍵結接合於水膠材料上，而上述的多個第二複合奈米粒子以非酵素敏感性鍵結接合於水膠材料上。

在本發明的一實施例中，上述的第一帶正電多醣、第二帶正電多醣、第一帶負電多醣以及第二帶負電多醣包括蛋白多醣。

在本發明的一實施例中，上述的第一帶正電多醣以及第二帶正電多醣包括殼聚醣（chitosan）。

在本發明的一實施例中，上述的第一帶負電多醣以及第二帶負電多醣包括硫酸乙醯肝素（heparan sulfate）、硫酸軟骨素（chondroitin sulfate）、硫酸皮膚素（dermatan sulfate）、硫酸角質素（keratan sulfate）其組合。

在本發明的一實施例中，上述的第一生長因子以及第二生長因子包括鹼性成纖維細胞生長因子（bFGF）、趨化基質衍生因子α（SDF-1α）、血小板衍生生長因子（PDGF）、血管內皮生長因子（VEGF）、肝細胞生長因子（HGF）、骨塑型蛋白（BMP）或其組合。

在本發明的一實施例中，上述的第一生長因子以及第二生長因子為相同或不相同的生長因子。

在本發明的一實施例中，上述的水膠材料包括生物可降解水膠材料。

在本發明的一實施例中，上述的水膠材料包括醣胺聚醣（glycosaminoglycan）、多醣（polysaccharide）、蛋白質或其組合。

在本發明的一實施例中，上述的水膠材料包括透明質酸（hyaluronic acid）、褐藻酸（alginic acid）、殼聚醣（chitosan）、膠原蛋白（collagen）或其組合。

在本發明的一實施例中，上述的多個第一複合奈米粒子以及多個第二複合奈米粒子的粒徑介於100奈米至500奈米之間。

在本發明的一實施例中，上述的第一帶正電多醣的分子量小於第一帶負電多醣的分子量，上述的第二帶正電多醣的分子量小於第二帶負電多醣的分子量。

在本發明的一實施例中，上述的複合水膠成膠後的儲存模數（storage modulus）介於100帕至1000帕之間。

本發明的複合水膠的製備方法包括以下步驟。提供水膠材料。形成多個第一複合奈米粒子接合於水膠材料上，其中每個第一複合奈米粒子包括第一帶正電多醣以及第一帶負電多醣。第一帶正電多醣位於第一複合奈米粒子的內核。第一帶負電多醣位於第一複合奈米粒子的外殼且負載多個第一生長因子，其中第一帶負電多醣以及第一帶正電多醣以靜電作用吸引而形成第一複合奈米粒子。

在本發明的一實施例中，複合水膠的製備方法更包括形成多個第二複合奈米粒子接合於水膠材料上，其中每個第二複合奈米粒子包括第二帶正電多醣以及第二帶負電多醣。第二帶正電多醣位於第二複合奈米粒子的內核。第二帶負電多醣位於第二複合奈米粒子的外殼且負載多個第二生長因子，其中第二帶負電多醣以及第二帶正電多醣以靜電作用吸引而形成第二複合奈米粒子。

在本發明的一實施例中，上述形成多個第一複合奈米粒子的步驟包括修飾第一帶負電多醣，修飾後的第一帶負電多醣接合酵素敏感性肽或非酵素敏感性肽。

基於上述，本發明的複合水膠包括水膠材料以及複合奈米粒子，可依據需求選擇適合的水膠材料和複合奈米粒子的組合以達到較佳的治療效果。在腦部損傷的治療應用中，水膠材料可仿生腦部組織的微環境並達到結構支持的作用。複合奈米粒子中的帶負電多醣可保護並負載不同的生長因子，且生長因子的負載效率高。接合水膠材料和複合奈米粒子的肽可調控複合奈米粒子釋放速率，進而控制複合奈米粒子負載的生長因子的釋放以達到更佳的治療效果。

為讓本發明的上述特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式作詳細說明如下。

在本文中，由「一數值至另一數值」表示的範圍，是一種避免在說明書中一一列舉該範圍中的所有數值的概要性表示方式。因此，某一特定數值範圍的記載，涵蓋該數值範圍內的任意數值以及由該數值範圍內的任意數值界定出的較小數值範圍，如同在說明書中明文寫出該任意數值和該較小數值範圍一樣。

以下將藉由實施方式對本發明作進一步說明，但該等實施方式僅為例示說明之用，而非用以限制本發明之範圍。 [ 複合奈米粒子 ]

圖1A至圖1E是依照本發明一些實施例的複合奈米粒子所繪示的製備流程的結構示意圖。

首先，請參照圖1A，提供帶負電多醣102以及帶正電多醣104。在一些實施例中，帶正電多醣104的分子量小於帶負電多醣102的分子量。換句話說，帶正電多醣104的分子量約介於帶負電多醣102的分子量的30%至50%。在一具體實施例中，帶正電多醣104的分子量例如是介於190,000道爾頓（Dalton，Da）至310,000 Da之間，帶負電多醣102的分子量例如是介於600,000 Da至700,000 Da之間，但本發明不限於此。在一些實施例中，帶負電多醣102以及帶正電多醣104例如包括蛋白多醣。在一些實施例中，帶負電多醣102例如包括硫酸乙醯肝素（heparan sulfate）、硫酸軟骨素（chondroitin sulfate）、硫酸皮膚素（dermatan sulfate）、硫酸角質素（keratin sulfate）或其組合，帶正電多醣104例如包括殼聚醣（chitosan），但本發明不限於此。

接著，請參照圖1B，帶負電多醣102以及帶正電多醣104以靜電作用吸引而形成奈米複合體。在一些實施例中，帶正電多醣104位於奈米複合體的內核，帶負電多醣102位於奈米複合體的外殼。值得一提的是，由於帶正電多醣104的分子量小於帶負電多醣102的分子量，而使位於奈米複合體外殼的帶負電多醣102有空間可於後續步驟中接合修飾的官能基以及藉由親和力（affinity）負載生長因子。

然後，請同時參照圖1C和圖1D，修飾帶負電多醣102，以使修飾後的帶負電多醣102上接合酵素敏感性肽108或非酵素敏感性肽108，以形成經修飾的複合奈米粒子100A。在一些實施例中，帶負電多醣102會先經修飾步驟而具有適當的官能基，接著，再於官能基上接合酵素敏感性肽108或非酵素敏感性肽108。舉例來說，修飾後的帶負電多醣102上具有馬來醯亞胺基（maleimide group）106，接著，於馬來醯亞胺基106上接合酵素敏感性肽108或非酵素敏感性肽108，但本發明不限於此。在一具體實施例中，加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳醯二亞胺（1-ethyl-3-3-dimethylaminopropyl carbodiimide hydrochloride，EDC）以及N-羥基琥珀醯亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）與帶負電多醣102反應，藉由EDC交聯而活化帶負電多醣102上的羧基，並形成與亞胺（imine）接合的NHS酯基。然後，加入N-（2-氨基乙基）馬來醯亞胺三氟乙酸鹽（n-(2-aminoethyl)maleimide trifluoroacetate salt）反應，使修飾後的帶負電多醣102具有馬來醯亞胺基106。接著，進行硫醇-馬來醯亞胺點擊反應（thiol-maleimide click reaction），使修飾後的帶負電多醣102的馬來醯亞胺基106上接合硫醇末端基肽（thiol-terminated peptide）。也就是說，修飾後的帶負電多醣102的馬來醯亞胺基106上接合帶有硫醇末端基的酵素敏感性肽108或非酵素敏感性肽108。為使圖式簡潔清楚，圖1D中省略馬來醯亞胺基106。

在一些實施例中，酵素例如是指基質金屬蛋白水解酵素（matrix metalloproteinase，MMP），但本發明不限於此。詳細來說，基質金屬蛋白水解酵素在腦損傷後會增量調控（upregulation）且可於組織重塑（tissue remodeling）過程中降解細胞外基質（extracellular matrix，ECM）結構蛋白，但本發明不限於此。在一些實施例中，酵素敏感性肽例如是指基質金屬蛋白水解酵素-裂解（MMP-cleavable）肽（peptide），其序列例如為GCDSGGRMSMPVSDGG。在一些實施例中，非酵素敏感性肽例如是指基質金屬蛋白水解酵素-非活性（MMP-inactive）肽，其序列例如為GCRDFGAIGQDGDRGG，但本發明不限於此。

然後，請參照圖1E，加入生長因子110，使帶負電多醣102藉由親和力負載多個生長因子110，以形成複合奈米粒子100B。在一些實施例中，生長因子110例如包括鹼性成纖維細胞生長因子（bFGF）、趨化基質衍生因子α（SDF-1α）、血小板衍生生長因子（PDGF）、血管內皮生長因子（VEGF）、肝細胞生長因子（HGF）、骨塑型蛋白（BMP）或其組合，但本發明不限於此。值得一提的是，帶負電多醣102除了具有負載生長因子110的功能外，還具有保護生長因子110的功能。

在一些實施例中，複合奈米粒子100B的粒徑例如介於100奈米至500奈米之間。也就是說，當本發明實施例中的複合奈米粒子100B應用於腦部組織修復時，可將複合奈米粒子100B的粒徑依需求控制於適當範圍以通過血腦屏障（blood-brain barrier，BBB），達到有效的治療效果，但本發明不限於此。本發明的複合奈米粒子100B的粒徑可依據不同的治療和應用調整至其他適當範圍，以達到較佳的治療效果 [ 複合水膠 ]

圖2A和圖2B是依照本發明一些實施例的複合水膠所繪示的結構示意圖。

請參照圖2A，提供水膠材料300。在一些實施例中，水膠材料300例如包括生物可降解水膠材料。在另一些實施例中，水膠材料300例如包括醣胺聚醣（glycosaminoglycan，GAG）、多醣（polysaccharide）、蛋白質或其組合。舉例來說，醣胺聚醣例如包括透明質酸（hyaluronic acid，以下簡稱HA）、多醣例如包括褐藻酸（alginic acid）、殼聚醣（chitosan）或其組合。蛋白質例如包括膠原蛋白（collagen）。

接著，依照前述複合奈米粒子100B的製備方式形成多個複合奈米粒子100B，並將其接合於水膠材料300上，其中，複合奈米粒子100B是以酵素敏感性鍵結或非酵素敏感性鍵結接合於水膠材料300上。在一些實施例中，水膠材料300與複合奈米粒子100B接合前會先經修飾步驟而具有適當的官能基，接著，再於官能基上接合複合奈米粒子100B上的酵素敏感性肽108或非酵素敏感性肽108。舉例來說，修飾後的水膠材料300上具有醛基（aldehyde group），接著，於醛基上接合複合奈米粒子100B上的酵素敏感性肽108或非酵素敏感性肽108，但本發明不限於此。在一具體實施例中，加入高碘酸鈉（NaIO ₄）與水膠材料300反應，而使修飾後的水膠材料300具有醛基。接著，將修飾後的水膠材料300與複合奈米粒子100B反應，使水膠材料300的醛基與複合奈米粒子100B的氨基（即帶負電多醣102上接合的酵素敏感性肽108或非酵素敏感性肽108的氨基）反應形成亞胺鍵（imine bond）。也就是說，在所形成的複合水膠400A中，複合奈米粒子100B是以酵素敏感性鍵結或非酵素敏感性鍵結接合於水膠材料300上是根據複合奈米粒子100B的帶負電多醣102所接合的肽為酵素敏感性肽108或非酵素敏感性肽108來決定。具體來說，當複合奈米粒子100B的帶負電多醣102所接合的肽為酵素敏感性肽108，複合奈米粒子100B是以酵素敏感性鍵結接合於水膠材料300上。換句話說，當複合奈米粒子100B的帶負電多醣102所接合的肽為非酵素敏感性肽108，複合奈米粒子100B是以非酵素敏感性鍵結接合於水膠材料300上。值得一提的是，在本實施例中（如圖2A所示），複合水膠400A中的複合奈米粒子100B皆相同，也就是說，形成複合奈米粒子100B的帶負電多醣102、帶正電多醣104、複合奈米粒子100B所負載的生長因子110以及（非）酵素敏感性肽108皆相同，但本發明不限於此。

請參照圖2B，複合水膠400B中的複合奈米粒子可以不相同。也就是說，複合水膠400B可以包括不同的複合奈米粒子100B以及複合奈米粒子200B。舉例來說，形成複合奈米粒子200B的帶負電多醣202與形成複合奈米粒子100B的帶負電多醣102可以相同或不同，形成複合奈米粒子200B的帶正電多醣204與形成複合奈米粒子100B的帶正電多醣104可以相同或不同，複合奈米粒子200B所負載的生長因子210與複合奈米粒子100B所負載的生長因子110可以相同或不同，複合奈米粒子200B與水膠材料300接合的（非）酵素敏感性肽208與複合奈米粒子100B與水膠材料300接合的（非）酵素敏感性肽108可以相同或不同。換句話說，複合奈米粒子200B可以根據治療或應用需求調整而與複合奈米粒子100B相同、部分相同或完全不同。以下僅列舉二種不同的複合奈米粒子的實施例，但本發明並不限於此，也就是說，複合水膠可包括二種以上不同的複合奈米粒子。

在一些實施例中，複合奈米粒子200B所負載的生長因子210與複合奈米粒子100B所負載的生長因子110不同。詳細來說，不同的生長因子具有不同的作用，故可藉由帶負電多醣負載不同的生長因子以達到不同的治療或應用。在一具體實施例中，生長因子210例如是SDF-1α，而生長因子110例如是bFGF，但本發明不限於此。

在另一些實施例中，形成複合奈米粒子200B的帶負電多醣202與形成複合奈米粒子100B的帶負電多醣102不同。詳細來說，由於不同的帶負電多醣對生長因子有不同的親和力，故可藉由帶負電多醣與生長因子之間不同的親和力來調整適當的配對以達到較佳的負載效率。舉例來說，硫酸乙醯肝素對SDF-1α具有較強的親和力，硫酸軟骨素對bFGF具有較強的親和力。在一具體實施例中，帶負電多醣202例如是硫酸乙醯肝素，帶負電多醣202所負載的生長因子210例如是SDF-1α；而帶負電多醣102例如是硫酸軟骨素，帶負電多醣102所負載的生長因子110例如是bFGF，但本發明不限於此。

在其他實施例中，複合奈米粒子200B與水膠材料300接合的（非）酵素敏感性肽208與複合奈米粒子100B與水膠材料300接合的（非）酵素敏感性肽108不同。詳細來說，酵素敏感性肽或非酵素敏感性肽對於特定酵素會有活性或不具活性，故可藉由選擇酵素敏感性肽或非酵素敏感性肽以達到不同的治療或應用。舉例來說，複合奈米粒子200B與水膠材料300接合的肽208為酵素敏感性肽208，複合奈米粒子100B與水膠材料300接合的肽108為非酵素敏感性肽108。在一具體實施例中，例如於腦損傷的治療中，帶負電多醣202所負載的生長因子210例如是SDF-1α，複合奈米粒子200B與水膠材料300接合的肽208例如是酵素敏感性肽208。由於腦損傷後基質金屬蛋白水解酵素（MMP）會增量調控，MMP可裂解酵素敏感性肽208，而使複合奈米粒子200B脫離水膠材料300，釋放SDF-1α至腦組織間，進而促使附近的內源性細胞（例如，神經幹細胞（neural stem cell，NSC））遷移（migrate）至損傷部分。另一方面，帶負電多醣102所負載的生長因子110例如是bFGF，複合奈米粒子100B與水膠材料300接合的肽108例如是非酵素敏感性肽108。由於MMP對非酵素敏感性肽108不具活性，因此，複合奈米粒子100B會較慢才脫離水膠材料300，故可待內源性細胞遷移至損傷部分時，促使內源性幹細胞進行增生（proliferation），藉此達到有效修復腦損傷的目的。

值得一提的是，複合水膠400A或複合水膠400B形成後，可經成膠製程以呈膠狀。具體來說，依照上述實施例所形成的複合水膠400A或複合水膠400B呈溶液狀，可藉由加入交聯劑反應而使複合水膠400A或複合水膠400B成膠。舉例來說，交聯劑例如包括己二酸二醯肼（adipic acid dihydrazide，ADH）、碳二亞胺（Carbodiimide）、戊二醛（Glutaraldehyde）或其組合，但本發明不限於此。複合水膠400A或複合水膠400B成膠後的硬度、成膠時間等皆可根據需求而控制交聯劑的種類、添加量等而調整至所需要的硬度。舉例來說，於腦損傷的治療應用中，為形成仿生的（biomimetic）腦組織基質，可將複合水膠400A或複合水膠400B成膠後的硬度調整至接近腦組織基質的硬度。在一些實施例中，複合水膠成膠後的儲存模數（storage modulus）例如介於100帕至1000帕之間。在另一些實施例中，複合水膠成膠後的儲存模數例如介於100帕至400帕之間，但本發明不限於此。也就是說，成膠後的複合水膠400A或複合水膠400B可具有基質支持（stromal support）的作用。 [ 實驗 ]

下文將參照實驗範例，更具體地描述本發明。雖然描述了以下實驗，但是在不逾越本發明範疇的情況下，可適當地改變所用材料、其量及比率、處理細節以及處理流程等等。因此，不應根據下文所述的實驗對本發明作出限制性地解釋。

實驗 1

以下，參照圖3A至圖3C以及表1來詳細說明本發明的複合奈米粒子的特性。 實驗例 1

將硫酸軟骨素鈉鹽（chondroitin sulfate sodium salt，以下簡稱CS）溶於6 mL去離子水（deionized water）中，加入0.1 N鹽酸以將硫酸軟骨素溶液的pH值調整至4.7。接著，加入EDC和NHS至硫酸軟骨素溶液中於室溫下攪拌15分鐘，藉由EDC交聯以活化硫酸軟骨素上的羧基，並形成與亞胺接合的NHS酯基。然後，加入N-（2-氨基乙基）馬來醯亞胺三氟乙酸鹽（n-(2-aminoethyl)maleimide trifluoroacetate salt），將反應混和物在室溫下攪拌6小時，使一級胺（primary amine）藉由醯胺鍵直接接合至活化的羧基。然後，將得到的溶液在去離子水中溫和地搖動下透析24小時以去除過量的偶聯劑（coupling agent）和反應副產物。最後，將得到的高分子溶液凍乾並保存於-10˚C，得到具有馬來醯亞胺基的硫酸軟骨素（以下簡稱CS-mal）。

接著，分別將1.2 mg/mL的CS-mal和0.6 mg/mL的殼聚醣（以下簡稱Chi）溶於0.1 M醋酸溶液中並使用0.22 μm的混合纖維素酯（mixed cellulose ester，MCE）針筒式過濾器（syringe filter）過濾。接著，將Chi溶液快速一次性地以體積比為1:6（Chi:CS-mal）的比例加入攪拌中的CS-mal溶液中，並將混合物大力攪拌3小時。然後，將得到的CS-mal/Chi奈米複合體在去離子水中透析24小時以去除未複合的高分子。

接著，將CS-mal/Chi奈米複合體溶液與定製的基質金屬蛋白水解酵素-非活性（MMP-inactive）肽溶液以莫耳比為1:1（馬來醯亞胺基：硫醇基）的比例於4˚C混合4小時，並將混合溶液的pH值調至6.5至7.5的範圍內以避免副反應，得到實驗例1的經基質金屬蛋白水解酵素-非活性肽修飾的硫酸軟骨素複合奈米粒子（MMP-inactive peptide modified chondroitin sulfate PCN，以下簡稱mCSPCN）。 實驗例 2

依照與實驗例1相似的製備程序來製備實驗例2的複合奈米粒子，差異在於：在實驗例2中，將硫酸軟骨素鈉鹽置換為硫酸乙醯肝素鈉鹽（heparan sulfate sodium salt，以下簡稱HS），因此，先得到具有馬來醯亞胺基的硫酸乙醯肝素鈉鹽（以下簡稱HS-mal），接著，再與Chi溶液混合進行後續步驟。另外，在實驗例2中，將Chi溶液的濃度調配成0.3 mg/mL，並將基質金屬蛋白水解酵素-非活性（MMP-inactive）肽溶液置換為基質金屬蛋白水解酵素-裂解（MMP-cleavable）肽溶液。因此，實驗例2得到的複合奈米粒子為經基質金屬蛋白水解酵素-裂解肽修飾的硫酸乙醯肝素複合奈米粒子（MMP-cleavable peptide modified heparan sulfate PCN，以下簡稱mHSPCN）。 實驗例 3

依照與實驗例1相似的製備程序來製備實驗例3的複合奈米粒子，差異在於：在實驗例3中，將實驗例1所得到的複合奈米粒子mCSPCN溶液與bFGF溶液在去離子水中以重量比為100 ng/mg（bFGF/mCSPCN）的比例混合。然後，將負載bFGF的複合奈米粒子mCSPCN溶液與作為冷凍劑的蔗糖溶液（20% w/v）混合，最後，將其冷凍乾燥並保存於4˚C。因此，得到實驗例3的複合奈米粒子mCSPCN（負載bFGF）。 實驗例 4

依照與實驗例3相似的製備程序來製備實驗例4的複合奈米粒子，差異在於：在實驗例4中，將複合奈米粒子mCSPCN溶液置換為實驗例2所得到的複合奈米粒子mHSPCN溶液，並將bFGF溶液置換為SDF-1α。因此，得到實驗例4的複合奈米粒子mHSPCN（負載SDF-1α）。 實驗例 5

依照與實驗例4相似的製備程序來製備實驗例5的複合奈米粒子，差異在於：在實驗例5中，將基質金屬蛋白水解酵素-裂解（MMP-cleavable）肽溶液置換為基質金屬蛋白水解酵素-非活性（MMP-inactive）肽溶液。因此，實驗例5得到的複合奈米粒子為經基質金屬蛋白水解酵素-非活性肽修飾的硫酸乙醯肝素複合奈米粒子（MMP-inactive peptide modified heparan sulfate PCN，以下簡稱non-mHSPCN）（負載SDF-1α）。 比較實驗例

依照與實驗例3相似的製備程序來製備比較實驗例的複合奈米粒子，差異在於：在比較實驗例中，CS並未經過修飾，即複合奈米粒子並未接合馬來醯亞胺基，也未接合基質金屬蛋白水解酵素-非活性（MMP-inactive）肽或基質金屬蛋白水解酵素-裂解（MMP-cleavable）肽，也就是說，在比較實驗例中，直接將CS溶液與Chi溶液混合後，再加入bFGF溶液混合。因此，得到比較實驗例的複合奈米粒子CSPCN（負載bFGF）。

圖3A和圖3B是本發明實驗例1和實驗例2的複合奈米粒子的穿透式電子顯微鏡圖像。圖3C是本發明實驗例1和實驗例2的複合奈米粒子的粒徑分析圖以及聚合物分散性指數分析圖。複合奈米粒子的形態（morphology）由穿透式電子顯微鏡觀測。複合奈米粒子的流體動力學尺寸（hydrodynamic size）和界達電位（ζ-potential）由馬爾文雷射粒度儀（Malvern zeta-sizer）測量。生長因子負載效率由酵素免疫分析法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）套組測量。實驗例1至實驗例4的複合奈米粒子的粒徑、聚合物分散性指數、界達電位、粒子產率（particle yield）以及生長因子負載效率（loading efficiency）的結果列於下表1。

表1

由圖3A和圖3B以及表1的內容可知，實驗例1至實驗例4的複合奈米粒子皆呈負電並可維持球形，且複合奈米粒子的膠體穩定性可保持一個月左右。另外，當複合奈米粒子負載生長因子時，複合奈米粒子的粒徑並不會有顯著的變化，且生長因子的負載效率可達到40-55%，故可減少蛋白質的損失並維持其生物學功能。

實驗 2

以下，參照圖4A至圖7B來詳細說明本發明的複合水膠的特性。 實施例 1

首先，將HA在黑暗中以及室溫下以莫耳比為1:1（HA: IO ₄）的比例與高碘酸鈉（NaIO ₄）混合24小時，然後，加入1 mL乙二醇（ethylene glycol）停止反應。接著，在去離子水中透析3天並冷凍乾燥，得到醛基官能基化的透明質酸（aldehyde-functionalized HA，以下簡稱HA-ALD）。

接著，將實驗例1所得到的複合奈米粒子mCSPCN溶於磷酸鹽緩衝生理鹽水（phosphate buffered saline，PBS）與6 wt% HA-ALD粉末在室溫下混合1小時，以形成複合體mCSPCN-HA。另外，將ADH（8 wt%）溶於PBS。然後，將複合體mCSPCN-HA溶液與ADH溶液以相同體積藉由移液（pipetting）方式混合，在幾秒內即可出現成膠反應，得到實施例1的複合水膠mCSPCN-HA。 實施例 2

依照與實施例1相似的製備程序來製備實施例2的複合水膠，差異在於：在實施例2中，將複合奈米粒子mCSPCN溶液置換為實驗例2所得到的複合奈米粒子mHSPCN溶液。因此，得到實施例2的複合水膠mHSPCN-HA。 實施例 3

依照與實施例1相似的製備程序來製備實施例3的複合水膠，差異在於：在實施例3中，將複合奈米粒子mCSPCN溶液置換為實驗例3所得到的複合奈米粒子mCSPCN（負載bFGF）溶液。因此，得到實施例3的複合水膠mCSPCN-HA（負載bFGF）。 實施例 4

依照與實施例1相似的製備程序來製備實施例4的複合水膠，差異在於：在實施例4中，將複合奈米粒子mCSPCN溶液置換為實驗例4所得到的複合奈米粒子mHSPCN（負載SDF-1α）溶液。因此，得到實施例4的複合水膠mHSPCN-HA（負載SDF-1α）。 實施例 5

依照與實施例1相似的製備程序來製備實施例5的複合水膠，差異在於：在實施例5中，將複合奈米粒子mCSPCN溶液置換為實驗例3所得到的複合奈米粒子mCSPCN（負載bFGF）溶液以及實驗例4所得到的複合奈米粒子mHSPCN（負載SDF-1α）。因此，得到實施例5的複合水膠mCS/HSPCN-HA（負載bFGF/SDF-1α）。 實施例 6

依照與實施例1相似的製備程序來製備實施例6的複合水膠，差異在於：在實施例6中，將複合奈米粒子mCSPCN溶液置換為實驗例5所得到的複合奈米粒子non-mHSPCN（負載SDF-1α）溶液。因此，得到實施例6的複合水膠non-mHSPCN-HA（負載SDF-1α）。 比較例 1

依照與實施例1相似的製備程序來製備比較例1的複合水膠，差異在於：在比較例1中，未對HA進行修飾直，且未加入複合奈米粒子和生長因子，即未修飾的HA直接與ADH反應成膠，得到比較例1的水膠HA。 比較例 2

依照與實施例1相似的製備程序來製備比較例2的複合水膠，差異在於：在比較例2中，將複合奈米粒子mCSPCN溶液置換為比較實驗例所得到的複合奈米粒子CSPCN（但未負載bFGF）溶液，也就是說，直接將CS溶液與Chi溶液混合，但未與bFGF溶液混合。因此，得到比較例2的複合水膠CSPCN-HA。需注意的是，所得到的複合水膠CSPCN-HA中複合奈米粒子CSPCN並未與HA鍵結接合，而僅是摻雜混合。

圖4A是本發明實施例1的複合水膠的穿透式電子顯微鏡圖像。圖4B是圖4A的局部放大圖。在圖4B中，虛線圓圈代表複合奈米粒子mCSPCN，箭頭所指代表HA結構。由圖4A和圖4B可知，實施例1的複合水膠顯示複合奈米粒子mCSPCN均勻地分佈於纏繞的（entangled）HA奈米纖維結構中。

圖5A是本發明比較例1的水膠的機械性質分析圖。圖5B是本發明實施例1的複合水膠的與時間相關的震盪剪切流變圖。圖5C是本發明實施例1和比較例1的複合水膠的與頻率相關的震盪剪切流變圖。（複合）水膠的流變特性是由流變儀量測，動態震盪應變（strain）幅度掃描量測是在25˚C、頻率為6.8 rad/s的條件下進行，動態震盪頻率掃描量測是在應變幅度為50%的條件下進行。

在圖5B中，箭頭所指代表ADH的加入。由圖5A至圖5B可知，藉由交聯具有不同氧化度（oxidation degree）（50%、15%以及5%）的HA-ALD，所得到的複合水膠顯示出具有不同的儲存模數（storage modulus），且可促使複合水膠的原位（ in situ）成膠時間（gelation time）在10秒內（損耗因子＜1）。也就是說，複合水膠的流變性質受交聯密度以及醛-醯肼縮合的影響。在本實施例中，為模擬腦組織的機械性質以達到適當的水膠接合以及防止機械不匹配（mechanical mismatch），後續的複合水膠實驗將選用50%氧化度的條件。另外，由圖5C可知，實施例1的複合水膠的儲存模數（~100帕）與比較例1的複合水膠的儲存模數（~400帕）相比有些微變化，這是因為加入複合奈米粒子mCSPCN所形成的複合水膠其接合上的肽暴露一級胺，會消耗HA-ALD的部分醛基，導致些微降低複合水膠的交聯密度。

圖6A至圖6C分別是本發明實施例1和比較例2的複合水膠的水膠降解分析圖、複合奈米粒子釋放分析圖以及水膠降解與複合奈米粒子釋放的曲線關係圖。

[水膠降解的測試]

40 μL複合水膠溶液置入圓柱形模型30分鐘使其成膠，接著，將圓柱形複合水膠移入96孔培養盤，在每孔中加入100 μL PBS，在定點時間（1, 3, 6, 9, 24, 48, 72, 168, 336, 600, 840小時）由針筒將上清液完全取出並置換為新鮮PBS。收集的上清液中的醣胺聚醣使用十六烷基三甲基溴化銨比濁法（cetyltrimethylammonium bromide turbidimetric method，CTM）測量。

[複合奈米粒子釋放測試]

在水膠成交前，殼聚醣先以異硫氰酸螢光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記。接著，將複合水膠培養於PBS（37˚C），在定點時間由針筒將上清液完全取出並置換為新鮮PBS。FITC標記的複合奈米粒子使用VICTOR X3微孔盤分析儀測定。另外，為測試MMP對於複合奈米粒子的釋放調控，在PBS中加入20和200 U/mL IV型膠原蛋白酶作為釋放緩衝液。

[生長因子釋放測試]

40 μL複合水膠培養於50 μL釋放緩衝液（PBS w/0.05% Tween 20，1% BSA）（37˚C），在第1、2、3、5、7、14天收集上清液並補充50 μL新鮮釋放緩衝液。培養14天後，將水膠中的HA、HS和CS以含有10 U透明質酸酶（hyaluronidase）、100 mU肝素酶II（heparinase II）以及20 mU硫酸軟骨素ABC的釋放緩衝液於37˚C下消化（digest）24小時。將收集的釋放緩衝液使用生長因子的ELISA套組定量。

由圖6A可知，實施例1和比較例2的複合水膠在起始階段快速降解的部分應是未交聯的水膠前驅物。之後，實施例1和比較例2的複合水膠持續降解，至約五星期後完全降解。由圖6B可知，由於實施例1的複合水膠的複合奈米粒子mCSPCN在交聯前先與HA-ALD混合，亞胺鍵（複合奈米粒子mCSPCN的肽上的一級胺與HA-ALD上的醛基之間）的形成使得實施例1的複合水膠的複合奈米粒子mCSPCN較緩慢地釋放，且複合奈米粒子mCSPCN在5星期後累積約80%的釋放量。反觀，由於比較例2的複合水膠的複合奈米粒子CSPCN與HA-ALD之間並沒有鍵結，比較例2的複合水膠的複合奈米粒子CSPCN在第1天即迅速顯著地釋放（約40%），且複合奈米粒子CSPCN僅維持14天的釋放。由圖6C可知，實施例1的複合水膠和比較例2的複合水膠的擬合趨勢線（fitted trend line）的斜率分別為0.82和2.32，這代表實施例1的複合水膠的複合奈米粒子mCSPCN的釋放與複合水膠的降解一致（斜率≦1），而不是來自於複合水膠的快速擴散（斜率＞1）。

圖7A是本發明實施例1和比較例1的複合水膠的細胞毒性測試螢光分析圖像。上排為複合水膠第1天的細胞毒性測試結果，下排為複合水膠第3天的細胞毒性測試結果。在此試驗中，測試的細胞選用大鼠神經幹細胞（半貼附HCN-A94-2）。由圖7A可知，活細胞佔有主導地位，僅觀察到少量的死細胞。

圖7B是本發明實施例1的複合水膠的細胞毒性測試分析圖。負控制組（negative control）代表細胞培養於組織培養聚苯乙烯（polystyrene）。正控制組（positive control）代表利用Triton X-100將細胞破膜完全毒殺。由圖7B可知，實施例1的複合水膠的細胞毒性相較於負控制組並沒有顯著差異。

實驗 3

以下，參照圖8A至圖10B來詳細說明本發明的複合水膠於神經幹細胞體外受控訊號調節（ in vitrocontrolled signaling regualtion）的特性試驗。

圖8A是依照本發明一些實施例的複合水膠與基質膠（Matrigel）組合之用於細胞遷移測試所繪示的結構示意圖。在圖8A中，使用如圖8A所示的圓柱形水膠700測試神經幹細胞在複合水膠中的趨化遷移，其中複合水膠400A位於圓柱形水膠700的核心，包含神經幹細胞600的基質膠（Matrigel）500位於圓柱形水膠700的外環。

圖8B是圖8A所繪示的複合水膠與Matrigel組合的顯微鏡觀測圖像。圖8C是圖8B的局部放大的螢光分析圖像。圖8D是本發明實施例3的複合水膠與Matrigel組合之用於細胞遷移測試的螢光分析圖像。圖8E是本發明實施例3的複合水膠與Matrigel組合的細胞遷移測試分析圖。在圖8D中，控制組代表由水膠材料300形成水膠700的核心，即核心僅由水膠材料300組成，比較組代表水膠材料300另外混入SDF-1α形成圓柱形水膠700的核心，但SDF-1α為游離的（free）SDF-1α。左列為第3天的螢光分析圖像，右列為第7天的螢光分析圖像。虛線代表核心與外環的界面，箭頭代表神經幹細胞遷移的方向，箭頭長度代表神經幹細胞遷移的距離。由圖8D和圖8E可知，實施例3和比較組的神經幹細胞在第3天皆跨越界面朝圓柱形水膠700的核心遷移，其中實施例3 的神經幹細胞遷移距離平均約200 μm，比較組的神經幹細胞遷移距離平均約100 μm。

圖9A和圖9B分別是本發明實施例4和實施例6的複合水膠與Matrigel組合的細胞遷移測試分析圖。外圈虛線代表起始核心與外環的界面，內圈虛線代表3天後細胞遷移的界面，箭頭代表神經幹細胞的遷移。由圖9A和圖9B可知，實施例6的複合水膠non-mHSPCN對於基質金屬蛋白水解酵素（MMP）不具酵素敏感性，故不會改變周圍神經幹細胞的移動。

圖10A是本發明實施例2和實施例4的複合水膠與Matrigel組合之用於細胞增生測試的顯微鏡觀測圖像。圖10B是本發明實施例2和實施例4的複合水膠與Matrigel組合的細胞增生測試分析圖。在圖10A中，由上至下分別代表第1天、第3天以及第7天的細胞增生觀測結果。由圖10A可知，實施例4的複合水膠在第3天可觀測到類神經球的（neurosphere-like）神經幹細胞團聚體（aggregate）（直徑約50至100 μm），且至第7天神經幹細胞團聚體逐漸變大。實施例2的複合水膠中的神經幹細胞在第3天仍均勻地分散。由圖10B可知，實施例4的複合水膠中的DNA含量顯著地高於實施例2的複合水膠中的DNA含量。

實驗 4

以下，參照圖11A至圖14B來詳細說明本發明的複合水膠於腦部損傷的治療效果以及內源性細胞再生的試驗。

圖11A和圖11B是大鼠腦部受損後的核磁共振影像圖。藉由光致血栓形成缺血（photothrombotic ischemia，PTI）的大鼠模型作為本發明的複合水膠於腦部損傷的治療效果測試。在圖11B中，左側為T2-加權影像（T2-weighted image，T2WI），中間為擴散加權影像（diffusion-weighted image，DWI），右側為表觀擴散係數（apparent diffusion coefficient，ADC）圖。在T2WI中，愈多液體填充，顯示的區域愈亮。在DWI中，液體流動愈困難，顯示的區域愈亮。由圖11A和圖11B可知，右半球大腦皮層在雷射照射部位顯示從皮層表面至胼胝體相對均勻的高信號，且高信號區域的平均體積為51.9±4.2 mm ³。擴散加權影像中的信號增加而在表觀擴散係數圖中的信號藉由與T2高信號區域共定位（colocalize）而降低。

圖11C是本發明實施例5的複合水膠、比較例1的水膠、比較實驗例的奈米複合粒子以及控制組用於治療大鼠腦部受損根據核磁共振影像圖所繪示的結果分析圖。圖11D是本發明實施例5的複合水膠以及控制組用於治療大鼠腦部受損的核磁共振影像圖。圖11D的左圖和右圖分別代表實施例5的複合水膠和控制組第35天的核磁共振影像圖。控制組代表僅用PBS注射至大鼠腦部受損部位。由圖11C和圖11D可知，使用實施例5的複合水膠和比較例1的水膠注射至大鼠腦部受損部位的梗塞體積在第21天相較於比較實驗例和對照組顯著地縮小。使用實施例5的複合水膠注射至大鼠腦部受損部位的梗塞體積在第35天相較於對照組顯著地縮小。

圖12是本發明實施例5的複合水膠、比較例1的水膠、比較實驗例的奈米複合粒子以及對照組用於治療大鼠腦部受損且根據大鼠行為所繪示的結果分析圖。在圖12中，使用對側前肢比例是由下式1所計算而得：

由圖12可知，使用實施例5的複合水膠和比較例1的水膠注射至大鼠腦部受損部位後，大鼠使用對側前肢比例在第28天之後相較於比較實驗例和對照組具有顯著地提升。

圖13A至圖13C是本發明實施例5的複合水膠、比較例1的水膠、比較實驗例的奈米複合粒子以及對照組用於治療大鼠腦部受損的腦部組織切片的免疫螢光染色圖。圖13D和圖13E是本發明實施例5的複合水膠、比較例1的水膠、比較實驗例的奈米複合粒子以及對照組用於治療大鼠腦部受損且根據腦部組織切片的免疫螢光染色圖所繪示的結果分析圖。DCX可作為辨識遷移神經前驅細胞的標記，Ki67和Nestin可作為計算神經前驅細胞的增生標記。由圖13A至圖15E可知，使用實施例5的複合水膠注射至大鼠腦部受損部位後，神經前驅細胞在治療第21天後明顯遷移至梗塞腔周圍，亦有許多神經前驅細胞增生於梗塞組織周圍。

圖14A是本發明實施例5的複合水膠、比較例1的水膠、比較實驗例的奈米複合粒子以及對照組用於治療大鼠腦部受損的靠近腦部組織堵塞部位切片的免疫螢光染色圖。圖14B是本發明實施例5的複合水膠、比較例1的水膠、比較實驗例的奈米複合粒子以及對照組用於治療大鼠腦部受損且根據靠近腦部組織堵塞部位切片的免疫螢光染色圖所繪示的結果分析圖。圖14C是本發明實施例5的複合水膠、比較例1的水膠、比較實驗例的奈米複合粒子以及對照組用於治療大鼠腦部受損的腦部組織堵塞部位周邊切片的免疫螢光染色圖。為了分析再生過程中的神經表型（neural phenotype），β-III微管蛋白（β-III butulin）和膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）可作為評估未成熟神經元（neuron）的形成以及星狀膠質細胞增生（astrogliosis）的標記。由圖14A至圖14C可知，使用實施例5的複合水膠和比較例1的水膠注射至大鼠腦部受損部位後，可減少星狀膠質細胞增生並促使未成熟神經元的形成。

綜上所述，本發明的複合水膠包括水膠材料以及複合奈米粒子，可依據需求選擇適合的水膠材料和複合奈米粒子的組合以達到較佳的治療效果。在腦部損傷的治療應用中，水膠材料可仿生腦部組織的微環境並達到結構支持的作用。複合奈米粒子中的帶負電多醣可保護並負載不同的生長因子，且生長因子的負載效率高。接合水膠材料和複合奈米粒子的肽可調控複合奈米粒子釋放速率，進而控制複合奈米粒子負載的生長因子的釋放以達到更佳的治療效果。

雖然本發明已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作些許的更動與潤飾，故本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。

100A、100B、200B：複合奈米粒子 102、202：帶負電多醣 104、204：帶正電多醣 106：馬來醯亞胺基 108、208：肽 110、210：生長因子 300：水膠材料 400A、400B：複合水膠 500：基質膠 600：神經幹細胞 700：圓柱形水膠

圖1A至圖1E是依照本發明一些實施例的複合奈米粒子所繪示的製備流程的結構示意圖。圖2A和圖2B是依照本發明一些實施例的複合水膠所繪示的結構示意圖。圖3A和圖3B是本發明實驗例1和實驗例2的複合奈米粒子的穿透式電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）圖像。圖3C是本發明實驗例1和實驗例2的複合奈米粒子的粒徑分析圖以及聚合物分散性指數（polymer dispersity index，PDI）分析圖。圖4A是本發明實施例1的複合水膠的穿透式電子顯微鏡圖像。圖4B是圖4A的局部放大圖。圖5A是本發明比較例1的水膠的機械性質分析圖。圖5B是本發明實施例1的複合水膠的與時間相關的震盪剪切流變（time-dependent oscillatory shear rheology）圖。圖5C是本發明實施例1和比較例1的複合水膠的與頻率相關的震盪剪切流變（frequency-dependent oscillatory shear rheology）圖。圖6A至圖6C分別是本發明實施例1和比較例2的複合水膠的水膠降解分析圖、複合奈米粒子釋放分析圖以及水膠降解與複合奈米粒子釋放的曲線關係圖。圖7A是本發明實施例1和比較例1的複合水膠的細胞毒性測試螢光分析圖像。圖7B是本發明實施例1的複合水膠的細胞毒性測試分析圖。圖8A是依照本發明一些實施例的複合水膠與基質膠（Matrigel）組合之用於細胞遷移測試所繪示的結構示意圖。圖8B是圖8A所繪示的複合水膠與Matrigel組合的顯微鏡觀測圖像。圖8C是圖8B的局部放大的螢光分析圖像。圖8D是本發明實施例3的複合水膠與Matrigel組合之用於細胞遷移測試的螢光分析圖像。圖8E是本發明實施例3的複合水膠與Matrigel組合的細胞遷移測試分析圖。圖9A和圖9B分別是本發明實施例4和實施例6的複合水膠與Matrigel組合的細胞遷移測試分析圖。圖10A是本發明實施例2和實施例4的複合水膠與Matrigel組合之用於細胞增生測試的顯微鏡觀測圖像。圖10B是本發明實施例2和實施例4的複合水膠與Matrigel組合的細胞增生測試分析圖。圖11A和圖11B是大鼠腦部受損後的核磁共振影像圖。圖11C是本發明實施例5的複合水膠、比較例1的水膠、比較實驗例的奈米複合粒子以及控制組用於治療大鼠腦部受損根據核磁共振影像圖所繪示的結果分析圖。圖11D是本發明實施例5的複合水膠以及控制組用於治療大鼠腦部受損的核磁共振影像圖。圖12是本發明實施例5的複合水膠、比較例1的水膠、比較實驗例的奈米複合粒子以及對照組用於治療大鼠腦部受損且根據大鼠行為所繪示的結果分析圖。圖13A至圖13C是本發明實施例5的複合水膠、比較例1的水膠、比較實驗例的奈米複合粒子以及對照組用於治療大鼠腦部受損的腦部組織切片的免疫螢光染色圖。圖13D和圖13E是本發明實施例5的複合水膠、比較例1的水膠、比較實驗例的奈米複合粒子以及對照組用於治療大鼠腦部受損且根據腦部組織切片的免疫螢光染色圖所繪示的結果分析圖。圖14A是本發明實施例5的複合水膠、比較例1的水膠、比較實驗例的奈米複合粒子以及對照組用於治療大鼠腦部受損的靠近腦部組織堵塞部位切片的免疫螢光染色圖。圖14B是本發明實施例5的複合水膠、比較例1的水膠、比較實驗例的奈米複合粒子以及對照組用於治療大鼠腦部受損且根據靠近腦部組織堵塞部位切片的免疫螢光染色圖所繪示的結果分析圖。圖14C是本發明實施例5的複合水膠、比較例1的水膠、比較實驗例的奈米複合粒子以及對照組用於治療大鼠腦部受損的腦部組織堵塞部位周邊切片的免疫螢光染色圖。

100B、200B：複合奈米粒子 102、202：帶負電多醣 104、204：帶正電多醣 108、208：肽 110、210：生長因子 300：水膠材料 400B：複合水膠

Claims

一種複合水膠，包括：水膠材料；以及多個第一複合奈米粒子，以酵素敏感性鍵結或非酵素敏感性鍵結接合於所述水膠材料上，其中每個所述第一複合奈米粒子包括：第一帶正電多醣，位於所述第一複合奈米粒子的內核；以及第一帶負電多醣，位於所述第一複合奈米粒子的外殼且負載多個第一生長因子，其中所述第一帶負電多醣以及所述第一帶正電多醣以靜電作用吸引而形成所述第一複合奈米粒子。
如申請專利範圍第1項所述的複合水膠，更包括多個第二複合奈米粒子，接合於所述水膠材料上，其中每個所述第二複合奈米粒子包括：第二帶正電多醣，位於所述第二複合奈米粒子的內核；以及第二帶負電多醣，位於所述第二複合奈米粒子的外殼且負載多個第二生長因子，其中所述第二帶負電多醣以及所述第二帶正電多醣以靜電作用吸引而形成所述第二複合奈米粒子。
如申請專利範圍第2項所述的複合水膠，其中所述多個第二複合奈米粒子以酵素敏感性鍵結或非酵素敏感性鍵結接合於所述水膠材料上。
如申請專利範圍第2項所述的複合水膠，其中所述多個第一複合奈米粒子以酵素敏感性鍵結接合於所述水膠材料上，而所述多個第二複合奈米粒子以非酵素敏感性鍵結接合於所述水膠材料上。
如申請專利範圍第2項所述的複合水膠，其中所述第一帶正電多醣、所述第二帶正電多醣、所述第一帶負電多醣以及所述第二帶負電多醣包括蛋白多醣。
如申請專利範圍第2項所述的複合水膠，其中所述第一帶正電多醣以及所述第二帶正電多醣包括殼聚醣(chitosan)。
如申請專利範圍第2項所述的複合水膠，其中所述第一帶負電多醣以及所述第二帶負電多醣包括硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)、硫酸軟骨素(chondroitin sulfate)、硫酸皮膚素(dermatan sulfate)、硫酸角質素(keratin sulfate)或其組合。
如申請專利範圍第2項所述的複合水膠，其中所述第一生長因子以及所述第二生長因子包括鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、趨化基質衍生因子α(SDF-1α)、血小板衍生生長因子(PDGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、肝細胞生長因子(HGF)、骨塑型蛋白(BMP)或其組合。
如申請專利範圍第2項所述的複合水膠，其中所述第一生長因子以及所述第二生長因子為相同或不相同的生長因子。
如申請專利範圍第1項所述的複合水膠，其中所述水膠材料包括生物可降解水膠材料。
如申請專利範圍第1項所述的複合水膠，其中所述水膠材料包括醣胺聚醣(glycosaminoglycan)、多醣(polysaccharide)、蛋白質或其組合。
如申請專利範圍第1項所述的複合水膠，其中所述水膠材料包括透明質酸(hyaluronic acid)、褐藻酸(alginic acid)、殼聚醣(chitosan)、膠原蛋白(collagen)或其組合。
如申請專利範圍第2項所述的複合水膠，其中所述多個第一複合奈米粒子以及所述多個第二複合奈米粒子的粒徑介於100奈米至500奈米之間。
如申請專利範圍第2項所述的複合水膠，其中所述第一帶正電多醣的分子量小於所述第一帶負電多醣的分子量，所述第二帶正電多醣的分子量小於所述第二帶負電多醣的分子量。
如申請專利範圍第1項所述的複合水膠，其中所述複合水膠成膠後的儲存模數介於100帕至1000帕之間。
一種複合水膠的製備方法，包括：提供水膠材料；形成多個第一複合奈米粒子，以酵素敏感性鍵結或非酵素敏感性鍵結接合於所述水膠材料上，其中每個所述第一複合奈米粒子包括：第一帶正電多醣，位於所述第一複合奈米粒子的內核；以及第一帶負電多醣，位於所述第一複合奈米粒子的外殼且負載多個第一生長因子，其中所述第一帶負電多醣以及所述第一帶正電多醣以靜電作用吸引而形成所述第一複合奈米粒子。
如申請專利範圍第16項所述的複合水膠的製備方法，更包括形成多個第二複合奈米粒子，接合於所述水膠材料上，其中每個所述第二複合奈米粒子包括：第二帶正電多醣，位於所述第二複合奈米粒子的內核；以及第二帶負電多醣，位於所述第二複合奈米粒子的外殼且負載多個第二生長因子，其中所述第二帶負電多醣以及所述第二帶正電多醣以靜電作用吸引而形成所述第二複合奈米粒子。
如申請專利範圍第17項所述的複合水膠的製備方法，其中所述多個第二複合奈米粒子以酵素敏感性鍵結或非酵素敏感性鍵結接合於所述水膠材料上。
如申請專利範圍第16項所述的複合水膠的製備方法，其中所述形成多個第一複合奈米粒子的步驟包括：修飾所述第一帶負電多醣，修飾後的所述第一帶負電多醣接合酵素敏感性肽或非酵素敏感性肽。
如申請專利範圍第17項所述的複合水膠的製備方法，其中所述第一生長因子以及所述第二生長因子為相同或不相同的生長因子。