CN1275408A

CN1275408A - 一种生物敷料的生产制备工艺

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Publication number: CN1275408A
Application number: CN99107774A
Authority: CN
Inventors: 钟卫民; 张燕; 邹清雁; 陈柯; 孔祥平; 王东晓; 余宙耀; 王旭良; 徐胜奎
Original assignee: Hospital No458 Chinese Pla
Current assignee: Hospital No458 Chinese Pla
Priority date: 1999-05-28
Filing date: 1999-05-28
Publication date: 2000-12-06
Anticipated expiration: 2019-05-28
Also published as: CN1213774C

Abstract

本发明涉及的是一种生物敷料的生产工艺,它是一种从幼年健康哺乳动物的上皮与真皮组织中,在低温下用生物化学技术提取具有促进上皮细胞生长的生物活性物质和胶原并与传统的纱布敷料相结合研制而成的,具有有效、廉价、使用方便的特点;通过动物实验及临床实验研究证明:本敷料能明显促进包括烧伤、慢性皮肤溃疡、手术及其它创伤在内的多种皮肤损伤性疾病的创面愈合,提高愈合质量,缩短愈合时间,且无明显不良反应及副作用。

Description

一种生物敷料的生产制备工艺

本发明涉及的是一种生物敷料，具体地讲，本发明涉及的是一种采用哺乳动物上皮和真皮组织中提取的具有生物活性的物质制成的生物敷料。

我们通过查阅文献及临床摸索，试制出一种新型的外科敷料。该敷料的主要材料为幼年动物皮提取物及医用纱布，它吸取了胶原及纱布敷料的优点。本产品对创面的发展、转归、和预后均有一定影响，它在临床上主要应用于烧伤、慢性溃疡及手术创面等多种创伤性疾病中，以达到防止伤口感染、加快伤口愈合的目的。

目前临床应用的敷料主要有以下几种类型：

(一)、非生物活性敷料：即传统敷料。如各类纱布型敷料，包括合成纤维纱布、塑料薄性不粘纱布、湿润性纱布等。这类敷料的主要功能是防止伤口感染，保护创面，但对促进伤口愈合的作用不大，甚至还会影响伤口愈合。

(二)、植物活性敷料：这类敷料的原材料是从各类植物品种中提炼出来的有机成份。如藻酸盐类、聚硅氧类、水胶体类敷料(Duoderm敷料、Comfeel敷料)、聚糖类敷料类。这类敷料的特点是它能维持伤口湿润环境，可与局部应用的药剂和机体内源性分子相作用，促进伤口愈合。有研究表明：能保持湿润的敷料可维持伤口表面的水化物。当用酶制剂对伤口坏死组织进行清创时，由于湿润的环境可激活酶的活性，从而促进酶的作用。此外这类敷料还与伤口上的分子起作用，加强伤口修复中自然生长因子的作用，从而加速伤口愈合。

(三)、生物型生物敷料这类敷料的原材料是从各类生物品种中提炼出来的生物成份，是取自动物体内有生活力的组织。经处理后可以较长期的保存，成为无生机的生物材料。如羊膜、腹膜和皮肤。这类敷料具有较强的抗原性，对伤口的愈合及愈合后影响大。现代临床上应用较多的敷料是用从异种动物皮肤中提取出来的胶原与其它材料合成的胶原类敷料。

胶原是一种天然蛋白质，广泛存在于动物的皮肤、肌腱和其它结缔组织中。胶原为表皮细胞的迁移、增殖铺垫了支架，并提供了良好的营养基础，有利于上皮细胞的增殖修复，因而能促进创面的愈合。早在70年代。就有用胶原膜覆盖烧伤创面的临床报道。其中Yang研制了一种YCWM胶原膜，通过临床试验表明，该膜使用方便，对未感染、干燥的烧伤及供皮区创面的治疗效果显著。Gao等用胃酶消化法从猪皮真皮中提取胶原，采用盐析法制成胶原膜，并用此胶原膜进行了临床试验研究，结果表明该膜具有明显的促进伤口愈合能力。80年代我国对胶原蛋白在烧伤创面的应用进行了研究。第三军医大学从猪皮革提取型胶原，配成溶液用于深度烧伤创面及残余肉芽创面的治疗，不仅创面愈合快，而且愈后皮肤平整。1990年第二军医大学第一附属医院用新鲜猪皮自制胶原，治疗烧伤后残余创面8例，结果表明胶原能明显促进伤口愈合。1994年美国、意大利、德国等西方国家已开始进行期临床阶段。

由于胶原通过与血小板粘合、聚集作用，从而促进伤口的血凝作用。早在60年代末大量的动物实验及临床实验就已证实胶原具有优异的止血性能。90年代初从美国进口的胶原海绵在国内部分医院进行了临床验证。结果表明胶原海绵较传统的明胶海绵具有更好的止血性能。

综上所述，胶原具有良好的促进伤口愈合及止血性能，是外科敷料较好的材料，但目前国内外所使用的都为纯制的胶原膜，这种胶膜制作过程复杂，原材料浪费严重。且不便于消毒保存，同时给医务人员换药治疗带来一定的困难。

本发明的目的在于提供一种新型敷料的制备方法，其主要特征在于：具备无毒、无刺激性及抗原性、便于临床应用，具备良好的韧性、透水性及微生物隔离作用，同时具备保护新生组织及维持创面湿度和温度，促进创口愈合的作用。具备止血及抑菌作用。具备保护新生组织及维护创面和温度有利创面愈合，且该敷料制备工艺简单，原料来源广泛。

本发明的目的可通过以下的技术措施来达到：选用健康哺乳类动物的真皮和皮肤组织，加水，采用任何机械捣碎，离心或其它任何方法分离上清和沉渣；上清用于制备生长活性因子，沉渣用于制备胶原。采用提取的上清，过正压截留柱，取滤液，除菌，称1号液。沉渣用稀酸溶解，用稀NaOH调pH值到7.0，过滤后取滤液，除菌，称2号液。按适当比例混合上述两液，即生物原材料。支架敷料先行高压灭菌，再加入适量的生物原材料，低温或任何温度干燥，经物理加工，包装，最后成品。

在上述方案中，健康哺乳类动物选自如猪、牛、马、驴、羊、狗、兔等。

在上述方案中，支架敷料可选用传统的纱布敷料及其它如棉、线、纱、布及合成纤维等具备良好的韧性、透气性、透水性及微生物隔离作用的敷料。

在上述方案中，优选加稀盐酸的比例为每1L沉渣加2L稀盐酸，加入量可从1L至5L。

在上述方案中，优选干燥温度为-10℃，真空干燥，时间按干燥程度确定。其它温度可从-10℃-+95℃不等，时间按干燥程度不同从一小时至数十小时不等。

下面，将用实施例进一步详述本发明。

实施例1

选用健康乳猪的真皮和皮肤组织，加水，采用任何机械捣碎，匀桨，离心或其它任何方法分离上清和沉渣；上清用于制备生长活性因子，沉渣用于制备胶原。采用提取的上清，过正压截留柱(截止分子量为50，000)，取滤液，除菌，称1号液。1L沉渣用2L稀盐酸(0.1mol/L)溶解，用稀NaOH(1mol/L)调pH值到7.0，过滤后取滤液，除菌，称2号液。按适当比例混合上述两液，即生物原材料。支架敷料先行高压灭菌，再加入适量的生物原材料液，-10℃真空干燥，经物理加工，包装，最后成品。

实施例2

选用健康乳猪的真皮和皮肤组织，加水，采用任何机械捣碎，匀浆，离心或其它任何方法分离上清和沉渣；上清用于制备生长活性因子，沉渣用于制备胶原。采用提取的上清，过正压截留柱(截止分子量为100,000)，取滤液，除菌，称1号液。1L沉渣用4L稀盐酸(0.1mol/L)用稀NaOH(1mol/L)调pH值到7.0，过滤后取滤液，除菌，称2号液。按适当比例混合上述两液，即生物原材料。支架敷料先行高压灭菌，再加入适量的生物原材料液，80℃真空干燥，经物理加工，包装，最后成品。

实施例3

采用本方法可以观察1号液促进成纤维细胞的增殖活性。

材料和方法

1.成纤维细胞的分离：取乳猪肾上腺，剪碎，加入0.25％胰酶，室温下消化30-60分钟；分离悬浮的单个细胞，离心，去胰酶，用含10％小牛血清的DME/F12培养基调细胞浓度为5-10×10⁸/L；用培养瓶培育2小时，倒去上清，加含10％小牛血清的DME/F12培养基继续培养，等细胞长满后，用胰酶消化贴壁细胞，调细胞浓度换液后做活性测定试验。

2.生物学活性测定：调细胞浓度为4.0-8.0×10⁸/L接种于96孔培养板，0.1ml/孔。置37℃5％CO₂ 24小时后换液，加入25-1000mg/L的1号液，以20米g/L EGF为阳性对照，以生理盐水为阴性对照孔。72小时后弃上清。96孔板加含0.15g/L MTT和2mci/L ³H-TDr F₁₂培养液0.05ml。培养4小时，分别做MTT比色和³H-TDr掺入的技术操作。

3.统计学处理，采用t检验或方差检验。

结果

1.1号液对成纤维细胞增殖的影响

(1)1号液对培养72小时大鼠成纤维细胞增殖的影响。

1号液对成纤维细胞³H-TdR掺入的影响(X±SD，n＝8)浓度(mg/L) Cpm(10^-1) 处理数 t值1000 1194±152 1 1.540500 1805±280 1 0.565250 2755±431 3 3.839*100 3506±1302 6 6.427**50 3019±1381 4 4.749**25 2713±834 2 3.695**EGF 3135±727 5 5.149**对照组 1641±334F值 7.215注：*，P＜0.05，**，P＜0.01，同对照组比较。(2)1号液对培养72小时大鼠成纤维细胞活力的影响。1号液对成纤维细胞脱氢酶活力的影响(X±SD，n＝8)浓度(mg/L) Cpm(10^-1) 处理数 t值1000 0.190±0.0346 1 1.237500 0.227±0.0580 1 0.397250 0.373±0.0763 6 6.846**100 0.307±0.0230 4 3.931**50 0.280±0.0361 2 2.738*25 0.297±0.0763 3 3.180*EGF 0.372±0.0627 5 6.801**对照组 0.218±0.0356F值 11.297注：*，P＜0.05， **，P＜0.01，同对照组比较。

结论

1号液能明显促进肾上腺成纤维细胞的DNA合成和脱氢酶的活力，并呈一定的剂量作用效应；其最适浓度为100mg/L，最佳效果同20米g/LEGF作用相似。

实施例4-5

本敷料的疗效分析判定分别从动物实验和临床研究两方面进行。具体疗效观察指标如下：

1.安全标准：观察全疗程

①一般检查：全身或局部不良反应

②血尿常规

③肝肾功能

2.创面情况

①外观、创缘反应、渗出情况、感染情况

②创面愈合：愈合面积百分比、愈合速度、创面深度及创面完全

愈合时间

③不同时间创面组织标本病理检查结果

④不同时间不同创面内肉芽生长情况

⑤创面愈后质量

疗效判断标准及其依据

①同时间愈合创面百分比

②同时间创面深度

③创面完全愈合时间

④创面肉芽生长情况

⑤病理学检查

(动物实验的计量资料采用配对T检验；临床实验的计量资料采用非配对的T检验)

实施例4

本敷料通过多个环节影响创面的愈合。我们以自制幼龄猪，取皮创面为动物模型，比较自制生物敷料与传统凡士林纱布对创面愈合的影响。

材料与方法

材料：2-3月龄乳猪5只，雌雄不限，体重15-20kg，由华南农业大学动物所提供。传统无菌凡士林纱布敷料。自制生物敷料。常规手术器械。

方法：

动物模型制备：在每只实验动物脊柱两侧各切取5个面积大小均为5cm×5cm，深度为1.5mm(厚中厚皮片)的正方形的对称性创面。

研究方法：对照采取同体、对称部位、同深度创面即同只动物的左侧5个创面为生物敷料实验组，右侧5个创面为传统凡士林纱布对照组。为防影响创面愈合，我们每隔3天换药，同时观察记录切口愈合情况、创面愈合率换药至创面愈合为止，并作好记录。每次换药时随机切取实验及对照组各一个创面中的组织标本，并送病理检查。

实验结果

1.创面面积变化(CM²)时间(d) 1 4 7 11 14 17实验组 25 *11.3±1.42 *5.15±0.87 *痊愈对照组 25 18.73±0.98 12.4±1.22 7.64±0.52 2.13±0.23 痊愈*P＜0.05，vs对照组。2.完全愈合时间

实验组平均为10.24±1.12天

对照组平均为15.87±0.94天

3.实验组创缘红、肿明显较对照组轻。

4.实验组肉芽生长情况良好，肉芽质地鲜，色粉红，表面光滑，肉芽颗粒细腻均匀，渗出少，炎症反应轻。对照组肉芽生长情况与实验组相比：肉芽质地粗糙，色偏白，肉芽颗粒大小不一致，渗出相对较多，炎症反应较重。

5.愈合皮肤情况：

实验组见创面不留瘢痕，皮肤色泽与正常皮肤相差无几，创面皮肤弹性良好，质地柔软。毛发生长良好。

对照组见创面存在散在性的细小瘢痕，皮肤存留暗红色的色素沉着斑，创面皮肤弹性欠佳，质地硬。毛发生长较差。

6.病理切片检查结果显示：

实验组：术后第四天表皮局灶性全层坏死，真皮及皮下组织有个别炎症细胞浸润；手术第7天表皮大致正常，真皮及皮下可见散在纤维母细胞增生及炎症细胞浸润，表皮鳞状上皮增生角化；术后第十一天表皮轻度角化，真皮及皮下见个别炎症细胞浸润。

对照组：术后第四天表皮内可见小脓肿形成，真皮及皮下大量纤维母细胞增生，较多炎症细胞浸润，并见上皮样细胞结节形成；术后第七天见纤维脂肪组织，灶性炎症细胞浸润；术后第11天见部分不完全表皮、真皮及皮下大量纤维组织增生，并有较多炎症细胞浸润，表皮增生角化，真皮及皮下大量纤维组织增生。

实施例5

临床实验病例纳入标准：患者自愿；无合并心、肝、肾及造血系统严重病变及精神患者；烧伤或其它创伤性瘢痕切疤后需植皮的患者。

材料与方法

试验材料：自制生物敷料；凡士林油纱布

方法：对照采取不同个体同部位、同深度供皮区创面，每2天换药一次，每次换药均同条件清洁创面，每次换药时均观察并记录创面面积，直至创面完全愈合。以上治疗性操作均由同一人承担。

实验结果

一、一般资料

(一)病例来源：本实验病例为我院烧伤整形科1998年6-12月

住院切瘢植皮的病人，共38例，随机分配到实验组与对照组中。

其中实验组和对照组均为19例病人。

(二)性别与年龄见下表

男女年龄(X±SD)

21 17 24±9

(三)供皮区创面面积(cm²)及深度：实验组平均面积为96.53±14.23；对照组平均面积为92.96±15.41。各病例供皮区均为中厚皮片创面。

二、疗效分析

(一)、一般情况：治疗前后实验组有对照组血尿常规、肝肾功能均未见引起异常改变；治疗过程中未见全身及局部过敏反应及其它不良反应。

(二)对照组创缘红、肿反应对照组明显较实验组严重。

(三)肉芽组织生长情况：

实验组肉芽生长情况良好，肉芽质地鲜，色粉红，表面光滑，肉芽颗粒细腻均匀，渗出少，炎症反应轻。对照组肉芽生长情况与实验组相比：肉芽质地粗糙，色偏白，肉芽颗粒大小不一致，渗出相对较多，炎症反应较重。

(四)创面面积变化

时间(d) 实验组(cm²) 对照组(cm²)

1 96.53±14.23 92.96±15.41

3 87.32±9.25 91.44±11.34

5 *65.60±17.21 83.45±9.53

7 *52.72±2.78 71.70±21.22

9 *39.71±19.86 59.49±8.65

11 *20.83±4.40 47.52±9.07

13 14.69±3.01 30.26±4.31

14 5.11±1.20 17.91±5.54

16 *痊愈 8.39±0.92

17 2.75±1.95

19 0.97±0.07

21 痊愈

*P＜0.05，vs对照组

(五)完全愈合天数：

实验组为14.74±2.37；

实验组为19.23±3.82。

(六)实验组见创面不留瘢痕，皮肤色泽与正常皮肤相差无几，创面皮肤弹性良好，质地柔软。

对照组见创面存在散在性的细小瘢痕，皮肤存留暗红色的色素沉着斑，创面皮肤弹性欠佳，质地硬。

(七)病理检查

大致与动物实验部分相类似

结果与讨论

创面修复需要一个良好的无菌环境，敷料是维护创面无菌环境及保护或提供创面局部有利于创口愈合的微环境——包括一定的温度、湿度、酸碱度及各种营养成份。所以理想型的敷料应具备隔离外界细菌、抑制创内细菌的特性；也应具备保证组织修复及促进创面愈合等重要特性。本敷料是由传统纱布与乳猪皮提取物合制而成，它具有传统纱布隔离、吸附渗透好、廉价及使用方便的特点，同时具有胶原及小分子促细胞生长因子的优点，即能防止过多水份蒸发丢失，保持创面的温度、湿度，最重要的是其具有促进细胞生长和促进创面愈合的作用。

从我们在动物实验及临床实验研究数据来分析：自制的生物敷料促进创面愈合的作用明显较对照组好，且创面愈合质量也明显较对照组好。应用自制的生物敷料后，创缘炎症反应较对照组轻，说明该敷料还具有抗菌或抑菌的作用。应用过程中未见毒副作用或不良反应。

Claims

1.本敷料是胶原及某些小分子的促成纤维细胞及上皮细胞生长因子同传统的纱布敷料相结合研制而成。其中胶原及某些小分子的生长因子成分是从幼年健康动物皮中提取。此敷料的主要特征是：

(1)具备良好的韧性、透水性及微生物隔离作用。

(2)敷料中的主要成份胶原及小分子促上皮细胞及成纤维细胞生长因子具备促进上皮细胞生长及成纤维细胞生长，促进创口愈合的作用。

(3)具备止血及抑菌作用。

(4)具备保护新生组织及维护创面和温度有利创面愈合，且该敷料制备工艺简单，原料来源广泛。

(5)临床应用不产生过敏反应，无毒、无刺激性。

2.权利要求1所述的生物敷料，其特征是所述的制备方法，生物原材料是选用健康哺乳类动物如人、猪、牛、马、驴、羊、狗、兔等的真皮和皮肤组织。

3.权利要求1所述的生物敷料，其特征是所述的制备方法，支架敷料可选用传统的纱布敷料及其它如棉、线、纱、布及合成纤维等具备良好的韧性、透气性，透水性及微生物隔离作用的敷料。

4.权利要求1所述的生物敷料，其特征是所述的制备方法，生物原材料是选用健康哺乳类动物的真皮和皮肤组织，加水，采用任何机械捣碎，离心或其它任何方法分离上清和沉渣；上清用于制备生长活性因子，沉渣用于制备胶原。

5.权利要求1所述的生物敷料，其特征是所述的制备方法，生物原材料的生长活性因子是采用提取的上清，过正压截留柱，取滤液，除菌，称1号液。沉渣用稀酸溶解，用稀NaOH调pH值到7.0，过滤后取滤液，除菌，称2号液。按适当比例混合上述两液，即生物原材料。

6.权利要求1所述的生物敷料，其特征是所述的制备方法，支架敷料先行高压灭菌，再加入适量的生物原材料液，低温或任何温度干燥，经物理加工，包装，最后成品。

7.权利要求1所述的生物敷料，其特征是所述的用途是在临床上可用于治疗烧伤、慢性溃疡及手术创面等多种创伤性疾病中，以达到防止伤口感染、加快伤口愈合的目的。