CN101274109B - 发泡法制备柞蚕丝素蛋白-高聚物多孔互穿网格状支架材料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学中组织工程材料领域，具体说涉及一种以柞蚕丝素蛋白和生物可降解的高聚物为原料制备出互穿网格状生物组织工程支架材料的方法。本发明以柞蚕丝素蛋白和生物可降解的高聚物共混得到组织工程支架材料，添加致孔起泡剂，采用起泡法，制备出柞蚕丝素蛋白和生物可降解的高聚物的质量百分比为55-95％∶45-5％的互穿网格状生物组织工程支架材料。本发明得到的多孔支架材料具有很好的生物相容性、可降解性和较优越的机械特性，不仅加工工艺简单、成本低，而且也适合工业化批量生产。

Description

发泡法制备柞蚕丝素蛋白-高聚物多孔互穿网格状支架材料的方法

技术领域

本发明属于生物医学中组织工程材料领域，具体说涉及一种以柞蚕丝素蛋白和生物可降解的高聚物为原料制备的互穿网格状生物组织工程支架材料的方法。

背景技术

组织和器官的衰竭、损伤是最主要的临床医学问题，而目前的治疗方法主要是器官移植、外科修复、人工取代物，这些方法虽然能起到一定的作用，但都存在这样或那样的不足。直到20世纪80年代，美国学者提出了组织工程再生医学，它是利用生命科学和工程科学的原理和方法，研究和开发用于替代组织或器官的一部分或全部功能的取代物。组织工程的发展，提高了组织工程组织和器官的衰竭、损伤的治疗水平，改善了患者的生活质量，有效地降低医疗成本。它集生物工程、生命科学、材料科学与工程及临床医学于一体，目的是修复和再生受损组织或器官，帮助病人恢复受损组织的功能，提高生活质量。其基本原理和方法是将体外培养的高浓度组织细胞扩增后吸附于一种生物相容性良好，并可被人体逐步降解吸收的细胞外基质(ECM)材料上，形成细胞-生物材料复合物，然后将这种复合体植入机体所需部位。种植的细胞在生物支架降解吸收过程中，继续增生繁殖，形成新的具有原来特殊功能和形态的相应组织和器官，从而可达到修复组织外形和功能重建的目的^[4]。

组织工程学研究的主要科学问题之一是可供细胞进行生命活动的支架材料以及细胞与支架材料的相互作用，核心是建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体。理想的生物材料在组织工程中起关键作用，并成为组织工程研究的主流。生物材料的研究经历了第一代惰性材料，第二代具有活性或具有降解性质的材料，现已发展到兼有可降解和生物活性的第三代生物材料。人们开始从生命科学的角度研究和设计生物材料，注重材料与细胞的相互作用，改变以往采用惰性材料的作法，将生物的某些功能引入材料。目前，组织工程中的天然生物材料主要是胶原蛋白，人工合成的替代物主要是聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)和聚乳酸与聚羟基乙酸共聚物(PLGA)。要获取理想的天然支架材料有一定困难，而且也存在一些问题，如胶原蛋白的抗原性强、力学强度不够，在处理过程中胶原蛋白容易变性等；人工合成的替代物虽然也具有可生物降解特点，但生物相容性差。

作为组织工程的第三代生物新材料，丝蛋白纤维材料因具有独特的机械特性和生物相容性，以及其本质是蛋白质的结构特点，引起了国内外生物材料界的极大关注。美国、日本、韩国、意大利等国的多个生物医用材料研究组近年逐渐将研究重点转向蚕丝蛋白材料，近年来成为在组织工程领域人们重新感兴趣的一类特殊的生物材料。

蚕分为家蚕(桑蚕)和野蚕(柞蚕、天蚕、蓖麻蚕、擂蚕等)两类，迄今被工业化利用的只有家蚕茧和柞蚕茧两种，在绝大部分的丝素蛋白材料的研究或报道中，所用原料都是家蚕丝。

柞蚕丝作为一种用野外放养蚕缫制的天然蛋白质纤维，虽与桑蚕丝一样是由18种氨基酸组成，但近年来的研究表明，柞蚕丝含有特殊的精氨酸—甘氨酸—天门冬氨酸(RGD)三肽序列，RGD序列作为细胞膜整合素受体与细胞外配体相结合的识别位点，介导细胞与细胞外基质及细胞之间的相互作用，能够促进支架对细胞的黏附，使得细胞在柞蚕丝素膜上的附着率和增殖率远优于桑蚕丝素膜上的附着率和增殖率，被视为新型的可用于人体的理想的生物和医学材料。由于柞蚕丝素一级结构中含有较多的细胞特异性粘附序列RGD，而家蚕丝素蛋白中不含RGD序列，因此，柞蚕丝素蛋白材料的生物学性能可能比家蚕丝素蛋白材料更好。

中国年产柞蚕茧3-4万吨，占世界柞蚕茧总产量的90％以上，这是世界稀有、中国特有的宝贵资源，但目前柞蚕丝主要用作普通的纺织原料，所体现出的经济价值十分有限。如果能用柞蚕丝素蛋白制备生物医用材料，则预计能够达到家蚕丝素蛋白材料需要进行修饰、接枝等化学加工才能达到的组织相容性效果，这样既不损失蚕丝蛋白材料现有的优良性能、不产生毒副作用，又节省成本。然而，要将柞蚕丝素蛋白制备生物医用支架材料，还必须解决材料的孔洞问题。

组织工程三维支架材料要求具有高度贯穿多孔的特征。不同的细胞对孔径大小的要求不同，必须有适合大小的孔径，细胞才能向内生长，分布不均的孔结构将使细胞分布不一，阻碍了细胞之间的信息传导，最终将达不到生长、分化的良好状态。

目前主要有三种方法用于致孔，分别为冷冻干燥法、颗粒沥滤法和气体起泡法。冷冻干燥是一种温和的干燥方法，利于减少蛋白变性的程度并可得到具有相连孔的多孔膜，但孔结构参数的控制需通过不断调节冷冻干燥工艺条件或采用反复冻融工艺。Mikos等人开发了溶剂流涎/颗粒沥滤技术以制备高孔隙率、高比表面积的多孔支架，无机盐NaCl、KCl、一些低分子量有机化合物以及水溶性聚合物如明胶或聚氧化乙烯(PEO)等均可作为致孔剂。其基本原理为，在制膜的蛋白溶液中加入配制好的致孔剂成分，成膜后再用水或其他溶剂将致孔剂溶出从而形成空洞，该技术可获得84％-98％孔隙率，孔径达100-500μm，较冻干法形成的孔径大，可观察到分别有畅口和闭合的孔结构，同时支架表面形成表层，当孔隙率增加则表层厚度减小。采该方法造孔的效果较好，但其致命的问题是孔与孔之间并不是完全相通的，细胞在向孔内生长过程中，大部分局限在支架的表面孔洞，难以延伸到支架的内部。

形成互穿网格状是支架材料实用化的关键。选择能够通过加热形成气体的盐为致孔剂加入到支架材料中，既能支架材料产生孔洞，又能使孔洞与孔洞之间形成相连的通道。

发明内容

本发明的目的是选择更好的致孔起泡剂，以柞蚕丝素蛋白和生物可降解的高聚物为主要原料，制备出既能达到产生孔洞，又能使孔洞与孔洞之间形成相连的通道，形成互穿网格状的组织工程支架材料的方法。

为实现本发明的目的所采用的技术方案如下：

1.配制支架制备液

取柞蚕丝素蛋白溶解于硫氰酸盐溶液、高聚物溶解于有机溶剂中，然后将两溶液混合，得到质量百分比为55-95％的柞蚕丝素蛋白：45-5％的高聚物的支架制备液。

2.添加致孔起泡剂：加入起泡剂，如碳酸氢铵或碳酸铵，混匀。

3.成型：将添加有起泡剂的支架制备液倒入模具中，置于80～105℃烘箱中，10～60min烘干，形成支架。

5.变性：将支架浸泡在变性剂溶液乙醇中变性8～10小时后取出，置于蒸馏水浸洗8小时。

6.烘干：将支架于40℃烘干，即得质量百分比为55-95％的柞蚕丝素蛋白：45-5％的高聚物的多孔支架材料。

本发明所述的有机溶剂是指甲酸、乙酸、六氟异丙醇。

本发明所述的硫氰酸盐溶液是指硫氰酸钠、硫氰酸锂或硫氰酸铵。

本发明所述的高聚物是指聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸与聚羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯、聚羟基丁酸、聚氨基酸、甲壳素、壳聚糖、纤维素、聚乙烯醇、聚氧乙烯。

本发明的有益效果是：

1.由于柞蚕丝素蛋白是天然蛋白质高分子材料，且具备有利益细胞黏附的RGD三肽序列，因此其制得的支架材料具备很好的生物相容性以及细胞黏附性。

2.加入生物可降解的高聚物不仅能够进一步提高多孔支架机械性能、调控多孔支架材料的可降解特性，而且也有利于降低多孔支架的成本。

3.发泡法制备多孔支架的工艺简单，成本低，对于工业化大批量生产也适合。

具体实施方式

下面根据实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

1.配制支架制备液：取0.3g的柞蚕丝素蛋白溶解于1ml 9M的硫氰酸锂溶液，取0.1g聚乙烯醇溶解于1ml 98％的乙酸溶液，然后将两溶液混合得到柞蚕丝素蛋白和聚乙烯醇的支架制备液。

2.添加起泡剂：取1ml支架制备液，加入0.35g碳酸氢铵，混匀。

3.倒模、加热：将添加有起泡剂的支架制备液倒入1cm×3cm×0.3cm模具中，置于80℃烘箱15min，形成支架。

4.变性：将支架浸泡在变性剂溶液乙醇中变性8小时后取出，置于蒸馏水浸泡10小时。

5.烘干：变性后的支架于40℃烘干，即得质量百分比为75％的柞蚕丝素蛋白：25％的聚乙烯醇多孔支架材料。

实施例2

1.配制支架制备液：取0.35g的柞蚕丝素蛋白溶解于1ml 9M的硫氰酸铵溶液，取0.08g壳聚糖溶解于1ml 98％甲酸溶液，然后将两种溶液混合得到柞蚕丝素蛋白和壳聚糖的支架制备液。

2.添加起泡剂：取1ml支架制备液，加入0.43g碳酸铵，混匀。

3.倒模、加热：将0.5ml添加有起泡剂的支架制备液倒入1cm×3cm×0.3cm模具中，置于90℃烘箱40min，形成支架。

4.变性：将支架浸泡在变性剂溶液(如乙醇)中变性9小时后取出，置于蒸馏水浸泡8小时。

5.烘干：变性后的支架于40℃烘干，即得质量百分比为81.4％的柞蚕丝素蛋白：18.6％的壳聚糖多孔支架材料。

实施例3

1.配制支架制备液：取0.4g的柞蚕丝素蛋白溶解于1ml 9M的硫氰酸钠溶液，取0.15g聚乳酸溶解于1ml六氟异丙醇溶液，然后将两溶液混合得到含柞蚕丝素蛋白和聚乳酸的支架制备液。

2.添加起泡剂：取1ml支架制备液，加入0.55g碳酸氢铵，混匀。

3.倒模、加热：将0.5ml添加有起泡剂的支架制备液倒入1cm×3cm×0.3cm模具中，置于105℃烘箱60min，形成支架。

4.变性：将支架浸泡在变性剂溶液(如乙醇)中变性8小时后取出，置于蒸馏水浸泡8小时。

5.烘干：变性后的支架于40℃烘干，即得质量百分比为72.7％的柞蚕丝素蛋白：27.3％的聚乳酸多孔支架材料。

实施例4

1.配制支架制备液：取0.25g的柞蚕丝素蛋白溶解于1ml 9M的硫氰酸钠溶液，取0.08g聚己内酯溶解于乙酸，然后将两溶液混合，得到含柞蚕丝素蛋白和聚己内酯的支架制备液。

2.添加起泡剂：取1ml支架制备液，加入0.33g碳酸氢铵，混匀。

3.倒模、加热：将0.5ml添加有起泡剂的支架制备液倒入1cm×3cm×0.3cm模具中，置于105℃烘箱35min，形成支架。

4.变性：将支架浸泡在变性剂溶液(如乙醇)中变性9小时后取出，置于蒸馏水浸泡8小时。

5.烘干：变性后的支架于40℃烘干，即得质量百分比为81.4％的柞蚕丝素蛋白：18.6％的聚乳酸多孔支架材料。

Claims (2)

1.一种发泡法制备柞蚕丝素蛋白-高聚物多孔互穿网格状支架材料的方法，其特征在于：

(1)配制支架制备液

取柞蚕丝素蛋白溶解于硫氰酸盐溶液、高聚物溶解于有机溶剂中，然后将两溶液混合，得到按质量百分比计，柞蚕丝素蛋白∶高聚物为55～95％∶45～5％的支架制备液；

(2)添加致孔起泡剂

加入致孔起泡剂碳酸氢铵或碳酸铵，混匀；

(3)成型

将添加有起泡剂的支架制备液倒入模具中，置于烘箱，烘干，形成支架；

(4)变性

将支架浸泡在乙醇中变性8～10小时后取出，置于蒸馏水浸洗8小时；

(5)烘干

将支架于40℃烘干，即得多孔支架材料；

所述的高聚物是聚乳酸、聚己内酯、壳聚糖或聚乙烯醇。

2.根据权利要求1所述的发泡法制备柞蚕丝素蛋白-高聚物多孔互穿网格状支架材料的方法，其特征在于所述的添加有起泡剂的支架制备液倒入模具中后进行烘干时，烘箱的温度为80～105℃，烘干时间10～60min。