CN108578761A - 负载溶菌酶的丝胶/琼脂糖凝胶的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物材料技术领域，公开了一种负载溶菌酶的丝胶/琼脂糖凝胶的制备方法及其应用。将蚕茧剪成碎片，121℃高温高压30min，将丝胶提取到水中；然后将丝胶溶液冻干制成丝胶粉保存，将丝胶粉溶解在热水中得到丝胶溶液；各取2％的丝胶和琼脂糖溶液(w/v)用于水凝胶的制备，将两种溶液轻轻混合，加入24孔细胞培养板后进行凝胶化；将稳定的水凝胶于‑80℃预冻12h后，冷冻干燥24h成为凝胶。丝胶/琼脂糖复合凝胶具有多孔性和互通连接的结构，溶胀性能良好。通过溶液浸泡法制备丝胶/琼脂糖/溶菌酶凝胶，该凝胶具有持续的溶菌酶释放能力，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有良好的抗菌活性和优良的细胞相容性。

Description

负载溶菌酶的丝胶/琼脂糖凝胶的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，尤其涉及一种负载溶菌酶的丝胶/琼脂糖凝胶的制备方法及其应用。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：未愈合的伤口皮肤经常暴露于细菌，造成创伤感染，其生物特征有延长炎症，干扰再上皮化，阻碍胶原蛋白的生成，并最终延缓了创伤的愈合。在创伤护理中，创伤敷料是一种用于保护伤口并促进创伤愈合的重要生物医学材料。在目前全世界的卫生保健系统中，随着慢性病越来越多，创伤敷料市场正在迅速增加。理想的创伤敷料应能及时吸收伤口渗出液，允许气体交换，并保持创伤界面的必要水分，没有细胞毒性和过敏反应。此外，它可以通过创造合适的微环境来防止细菌感染，促进细胞粘附和增殖，从而促进创伤愈合。在所有的创伤敷料材料中，水凝胶由于具有亲水性、溶胀性、药物缓释性和原位成凝胶能力等多种功能而被证明是传统敷料诱人的替代品。丝胶(SS)是蚕丝的主要蛋白质成分之一，在纺织工业的脱胶过程中常作为废弃物被丢弃。丝胶是一种天然蛋白质，具有生物可降解性、易得性和亲水性等优点，在生物材料领域显示出巨大的应用潜力。此外，丝胶还具有抗氧化、抗细菌、抗凝血、促细胞生长和分化等多种生物学活性。然而，丝胶由于其无定形结构，具有物理脆性和高溶解性，这种性质不适于生物医学应用。因此，为了促进丝胶在再生医学材料中的应用，根据其含有不同的官能团如氨基、羟基和羧基的极性侧链，常常将丝胶与其它聚合物共聚、交联或共混以提高丝胶的性能。
琼脂糖(AR)是一种透明和热可逆的天然多糖。琼脂糖已被广泛使用在体外软骨组织工程，因为其能为软骨提供优秀的基底，且能产生更多的在结构与功能上接近天然软骨的糖胺聚糖(GAG)沉积物。此外，琼脂糖凝胶由于具有优良的生物相容性，可以匹配神经轴的生长并具有可调控的力学性能，有利于营养输送的多孔结构，且其植入不会引起不良反应，因此被认为是可用于修复和再生中枢神经系统的生物支架材料。然而，琼脂糖显示出了较低的细胞粘附和细胞增殖活性。因此，近年的研究趋势是把琼脂糖与其它聚合物如壳聚糖、明胶混合从而有效克服其缺点。然而，水凝胶作为创伤敷料材料也存在一定的不足，因为它可能为感染性细菌提供了一个有利的生长环境。为了防止皮肤创伤和敷料材料的细菌感染，青霉素和甲氧西林等抗生素被大量广泛地使用。然而，滥用抗生素导致了耐药病原体的出现，这已经成为了全世界关注的重大健康问题。因此，鉴定新型抗生素，尤其是具有克服耐药性的抗生素受到了极大的关注。溶菌酶(LZM)是一种天然抗菌剂，在几乎所有生物的细胞和分泌物中都存在。溶菌酶通过催化水解细菌细胞壁的肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1,4糖苷键从而发挥其抗菌作用。溶菌酶价格低廉，被美国食品药品管理局(FDA)列为安全等级，并被欧洲联盟列为安全的食品添加剂(E1105)。溶菌酶已广泛用于抗菌剂、创伤敷料和蛋白质分离。因此，基于溶菌酶的抗菌材料的开发对于制备环境友好的抗菌材料非常重要。
综上所述，现有技术存在的问题是：丝胶是一种良好的蛋白质资源，但无定形结构使其具有物理脆性和高溶解性，如开发其在生物医学材料的应用潜能，需对其进行改性；琼脂糖具有良好的机械性能和生物相容性，但其细胞粘附和增殖活性较低；水凝胶可以为感染性细菌提供一个有利的生长环境，故作为创伤敷料材料也不可能；已开发的金属/金属氧化物等抗菌材料，在生产和使用过程中可能对生态系统产生不利影响。
解决上述技术问题的难度和意义：
一种可替代的创伤敷料，需具备的特征有：具有为细胞生长和增殖提供足够的空间，可以促进生物活性分子的释放，且允许气体交换的多孔结构；具有良好的吸附伤口渗出液的能力；具有保持创伤界面必要的水分，最大程度减轻揭除敷料造成的二次伤害；具有抗细菌感染的能力；具有无毒性、无致敏性及良好的细胞相容性。为解决以上问题，我们提出的策略是将丝胶、琼脂糖和溶菌酶的先天优势结合起来，开发一种具有交联互通结构、多孔性、高溶胀率的丝胶/琼脂糖复合凝胶，进一步制成具有良好抗菌活性和细胞相容性的丝胶/琼脂糖/溶菌酶复合凝胶。
丝胶在纺织工业的脱胶过程中常作为废弃物被丢弃，本发明可以拓展丝胶在生物医学领域的应用，对于促进蚕丝的多元化利用和蚕丝产业的转型升级具有积极的作用。溶菌酶最大的优点是无毒性、无耐药性，生物相容性好，对人体和环境安全。本发明开发的复合凝胶具有良好的抗菌活性和细胞相容性，在生物医学材料如创伤敷料领域具有巨大的应用潜力。本发明方法步骤简单，绿色环保，且成本低廉，具有重要的研究价值，可能会产生重要的经济效益。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种负载溶菌酶的丝胶/琼脂糖凝胶及其制备方法和应用。
本发明是这样实现的，一种负载溶菌酶的丝胶/琼脂糖凝胶，所述负载溶菌酶的丝胶/琼脂糖凝胶由浓度均为2％的丝胶和琼脂糖溶液(w/v)按不同的体积比共混后冷冻干燥，将获取的凝胶在不同浓度的溶菌酶(20-75mg/mL)溶液中浸泡16h后冷冻干燥制成。
本发明的另一目的在于提供一种所述负载溶菌酶的丝胶/琼脂糖凝胶的制备方法，所述负载溶菌酶的丝胶/琼脂糖凝胶的制备方法包括以下步骤：
步骤一，将蚕茧剪成碎片，121℃高温高压30min，将丝胶提取到水中；然后将丝胶溶液冻干制成丝胶粉保存，将丝胶粉溶解在热水中得到丝胶溶液；
步骤二，分别取2％的丝胶和琼脂糖溶液(w/v)用于水凝胶的制备，将两种溶液轻轻混合，加入24孔细胞培养板后进行凝胶化；
步骤三，将稳定的水凝胶于-80℃预冻12h后，冷冻干燥24h成为丝胶/琼脂糖凝胶。
步骤四，将丝胶/琼脂糖凝胶浸入不同浓度的溶菌酶溶液(20-75mg/mL)中16小时，随后取出复合凝胶冷冻干燥，制成装载溶菌酶的丝胶/琼脂糖凝胶。
本发明的另一目的在于提供一种由所述负载溶菌酶的丝胶/琼脂糖凝胶制备的创伤敷料。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：丝胶由于具有显著的生物可降解性、生物相容性、亲水性和反应活性，是一种非常有前途的生物材料资源。本发明制备一种具有高吸水性、抗菌性和无细胞毒性的创伤敷料，有利于减少伤口感染，促进创伤愈合。本发明通过溶液共混和冷冻干燥法将丝胶和琼脂糖共混制成互穿网络聚合物凝胶；测定了丝胶/琼脂糖凝胶的表面形态、孔隙率、溶胀能力、结晶度、二级结构、热稳定性等理化性质；采用绿色的溶液浸渍法成功制备了溶菌酶负载的丝胶/琼脂糖复合生物材料。为了评价所制备的溶菌酶/丝胶/琼脂糖凝胶在创伤敷料中的应用潜力，测试了凝胶的溶菌酶装载与释放、抗菌活性和细胞毒性。结果表明，所制备的溶菌酶共混凝胶孔隙率高，吸水性能好，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有良好的抗菌活性。此外，溶菌酶共混凝胶对NIH3T3细胞和HEK293细胞具有良好的细胞相容性。因此，具有良好的抗菌活性和细胞相容性的多功能凝胶是一个很好的创伤敷料替代材料。
附图说明
图1是本发明实施例提供的负载溶菌酶的丝胶/琼脂糖凝胶的制备方法流程图。
图2是本发明实施例提供的制备SS/AR/LZM凝胶的示意图。
图3是本发明实施例提供的S75A25(A)、S50A50(B)、S25A75(C)和S0A100(D)凝胶的多孔微观结构；不同组分的凝胶的孔隙率(E)。
图4是本发明实施例提供的SS/AR凝胶的特征：(A)ATR-FTIR；(B)XRD；(C)TGA；(D)溶胀比。
图5是本发明实施例提供的体外溶菌酶的加载和释放：溶菌酶含量(A)，装载效率(B)，UV强度与溶菌酶浓度的标准曲线(C)和累积释放速率(D)。
图6是本发明实施例提供的SS/AR/LZM凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性测试：(A)细菌菌落总数；(B-C)细菌减少率。
图7是本发明实施例提供的混合凝胶的CCK-8测定细胞相容性，NIH3T3(A)和HEK293(B)的细胞活力；NIH3T3和HEK293细胞显微图像(C，比例尺，200μm)。
图8是本发明实施例提供的LIVE/DEAD染色测定细胞相容性：NIH3T3细胞(A，比例尺，200μm)和HEK293细胞(B，比例尺，100μm)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明制备了装载溶菌酶(LZM)的丝胶/琼脂糖(SS/AR)凝胶。通过扫描电子显微镜(SEM)、衰减全反射傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)、X射线衍射(XRD)、热重分析(TGA)和溶胀性能测试对SS/AR凝胶的理化性质进行表征。采用溶液浸渍法成功制备负载溶菌酶的复合材料。利用典型革兰氏阴性菌大肠杆菌(E.coli)和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(S.aureus)对丝胶/琼脂糖/溶菌酶凝胶(SS/AR/LZM)的抗菌活性进行评价。此外，还利用NIH3T3和HEK293细胞对SS/AR/LZM凝胶的细胞毒性进行评价。结果表明，SS/AR/LZM凝胶具有良好的抗菌活性和生物相容性，具有可替代的创伤敷料的应用潜能。
本发明实施例提供的负载溶菌酶的丝胶/琼脂糖凝胶由浓度均为2％的丝胶和琼脂糖溶液(w/v)共混后冷冻干燥，随后在不同浓度的溶菌酶溶液中浸泡后冻干制成。
如图1所示，本发明实施例提供的负载溶菌酶的丝胶/琼脂糖凝胶的制备方法包括以下步骤：
S101：将蚕茧剪成碎片，121℃高温高压30min，将丝胶提取到水中；然后将丝胶溶液冻干制成丝胶粉保存，将丝胶粉溶解在热水中得到丝胶溶液；
S102：分别取2％的丝胶和琼脂糖溶液(w/v)用于水凝胶的制备，将两种溶液轻轻混合，加入24孔细胞培养板后进行凝胶化；
S103：将稳定的水凝胶于-80℃预冻12h后，冷冻干燥24h成为丝胶/琼脂糖凝胶。
S104：将丝胶/琼脂糖凝胶浸入不同浓度的溶菌酶溶液(20-75mg/mL)中16小时，随后取出复合凝胶冷冻干燥，制成装载溶菌酶的丝胶/琼脂糖凝胶。
下面结合试验对本发明的应用原理作进一步的描述。
1材料与方法
1.1材料
家蚕蚕茧由西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室提供，溶菌酶(来源于鸡蛋清、20000U/mg)购买于生工生物技术有限公司，琼脂糖(BiowestG-10)购自Baygene生物技术有限公司，CellCountingKit-8(CCK-8)购买于碧云天，LIVE/DEAD活力/细胞毒性试剂盒购买于赛默飞公司，NIH3T3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)和HEK293(人胚肾细胞系)来自中国基础设施的细胞株资源。用于细胞培养的DMEM培养基，胎牛血清(FBS)，含EDTA的胰酶和青霉素/链霉素购买于Gibco公司。所使用的其他化学品均为分析级。
1.2凝胶的制备
将蚕茧剪成碎片，121℃高温高压30min，将丝胶提取到水中。然后将丝胶溶液冻干制成丝胶粉，丝胶粉可在热水中重新溶解。取浓度均为2％的丝胶和琼脂糖溶液(w/v)用于水凝胶的制备，将两种溶液轻轻混合，加入24孔细胞培养板后进行凝胶化。然后将这些稳定的水凝胶于-80℃预冻12h后，冷冻干燥24h成为凝胶。根据丝胶和琼脂糖体积比，相应的SS/AR凝胶被命名为S100A0、S75A25、S50A50、S25A75和S0A100。
1.3凝胶的表征
利用工作电压25kV的扫描电镜JSM-5610LV观察凝胶的表面形貌结构。用液相位移法计算了凝胶的孔隙率。简单地说，在一个有刻度的量筒中，将凝胶浸泡在已知体积(V1)的水中，水和凝胶的总体积记为V2。然后，从量筒中取出凝胶，剩余水量体积记为V3。用下面的公式计算凝胶的孔隙率(p)：p＝(V1-V3)/(V2-V3)×100％。
用分辨率为4cm-1的红外光谱仪Nicoletiz10确定丝胶和SS/AR凝胶在4000-650cm-1波数的ATR-FTIR光谱。用X射线衍射仪测定丝胶和SS/AR凝胶在2θ角度10-70°范围的XRD光谱。通过热重分析仪TGA-Q50测定丝胶和SS/AR凝胶的热稳定性，试样在室温下加热至600℃，氮气流20mL/min，升温速率为10℃/min。
1.4溶胀行为
用常规重量法测量凝胶的溶胀性能。简单地说，一个预称重(WD)的干凝胶浸泡在37℃的水中，直到达到平衡。在特定的时间间隔，凝胶被取出，其溶胀重量被记录为WS。实验在相同条件下重复三次。溶胀率(S)用下面的公式确定：S＝(WS-WD)/WD×100％。
1.5SS/AR/LZM凝胶的制备
为了制备溶菌酶加载的SS/AR凝胶，本发明不添加化学物质，采用绿色简单的溶液浸泡方法。将直径为1.5cm的S50A50圆片浸入溶菌酶溶液(20-75mg/mL)中吸收16小时后取出。将装载有SS/AR的溶菌酶凝胶冷冻干燥并命名为S50A50L20、S50A50L50或S50A50L75。溶菌酶在280nm处有紫外吸收，可作为测量溶菌酶加载和释放浓度的指标。取出未吸收的溶菌酶溶液用紫外可见分光光度计测定，计算S50A50L20和S50A50L50凝胶中溶菌酶的含量，并计算其装载效率。
1.6溶菌酶释放试验
用紫外可见分光光度计测定SS/AR/LZM凝胶的溶菌酶释放。将一个直径为1.5cm的圆形SS/AR/LZM凝胶加入到包含有4mL的0.01MPBS(pH7.4)缓冲液的离心管中，置于37℃，在特定的时间点，取PBS缓冲液(1mL)测定其280nm处的吸光度。将凝胶转至4mL新鲜的PBS溶液中进行下一次测量。计算溶菌酶的释放量和累积释放率。制备不同浓度(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6mg/mL)的溶菌酶溶液用于绘制标准曲线。所有实验均重复三次。
1.7体外抗菌试验
将SS/AR和SS/AR/LZM凝胶制备成直径1.5cm，厚1mm的圆片，随后经紫外光辐射灭菌30min。将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌于37℃在LB培养基中震荡培养至OD600约1.5。取500μL菌液1000转离心5min，然后用0.01MPBS缓冲液(pH7.4)漂洗。随后，用PBS缓冲液悬浮和稀释细菌。接下来，取50μL稀释后的菌悬液与SS/AR凝胶或SS/AR/LZM凝胶于37℃共培养2小时。随后，取出1μL的混合液，在PBS里稀释(1:10000)，然后手动涂布在琼脂平板表面。37℃培养16h后，在每个琼脂平板上统计形成的菌落数，从而评估SS/AR/LZM凝胶的抗菌能力。每个独立实验重复三次。
1.8细胞毒性试验
将NIH3T3和HEK293细胞常规培养于含10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素的高糖DMEM培养基中，湿度95％、温度37℃，CO2浓度5％。取100μL细胞密度为1×104/cm2的NIH3T3和HEK293细胞，分别装在96孔细胞培养板于37℃孵育12h。SS/AR和SS/AR/LZM凝胶被紫外线辐射过夜消毒后加入到细胞培养板中，以未处理的细胞作为对照。
根据CCK-8试剂盒使用说明，在96孔板中测定添加复合凝胶后12h、24h和36h的细胞活力。取CCK-8溶液(10μL)加入每个孔，复合液在37℃培养箱孵育1.5小时后，用酶标仪TECAN测定每孔溶液在450nm处的光密度(OD450)。细胞存活率定义为对照组与实验组OD450值的百分比。对每一个实验，至少有三个样本进行了重复测试。在SS/AR和SS/AR/LZM复合凝胶加入24小时孵育后，用荧光显微镜EVOSFL自动细胞成像系统观察NIH3T3细胞和HEK293细胞的形态。
此外，利用死活细胞染色实验，进一步研究共混凝胶对细胞活力的影响。在37℃培养NIH3T3和HEK293细胞，然后加入SS/AR和SS/AR/LZM凝胶继续培养24h，按试剂说明加入染色溶液在37℃孵育15min，用荧光显微镜EVOS FL自动细胞成像系统对细胞形态进行观察并拍照。每个样品的实验重复三次。
2结果
2.1SS/AR/LZM凝胶的制备
我们制备了一种新型的具有良好抗菌活性和细胞相容性的SS/AR/LZM凝胶，如图2所示。本发明将丝胶和琼脂糖的混合物冻干得到多孔凝胶。随后，采用绿色、简单的溶液浸泡法在共混凝胶中载入天然抗菌剂溶菌酶，这种绿色的制备方法对创伤敷料至关重要。由于丝胶是带负电的，琼脂糖是中性的，而溶菌酶是带正电的，因此溶菌酶在凝胶中的吸附可能是通过丝胶和溶菌酶的相反电荷之间的静电作用。此外，自由扩散引起的物理吸附也可能促进溶菌酶的吸附。溶菌酶具有羧基、氨基和四个二硫键，丝胶具有羟基、羧基和氨基。溶菌酶与丝胶的特殊亲水/疏水相互作用同样能促进溶菌酶的吸附。由此产生的SS/AR/LZM凝胶具有多孔结构、高溶胀性、良好的抗菌活性和细胞相容性，是一种具有潜力的创伤敷料替代物。
2.2凝胶的形态
多孔材料提供了细胞生长和增殖的空间，以及生物活性分子保持和释放的微环境。此外，多孔结构会影响营养和氧气的供应以及废物的清除，这对创伤敷料至关重要。在本研究中，制备的凝胶具有多孔的“开放细胞”结构(图3A-D)。S75A25、S50A50、S25A75和S0A100凝胶的孔隙率分别为53.17％、49.54％、46.17％和59.75％(图3E)。相比其他的凝胶，凝胶S50A50和S25A75具有更大的孔径。这可能是因为，S50A50和S25A75凝胶能吸附更多的水分子，冷冻干燥后，占用的水空间导致了孔隙的形成。因此，凝胶的孔径大小和孔隙率主要取决于丝胶和琼脂糖溶液的比例。
2.3凝胶的表征
利用ATR-FTIR分析了丝胶和琼脂糖之间的化学相互作用。丝胶的特征峰体现在1700-1600cm-1(酰胺Ⅰ，C＝O伸缩振动)，1575-1480cm-1(酰胺Ⅱ、N-H弯曲振动带)和1301-1229cm-1(酰胺Ⅲ)。如图4A所示，丝胶凝胶的特征峰在1621cm-1、1521cm-1和1521cm-1，分别对应酰胺Ⅰ、Ⅱ和酰胺Ⅲ键。纯琼脂糖的特征峰位于1068cm-1(C-O，轴向变形)，930cm-1(3，6-脱水半乳糖)，和891cm-1(C-H，对β异头碳角变形)，结果与以前的研究一致。共混凝胶记录了琼脂糖和丝胶的特征峰，证实了共混凝胶的形成和两种组分的存在。在共混物中，酰胺Ⅰ和Ⅱ的峰略有变化，峰的强度不同，说明共混物的主链结构在反应过程中并没有发生变化。
此外，采用ATR-FTIR分析来确认溶菌酶的存在。溶菌酶在3295cm-1(游离氨基的N-H拉伸)和2961cm-1(C-H拉伸)具有红外特征吸收峰。此外，它还有三个特征峰，包括酰胺Ⅰ(1700-1600cm-1)，酰胺Ⅱ(1600-1500cm-1)和酰胺Ⅲ(1320-1230cm-1)。在本发明中，发现这几个峰与丝胶的特征峰重叠。
用XRD分析了复合材料的结晶结构。蚕丝蛋白的主要衍射峰是SilkⅠ(2θ＝12.2°和28.2°)和SilkⅡ(2θ＝18.9°和20.7°)。相似的丝胶XRD吸收峰在2θ＝19.2°和21.15°被观察到。丝胶和SS/AR凝胶分别在19.08°和19.56°表现出明显的衍射峰(图3B)。这证明了丝胶成分明显存在于SS/AR混合凝胶中。加入AR后，SS/AR和丝胶的衍射峰几乎相同。二者特征峰的差异表明SS/AR中丝胶氨基酸的羟基之间可能发生了分子间氢键作用，从而诱导其由无规卷曲结构转变为β折叠结构。
用热重法分析丝胶和复合凝胶的热稳定性。丝胶和复合凝胶的TGA光谱经历了脱水、解聚和分解三个阶段。第一阶段从室温到110℃左右，质量损失主要为丝胶和复合凝胶中吸附水分子的蒸发。第二个分解阶段归因于丝胶和琼脂糖熔化的降解，发生在120-410℃之间。在这个阶段，SS/AR凝胶失重比丝胶更快，这表明丝胶在共混物的热稳定性中发挥了重要作用，延缓了热降解过程。最后一个阶段，从420℃至600℃，样品的质量损失趋于缓和，这与丝胶和琼脂糖的分解有关。
2.4溶胀行为
溶胀率是创伤敷料液体吸收的一个重要特性。因此，溶胀率是评价凝胶溶胀性能的重要特征。图4D显示了在水中浸泡不同时间后各种凝胶的溶胀率。60min后，S75A25和S0A100凝胶的溶胀率为3628-4196％，而S50A50和S25A75为3040-3262％。相比S50A50和S25A75凝胶，S75A25和S0A100凝胶具有较高的吸水能力，因为其具有较小的孔径和较高的孔隙率。凝胶的溶胀行为表现为增长期和相对稳定期两个阶段。在最初的20min内，所有样品的溶胀率都有显著的增加，显示了复合凝胶极好的亲水性。此外，在20至60min内，所有的凝胶迅速达到溶胀平衡，水凝胶的吸水能力保持稳定，表明吸水达到饱和状态。
不同比例的复合凝胶具有蜂窝状结构，孔隙率高，溶胀性能好。本研究将丝胶与琼脂糖的先天优势结合起来，开发出一种可替代的创伤敷料。丝胶含量过高会降低凝胶的力学性能，高含量的琼脂糖可能会影响细胞的黏附和增殖。SS/AR凝胶50:50比例(S50A50)有适中的力学性能和生物相容性，可适用于创伤敷料。因此，我们建议S50A50凝胶选作进一步的实验。
2.5溶菌酶释放
为了避免频繁更换敷料，减少创面暴露于细菌的风险，创伤敷料应具有保持药物缓释的性能。为了评价药物的装载和释放，本发明用标准曲线分析溶菌酶浓度与紫外吸收的相关性。结果表明，紫外吸收与溶菌酶含量密切相关(图5C)。通过计算，S50A50L20和S50A50L50凝胶装载的溶菌酶含量分别为24.94mg和50.78mg(图5A)。此外，S50A50L20和S50A50L50凝胶对溶菌酶的装载效率分别为62％和51％(图5B)。增加溶菌酶溶液浓度可以增加复合凝胶中溶菌酶的装载量，但会影响其装载效率。我们的结果表明，溶菌酶可以从S50A50L20和S50A50L50凝胶中释放。溶菌酶的释放可分为快速释放期和稳定期(图5D)。在最初阶段，溶菌酶的释放速率相对较高，从开始到3小时，因为水分子的扩散和复合凝胶表面的溶菌酶因扩散作用而解吸附，SS/AR/LZM凝胶进入释放介质后迅速释放溶菌酶。在稳定阶段，溶菌酶从SS/AR/LZM凝胶中释放可持续至60h。S50A50L20和S50A50L50凝胶在3h时累积释放率分别达到74％和86％。此外，在60h的累积释放达到98％和99％，说明溶菌酶几乎完全从复合凝胶中释放。结果表明负载的溶菌酶可以从SS/AR/LZM凝胶中持续释放，这对于用作创伤敷料时的抗菌作用是有益的。
2.6抗菌活性
为证明SS/AR/LZM凝胶的抗菌效果，本发明测试了共混凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制能力。如图6A所示，由SS/AR/LZM凝胶处理后的总菌落数明显低于对照。S50A50L20和S50A50L50凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细菌减少率分别为76％/87％和84％/95％。S50A50L75凝胶完全抑制了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，这表明提高溶菌酶溶液的浓度可以增强复合凝胶的杀菌能力，因为它增加了装载和释放的溶菌酶量。
溶菌酶是一种天然抗菌剂，与无机和有机抗菌剂相比，其抗菌活性比较温和。为了提高溶菌酶的抗菌效果，拓宽其应用领域，近年来一些学者已通过物理化学改性或协同作用处理溶菌酶来增强其抗菌效果。在本发明的研究中，用于抗菌实验的SS/AR/LZM凝胶的直径为1.5cm，厚度为1mm。溶菌酶的直径和厚度决定了溶菌酶的负荷含量。此外，细菌悬浮液体积对凝胶溶菌酶释放效率也有一定的影响。因此，SS/AR/LZM凝胶表现出了预期的抗菌效果；然而，溶菌酶的加载量和释放效率决定了其抗菌活性。
为了制备具有抗菌能力的创伤敷料，已有报道各种抗菌材料，如金属/金属氧化物等。然而，众所周知，这些材料可能对生态系统会产生不利的影响。纳米银粒子作为一种最经典、最重要的材料，在制备和使用过程中对环境和安全都造成了不良影响。此外，滥用抗生素导致了耐药病原体的出现。合成抗菌肽的生产成本较高。本发明开发的SS/AR/LZM材料具有无毒副作用、无耐药性，具有良好的细胞相容性。溶菌酶基材料的主要优点是对人体和环境安全，在生物医学材料如创伤敷料方面具有巨大的潜力。
2.7细胞相容性试验
为评价SS/AR和SS/AR/LZM凝胶的细胞相容性，本发明测试了SS/AR和SS/AR/LZM凝胶对NIH3T3细胞和HEK293细胞的影响。在CCK-8实验中，代谢活跃的细胞与CCK-8试剂中的四氮唑盐(WST-8)反应，产生的可溶性染料在波长450nm处具有最大吸收。而且光密度越高，代表细胞存活率越高，活细胞越多。如图7A-B所示，培养12h后，在SS/AR和SS/AR/LZM混合凝胶培养的细胞和空白对照组没有显著差异。培养后24小时，SS/AR、SS/AR/LZM和对照组的细胞活力都增加。培养36h后，各实验组细胞表现出显着高于24h的活性。结果显示共混凝胶对NIH3T3细胞和HEK293细胞均表现出良好的细胞相容性。这可能是由于丝胶分子具有细胞保护和促细胞有丝分裂能力，进而具有促细胞生长的活性。此外，培养细胞24h后，对NIH3T3和HEK293细胞的形态通过光学显微镜进行观察。结果表明，处理组和对照组的细胞形态基本相同(图7C)，说明SS/AR和SS/AR/LZM共混凝胶对NIH3T3和HEK293细胞没有毒性。
利用死活细胞荧光染色后，活细胞呈绿色，凋亡细胞呈红色。在本发明中，显微镜结果显示，视野可见大量绿色的细胞，只有少数的红细胞(图8)，这再次证明了SS/AR和SS/AR/LZM凝胶对NIH3T3和HEK293细胞具有良好的细胞相容性。死活细胞染色的荧光图像与CCK-8检测结果一致。结果证明，SS/AR/LZM凝胶用于创伤敷料是安全的。
本发明采用溶液共混和冷冻干燥法成功制备了SS/AR/LZM复合凝胶。该凝胶具有多孔和交联的结构，溶胀性能良好。SS/AR/LZM凝胶具有可持续的溶菌酶释放能力和对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌良好的抗菌活性，以及对NIH3T3和HEK293细胞优良的生物相容性。SS/AR/LZM凝胶有望开发成为现有创伤敷料的替代品。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种负载溶菌酶的丝胶/琼脂糖凝胶，其特征在于，所述负载溶菌酶的丝胶/琼脂糖凝胶由2％的丝胶(w/v)和2％的琼脂糖溶液(w/v)混合所得。
2.一种如权利要求1所述负载溶菌酶的丝胶/琼脂糖凝胶的制备方法，其特征在于，所述负载溶菌酶的丝胶/琼脂糖凝胶的制备方法包括以下步骤：
步骤一，将蚕茧剪成碎片，121℃高温高压30min，将丝胶提取到水中；然后将丝胶溶液冻干制成丝胶粉保存，将丝胶粉溶解在热水中得到丝胶溶液；
步骤二，分别取2％的丝胶和琼脂糖溶液(w/v)用于水凝胶的制备，将两种溶液轻轻混合，加入24孔细胞培养板后进行凝胶化；
步骤三，将稳定的水凝胶于-80℃预冻12h后，冷冻干燥24h成为丝胶/琼脂糖凝胶；
步骤四，将丝胶/琼脂糖凝胶浸入不同浓度的溶菌酶溶液(20-75mg/mL)中16小时，随后取出复合凝胶冷冻干燥，制成装载溶菌酶的丝胶/琼脂糖凝胶。
3.一种由权利要求1所述负载溶菌酶的丝胶/琼脂糖凝胶制备的创伤敷料。
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