CN108676769A - 一种促进肝细胞生长的无纺布支架材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种促进肝细胞生长的无纺布支架材料及其制备方法，该无纺布支架材料包含0.1～1.5wt％的促肝细胞生长素。它是通过静电纺丝技术制备获得的。本发明操作简便，生产条件温和，易于工业化生产，所制备的纳米纤维无纺布，采用的是明胶作为主要载体，明胶生物相容性优异，所得无纺布最大程度模仿天然细胞外基质，使肝细胞在生物材料上生长的微环境和体内相差无异。本发明制备的纳米纤维无纺布采用促肝细胞生长素改性，促肝细胞生长素促进了肝细胞在无纺布上的粘附、生长和增殖。在增加了硝酸纤维素之后，本发明的无纺布，纤维分布均匀，且纤维丝粗细更加一致，能够较大的改进无纺布的均一性，使肝细胞在无纺布上的生长分布更均匀。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体地指一种促进肝细胞生长的无纺布支架材料及其制备方法。
背景技术
生物反应器是生物人工肝的核心部件，为肝细胞提供生长和代谢的场所，生物反应器中，肝细胞直接生长在生物相容性优异的载体材料上面。现有的肝细胞体外培养采用的载体多样，如中空纤维、凝胶，聚合物微囊膜等等，但是存在各种缺陷，如凝胶培养的细胞数额有限不利于工业化生产，中空纤维培养的细胞易分布不均，细胞团块易堵塞半透膜孔隙影响物质交换；微囊培养细胞长势不佳等。
无纺布又称不织布，是由定向的或随机的纤维而构成，广泛应用于医疗技术领域。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的供肝细胞体外培养用的促进肝细胞生长的无纺布支架材料，具有比表面积大、孔隙率高的特点，与细胞外基质的组成和结构非常相似，可作为肝细胞生长的组织工程支架材料。
为实现上述目的，本发明所设计的促进肝细胞生长的无纺布支架材料，包含0.1～1.5wt％的促肝细胞生长素。
优选地，所述无纺布支架材料还包含0.1～0.5wt％的硝酸纤维素。
优选地，所述无纺布支架材料还包含0.1～0.5wt％的聚氧化乙烯。在制备无纺布的静电纺丝过程中增加聚氧化乙烯可以提高其可纺性。
本发明还提供了一种上述促进肝细胞生长的无纺布支架材料的制备方法，其步骤如下：
1)在明胶溶液中加入聚氧化乙烯、促肝细胞生长素，明胶溶液的终浓度为5～15wt％，促肝细胞生长素的终浓度为0.1～1.5wt％，获得静电纺丝液；
2)利用静电纺丝液进行静电纺丝，设定静电纺丝参数，电压5～20kv，静电纺丝液流速0.5～2mL/h，正负极间接收距离5～20cm，收集无纺布；
3)对收集的无纺布进行戊二醛蒸汽交联处理，获得所述促进肝细胞生长的无纺布支架材料。
优选地，所述步骤1)在明胶溶液中还添加有0.1～0.5wt％的硝酸纤维素。
优选地，所述步骤1)在明胶溶液中还添加有0.1～0.5wt％的聚氧化乙烯。
可选地，所述戊二醛蒸汽交联处理时采用的戊二醛是体积百分比25％的戊二醛水溶液。
可选地，所述戊二醛蒸汽交联处理的时间为0.5～24小时。
本发明的有益效果：
1)本发明操作简便，生产条件温和，易于工业化生产。
2)本发明制备的纳米纤维无纺布，采用的是明胶作为主要载体，明胶生物相容性优异，采用静电纺丝技术制备，所得无纺布最大程度模仿天然细胞外基质，使肝细胞在生物材料上生长的微环境和体内相差无异。
3)本发明制备的纳米纤维无纺布采用促肝细胞生长素改性，促肝细胞生长素促进了肝细胞在无纺布上的粘附、生长和增殖。
4)在增加了硝酸纤维素之后，本发明的无纺布，纤维分布均匀，且纤维丝粗细更加一致，能够较大的改进无纺布的均一性，使肝细胞在无纺布上的生长分布更均匀。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
以下实施例中采用的促肝细胞生长素是从新鲜乳猪肝脏中提取分离纯化制备而成的多肽类活性物质，具体来说为pHGF，它来源于人类和哺乳类动物的胚胎肝和再生肝，正常成年肝脏和身体其他组织都未检测出pHGF活性。研究结果证明pHGF是一种小分子量蛋白多肽类物质，在紫外扫描图谱中存在两个吸收峰，分别为200nm及260nm左右，在紫外280nm检测波长下的反相高效液相色谱分析图中有6.7个组分峰，和LaBreeque报道的物质相似：梁登等对牛肝细胞再生刺激因子(eHSS)的研究发现至少含有13种游离氨基酸，其中6种为必须氨基酸；张宜俊等测定肝细胞生长素(HGF)制剂中含有18种游离氨基酸；姚志强测定纯化人胎肝pHGF由16种氨基酸组成，含量最高者为甘氨酸，最低者为酪氨酸：侯淦泉测定胎牛肝再生因子中含有17种游离氨基酸。pHGF不属于糖蛋白，耐热(95℃，15min不失活)，易溶于0.9％NaCl，可被乙醇沉淀，在pH2～9范围内稳定，pH值低于2时失活，pHGF水溶液在室温很快失活。
应该理解的是，其他能够促进肝细胞体外生长的活性物质都可以作为促肝细胞生长素应用于本发明。
实施例促进肝细胞生长的无纺布支架材料的制备方法
利用静电纺丝技术制备促进肝细胞生长的无纺布支架材料，步骤如下：
1、配制质量分数为5～15wt％的明胶溶液，搅拌后备用
2、在明胶溶液中加入聚氧化乙烯(PEO)，聚氧化乙烯的质量分数为0.1～0.5wt％。
3、在明胶溶液中加入促肝细胞生长素及硝酸纤维素，促肝细胞生长素的添加量为0.1～1.5wt％，硝酸纤维素添加量为0.1～0.5wt％。
4、将上述由明胶、聚氧化乙烯、促肝细胞生长素组成的共混液作为静电纺丝液
5、将上述静电纺丝液注入静电纺丝机的微量进样器中
6、设定静电纺丝参数，电压5～20kv，纺丝液流速0.5～2mL/h，正负极间接收距离5～20cm。
7、启动静电纺丝机，一段时间后收集负极接收板上的无纺布
8、对所得无纺布进行25％戊二醛蒸汽交联处理
9、上述戊二醛蒸汽交联处理时间为0.5h～24h，得到无纺布支架材料。
试验例1
按照实施例的方法，制备一组促进肝细胞生长的无纺布支架材料(无硝酸纤维素)，其中促肝细胞生长素质量分数的添加量分别为0、0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％、1wt％、1.1wt％、1.2wt％、1.3wt％、1.5wt％，并且不添加硝酸纤维素，编号样品0～15。
样品1～15的无纺布裁剪成3mmx3mm的大小，使其浸泡于生理盐水中，完全浸湿后放入96孔板中，待其在无菌环境中干燥，同时做好标记，备用。将含有不同含量生长因子的无纺布的96孔板分别与加入同等数量的细胞进行培养，同时设置两组空白对照试验一起，一组空白对照试验只单独培养细胞，无细胞因子和无纺布(标记为对照组1)，另一组空白对照试验只有无纺布，无细胞培养(标记为对照组2)。实验组和对照组一共18组，且每组至少做6次重复试验，每次试验的细胞数量及培养基数量一致。培养3天，所有实验的培养液配方完全相同，观察每天的细胞状态，待第三天后测OD值。
通过观察，发现含有无纺布的实验组细胞贴壁时间比对照组的要早，5小时左右即可贴壁，而对照组则需要6～8小时，12h后镜下观察各组细胞未肉眼可见差别，24h观察细胞，发现含有质量分数0.7～1.5wt％的生长因子的无纺布上细胞明显较0～0.6wt％生长因子及空白对照组多，48h后更加明显，即0.3～1.5wt％的生长因子的无纺布上细胞明显较0～0.2wt％生长因子及空白对照组多，72h观察所有添加生长因子的无纺布上细胞都明显高于0wt％及空白对照组，并同时用台酚蓝染色，检测OD值，将每组每次试验结果汇总处理后如下：
表1.促肝细胞生长素对肝细胞生长的影响
将实验组分别减去对照组2中的OD值后，在于对照组1中的OD值进行比较，可以发现，随着生长因子的加入，细胞生长明显，并且，生长因子浓度与细胞数量成正相关，但是到了生长因子浓度10wt％之后则没有相关性。
试验例2
1)选取试验例1中表现较佳的无纺布支架材料样品10和14，与样品10同等成分仅增加0.1wt％硝化纤维素的纤维素样10，与样品14同等成分仅增加0.3wt％硝化纤维素的纤维素样14，将添加了纤维素和缺少纤维素的进行理化性质对比，在高倍显微镜下观察纤维形貌，每张照片用Photoshop图形处理软件随机测量50根纤维直径，取平均值，统计数据如下：
表2.促硝化纤维素对无纺布性质的影响
| 检测品 | 是否添加添加硝化纤维素 | 直径(nm) |
| 样品10 | 无 | 813±368 |
| 纤维素样10 | 有 | 752±126 |
| 样品14 | 无 | 835±393 |
| 纤维素样14 | 有 | 723±112 |
实验结果表明，添加纤维纤维素后，无纺布纤维直径分布更均匀，且纤维丝粗细更加一致，能够较大的改进无纺布的均一性。
试验例3
将试验例2中的样品10、样品14、纤维素样10、纤维素样14分成4组进行肝细胞培养实验，每组至少做6次重复实验，将以上两种无纺布分别减成1cmx1cm灭菌处理后放入12孔板，每孔加入相同完全培养基及相等数量的肝细胞，统一培养三天，显微镜观察细胞生长状态。8小时后镜下观察，两组细胞已经贴壁。24小时后镜下观察到两组细胞已经呈正常肝细胞形态。
48小时后镜下观察，可发现添加硝化纤维素无纺布组细胞密度分布较另一组更均匀。
72小时后将12孔板用PBS轻轻清洗两遍，用无菌镊子轻取出无纺布，分别放在干净玻璃片上用台酚蓝染色，镜下观察发现添加硝化纤维素无纺布组较另一组细胞染色更均匀，细胞状态更好。同时将其12孔板用台酚蓝染色，镜下观察发现添加纤维素无纺布组未有细胞，而无添加硝化纤维素无纺布组有少量细胞留在孔板内。
以上结果表明：添加硝化纤维素的无纺布较未添加硝化纤维素的无纺布上细胞生长更密集，密度更均匀。
Claims (8)
1.一种促进肝细胞生长的无纺布支架材料，其特征在于，该无纺布支架材料包含0.1～1.5wt％的促肝细胞生长素。
2.根据权利要求1所述促进肝细胞生长的无纺布支架材料，其特征在于：所述无纺布支架材料还包含0.1～0.5wt％的硝酸纤维素。
3.根据权利要求1所述促进肝细胞生长的无纺布支架材料，其特征在于：所述无纺布支架材料还包含0.1～0.5wt％的聚氧化乙烯。
4.权利要求1所述促进肝细胞生长的无纺布支架材料的制备方法，其步骤如下：
1)在明胶溶液中加入聚氧化乙烯、促肝细胞生长素，明胶溶液的终浓度为5～15wt％，促肝细胞生长素的终浓度为0.1～1.5wt％，获得静电纺丝液；
2)利用静电纺丝液进行静电纺丝，设定静电纺丝参数，电压5～20kv，静电纺丝液流速0.5～2mL/h，正负极间接收距离5～20cm，收集无纺布；
3)对收集的无纺布进行戊二醛蒸汽交联处理，获得所述促进肝细胞生长的无纺布支架材料。
5.根据权利要求4所述促进肝细胞生长的无纺布支架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤1)在明胶溶液中还添加有0.1～0.5wt％的硝酸纤维素。
6.根据权利要求4所述促进肝细胞生长的无纺布支架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤1)在明胶溶液中还添加有0.1～0.5wt％的聚氧化乙烯。
7.根据权利要求4或5或6所述促进肝细胞生长的无纺布支架材料的制备方法，其特征在于：所述戊二醛蒸汽交联处理时采用的戊二醛是体积百分比25％的戊二醛水溶液。
8.根据权利要求4或5或6所述促进肝细胞生长的无纺布支架材料的制备方法，其特征在于：所述戊二醛蒸汽交联处理的时间为0.5～24小时。
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