CN113413488A - 一种可降解压电纤维支架的制备方法及其产品 - Google Patents
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- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
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Abstract
本发明属于医用材料制备技术领域,提供了一种可降解压电纤维支架的制备方法及其产品。可降解压电纤维支架的制备方法包括以下步骤:配制明胶溶液静电纺丝制备纤维膜干燥获得明胶纤维膜;将明胶纤维膜置于戊二醛饱和蒸汽中常温交联、干燥获得可降解压电纤维支架。本发明提供的制备方法,通过静电纺丝和化学交联的方式制备,方法简单,反应条件易于实现。本发明制备的可降解压电纤维膜支架能够以无线刺激方式诱导神经干细胞神经分化,在临床和神经组织工程中具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于医用材料制备技术领域,具体涉及一种可降解压电纤维支架的制备方法及其产品。
背景技术
成人神经系统在创伤性损伤或疾病后的自发更新修复是有限的,例如由脑血管病,脑肿瘤,脑外伤,帕金森病,脱髓鞘病等引起的神经功能障碍。目前的研究发现,将神经干细胞移植到病损或受伤的脑组织中,可能产生新的神经细胞,促进脑的再生修复。
神经干细胞(neural stem cells, NSCs)作为一种具有自我更新能力的多功能细胞,拥有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能,因此可以诱导神经干细胞分化为功能性细胞对脑损伤进行修复。近年来,神经干细胞移植在神经系统疾病的基础研究和临床应用中获得了一定的进展。有研究表明,细胞微环境中的生物电信号能够调节干细胞命运,促进神经系统的修复与再生。细胞微环境包括细胞间相互作用、可溶性生长因子、细胞外基质(extracellular matrices, ECM)等,可以提供信号来调控干细胞的活性、增殖和分化。工程支架用来模拟细胞微环境是调控NSCs增殖分化的重要因素之一。因此,选择一种具有优良生物相容性,可降解性以及能够提供电刺激信号的支架具有重要意义。
目前大部分研究主要采用导线外接电场产生电刺激信号诱导干细胞神经分化。但这种方式由于导线的连接容易引起创口感染,并且材料生物相容性较差且不可降解,从而引起机体的体内炎症以及排斥反应,很难应用于实际临床中。如,中国专利文献CN107778496A公开了一种掺杂有聚苯胺的高强导电水凝胶及其制备方法和应用,凝胶上包覆一层掺杂态聚苯胺形成导电水凝胶,通过外接电刺激干细胞分化,操作复杂,而且生物相容性和材料降解性均不甚理想,难以用于临床治疗。因此,如何开发利用一种更适用于临床应用的可降解自供电生物材料成为一个比较棘手的问题。
发明内容
针对目前导电水凝胶生物相容性和材料降解性差的问题,本发明提供一种可降解压电纤维支架,在超声波作用下产生的电刺激和支架自身的三维结构下能够对神经干细胞的神经分化产生促进作用。
本发明的另一目的在于,提供一种上述纤维支架的制备方法,通过静电纺丝和化学交联的方式制备,方法简单,反应条件易于实现。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案。
一种可降解压电纤维支架的制备方法,包括以下步骤:
(1)配制明胶溶液静电纺丝制备纤维膜干燥获得明胶纤维膜;
(2)将明胶纤维膜置于戊二醛饱和蒸汽中常温交联、干燥获得可降解压电纤维支架。
步骤(1)中,所述明胶溶液的浓度为10-30%w/v。
所述明胶溶液的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺和甲酸或六氟异丙醇的混合液。优选的,所述N,N-二甲基甲酰胺与甲酸或六氟异丙醇的体积比为1:9-4:6。
所述静电纺丝参数如下:针头内径为21G-24G,电压为1.5 kV/cm,接收器和针头距离为10-20cm。
步骤(1)中,所述干燥温度为40℃,时间为30 min。
步骤(2)中,交联时间为12h-24h。
一种上述制备方法获得的可降解压电纤维支架。
一种上述可降解压电纤维支架作为医用材料的用途。所述医用材料用于诱导间充质干细胞向神经细胞分化。
一种利用上述可降解压电纤维支架诱导神经干细胞分化的方法,包括以下步骤:将神经干细胞悬液接种于可降解压电纤维支架上,间歇超声处理下培养。
所述神经干细胞悬液的接种密度为1×105/mL。
所述超声处理为:超声功率400W,2次/天,间隔6h,每次8min。
本发明具有以下优点:
本发明提供了一种可降解压电纤维支架的制备方法,通过静电纺丝和化学交联的方式制备,方法简单,反应条件易于实现;当反应条件超出本发明的范围,如混合溶剂的比例、明胶浓度、纺丝参数、交联时间等,获得的纤维形貌发生变化、降解时间过短或过长,不符合临床要求。本发明制备所得支架安全、细胞毒性低,生物相容性好,表面形貌均一、具有较大的比表面积和合适的机械性能、适宜细胞贴附。而且在超声波作用下能够发生形变,产生极化现象,通过局部电刺激和支架自身的三维结构能够对神经干细胞的神经分化产生促进作用;该纤维支架可降解且降解周期符合神经干细胞分化周期。本发明的由明胶为原料制备的可降解压电纤维膜支架能够以无线刺激方式诱导神经干细胞神经分化,在临床和神经组织工程中具有重要意义。
附图说明
图1是交联后30%明胶纤维膜的SEM图谱;
图2是明胶纤维膜的PFM图;
图3是不同交联时间处理的膜3种神经细胞标志物mRNA相对含量图;
图4是神经干细胞在明胶膜上的活/死细胞染色图;
图5是不同可降解压电纤维支架降解率;
图6是不同培养条件下第3d、5d、7d时几种神经细胞标志物mRNA相对含量图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明,但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 可降解压电纤维支架的制备
(1)将明胶粉末溶解在N,N-二甲基甲酰胺:甲酸=1:9(v/v)的混合溶液中,配置质量分数为20%的明胶溶液;使用注射器吸取5mL左右的明胶溶液,插入规格为21G的针头,置于纺丝机中;设置纺丝参数:距离12cm,电压18kV。纺丝结束后,取下纤维膜置于40℃烘箱中干燥30分钟。纤维膜的SEM图如图1所示,由SEM图可看出,明胶纤维表面光滑粗细均匀,纤维丝直径在150nm左右。
(2)将明胶纤维膜置于戊二醛饱和蒸汽中,25℃交联24h,交联后取出置于通风橱通风30min挥发戊二醛并干燥,获得可降解压电纤维支架,纤维支架具有良好的压电性。
实施例2 可降解压电纤维支架的制备
(1)将明胶粉末溶解在N,N-二甲基甲酰胺:甲酸=4:6(v/v)的混合溶液中,配置质量分数为30%的明胶溶液;使用注射器吸取5mL左右的明胶溶液,插入规格为21G的针头,置于纺丝机中;设置纺丝参数:距离12cm,电压18kV。纺丝结束后,取下纤维膜置于40℃烘箱中干燥30分钟。纤维膜的SEM图如图1所示,由SEM图可看出,明胶纤维表面光滑粗细均匀,纤维丝直径在200nm-500nm之间。
(2)将明胶纤维膜置于戊二醛饱和蒸汽中,25℃交联24h,交联后取出置于通风橱通风30min挥发戊二醛并干燥,获得可降解压电纤维支架,其PFM图如图2所示:从图中可以看出,纤维支架具有良好的压电性。
实施例3 可降解压电纤维支架的制备
(1)将明胶粉末溶解在N,N-二甲基甲酰胺:甲酸=1:9(v/v)的混合溶液中,配置质量分数为30%的明胶溶液;使用注射器吸取5mL左右的明胶溶液,插入规格为21G的针头,置于纺丝机中;设置纺丝参数:距离12cm,电压18kV。纺丝结束后,取下纤维膜置于40℃烘箱中干燥30分钟。纤明胶纤维表面光滑粗细均匀,纤维丝直径在200nm左右。
(2)将明胶纤维膜置于戊二醛饱和蒸汽中,25℃交联24h,交联后取出置于通风橱通风30min挥发戊二醛并干燥,获得可降解压电纤维支架,纤维支架具有良好的压电性。
对比例1 压电纤维支架的制备
将明胶粉末溶解在N,N-二甲基甲酰胺:甲酸=5:5(v/v)的混合溶剂中,配置质量分数为20%的明胶溶液;使用注射器吸取5毫升左右的明胶溶液,插入规格为24G的针头,设置纺丝参数为:距离12cm,电压18kV,纺丝结束后,取下膜置于40℃烘箱中干燥30min,获得明胶纤维膜,在戊二醛饱和蒸汽中交联24h,其纤维表面所得样品纤维丝不均匀,且具有珠结丝,形成不连续的串珠或串珠纤维。所获得的薄膜与本发明方法制备的形貌差异较大。
实施例4 不同交联时间的可降解压电纤维支架对神经干细胞分化影响
采用实施例2中相同的方法分别制备交联12h、18h和24h的可降解压电纤维支架,与实施例1中制备的支架分别接种培养到第4代的小鼠胚胎神经干细胞单细胞悬液(1×105/mL),然后将细胞-支架复合材料置于24孔板中,37℃,5% CO2湿化培养箱中孵育48h;然后进行超声处理:功率400W,一天两次,每次8min,两次间隔6h。接种细胞7天后,对细胞-支架复合材料上的细胞裂解处理提取RNA,qPCR结果显示,超声处理接种在交联12,18,24小时后的明胶膜上的与接种在超声的TCP上的神经干细胞相比,第七天β微管蛋白Ⅲ(Tuj1)、微管蛋白2(MAP-2)和GFAP的含量皆有所提升且不同交联时间无明显差别(图3)。这表明,交联12,18,24h获得的支架对神经干细胞的分化无显著影响,戊二醛蒸汽交联时间并未显著影响神经干细胞向神经元分化。
实施例5 可降解压电纤维支架的生物相容性
(1)在紫外线照射下,依次采用75%酒精、PBS溶液浸没实施例1制备的可降解压电纤维支架进行灭菌处理,再浸泡于培养基中置于恒温37℃的培养箱备用;
(2)将培养到第4代的小鼠胚胎神经干细胞单细胞悬液密度为1×105个/mL,接种到可降解压电纤维支架上,然后将细胞-支架复合材料置于24孔板中,37℃,5% CO2湿化培养箱中孵育48h;然后进行超声处理:功率400W,一天两次,每次8min,两次间隔6h;
(3)培养至第2天后,对接种在材料上的细胞使用Live/Dead活死细胞试剂盒染色,直接对材料上的细胞进行染色,无需胰酶消化。评估材料的生物相容性,将培养基替换为200μL含有4μM碘化丙啶(PI)和24μM钙黄素(AM)的无血清α-MEM培养基,然后将细胞在培养箱中孵育20分钟,使用PBS溶液洗涤3次,然后使用激光共聚焦显微镜观察细胞活死状态。钙黄素(AM)激发和发射波长分别为490 nm和515 nm,碘化丙啶(PI)激发波长和发射波长分别为535 nm 和617nm。如图4所示,其中绿色的为活细胞,红色的为死细胞。从图3中可以看出,材料具有良好的生物相容性。
实施例6 可降解压电纤维支架的降解特性
将实施例1-3和对比例1中制备的可降解压电纤维支架膜以及实施例1中制备的明胶纤维膜分别切取5cm×5cm大小的样品,精确称重后放在培养皿中,加入PBS缓冲液(pH=7.2)并放置于37℃摇床培养箱中震荡,转速为100r/min。振荡7天后冷冻干燥并称重,计算降解率。实施例1-3和对比例1中的样品的7d降解率如图5所示:7天降解率在25-30%之间,符合神经干细胞的分化要求,当神经干分化成神经元时,支架降解三分之一左右,适于临床应用;而对比例1的支架降解率过高,超过35%,降解速度过快。
应用例1 可降解压电纤维支架在神经干细胞分化中的应用
(1)在紫外线照射下,依次采用75%酒精、PBS溶液浸没实施例1制备的可降解压电纤维支架和明胶纤维膜,进行灭菌处理,再浸泡于培养基中置于恒温37℃的培养箱备用;
(2)将培养到第4代的小鼠胚胎神经干细胞以神经增殖培养基培养基制成单细胞悬液,接种密度为1×105/ml接种到可降解压电纤维支架、明胶纤维膜和细胞爬片(TCP)上,然后将细胞-支架复合材料置于24孔板中,37℃,5% CO2湿化培养箱中孵育48h;然后进行超声处理:功率400W,一天两次,每次8min,两次间隔6h;同时设置无超声的对照。
接种细胞3,5,7天后,对接种到不同样品上的细胞裂解处理提RNA,对几种特定的神经标志物进行PCR扩增,结果如图6所示:在超声波400W作用下,可降解压电纤维膜能够有效促进神经干细胞向神经元分化,可显著促进NSCs向神经元(β微管蛋白III)、微管蛋白2和星形胶质细胞(GFAP)的分化,上调β微管蛋白Ⅲ、微管蛋白2和GFAP的表达,其分化效果远高于无超声波作用的样品以及超声波作用下的明胶纤维膜和TCP。
Claims (10)
1.一种可降解压电纤维支架的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)配制明胶溶液静电纺丝制备纤维膜干燥获得明胶纤维膜;
(2)将明胶纤维膜置于戊二醛饱和蒸汽中常温交联、干燥获得可降解压电纤维支架。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述明胶溶液的浓度为10-30%w/v;
所述明胶溶液的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺和甲酸或六氟异丙醇的混合液;所述N,N-二甲基甲酰胺与甲酸或六氟异丙醇的体积比为1:9-4:6。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,交联时间为12h-24h。
4. 根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述静电纺丝参数如下:针头内径为21G-24G,电压为1.5 kV/cm,接收器和针头距离为10-20cm。
5. 根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述干燥温度为40℃,时间为30 min。
6.一种如权利要求1-5任一所述制备方法获得的可降解压电纤维支架。
7.一种如权利要求6所述的可降解压电纤维支架作为医用材料的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述医用材料用于诱导间充质干细胞向神经细胞分化。
9.一种利用如权利要求6所述的可降解压电纤维支架诱导神经干细胞分化的方法,其特征在于,包括以下步骤:将神经干细胞悬液接种于可降解压电纤维支架上,间歇超声处理下培养。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述神经干细胞悬液的接种密度为1×105/mL;所述超声处理为:超声功率400W,2次/天,间隔6h,每次8min。
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GR01 | Patent grant | ||
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