CN113373595B - 一种FeOOH/PVDF纤维支架及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种FeOOH/PVDF纤维支架的制备方法：将PVDF粉末溶解在丙酮和N,N‑二甲基甲酰胺的混合溶剂中配置成PVDF溶液，然后静电纺丝获得纤维膜，然后烘干获得PVDF纤维膜；将六水合氯化铁和硝酸钠的混合溶液与PVDF纤维膜共同转入反应釜进行水热反应，产物经洗涤干燥获得FeOOH/PVDF纤维支架。上述制备方法获得的FeOOH/PVDF纤维支架中FeOOH为棒状，长约为800‑900nm，宽约为100nm，晶型为β型；负载于PVDF纤维表面。上述FeOOH/PVDF纤维支架可作为诱导间充质干细胞向神经细胞分化的医用材料。本发明利用静电纺丝技术和水热反应工艺设计并制备了FeOOH/PVDF纤维膜，制备方法简单，反应条件易于实现；所得支架表面形貌均一、具有良好的压电性，能够以无线刺激方式诱导rBMSCs神经分化。

Description

一种FeOOH/PVDF纤维支架及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种通过超声波作用下无导线电刺激诱导间充质干细胞定向分化为功能性神经细胞的FeOOH/PVDF纤维支架的制备方法及应用。
背景技术
人口老龄化、心血管和脑血管疾病以及交通事故导致的神经退行性疾病，已经成为日益严重威胁人类生命健康的问题。医学科学家和临床医生虽然付出了巨大的努力并取得了很大的进步，但是在临床应用上，神经修复和再生问题仍然面临着巨大的挑战。其中，主要问题是缺少足够的具有功能性的神经元。目前，一种有前途的方法是诱导神经干细胞分化成功能性神经元，以恢复神经系统的功能。然而，由于伦理、免疫原性以及神经干细胞来源问题，临床上很难使用他人或者自身的神经干细胞来治疗神经退行性疾病。因此，有必要探索一种新的治疗方法来获得神经退行性疾病治疗期间需要的足量功能性神经元。神经组织工程是基于生物医学、材料科学以及工程力学等学科交叉融合发展而来的新型学科，主要包括生物材料、种子细胞和生长因子三要素，有望克服神经系统组织修复的难题。
在组织工程的发展探索过程中，研究人员发现细胞外基质环境中的生物电能够调节干细胞命运，促进神经系统的修复与再生。目前，电刺激应用于神经系统组织修复已经有报道。比如，中国专利文献CN 107778496A公开了一种掺杂有聚苯胺的高强导电水凝胶及其制备方法和应用，以2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪和乙烯基咪唑为主体的水凝胶，并在凝胶上包覆一层掺杂态聚苯胺，赋予凝胶导电性，通过微弱电流的刺激，促进神经干细胞向神经元方向分化。另外，中国专利文献CN 109865162 A也公开了一种用于电刺激组织再生的导电支架的制备方法，以多巴胺和导电微粒为主体的天然高分子基导电支架可用于刺激组织再生。目前，利用电刺激修复神经系统组织主要是通过制备导电支架，施加外部电流的方式。然而，这种方式会存在外接导线，在实际应用过程中会存在感染、排斥等问题，不利于后续应用。理想的做法是对干细胞进行无导线电刺激以进行神经分化。因此，能够将各种机械刺激转换为电信号的压电材料成为了最佳选择。然而，单独的电刺激对干细胞分化的影响比较弱，如何利用压电材料制备更适合临床应用的材料成为一个比较棘手的问题。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种FeOOH/PVDF纤维支架的制备方法及其产品。
本发明的另一目的在于提供上述支架在诱导间充质干细胞定向分化为功能性神经细胞的应用，该支架能够在超声波作用下以无导线电刺激间充质干细胞定向分化为神经元细胞用于修复神经系统组织。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种FeOOH/PVDF纤维支架的制备方法，包括以下步骤：
（1）将聚偏氟乙烯（PVDF）粉末溶解在丙酮和N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中配置成PVDF溶液，然后在室温下进行静电纺丝，获得纤维膜，然后烘干掉多余溶剂，获得PVDF纤维膜；
（2）将六水合氯化铁和硝酸钠的混合溶液与PVDF纤维膜共同转入反应釜进行水热反应，产物经洗涤干燥获得FeOOH/PVDF纤维支架。
所述聚偏氟乙烯的型号为Solvay 6010。
所述PVDF溶液的质量分数为10-15%。
步骤（1）中，所述混合溶剂中丙酮和N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:9-4:6。
所述静电纺丝的参数为：针头直径22-26G，电压为15-20 kV，接收器和针头距离为15cm。
步骤（2）中，所述混合溶液的pH为1.25。所述混合溶液中氯化铁的浓度为0.1-0.15M，硝酸钠的浓度为1 M。
步骤（2）中，所述水热反应温度为80-110℃，反应时间为9-12h。
一种上述制备方法获得的FeOOH/PVDF纤维支架。所述FeOOH为棒状，长约为800-900nm，宽约为100nm，晶型为β型；负载于PVDF纤维表面。
一种上述FeOOH/PVDF纤维支架作为医用材料的用途。所述医用材料用于诱导间充质干细胞向神经细胞分化。
一种利用上述FeOOH/PVDF纤维支架诱导间充质干细胞向神经细胞分化的方法，包括以下步骤：将间充质干细胞的单细胞悬液与FeOOH/PVDF纤维支架混合以间歇超声波处理方式培养。
所述超声波功率为400W，超声波频率为2次/天，超声波时长为8min/次，两次间隔6h。
本发明的机理如下：
在超声波作用下，FeOOH/PVDF纤维膜发生形变，在纤维表面产生局部电信号，同时也诱导铁离子释放到干细胞的微环境中，在没有任何诱导分化因子的存在下，电刺激和铁离子的协同作用能够共同促进干细胞的神经分化。
本发明具有以下优点：
本发明利用静电纺丝技术和水热反应工艺设计并制备了FeOOH/PVDF纤维膜，制备方法简单，反应条件易于实现；所用原料廉价易得，成本低。所得支架表面形貌均一、具有良好的压电性，且安全、细胞毒性低，生物相容性好。纤维膜是三维立体结构，具有较大的比表面积，因此能够在单位面积上实现更多细胞的附着。在超声波作用下产生的电刺激和释放的铁离子能够对间充质干细胞的神经分化产生促进作用。本发明获得的FeOOH/PVDF纤维支架，能够以无线刺激方式诱导rBMSCs神经分化，避免了导线存在的排斥或者感染问题，能够促进自体骨髓间充质干细胞定向分化为神经元细胞用于修复神经系统组织，具有较强的临床应用前景。
附图说明
图1是实施例1中PVDF纤维膜的SEM图（a）、羟基氧化铁的TEM图（b）和FeOOH/PVDF纤维支架的SEM图（c）；
图2是实施例1中羟基氧化铁的XRD图（a）和FeOOH、PVDF和FeOOH/PVDF的XRD对比图（b）；
图3是实施例1中PVDF和FeOOH/PVDF的PFM图；
图4是实施例1中FeOOH/PVDF纤维支架的铁离子的释放曲线图；
图5是实施例2中羟基氧化铁的TEM图（a、b）和FeOOH/PVDF纤维支架的SEM图（c、d）；
图6是实施例2中FeOOH、PVDF和FeOOH/PVDF的XRD图；
图7是实施例2中PVDF和FeOOH/PVDF的PFM图；
图8是实施例3中PVDF纤维膜的SEM图；
图9是实施例3中PVDF和FeOOH/PVDF的PFM图；
图10是对比例1中PVDF和FeOOH/PVDF的SEM图；
图11是不同培养条件下第7d、14d、21d时几种神经细胞标志物mRNA相对含量；
图12是培养21天的细胞加入GABA后不同时刻的细胞钙离子荧光强度变化。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 FeOOH/PVDF纤维支架的制备
（1）将PVDF粉末（Solvay 6010）溶解在丙酮：N,N-二甲基甲酰胺=3:7（v/v）的混合溶剂中，配置质量分数为12%的PVDF溶液；使用注射器吸取5毫升左右的PVDF溶液，插入规格为22G的针头，设置纺丝参数为：距离15cm，电压18kV，纺丝结束后，取下膜置于60℃烘箱中干燥30min，获得PVDF纤维膜，其SEM图如图1a所示：PVDF纤维表面光滑粗细均匀，直径约为600nm；
（2）称取六水合氯化铁和硝酸钠溶于50 mL蒸馏水中，使氯化铁浓度为0.1 M，硝酸钠浓度为1 M，加入盐酸水溶液调节pH至1.25；加入步骤（1）制备好的PVDF纤维膜（规格2 cm×4 cm）一同转移至水热反应釜中，然后于100℃反应10h，经水和无水乙醇的交替洗涤3次、烘干后得FeOOH/PVDF纤维支架；其中羟基氧化铁的TEM图和XRD图如图1b和图2a所示：FeOOH为棒状，晶型为β型，大小均一，长约为800nm，宽约为100nm，说明FeOOH有良好的结晶性。FeOOH/PVDF纤维支架的SEM图如图1c所示：FeOOH能够在PVDF纤维上实现均匀包覆，且FeOOH/PVDF纤维的直径约为2微米。FeOOH、PVDF和FeOOH/PVDF的XRD图如图2b所示：FeOOH成功的负载到PVDF纤维膜上。
将步骤（1）中的PVDF和FeOOH/PVDF进行PFM，结果如图3所示：FeOOH/PVDF具有良好的压电性，同时，与PVDF相比，负载FeOOH后并没有使得压电性减弱。
将制备的FeOOH/PVDF纤维支架浸没于蒸馏水中，采用与上述细胞分化相同的操作进行处理，以不超声做对照，测定铁离子的浓度。铁离子的释放曲线如图4所示：在超声波作用下铁离子的释放量显著高于未超声的，说明超声波有利于铁离子的释放。
实施例2 FeOOH/PVDF纤维支架的制备
（1）PVDF膜的制备与实施例1（1）相同；
（2）称取六水合氯化铁和硝酸钠溶于50 mL蒸馏水中，使氯化铁浓度为0.12M，硝酸钠浓度为1M，加入盐酸水溶液调节pH至1.25；加入步骤（1）制备好的PVDF纤维膜（约2 cm×4cm）一同转移至水热反应釜中，然后于95℃反应12h，经水和无水乙醇的交替洗涤3次、烘干后得FeOOH/PVDF纤维支架。其中羟基氧化铁的TEM图如图1a、b所示：FeOOH为棒状，晶型为β型，大小均一，长约为900nm，宽约为100nm，具有良好的结晶性。FeOOH/PVDF纤维支架的SEM图如图5c、d所示、XRD图如图6所示：FeOOH能够在PVDF纤维上实现均匀包覆，且FeOOH/PVDF纤维的直径约为2.5微米。将步骤（1）中的PVDF和FeOOH/PVDF进行PFM测试，结果如图7所示：FeOOH/PVDF具有良好的压电性，同时，与PVDF相比，负载FeOOH后并没有使得压电性减弱。
实施例3 FeOOH/PVDF纤维支架的制备
（1）将PVDF粉末（Solvay 6010）溶解在丙酮：N,N-二甲基甲酰胺=4:6（v/v）的混合溶剂中，配置质量分数为15%的PVDF溶液；使用注射器吸取5毫升左右的PVDF溶液，插入规格为22G的针头，设置纺丝参数为：距离15cm，电压20kV，纺丝结束后，取下膜置于60℃烘箱中干燥30min，获得PVDF纤维膜，其SEM图如图8所示。从图中能够看出PVDF纤维表面光滑粗细均匀，直径约为600nm；
（2）FeOOH的合成与实施例1（2）相同。将步骤1中PVDF膜和FeOOH/PVDF膜进行PFM测试，结果如图9所示：FeOOH/PVDF具有良好的压电性，同时，与PVDF相比，负载FeOOH后并没有使得压电性发生显著减弱。
对比例1 FeOOH/PVDF材料的制备
（1）将PVDF粉末（Solvay 6010）溶解在丙酮：N,N-二甲基甲酰胺=1:19（v/v）的混合溶剂中，配置质量分数为10%的PVDF溶液；使用注射器吸取5毫升左右的PVDF溶液，插入规格为24G的针头，设置纺丝参数为：距离15cm，电压20kV，纺丝结束后，取下膜置于60℃烘箱中干燥30min，获得PVDF纤维膜。所得样品SEM图如图10左所示，能够看出所获得的PVDF薄膜与本发明方法制备的形貌差异较大，无法观察到PVDF纤维；
（2）称取六水合氯化铁和硝酸钠溶于50 mL蒸馏水中，使氯化铁浓度为0.1M，硝酸钠浓度为1M，加入盐酸水溶液调节pH至1.25；加入步骤（1）制备好的PVDF纤维膜（规格2 cm×4 cm）一同转移至水热反应釜中，然后于95℃反应10h，经水和无水乙醇的交替洗涤3次、烘干后得FeOOH/PVDF纤维支架。所得样品SEM图如图10右所示，能够看出FeOOH负载到PVDF薄膜上，而不是获得FeOOH/PVDF纤维。
应用例1 FeOOH/PVDF纤维支架体外诱导间充质干细胞向神经细胞分化
将FeOOH/PVDF纤维膜用于体外诱导间充质干细胞定向神经分化，具体步骤如下：
（1）小鼠骨髓间充质干细胞的提取培养：4周龄、平均体重80g的雄性Wister大鼠（购自山东大学医学院实验动物中心）用无水乙醚麻醉后脱颈处死，然后用75%酒精浸泡10分钟除菌，在生物安全柜内剪开皮毛取出后腿，依次浸泡在75%酒精、PBS缓冲溶液中，去掉肌肉组织将腿骨泡在PBS溶液中，通过冲髓法获得骨髓间充质干细胞，使用含有10%血清、1%生长因子和1%双抗的培养基反复吹打，分散细胞，将细胞接种于培养皿中进行培养。细胞在培养皿底部铺满后，采用胰酶消化、离心的方式将细胞吹打成单细胞悬液的方式对细胞进行传代；
（2）在紫外线照射下，采用75%酒精浸没FeOOH/PVDF纤维骨架进行灭菌处理，然后以PBS缓冲溶液冲洗酒精，然后浸泡在培养基后，置于恒温37℃的培养箱备用；将培养到二代的骨髓间充质干细胞用胰酶消化后制成单细胞悬液，接种到FeOOH/PVDF纤维骨架上，在恒温37℃的培养箱中培养48h后，对细胞进行超声处理，超声波功率为400W，一天2次，每次8min，两次间隔6h；共培养21天；按照上述同样的方法，以细胞接种FeOOH/PVDF纤维骨架、PVDF纤维膜、玻片分别在无超声、超声下培养。
将不同处理条件下培养的骨髓间充质干细胞裂解后提取RNA，以其为模板分别采用GFAP、MAP-2、Nestin和Tuj-1的特异性引物进行扩增，比较不同条件下上述神经标志物的转录水平。结果如图11所示：较相同处理玻片上细胞中表达量相比，超声处理的FeOOH/PVDF纤维支架上的细胞中典型神经分化基因Nestin、Tuj1和MAP2增长了约89倍、120倍和220倍。这说明，在超声波作用下，FeOOH/PVDF纤维骨架能够有效促进骨髓间充质干细胞向神经元分化，其分化效果远高于无超声波作用的样品以及超声波作用下的PVDF纤维膜和空白对照的玻片（TCP）。
将不同处理条件下培养21天后的细胞与钙离子探针（Flu-4 AM，碧云天）共孵育，加入0.5M的γ-氨基丁酸（GABA神经递质），通过加入神经递质后细胞内钙离子浓度变化来检验培养后细胞是否具有神经功能。结果如图12所示：加入神经递质前荧光较弱，加入神经递质后13s即可观察到荧光明显变强。加入神经递质后，钙离子浓度迅速增加，在约13s时达到峰值，然后迅速降低，至约40s时达到加入前的水平；表明细胞内钙离子浓度发生了明显变化。这说明接种在FeOOH/PVDF纤维骨架上的骨髓间充质干细胞分化后的神经细胞具有一定的神经功能，展现出修复神经系统组织的潜力。

Claims (8)

1.一种用于诱导间充质干细胞向神经细胞分化的FeOOH/PVDF纤维支架，其特征在于采用以下方法制成，所述的方法包括以下步骤：
（1）将聚偏氟乙烯粉末溶解在丙酮和N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中配置成PVDF溶液，然后在室温下进行静电纺丝，获得纤维膜，然后烘干掉多余溶剂，获得PVDF纤维膜；
（2）将六水合氯化铁和硝酸钠的混合溶液与PVDF纤维膜共同转入反应釜进行水热反应，产物经洗涤干燥获得FeOOH/PVDF纤维支架。
2.根据权利要求1所述的FeOOH/PVDF纤维支架，其特征在于，所述聚偏氟乙烯的型号为Solvay 6010。
3.根据权利要求1所述的FeOOH/PVDF纤维支架，其特征在于，所述PVDF溶液的质量分数为10-15%。
4.根据权利要求1所述的FeOOH/PVDF纤维支架，其特征在于，步骤（1）中，所述混合溶剂中丙酮和N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:9-4:6。
5.根据权利要求1所述的FeOOH/PVDF纤维支架，其特征在于，所述静电纺丝的参数为：针头直径22-26G，电压为15-20 kV，接收器和针头距离为15cm。
6.根据权利要求1所述的FeOOH/PVDF纤维支架，其特征在于，步骤（2）中，所述混合溶液的pH为1.25；所述混合溶液中氯化铁的浓度为0.1-0.15 M，硝酸钠的浓度为1 M。
7.根据权利要求1所述的FeOOH/PVDF纤维支架，其特征在于，步骤（2）中，所述水热反应温度为80-110℃，反应时间为9-12h。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的FeOOH/PVDF纤维支架，其特征在于，所述的分化方法，包括以下步骤：将间充质干细胞的单细胞悬液与FeOOH/PVDF纤维支架混合以间歇超声波处理方式培养。
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