JP6301001B1

JP6301001B1 - エレクトロスピニングを用いて生分解性繊維からなる骨再生用材料を製造するための方法

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Publication number: JP6301001B1
Application number: JP2017223993A
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Inventors: 敏宏春日; 靖俊西川
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Filing date: 2017-11-21
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Abstract

【課題】PLGAからなる生分解性繊維にリン酸カルシウム粒子を含有させた骨再生用材料をエレクトロスピニングを用いて製造するための新たな方法、およびその方法で製造された新たな骨再生用材料の提供。【解決手段】PLGA樹脂をニーダー中で加熱して、樹脂の粘度が102〜107Pa・sになるまで軟化させ、リン酸カルシウム微粒子の粉体を投入することによって、粉体を軟化したPLGA樹脂と混合し、前記混合物に対して熱的かつ機械的エネルギーをかけて混練し、リン酸カルシウムの微粒子がPLGA樹脂中に分散した複合体を作製し、PLGA樹脂が溶剤によって完全に溶解され、かつリン酸カルシウム微粒子がPLGA樹脂が溶解された溶液中で凝集することなく分散した紡糸溶液を作製し、当該紡糸溶液を用いてエレクトロスピニングすることによって、リン酸カルシウム微粒子が生分解性繊維中に略均一に分散している生分解性繊維を製造する。【選択図】図４（１）

Description

本発明は、エレクトロスピニングを用いて生分解性繊維からなる骨再生用材料を製造するための方法に関する。

骨再生医療の分野では、ポリ乳酸（PLA）、ポリ乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA）等の生分解性樹脂をマトリクス樹脂として骨形成因子を含有させて作成した骨再生材料を骨欠損部に埋め込む方法が実施されている。骨再生材料が体内に埋め込まれた後、体液に接して分解されて、含有された骨形成因子が徐放されると共に、時間の経過とともに体内に吸収されて消失するため、効果的な骨形成が得られると共に、患者の負担が少なくて済む。

骨再生用材料が人の体内に埋め込まれて骨形成活性を発揮するためには、マトリクス樹脂は足場材(scaffold)として骨形成因子を徐放可能に担持できることが求められる。骨形成因子としてはリン酸カルシウム、特にβ相リン酸三カルシウム（β― TCP）が優れた骨形成活性を有するので好適に用いられている。β― TCPによる骨吸収・置換には数ヶ月を要するので、マトリクス樹脂は体液と接触して早期に加水分解してリン酸カルシウムの徐放を開始して一定期間継続し、その後速やかに分解吸収されて消滅することが望ましい。

近時、骨再生用材料として骨形成因子を含有する生分解性繊維を用いることが盛んに行われており、そのような生分解性繊維を作製する方法としてエレクトロスピニング法が用いられている。エレクトロスピニング法は紡糸溶液を電場で生じる静電引力により溶液を引っ張ってノズルから細い繊維として出射してコレクターに堆積させるので、そのようなスピニングが可能な紡糸溶液を調製することが重要な課題である。

In vivo and in vitro evaluation of flexible, cottonwool-like nanocomposite as bone substitute material for complex defects Acta Biomaterialia 5 2009 は、アモルファスTCP微粒子を分散させた溶媒にPLGA を加えて溶かして作製した紡糸溶液を、低温エレクトロスピニング法を用いて綿状に形成している。同文献の方法は、クロロホルム中でTCP粒子に超音波をかけることによって分散させた上で、PLGAを投入して溶かして撹拌することによってエレクトロスピニングの紡糸溶液（PLGA/TCPの重量比60/40）を調製している。

本発明の発明者等は、PLAを加熱溶融して調製した溶融溶液にケイ素溶出型炭酸カルシウム粒子をリン酸カルシウムとともに添加して混合混練して冷却固化して作製した複合体を溶媒で溶かして紡糸溶液とする方法を提案した（特許第5855783号）。この方法によれば、ポリ乳酸樹脂に50重量％以上の無機粒子を含有させて紡糸溶液を製造することが可能である。しかし、PLAは生体内で分解吸収される速度が遅いので、そのことが無機微粒子が骨形成能を早期に発揮するためには妨げとなる可能性が指摘されている。また、粒径が１〜４μ程度の微粒子粉末を、PLA樹脂の融点以上に加熱して溶融させた溶液に投入して混練すると、微粒子の凝集が生じて、混練によって樹脂中に完全に分散されずに残ってしまうという問題がある。

特許第5855783号特許公報

In vivo and in vitro evaluation of flexible, cottonwool-like nanocomposite as bone substitute material for complex defects Acta Biomaterialia 5 2009 1775-1784 Stark et al. University of Zurich.

PLGAは加水分解の速度が速く、生体内に埋め込まれると樹脂が分解吸収されて骨形成因子を早期に徐放できると共に体内に長期間残ることがない点でPLAと比べて優れており、骨再生材料の足場材用の樹脂として広く用いられている。しかし、PLGAはアモルファス樹脂であるため、エレクトロスピニング法を用いて生分解性繊維を製造するためには、繊維の成形・加工性の面でPLAと比べて困難な材料である。

リン酸カルシウムの微粒子が骨形成活性を発揮するためには、できるだけ多くの骨形成因子を含有することが望ましい。しかし、粒子が紡糸溶液中に多量に存在するとエレクトロスピニング法による紡糸が困難になりやすい。

以上のような状況下で、PLGAからなる生分解性繊維に多量のリン酸カルシウム粒子を含有させた骨再生用材料をエレクトロスピニングを用いて商業ベースで実用可能なレベルで効率的に製造するための新たな方法、およびその方法で製造された新たな骨再生用材料が求められていた。

本発明は、リン酸カルシウム粒子、とりわけ粒径の小さいβ―TCP微粒子を多量に含んだPLGA樹脂からなる生分解性繊維をエレクトロスピニング法を用いて商業的に製造するための方法に関する。

本発明はさらに、エレクトロスピニング法を用いて製造されたリン酸カルシウム粒子を含んだPLGA樹脂からなる生分解性繊維に関する。

本発明は、さらに、上記の製造方法で用いるエレクトロスピニング用紡糸溶液の製造方法に関する。

本発明は、さらに、エレクトロスピニング法で製造された生分解性繊維からなる不織布又は綿状の骨再生材料とその製造方法に関する。

本発明の一つの実施態様は、エレクトロスピニング法を用いて生分解性繊維からなる骨再生用材料を製造する方法であって、
PLGA樹脂をニーダーに投入し加熱することによって、前記PLGA樹脂の粘度が10²〜10⁷Pa・sになるまで軟化させ、
前記ニーダー中にリン酸カルシウム微粒子の粉体を前記ニーダーの羽根を回転させながら投入することによって、前記粉体を前記軟化したPLGA樹脂と混合し、
前記ニーダーの羽根を前記加熱状態で継続して力をかけて回転させることによって前記混合物に対して熱的かつ機械的エネルギーをかけて混練することによって、前記リン酸カルシウム微粒子の凝集を解砕して、前記リン酸カルシウムの微粒子が前記PLGA樹脂中に分散した複合体を作製し、
前記複合体を冷却固化し、
前記冷却固化した複合体を溶媒で溶かし、所定時間撹拌することによって、前記PLGA樹脂が前記溶媒によって完全に溶解され、かつ前記リン酸カルシウム微粒子が前記PLGA樹脂が溶解された溶液中で凝集することなく分散した紡糸溶液を作製し、
前記紡糸溶液をエレクトロスピニング装置のシリンジに注入して高電圧をかけることによってエレクトロスピニングすることによって、前記リン酸カルシウム微粒子が前記生分解性繊維中に物理的に略均一に分散している生分解性繊維を製造する、
前記生分解性繊維からなる骨再生用材料の製造方法である。

好ましくは、前記リン酸カルシウム微粒子はβ―TCP微粒子である。

好ましくは、前記ニーダー中で前記PLGA樹脂の粘度を10^3.2〜10^3.6Pa・sになるまで軟化させる。

本発明の一つの実施態様は、エレクトロスピニング法を用いて製造した生分解性繊維からなる骨再生用材料であって、
前記生分解性繊維は、実質的にPLGA樹脂が約３０〜６０重量％と、リン酸カルシウム微粒子が約７０〜４０重量％とからなり、
前記生分解性繊維は、加熱ニーダーに所定量のPLGA樹脂を投入して所定の温度で加熱して樹脂の粘度を10² 〜10⁷ Pa・sになるまで軟化させた後、前記リン酸カルシウム微粒子を投入して、ニーダーで熱的かつ機械的エネルギーをかけることによって、前記β-TCP微粒子の凝集が解砕されて前記PLGA樹脂中に前記リン酸カルシウム微粒子が実質的に均一に分散した複合体を作製し、前記複合体を冷却固化した後溶媒で溶かして作製した紡糸溶液をエレクトロスピニング法を用いて紡糸することによって製造され、前記リン酸カルシウム微粒子のカルシウムイオンが前記PLGA樹脂のカルボキシル基と結合していない、前記エレクトロスピニング法を用いて製造した生分解性繊維からなる骨再生用材料である。

好ましくは、前記ニーダーにPLGA樹脂を約３０〜５０重量％、リン酸カルシウム微粒子が約７０〜５０重量％となる量を投入して混練する。

好ましくは、前記PLGA樹脂を前記ニーダーに投入して加熱して所定の粘度まで軟化して所定の時間混練した後、前記ニーダー中の前記混練したPLGA樹脂にリン酸カルシウム微粒子粉末を投入し、前記混練をした温度と略同等の温度で所定の時間前記ニーダーで前記PLGA樹脂と前記リン酸カルシウム微粒子とを混練する。

好ましくは、前記PLGAは、L体のみを含むPLAとPGAとの共重合体である。

好ましくは、前記PLGAは、L体とD体が混在したPLAとPGAとの共重合体である。

好ましくは、前記PLGAの乳酸とグリコール酸の比率は略８５〜５０：１５〜５０である。

好ましくは、前記β―TCP微粒子の外径は０．５〜４μｍである。

好ましくは、前記生分解性繊維の外径は１０〜２５０μmである。

好ましくは、エレクトロスピニング装置のコレクターにはエタノールを満たしており、ノズルから出射された繊維はコレクター容器のエタノール液に沈殿して綿状に堆積する
好ましくは、記生分解性繊維からなる骨再生用材料の嵩密度が０．０１〜０．１ｇ／ｃｍ³の綿状である。

好ましくは、前記PLGA樹脂の分子量は６万〜６０万である。

本発明の骨再生材料の製造方法を用いることで、一般にPLAと比べて成形・加工が難しいPLGAを生分解性樹脂として用いて、エレクトロスピニング法で効率的に生分解性繊維からなる骨再生材料を商業的に製造することができる。

本発明の骨再生材料の製造方法を用いて製造されたPLGA樹脂を生分解性樹脂として用いた生分解性繊維は、生体内での分解吸収が速いので、β―TCPの早期の徐放を可能にし、骨形成を促進する。

本発明の方法を用いて製造された生分解性繊維は、エレクトロスピニングしてコレクターに綿状に堆積させて回収することが可能であるので、綿状の骨再生材料に好適に用いることができる。

本発明の実施例である骨再生用材料の概観写真である。本発明の実施例である骨再生用材料の繊維の表面を示すＳＥＭ写真である。本発明の実施例である骨再生用材料の綿を人体の脊椎固定用のインプラント器具の周囲に埋めて使用する方法を示す。実験１の結果(PLLGA)を示す。実験１の結果(PDLGA)を示す。サンプル(1)を水酸化ナトリウム溶液に浸漬して０〜８日を経過することによる見た目の変化を示す写真である。サンプル(2)を水酸化ナトリウム溶液に浸漬して０〜８日を経過することによる見た目の変化を示す写真である。サンプル(3)を水酸化ナトリウム溶液に浸漬して０〜８日を経過することによる見た目の変化を示す写真である。サンプル(4)を水酸化ナトリウム溶液に浸漬して０〜８日を経過することによる見た目の変化を示す写真である。サンプル(5)を水酸化ナトリウム溶液に浸漬して０〜８日を経過することによる見た目の変化を示す写真である。サンプル(1)〜(6)のＤＳＣ測定の結果を示す。サンプル(1)〜(6)のＤＳＣ測定の結果を示す。サンプル(1)と(4)についてNMR測定した結果を示す。サンプル(1)と(4)についてNMR測定した結果を示す。本発明で用いるβ―TCPのXRD測定の結果を示す。

以下、本発明の実施態様を図面を参照しながら詳細に説明する。

＜PLGA樹脂＞
本発明の骨再生用材料の生分解性繊維の生分解性樹脂としては、PLGA樹脂が好適に用いられる。本発明でPLGA樹脂とは、乳酸とグリコール酸の共重合体を広く含む。一般にPLGA樹脂はアモルファスであるので、熱をかけると軟化するが明確な融点は有しない。

本発明のPLGA樹脂の乳酸とグリコール酸の比率は必要に応じて適宜選択され、85対15、75対25、50対50のものを含む。

ポリ乳酸（PLA）には、異性体であるL体のみを重合させたポリ-L-乳酸（PLLA）とD体のみを重合させたポリ-D-乳酸（PDLA）と、D、L両方の乳酸が混在したPDLLAがあるが、本発明のPLGAはこれらのいずれのタイプのポリ乳酸とポリグリコール酸との共重合体であっても良い。本出願ではPLLAとPGAの共重合体をPLLGAと称し、PDLAとPGAの共重合体をPDLGAと称する。図６（１）（２）のDSC測定結果に示す通り、PLLGAは結晶化部分を有しているのに対し、PDLGAは結晶化部分を有しない。

＜β相リン酸三カルシウム＞
本発明の骨再生用材料に用いる骨形成因子には、β相リン酸三カルシウム（β―TCP）の微粒子を好適に用いる。一般にリン酸カルシウムとしては、リン酸水素カルシウム、リン酸八カルシウム、リン酸四カルシウム、リン酸三カルシウム、炭酸含有アパタイト等の生体吸収性リン酸カルシウムなどが知られているが、β-TCPは、骨芽細胞系の細胞の増殖と分化のためのscaffoldになる物質として特に好適である。β― TCP微粒子の外見はパウダー状である。パウダーを構成する粒子の径は０．５〜４μｍのものが好ましい。本発明の骨再生用材料を構成する繊維の外径が１０〜１５０μｍであることからすると、粒子径は４μｍ以下程度のものが好適である。混錬にあたって混合するリン酸カルシウム粒子と均一分散させるためには、粒子の外径がそれと同等の０．５〜４μｍ程度のものとすることが好ましい。

本発明のリン酸カルシウムがアモルファス相をほとんど含まないβ-TCPであれば、生分解性樹脂との混練によってポリマーの分子との結合が生じないと考えられる。図8に本発明で用いるβ―TCPについてXRD測定した結果を示す。明確なピークの存在がβ―TCPが結晶性である事を示している。

＜紡糸溶液の製造＞
（１）混練による複合体の作成
ペレット状のPLGA樹脂をニーダーに投入して作業温度範囲にまで加熱することによって、PLGA樹脂の粘度を作業粘度範囲10² 〜10⁷Pa・s、より好ましくは10^3.2〜10^3.6 Pa・s になるまで軟化させる。次いで、粉末状のリン酸カルシウム微粒子をニーダーに投入して生分解性樹脂と混合して一定時間混錬することで、リン酸カルシウム粒子と生分解性樹脂の複合体を作製する。

複合体の重量比は、PLGA樹脂が約３０〜６０重量％、リン酸カルシウム微粒子が約７０〜４０重量％であることが好ましい。さらに好ましくは、PLGA樹脂が約３０〜５０重量％、リン酸カルシウム微粒子が約７０〜５０重量％である。またさらに、好ましくは、PLGA樹脂が約３０重量％、リン酸カルシウム微粒子が約７０重量％である。本発明においてPLGA樹脂とリン酸カルシウムの適当な重量比率を一桁の％レベルまで厳密にコントロールするのは困難であるので、上記の数値範囲から前後 5％は範囲内として考慮されるべきである。

骨再生材料の骨形成活性を高めるためにはできるだけリン酸カルシウムの含有量を増やすことが望ましい。しかしリン酸カルシウムの量を70重量％を実質的に超えて、例えば80重量％にすると、複合体から紡糸溶液を調製してエレクトロスピニングで紡糸することが難しくなる。

TCP微粒子は軟化したPLGA樹脂と混合されると凝集を生じるが、10²〜10⁷Pa・s、より好ましくは10^3.2〜10^3.6 Pa・sの粘度のPLGAと共にニーダーで一定時間熱的かつ機械的エネルギーをかけて混練すると、β-TP微粒子の凝集が物理的に解砕されて、粒子間にポリマーが侵入し、PLGA樹脂中にリン酸カルシウム微粒子が実質的に均一に分散した状態を得ることができる。ここで、熱的かつ機械的エネルギーをかけるとは、樹脂を加熱することによって軟化させて高粘度状態にした状況で力をかけて練ることをいう。高粘度な状態で練られることによって、樹脂に含有されているリン酸カルシウム微粒子の凝集体が物理的に解砕される。

本発明で用いるニーダーとしては、高粘度の混練、または固体の粉砕を伴う混練に適したタイプの混練機が好適である。リン酸カルシウム微粒子を高粘度の生分解性樹脂中で効率的に解砕するには、例えば、2枚のスクリュー型の羽根が切断不等速運動で羽根と壁面により剪断混合され特に強力な粉砕捏和を行うＰＢＶ型ニーダーが適している。また、カートリッジヒーター等を備えて、短時間で樹脂の融点まで加熱できるものであることが望ましい。

ニーダーでリン酸カルシウム粒子に熱的・機械的エネルギーをかけるためには、加熱して軟化したPLGAは一定以上の粘度を有することが必要である。PLGA樹脂を適当な作業粘度範囲（10²〜10⁷Pa・s、より好ましくは10^3.2〜10^3.6 Pa・s）とするための加熱温度の範囲（作業温度範囲）は、PLGA樹脂の種類によって異なる。PLLGA（85:15）では、160℃近辺が好ましい。加熱する温度がより低い温度（例えばPLLGAで140℃）ではニーダーで練るためにはより強い力が必要になり、混練の効率性が悪くなる。

加熱する温度をさらに上げると（例えばPLLGAで160℃近辺からさらに上げて190℃以上にすると）、PLGA樹脂の粘度が下り液相状態になり、その結果混練によって機械的エネルギーがかかりにくくなり、リン酸カルシウム微粒子の凝集を解砕することが難しくなり、その結果β-TCP微粒子をPLGA樹脂中に均一に分散させるのが難しくなる。

本発明ではPLGA樹脂を先にニーダーに投入して加熱し、その後リン酸カルシウム微粒子を投入して混練するほか、PLGA樹脂とリン酸カルシウム微粒子を同時にニーダーに投入して混合混練しても良いし、 PLGAとリン酸カルシウム微粒子を混合した混合物をニーダーに投入して混練しても良い。 PLGAの結晶化度が低いものを用いる場合には加熱したときの粘度が低くなるので、PLGA樹脂を先に加熱することをせずにリン酸カルシウム微粒子と同時にニーダーに投入して混練する方が熱的・機械的エネルギーをかけやすい。

混練によってPLGA樹脂とリン酸カルシウム微粒子との間に分子レベルでどういう関係が生じているかは必ずしも明らかでない。本発明の方法で製造した生分解性繊維のサンプルについて固体核磁気共鳴（NMR測定をしたところ、PLGA樹脂のカルボキシル基にβ-TCPのカルシウムイオンとの間に結合は生じていなかった。図７（１）及び（２）にNMR測定の結果を示す。

β―TCPにアモルファス相がなければ、PLGA樹脂との結合は生じないと考えられる。リン酸カルシウム粒子と生分解性樹脂マトリクスとが反応して界面に結合があるとなれば、骨再生用材料として使用した場合に、そのことが生体に影響があるのかどうかが薬事審査において懸念される可能性があるので、β-TCPとPLGA樹脂との間に結合が生じない事は好都合である。

PLGA樹脂とβ-TCP微粒子を混練する過程で、β-TCP微粒子はPLGAの分子と結合はしないものの、PLGA樹脂がβ-TCP微粒子周辺を完全に被覆することができるので、繊維にした時にβ-TCP微粒子がPLGA樹脂からぽろぽろ外れることがないと考えられる。

（２）複合体の冷却、固化
上記で調製された複合体をニーダーから取り出して常温冷却して固化させる。加熱された複合体が冷却される過程で結晶化温度Ｔｃ（PLLGAのTcは130℃近辺）に達すると、複合体中に分散した TCP微粒子が結晶核剤となってPLLGA樹脂に結晶成長が生じると考えられる。

ニーダー中で軟化したPLGA樹脂とβ-TCP微粒子を混練して熱的かつ機械的エネルギーをかけてTCP微粒子を分散させると、その過程でPLGAの分子の末端部が増えて多数の核サイトが形成されるので、複合体を冷却する過程でその多数の核サイトを起点としてPLGA樹脂の結晶成長が進むと考えられる。しかし、ブロック共重合体であるPLGA、特にPDLGAはもともとアモルファス性が高く結晶化の速度が遅いので、混練を経て多数の核サイトが形成されていても、 TCP微粒子を核とする結晶成長はそれほど進まないと考えられる。

（３）溶媒による複合体の溶解
上記で製造した複合体を溶媒の溶液中に投入して撹拌して複合体を溶解して紡糸溶液を作製する。エレクトロスピニングの紡糸溶液とするためには複合体は溶媒によってほぼ完全に溶解されていることが必要である。そのために複合体を溶解するには、マグネチックスターラー等を用いて、溶媒液中で4時間以上撹拌することが望ましい。

本発明で用いる溶媒としては、生分解性樹脂に対する溶解性が良く、尚且つエレクトロスピニングの過程で繊維から溶媒を効率的に蒸発させることができる点で、クロロホルムを好適に用いることができる。

溶媒で溶かした紡糸溶液の樹脂濃度は必要に応じて適宜選択調整されるが、8重量%〜10重量％であることがエレクトロスピニングでの紡糸にとって好ましい。

溶媒で溶解されるとPLGA樹脂の分子鎖がほどけて分子鎖間の拘束力がなくなりバラバラに分散し、配列していた分子鎖は自由度が与えられる。その後エレクトロスピニングを経て溶媒を除去された生分解性繊維の生分解性樹脂の分子は繊維の固化に伴って再配列されると考えられる。

＜エレクトロスピニング＞
上記で調製された紡糸溶液をエレクトロスピニングの装置のシリンジに充填し、ノズルに電荷をかけて一定の方法／条件下でノズルから紡糸溶液を繊維状に出射することによってエレクトロスピニングで生分解性繊維を紡糸する。

本発明のエレクトロスピニング法としては、乾式-湿式-電界紡糸法（Dry-Jet-Wet-Electrospinning）を好適に用いることができる。乾式-湿式-電界紡糸法は、繊維をノズルから飛ばして、飛行中に溶媒が蒸発して固化した繊維をコレクター漕のエタノール液の液面に入射させて、繊維を液中に沈殿させてコレクター漕内に綿状に堆積させる。生分解性樹脂は、クロロホルムには溶解されてＥＳ紡糸溶液となるが、コレクター漕に満たすエタノールには溶解されないので、繊維が液相中に堆積される。乾式-湿式-電界紡糸法については、Study on the Morphologies and Formational Mechanism of Poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) Ultrafine Fibers by Dry-Jet-Wet-Electrospinning、Shuqi et al. Journal of Nanomaterials Volume 2012 Hindwi Publishing Corporation October 2012、及び特開２０１２−１６１３６３、米国特許番号８８５３２９８等に詳細に開示されている。

本発明では、ノズルから出射された繊維はエタノール液を満たしたコレクター容器に沈殿してコレクター容器のプレート上に堆積される。エタノール液中で生分解性繊維の表面からクロロホルムが除去されて、その結果コレクタープレート上に堆積された繊維同士が互いに接着するのを防ぐことができるので、図１に示すような、ふわふわ感のある綿状物を得ることができる。本発明の生分解性繊維からなる綿状の骨再生用材料は、０．００１〜０．１ｇ／ｃｍ³程度の嵩密度を有する。好ましくは、０．０１〜０．１ｇ／ｃｍ³、さらに好ましくは、０．０１〜０．０４ｇ／ｃｍ³である。図３に本発明の骨再生用材料の使用例を示す。本発明の骨再生用材料は、繊維の外径が、１０〜１５０μｍの範囲にあり、かつ綿の嵩密度が上記の範囲にあるので取り扱い性が優れている。

PLGA樹脂がアモルファス性が高いPDLGAである場合には、コレクターに堆積した繊維は柔らかくなるので、紡糸された繊維の表面にわずかに残留しているクロロホルムによって繊維同士がくっついてしまうので、互いに独立した繊維としての形状を維持できなくなり、その結果コレクター容器のエタノール液に堆積した繊維を綿として回収することが困難になる傾向がある。この問題を解決してPLGA繊維をコレクターから綿として回収するためには、できるだけ早く乾燥して繊維の表面からクロロホルムを除去することが望ましい。

＜生分解性繊維＞
図２と図４は、本発明のエレクトロスピニングを用いて製造された骨再生用材料の生分解性繊維の外観写真を示す。繊維の外径はバラつきがあり、大体１０〜１５０μｍの範囲にあるが、好ましい平均径は１０〜５０μｍである。エレクトロスピニングで紡糸すると繊維は一般に数μｍ以下の外径になりやすいが、それと比較すると本発明の骨再生用材の生分解性繊維は太い。繊維の外径が１０μｍ以上とすることで、本発明の綿状多孔体の内部に細胞が侵入していくために必要な繊維と繊維の間のスペース（ギャップ）を作り出すことが可能になる。

本発明の生分解性繊維で作成した骨再生用材料は加水分解の速度が速く、人の体内にインプラントされた後直ちに分解が開始し、その後数ヶ月以内に体内に吸収されて消滅する。

本発明の骨再生用材料の生分解性繊維は繊維表面には超微細な無数の孔が形成されている。エレクトロスピニングによる紡糸では、ノズルから繊維状に射出された紡糸溶液が揮発する過程で、繊維表面に微細孔が形成される。本発明の骨再生用材料では、生分解性繊維に超微細孔が形成されていることで、含有するセラミック粒子（骨形成因子）と体液との接触面積が著しく増加しており、その結果高い骨形成能が得られる。

＜滅菌処理＞
本発明の骨再生用材料は、エレクトロスピニングで綿状に形成した後、ピンセット等を用いて所望のサイズ／重量に取り分けた上で、アルミ包装して滅菌処理を施すことが望ましい。滅菌の方法としては、放射線滅菌（ガンマ線、電子線）、酸化エチレンガス滅菌、高圧蒸気滅菌等がある。本発明ではγ線による放射線滅菌を好適に用いる。

実験１
１）実験１の内容
PLLGAとPDLGAのそれぞれについて樹脂とβ-TCP微粒子との混合割合、混練条件を変えてPLLGAの複合体のサンプル(1)〜(4)と、PDLGAの複合体のサンプル(5)〜(7)を作製して、作製した複合体をクロロホルムで溶解してエレクトロスピニングの紡糸溶液として紡糸を試みた。

（１）PLLGA-混練
・PLLA／PGAの共重合体（PLLGA 85:15）をβ-TCP微粒子と共にニーダーに投入して180℃で加熱混練してPLLGA 30 重量％にTCP微粒子70重量％を含む複合体を作製し、複合体をクロロホルムで溶かして紡糸溶液サンプル（１）とした。
・PLLA／PGAの共重合体（PLLGA 85:15）をβ-TCP微粒子と共にニーダーに投入して165℃で混練してPLLGA 30 重量％にTCP微粒子70重量％を含む複合体を作製し、複合体をクロロホルムで溶かして紡糸溶液サンプル（２）とした。
・PLLA／PGAの共重合体（PLLGA 85:15）をβ-TCP微粒子と共にニーダーに投入して115℃で混練してPLLGA 30重量％にβ-TCP微粒子70重量％を含む複合体を作製し、複合体をクロロホルムで溶かして紡糸溶液サンプル（３）とした。
・PLLA／PGAの共重合体（PLLGA 85:15）をβ-TCP微粒子と共にニーダーに投入して165℃で混練してPLLGA 50重量％にβ-TCP微粒子50重量％を含む複合体を作製し、複合体をクロロホルムで溶かして紡糸溶液サンプル（４）とした。

（２）PDLGA-混練
・PDLA／PGAの共重合体（PDLGA 85:15）をβ-TCP微粒子と共にニーダーに投入して180℃で混練してPLLGA 30 重量％にβ-TCP微粒子70 重量％を含む複合体を作製し、複合体をクロロホルムで溶かして紡糸溶液サンプル（５）とした。
・PDLA／PGAの共重合体（PLLGA 85:15）をβ-TCP微粒子と共にニーダーに投入して165℃で混練してPDLGA 30 重量％にβ-TCP微粒子70 重量％を含む複合体を作製し、複合体をクロロホルムで溶かして紡糸溶液サンプル（６）とした。
・PLLA／PGAの共重合体（PLLGA 85:15）をβ-TCP微粒子と共にニーダーに投入して165℃で混練してPDLGA 50重量％にβ-TCP微粒子50重量％を含む複合体を作製し、複合体をクロロホルムで溶かして紡糸溶液サンプル（７）とした。
（３）PLLGA-混練無し（比較実験１）
・PLLA／PGAの共重合体（PLLGA 85:15）をβ-TCP微粒子と共にクロロホルムを満たした容器に投入し、撹拌器で約4時間撹拌しPLLGA 30 重量％にTCP微粒子70 重量％を含む複合体を作製し、複合体をクロロホルムで溶かして紡糸溶液サンプル（８）とした。
（４）PLLA-溶融混練（比較実験２）
・PLLA30wt%をβ-TCP微粒子70wt%と共にニーダーに投入して185℃〜190℃で加熱してPLLAを溶融させた状態で混練してPLAとβ-TCP微粒子の複合体を作製した。

＜サンプル作製に用いた材料＞
・β― TCP（Ca3(PO4)2）：太平化学産業株式会社のβ-ＴＣＰ−１００を用いた。粒径１．７ｍｍ以下のものを４μｍ程度に粉砕したもの（β―ＴＣＰ粉砕品）を用いた。
・PLGA：PLLGAとしてEvonik社製 LG855Sを使用した。
PDLGAとしてPurac社製PDLG8531を使用した。

＜サンプルの作製条件＞
・ニーダー条件
ニーダー：卓上ニーダー PBV-0.1 （バッチ式、真空式、双腕型ニーダー。株式会社入江商会提供）を用いた。

・ES条件
ES装置： NANON (株式会社MECC提供)
溶媒：クロロホルム
溶媒中の樹脂濃度：8〜10wt%
押し出し速度：15ml/h
針の太さは１８Ｇ、電圧は２５ｋＶ、ノズルからコレクターまでの飛距離は２５ｃｍとした。コレクター容器にはエタノール液を満たして、エレクトロスピニングされた糸を受けて、堆積させた。
２）実験1の結果
実験１の結果を図４（１）及び（２）に示す。

ニーダーの加熱温度を165℃に設定してPLLGAとβ-TCP微粒子をニーダーに投入して混練したところ、PLLGAとβ-TCP微粒子を作業粘度範囲でニーダーで熱的かつ機械的エネルギーをかけて練ることができた。ニーダーの加熱温度を高く185℃に設定して混練すると、PLLGAの粘度が低くなりすぎて、β-TCP微粒子粉体がうまくPLLGA樹脂に混ざらず、一部粉が残ってしまった。逆にニーダーの加熱温度を低く115℃に設定して混練すると、PLLGAの粘度が高くなりすぎて、ニーダーでβ-TCP微粒子粉体とPLLGA樹脂を混ぜることが困難であった。

PDLGAは、PLLGAと比較して、加熱して粘度が低くなりやすく、165℃で加熱して混練すると、樹脂がニーダーの羽根に付着して粉が完全に混ざらずにわずかに残ってしまう傾向があった。同じ加熱温度で粉体を樹脂に混ぜるために、ポリマーと粉を共に混練する時間を約3分間延長すると何とか混ぜることはできた。しかし、それで作製した複合体をクロロホルムで溶かしてES紡糸して得られた繊維は柔らかく、乾燥後に綿状に形成するのが難しかった。

比較実験１で、PLLGAとβ-TCP微粒子をニーダーによる混練を経ないで、クロロホルムを満たした容器中で4時間程度撹拌することによって、クロロホルム／樹脂の溶液中にβ-TCP微粒子を、目視によっては粉体の粒子が見えない状態にまで分散させた溶液を調製することができた。しかし、その溶液を紡糸溶液としてエレクトロスピニング装置のシリンジに注入して電圧をかけることによって紡糸を試みると、テイラーコーン現象によるスピニングは得られず、紡糸溶液がノズルから押し出されて下方向に落下して太い繊維状に堆積した。

比較実験２で、PLLA（融点180℃）とβ-TCP微粒子粉体を30重量％／70重量％の割合でニーダーに投入して設定温度185℃〜190℃で加熱すると、PLLAが液相状態に溶融した。その状態でニーダーの羽根を回して混練したところ、溶融したPLLA樹脂がニーダーの内壁面にこびりつき、β-TCP微粒子粉体は完全にPLLA樹脂に混ざらないで、一部白い粉が残った。

３）実験1の結果の分析、評価
・PLGA樹脂を作業粘度範囲に軟化してβーTCP微粒子粉体と混ぜて加熱したニーダーで力をかけて混練して作製した複合体を作製する方法は、βーTCP微粒子粉体をPLGAに分散混合させた複合体を作製する上で極めて有効であることが分かった。その複合体をクロロホルムで溶かして紡糸溶液としてエレクトロスピニングすると、ほぼ安定して繊維を紡糸することができた。
・逆に、混練にあたって、PLGA樹脂の粘度範囲が作業粘度範囲よりも高い又は低いと粉体がPLGA樹脂中に分散させるのが容易でなく、複合体を作製するのが難しくなり、その結果、複合体を溶媒で溶かしてエレクトロスピニング法を用いて紡糸することが困難になった。
・結晶性樹脂であるPLAを融点以上で加熱して溶融状態にすると、樹脂の粘度が急激に低下して作業粘度範囲以下となり、その結果混合物に力をかけて練ることが難しくなって、粉を混練によって完全に樹脂に混ぜることが難しくなった。

PDLGAは、PLLGAと比べてアモルファス性が高いので、成形加工が容易でないが、本発明の方法を用いることで、エレクトロスピニングでβ-TCP微粒子を多量に含んだ状態で紡糸することができた。しかし、紡糸したPDLGA繊維は柔らかくなっており、繊維の表面にわずかに残存しているクロロホルムによって繊維同士がくっついてしまう傾向がある。したがって、エタノール液中ではなんとか一応綿状に堆積させることができるが、エタノール液から取り出すと、一本一本が互いに独立した繊維としての形状を維持するのが難しい。コレクターから生分解性繊維を綿状に回収するには、できるだけ早く繊維からクロロホルムを除去して乾燥させることが必要であると考えられる。

実験２
１）実験２の内容
PLGAとβ-TCP からなる生分解性繊維のサンプル(1)〜(6)を作製し、各サンプルのPLGAの結晶化度および水溶液中での崩壊性の違い、及びＮＭＲ測定を実施した。

(1) 70β-TCP-30PLLGA (85:15)
(2) 60β-TCP-40PLLGA (85:15)
(3) 50β-TCP-50PLLGA (85:15)
(4) 100PLLGA (85:15)
(5) 70β-TCP-30PDLGA (85:15)
(6) 50β-TCP-50PDLGA (85:15)

＜サンプル作製に用いた材料＞
・β― TCP（Ca3(PO4)2）：太平化学産業株式会社のβ-ＴＣＰ−１００を用いた。粒径１．７ｍｍ以下のものを４μｍ程度に粉砕したもの（β―ＴＣＰ粉砕品）を用いた。
・PLGA：PLLGA(85:15)としてEvonik社製 LG855Sを使用した。
PDLGA(85:15)としてPurac社製PDLG8531を使用した。

＜サンプルの作製条件＞
・ニーダー条件
ニーダー：卓上ニーダー PBV-0.1（株式会社入江商会提供）。
温度： 160℃
時間：ポリマーだけで3分半、その後TCPを入れて11分、合計で14分半混練した。(6)50TCP-50PLGA (PDLGA85:15)については、ポリマーとTCPを同時にニーダーに入れ、14分半混練した。

・ES条件
ES装置： NANON (株式会社MECC提供)
溶媒：クロロホルム
溶媒中の樹脂濃度：(1)〜(4)は8wt%、(5)は16wt％、(6)は12wt%
電圧：(1)〜(4)は20kV、(5)は28kV、(6)は25kV
押し出し速度：15ml/h
針の太さは１８Ｇ、電圧は２０〜２８ｋＶ、ノズルからコレクターまでの飛距離は２５ｃｍとした。コレクター容器にはエタノール液を満たして、エレクトロスピニングされた糸を受けて、堆積させた。

＜DSC測定＞
(1)〜(6)のサンプルの結晶化度をＤＳＣにて測定した。

＜NMR測定＞
(1)と(4)のサンプルにおいて、PLGAのカルボキシル基とTCPのカルシウムイオ
ンとの間に配位を生じているか否かをNMRで調べた。

＜水溶液中での崩壊性の測定＞
(1)〜(5)のサンプルを水酸化ナトリウム水溶液に浸漬し、所定の浸漬期間後の綿の崩壊性を評価した。
・溶液：5 mmol/L 水酸化ナトリウム水溶液
・浸漬期間：0, 3, 6, 8日
・サンプル重量各100 mg
・溶液量：20 ml
・室温放置
・朝晩に容器をひっくり返して、撹拌させる。
・浸漬直後および浸漬後適当なタイムポイント毎に写真を撮り、見た目の変化を観察した。

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２）実験２の結果
＜DSC測定＞
結果を図６（１）と（２）に示す。

＜NMR測定＞
結果を図７（１）（２）に示す。

＜水溶液中での崩壊性測定＞
結果を図５（１）〜（５）に示す。
サンプル(1)（30 PLLGA-70 TCP）を水酸化ナトリウム水溶液に、浸漬期間： 0, 3, 6, 8日の経過で外観の変化を観察した結果、浸漬開始後６日を経過して、綿の体積は見かけ上２／３程度に減少し、軽く撹拌すると、多数の短繊維が容器内で拡散した。浸漬開始後８日を経過すると、綿の見かけ上の体積はさらに１／３程度に減少し、軽く撹拌すると、短繊維が容器全体に拡散した。

サンプル(2)（40 PLLGA-60 TCP ）を水酸化ナトリウム水溶液に、浸漬期間： 0, 3, 6、8,日で経過を観察した結果、サンプル（１）とほぼ同様の現象が見られたが、浸漬開始後の綿の見かけ上の体積の減少は、サンプル（１）よりも遅く、軽く攪拌したときの容器内の短繊維の分散もサンプル（１）より少なかった。

サンプル(3)（50PLLGA-50TCP）を水酸化ナトリウム水溶液に、浸漬期間： 0, 3, 6、8日で経過を観察した結果、サンプル（１）（２）とほぼ同様の現象が見られたが、浸漬開始後の綿の見かけ上の体積の減少は、サンプル（２）よりもさらに遅く、軽く攪拌したときの容器内の短繊維の分散もサンプル（２）よりさらに少なかった。

サンプル(4)（100 PLLGA）を水酸化ナトリウム水溶液に浸漬期間： 0, 3, 6、8日で経過を観察した結果、浸漬開始から8日後において、綿の見かけ上の体積に若干の減少が見られた程度で、軽く攪拌したときの容器内の短い繊維の分散も少なかった。

サンプル(5)（30 PDLGA -70TCP）を水酸化ナトリウム水溶液に浸漬期間： 0, 3, 6、8日で経過を観察した結果、浸漬開始後３日を経過して、綿としての見かけはほぼ失われた、軽く撹拌すると、短く細い繊維が容器全体に拡散した。この現象は6日、8日と経過するとさらに進行した。

３）実験結果の分析、評価
（i）示差走査熱量計（DSC）測定
サンプルの結晶化度は、PLLGA／TCPでは、PLLGAの含有量か少なくTCPの含有量が多いほど結晶化度が低かった。β-TCPを含有せずPLLGA100％のサンプルは、TCPを含有するサンプルと比べて結晶化度がかなり高かった。
（ii）崩壊性測定
PLLGA／TCPのサンプルでは、PLLGAの含有量が少なくβ-TCPの含有量が多いほど加水分解速度が速かった。この結果は、サンプルのPLLGAの結晶化度が低いほど加水分解速度が速いということだと推測される。

（iii）NMR測定
PLGA(100）とTCP/PLGA(70-30)の13C CP/MAS-NMRスペクトルを測定した。
カルボニル基（C=O;〜170 ppm）周辺のフェーズを合わせて拡大し、ピークフィッティングした。ノイズが多くて見にくいが、PLGA(100)、 TCP/PLGA(70-30)とも、破線で示した幅広のピークと破線で示した170.4 ppmをトップとするピークに分離（ガウシアン）できた。いずれも磁場シフトしたピークは見られず、したがって、カルボキシ基にCa2+イオンが配位していることはないと言える。（なお、定かではないが、破線の分離ピークは、高いアモルファス性による揺らぎに起因する可能性がある。

本出願の実施例では、生分解性樹脂として、乳酸とグリコール酸の比率が８５対１５のPLGAものを用いているが、乳酸とグリコール酸の比率は、これに限られず、７５対２５、５０対５０のものも含む。グリコール酸の比率が高いと、 PLGAのアモルファス性は高くなり、それを用いた生分解性繊維の加水分解の速度はより速くなると考えられる。

本発明の方法を用いて製造された骨再生用材料は、単独で使用する他、自家骨を綿材に包んだ状態で骨欠損部に充填するという方法で使用することが可能である。本発明の骨再生材料は自家骨との親和性が高いので、欠損部に充填ざれて、その状態で骨形成を助ける。図３は自家骨を本発明の骨再生材料に包んで使用する状態を示す。

本発明の方法を用いて製造された骨再生用材料は、β-TCP微粒子が生分解性繊維中に均一に分散しているので、PLGAの分解吸収とβ-TCPの骨置換とが同時並行して継続的に生じると考えられる。

Claims

生分解性繊維からなる骨再生用材料をエレクトロスピニング法を用いて製造するための紡糸溶液の製造方法であって、

ＰＬＬＧＡ樹脂をニーダー中に投入して、作業温度範囲で所定時間加熱することによって、前記ＰＬＬＧＡ樹脂の粘度が作業粘度範囲になるまで軟化させ、

リン酸カルシウム微粒子の粉体を前記ニーダー中に投入し、前記ニーダーの羽根を前記加熱状態で回転させることによって前記軟化したＰＬＬＧＡ樹脂と前記リン酸カルシウム微粒子の混合物に対して熱的かつ機械的エネルギーをかけて混練することによって、前記リン酸カルシウム微粒子が前記軟化したＰＬＬＧＡ樹脂中で凝集することなく略均一に分散した複合体を作製し、

前記複合体を冷却固化し、前記冷却固化した複合体を溶媒で溶かし、所定時間撹拌することによって、前記ＰＬＬＧＡ樹脂が前記溶媒によって完全に溶解され、かつ前記リン酸カルシウム微粒子が前記ＰＬＬＧＡ樹脂が溶解された溶媒中に略均一に分散した紡糸溶液を作製する、

前記生分解性繊維からなる骨再生用材料をエレクトロスピニング法を用いて製造するための紡糸溶液の製造方法。
前記作業粘度範囲は、１０^3.2〜１０^3.6Pa・sである、請求項１に記載のエレクトロスピニング法を用いた生分解性繊維からなる骨再生用材料を製造するための紡糸溶液の製造方法。
前記リン酸カルシウム微粒子はβ−TCP微粒子である、請求項１又は２に記載のエレクトロスピニング法を用いた生分解性繊維からなる骨再生用材料を製造するための紡糸溶液の製造方法。
前記ＰＬＬＧＡ樹脂の乳酸とグリコール酸の比率が略８５〜５０：１５〜５０である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のエレクトロスピニング法を用いた生分解性繊維からなる骨再生用材料を製造するための紡糸溶液の製造方法。
前記β―TCP粒子の外径は約０．５〜４μｍである、請求項３又は４に記載のエレクトロスピニング法を用いた生分解性繊維からなる骨再生用材料を製造するための紡糸溶液の製造方法。
前記ＰＬＬＧＡ樹脂約３０〜６０重量％に対してリン酸カルシウム微粒子を７０〜４０重量％投入する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のエレクトロスピニング法を用いた生分解性繊維からなる骨再生用材料を製造するための紡糸溶液の製造方法。
前記ＰＬＬＧＡ樹脂約３０〜５０重量％に対してリン酸カルシウム微粒子を７０〜５０重量％投入する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のエレクトロスピニング法を用いた生分解性繊維からなる骨再生用材料を製造するための紡糸溶液の製造方法。