TWI634914B - 由生物可分解性纖維組成的骨再生用材料，以及用於製造骨再生用材料的方法 - Google Patents

Abstract

需要一種使用靜電紡絲法有商業效率的製造骨再生用材料的新方法、以及以該方法製造的新的骨再生用材料，其中，骨再生用材料係由含有磷酸鈣粒子之由PLGA所組成的生物可分解性纖維所組成。

在捏合機中加熱PLGA樹脂，使其軟化至樹脂的黏度達到10²~10⁷Pa‧s後，一邊使捏合機的葉片旋轉一邊投入磷酸鈣微粒粉體，藉此混合粉體與軟化的PLGA樹脂，使捏合機的葉片在前述加熱狀態下持續旋轉，藉此對前述混合物施加熱能與機械能進行混煉，以打碎磷酸鈣微粒的凝集，進而製備出磷酸鈣微粒分散在PLGA樹脂中的複合體，而後於溶劑中溶解前述複合體並攪拌既定時間，使PLGA樹脂完全被溶劑溶解、且磷酸鈣微粒未凝集的分散在溶解了PLGA樹脂的溶液中，而製備成紡絲溶液，再透過使用該紡絲溶液進行靜電紡絲來製造出一種磷酸鈣微粒大致均勻地分散在其中的生物可分解性纖維。

Description

由生物可分解性纖維組成的骨再生用材料，以及用於製造骨再生用材料的方法

本發明係關於一種由利用靜電紡絲法製造之生物可分解性纖維組成的骨再生用材料，以及用於製造骨再生用材料的方法。

在骨再生醫療的領域，會將聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)等生物可分解性樹脂作為基質樹脂，再將骨形成因子加入其中而製成骨再生用材料，並將其植入骨缺損處。骨再生用材料會在被植入體內後與體液接觸而被分解，其所含有的骨形成因子被緩慢釋放並且隨著時間經過被吸收至體內而消失，因此可在得到骨形成效果的同時減少對患者的負擔。

為了讓骨再生用材料在被植入人體內後發揮骨形成活性，基質樹脂會被要求能作為支架(scaffold)承載骨形成因子並能緩慢釋放骨形成因子。磷酸鈣，特別是β相的磷酸三鈣(β-TCP)，因具有優良的骨形成活性而適合作為骨形成因子使用。由於基於β-TCP的骨吸收、置換需要數個月的時間，因此期望基質樹脂會在與體液接觸後在初期就開始水解緩慢釋放磷酸鈣並持續一定的時間，隨後迅速的被分解吸收進而消失。

近年來，興起將含有骨形成因子的生物可分解性纖維作為骨再生用材料使用，而靜電紡絲法被採用為製備上述生物可分解性纖維的方法。靜電紡絲法是一種利用電場產生的靜電引力吸引紡絲溶液，並由噴嘴以細纖維狀射出使其堆積至收集器上的方法，因此調配出可以用該種方法紡絲的紡絲溶液是一個重要的課題。

可撓性、棉絨狀奈米複合物作為複合性缺陷的骨替代材料之體內及體外評估(In vivo and in vitro evaluation of flexible,cottonwool-like nanocomposite as bone substitute material for complex defects)，Acta Biomaterialia，5，2009，是透過使非晶體TCP微粒分散在溶劑中，並於此溶劑中加入PLGA使PLGA溶解而製備紡絲溶液，再利用低溫靜電紡絲法將紡絲溶液形成為棉狀。此文獻的方法是透過在氯仿中對TCP粒子施加超音波使其分散後，投入PLGA並攪拌溶解來調製靜電紡絲的紡絲溶液(PLGA/TCP的重量比為60/40)。

本發明的發明者等提出了一種形成紡絲溶液的方法，其係加熱熔解PLA並調製出熔融溶液，再將矽溶出型碳酸鈣粒子及磷酸鈣一起添加至熔融溶液中進行混合混煉，而後冷卻固化製備成複合體，最後再於溶劑中將複合體溶解而形成紡絲溶液(日本特許第5855783號)。根據此方法，可以製造出使50重量%以上的無機粒子均勻分散於聚乳酸樹脂中，且能夠在利用靜電紡絲法紡絲的狀態下加入無機粒子的紡絲溶液。然而，PLA在生物體內被分解吸收的速度緩慢，因此被指出該特性可能阻礙無機微粒在初期發揮骨形成功能。另外，若將粒徑為1~4μm左右的微粒粉末投入至加熱到PLA樹脂的熔點以上而熔融的溶液中進行混煉，會發生微粒的凝集，而導致 無法藉由混煉讓其完全分散於樹脂中而殘留的問題。

[先前技術文件] [專利文獻]

[專利文獻1]日本特許第5855783号 特許公報

[非專利文獻]

[非專利文獻1]可撓性、棉絨狀奈米複合物作為複合性缺陷的骨替代材料之體內及體外評估(In vivo and in vitro evaluation of flexible,cottonwool-like nanocomposite as bone substitute material for complex defects)，Acta Biomaterialia，5，2009，1775-1784，Stark等人，蘇黎世大學(University of Zurich)。

PLGA的水解非常迅速，在被植入生物體內後樹脂會被分解吸收，在初期即能緩慢釋放出骨形成因子而且不會在體內長時間殘留，因此較PLA更為優異，而成為廣泛用於製作骨再生用材料的支架的樹脂。然而，因PLGA的非晶性高，若要使用靜電紡絲法來製造生物可分解性纖維，PLGA是在纖維的成形、加工性上較PLA來的困難的材料。

為了讓磷酸鈣微粒發揮骨形成活性，包含盡可能多的骨形成因子是較理想的。然而，若在溶液中存在大量的粒子，則基於靜電紡絲法的紡絲容易變得困難。

因此需要一種可以在上述的狀況下，利用靜電紡絲法以能夠 商業實用化的水準，有效率地製造含有大量的磷酸鈣粒子之由PLGA組成的生物可分解性纖維而製成骨再生用材料的新的方法，以及利用該方法製造的新的骨再生用材料。

本發明是關於一種利用靜電紡絲法的商業化的製造方法，其目的是利用靜電紡絲法製成由含有大量的磷酸鈣粒子，特別是粒徑小的β-TCP微粒的PLGA樹脂組成的生物可分解性纖維。

本發明亦是關於一種生物可分解性纖維，該生物可分解性纖維是由包含磷酸鈣粒子的PLGA樹脂組成，且該PLGA樹脂是利用靜電紡絲法製造。

本發明亦是關於一種在上述製造方法中使用的靜電紡絲用紡絲溶液的製造方法。

本發明亦是關於一種不織布狀或棉狀的骨再生用材料以及其製造方法，該骨再生用材料是由以靜電紡絲法製造出的生物可分解性纖維組成。

於一實施態樣中，本發明提供一種由生物可分解性纖維組成的骨再生用材料的製造方法，其係利用靜電紡絲法來製造由生物可分解性纖維組成的骨再生用材料的方法，包含以下步驟：將PLGA樹脂投入捏合機中，加熱以使前述PLGA樹脂軟化至黏度達到10²~10⁷Pa‧s；一邊使前述捏合機的葉片旋轉一邊將磷酸鈣微粒粉體投入前述捏合機中，藉此混合前述粉體與軟化的前述PLGA樹脂； 透過使前述捏合機的葉片在前述加熱狀態下持續旋轉，對前述混合物施加熱能與機械能進行混煉，藉此打碎前述磷酸鈣微粒的凝集，進而製備出前述磷酸鈣微粒分散在前述PLGA樹脂中的複合體；將前述複合體冷卻固化；於溶劑中溶解冷卻固化後的前述複合體並攪拌既定時間，藉此製備出前述PLGA樹脂完全被前述溶劑溶解、且前述磷酸鈣微粒未凝集的分散於溶解了前述PLGA樹脂的溶液中的紡絲溶液；以及將前述紡絲溶液注入靜電紡絲裝置的注射器中並施加高電壓來進行靜電紡絲，藉此製造出一種前述磷酸鈣微粒物理性大致均勻地分散在其中的生物可分解性纖維。

較佳者，前述磷酸鈣微粒是β-TCP微粒。

較佳者，使前述PLGA樹脂在前述捏合機中軟化至黏度達到10^3.2~10^3.6Pa‧s。

於本發明的一實施態樣中，提供一種利用靜電紡絲法製造的由生物可分解性纖維組成的骨再生用材料，其中，前述生物可分解性纖維實質上由約30~60重量%的PLGA樹脂，以及約70~40重量%的磷酸鈣微粒組成，而且，前述生物可分解性纖維是透過以下流程製造：將既定量的PLGA樹脂投入加熱捏合機中，以既定的溫度進行加熱使樹脂軟化至黏度達到10²~10⁷Pa‧s後投入前述磷酸鈣微粒，再透過捏合機施加熱能與機械能，藉此使前述β-TCP微粒的凝集被打碎，進而製備出前述磷酸鈣微粒實質上均勻分散在前述PLGA樹脂中的複合體，將前述複合體冷卻固化後，於溶劑中 溶解並製備成紡絲溶液，再利用靜電紡絲法對紡絲溶液進行紡絲而製造出該生物可分解性纖維，此外，前述磷酸鈣微粒中的鈣離子未與前述PLGA樹脂中的羧基鍵結。

較佳者，前述磷酸鈣微粒是β-TCP微粒。

較佳者，使前述PLGA樹脂在前述捏合機中軟化至黏度達到10^3.2~10^3.6Pa‧s。

較佳者，將約30~50重量%的PLGA樹脂，約70~50重量%的磷酸鈣微粒投入前述捏合機中進行混煉。

較佳者，在將前述PLGA樹脂投入前述捏合機中加熱到軟化至既定黏度並混煉既定時間後，將磷酸鈣微粒粉末投入到前述捏合機中的經過混煉的前述PLGA樹脂之中，利用前述捏合機在與進行前述混煉時的溫度大致相同的溫度下，將前述PLGA樹脂和前述磷酸鈣微粒混煉既定時間。

較佳者，前述磷酸鈣微粒是β-TCP微粒。

較佳者，前述PLGA是僅含左旋(L)體的PLA和PGA的共聚物。

較佳者，前述PLGA是混雜了左旋體與右旋(D)體的PLA和PGA的共聚物。

較佳者，前述PLGA的乳酸和乙醇酸的比例約是85~50：15~50。

較佳者，前述β-TCP微粒的外徑為0.5~4μm。

較佳者，前述生物可分解性纖維的外徑為10~150μm。

較佳者，靜電紡絲裝置的收集器中裝滿了乙醇，從噴嘴射出的纖維沉澱在收集容器中的乙醇液裡並堆積成棉狀。較佳者，前述由生物 可分解性纖維組成的骨再生用材料的體密度為0.01~0.1g/cm³的棉狀。

較佳者，前述PLGA樹脂的分子量為6萬~60萬。

利用本發明提供的骨再生用材料的製造方法，可將一般而言在成形、加工上較PLA困難的PLGA作為生物可分解性樹脂使用，以靜電紡絲法有效率地商業化的製造出一種由生物可分解性纖維組成的骨再生用材料。

利用本發明提供的骨再生用材料的製造方法製造的生物可分解性纖維，係採用PLGA樹脂作為生物可分解性樹脂，由於在生物體內分解吸收迅速，可在初期即開始緩慢釋放β-TCP，進而促進骨形成。

利用本發明提供的方法製造的生物可分解性纖維，由於可在實施靜電紡絲後於收集器中堆積成棉狀並以此狀態回收，適合用於棉狀的骨再生用材料。

圖1是本發明實施例的骨再生用材料的概要照片。

圖2是本發明實施例的骨再生用材料的纖維表面的SEM照片。

圖3是使用本發明實施例的棉狀的骨再生用材料植入至人體脊椎固定用之植入裝置周圍的方法的示意圖。

圖4(1)顯示實驗1的結果(PLLGA)。

圖4(2)顯示實驗1的結果(PDLGA；樣本(5)~(7))、以及對照實驗1的結果(樣本(8)~(9))。

圖5(1)是顯示樣品(1)浸漬在氫氧化鈉溶液中經過0~8天後的外觀變化的照片。

圖5(2)是顯示樣品(2)浸漬在氫氧化鈉溶液中經過0~8天後的外觀變化的照片。

圖5(3)是顯示樣品(3)浸漬在氫氧化鈉溶液中經過0~8天後的外觀變化的照片。

圖5(4)是顯示樣品(4)浸漬在氫氧化鈉溶液中經過0~8天後的外觀變化的照片。

圖5(5)是顯示樣品(5)浸漬在氫氧化鈉溶液中經過0~8天後的外觀變化的照片。

圖6(1)顯示樣品(1)~(6)的DSC測定結果。

圖6(2)顯示樣品(1)~(6)的DSC測定結果。

圖7(1)顯示樣品(1)和(4)的NMR測定結果。

圖7(2)顯示樣品(1)和(4)的NMR測定結果。

圖8顯示本發明所使用的β-TCP的XRD測定結果。

以下，將參照圖式詳細地說明本發明的實施態樣。

<PLGA樹脂>

PLGA樹脂適合作為本發明的骨再生用材料的生物可分解性纖維的生物可分解性樹脂使用。本發明中所述的PLGA樹脂廣泛包含乳酸與乙醇酸的共聚物。由於PLGA樹脂通常是非晶性的，加熱後會軟化但不具有熔點。

本發明的PLGA樹脂的乳酸和乙醇酸的比例可根據需要而適當地選擇，包括85比15，75比25，50比50的比例。

聚乳酸(PLA)有僅由異構體的左旋體聚合而成的聚-L-乳酸(PLLA)與僅由右旋體聚合而成的聚-D-乳酸(PDLA)、以及左旋和右旋兩方的乳酸混合存在的PDLLA，而本發明中的PLGA可以是上述任一種類的聚乳酸與聚乙醇酸的共聚物。在本申請中將PLLA與PGA的共聚物稱為PLLGA，將PDLA與PGA的共聚物稱為PDLGA。如圖6(1)(2)的DSC測定結果所示，PLLGA具有結晶化部分，而PDLGA不具有結晶化部分。

<β相的磷酸三鈣>

作為本發明的骨再生用材料的骨形成因子，適合使用β相的磷酸三鈣(β-TCP)微粒。作為磷酸鈣，雖然一般所知為磷酸氫鈣、磷酸八鈣、磷酸四鈣、磷酸三鈣、以及碳酸磷灰石等生物可吸收性磷酸鈣等，但β-TCP是特別適合作為成骨細胞株的細胞增殖和分化的支架(scaffold)的物質。β-TCP微粒的外觀是粉末狀的。構成粉末的粒子的粒徑較佳為0.5~4μm。由於構成本發明的骨再生用材料的纖維的外徑為10~150μm，因此粒徑在4μm以下較佳。為了讓混煉過程中混合的磷酸鈣粒子能均勻分散，粒子的外徑亦較佳為與上述相同範圍的0.5~4μm左右。

如果本發明的磷酸鈣是幾乎未包含非晶相的β-TCP，則可以推測其與生物可分解性樹脂混煉時不會與聚合物分子產生鍵結。圖8中顯示本發明所使用的β-TCP的XRD測定結果。由於存在明確的波峰(peak)，顯示了β-TCP是有結晶性的。

<紡絲溶液的製造>

(1)通過混煉製成複合體

將顆粒狀的PLGA樹脂投入捏合機中加熱到作業溫度範圍內，藉此使PLGA樹脂軟化至黏度達到作業黏度範圍10²~10⁷Pa‧s，較佳軟化至黏度達到10^3.2~10^3.6Pa‧s。接下來，將粉末狀的磷酸鈣微粒投入捏合機中與生物可分解性樹脂混合並混煉一定時間，以製備出磷酸鈣粒子與生物可分解性樹脂的複合體。

複合體的重量比在較佳的情況下，PLGA樹脂約為30~60重量%，磷酸鈣微粒約為70~40重量%。在更佳的情況下，PLGA樹脂約為30~50重量%，磷酸鈣微粒約為70~50重量%。而在更佳的情況下，PLGA樹脂約為30重量%，磷酸鈣微粒約為70重量%。因在本發明中將PLGA樹脂與磷酸鈣的適當的重量比例嚴密的控制到個位數%是困難的，故上述的數值範圍加減5%都應被視為在範圍之內。

為了提高骨再生用材料的骨形成活性，儘可能的提高磷酸鈣的含量是較理想的。然而，實際上若磷酸鈣的含量超過70重量%(例如達到80重量%)，將難以從複合體調製紡絲溶液並以靜電紡絲法進行紡絲。

β-TCP微粒在與軟化後的PLGA樹脂混合時會發生凝集，但若與黏度10²~10⁷Pa‧s(更佳為10^3.2~10^3.6Pa‧s)的PLGA一起在捏合機中被施加一定時間的熱能及機械能進行混煉，β-TCP微粒的凝集會被物理性的打碎，聚合物進入到粒子間而可以達到磷酸鈣微粒實質上均勻分散於PLGA樹脂中的狀態。在這裡施加熱能及機械能是指在透過加熱樹脂使其軟化成高黏度狀態的情況下施加力進行揉合。經由在高黏度的狀態下被揉合，樹脂中所含有的磷酸鈣微粒的聚集體被物理性的打碎。

本發明所使用的捏合機，較佳為適合用於高黏度狀態下的混煉，或者適合用於伴隨著固體的粉碎的混煉之機種的混煉機。為了將磷酸鈣微粒在高黏度的生物可分解性樹脂中有效率的打碎，舉例來說，較佳為利用兩片螺紋型葉片以剪切不等速運動方式藉由葉片與壁面剪斷混合，特別是進行強力的粉碎捏合的PBV型捏合機。此外，具備筒式加熱器等，可在短時間內將樹脂加熱至熔點的機種較為理想。

為了在捏合機中對磷酸鈣粒子施加熱能和機械能，加熱軟化後的PLGA必須具有一定程度以上的黏度。為了讓PLGA樹脂達到合適的作業黏度範圍(10²~10⁷Pa‧s、更佳為10^3.2~10^3.6Pa‧s)，加熱溫度的範圍(作業溫度範圍)依PLGA樹脂的種類而異。PLLGA(85：15)時，約160℃較佳。在加熱溫度為較低溫度的情況下(例如對PLLGA加熱140℃)，捏合機需要更強大的力量進行揉合，使得混煉的效率變差。

如果進一步提升加熱溫度(例如對PLLGA從160℃左右進一步提升至190℃以上)，會導致PLGA樹脂的黏度下降成為液態，造成難以透過混煉施加機械能，使得磷酸鈣微粒的凝集較難被打碎，其結果會導致難以使β-TCP微粒均勻分散在PLGA樹脂中。

本發明中除了先將PLGA樹脂投入捏合機中進行加熱，其後再將磷酸鈣微粒投入進行混煉之外，亦可將PLGA樹脂和磷酸鈣微粒同時投入捏合機中進行混合混煉，或者亦可將混合了PLGA和磷酸鈣微粒之混合物投入捏合機中進行混煉。在使用結晶度低的PLGA的情況下加熱會使其黏度降低，故不先加熱PLGA樹脂而將PLGA樹脂與磷酸鈣微粒同時投入捏合機中進行混煉，如此能更容易施加熱能及機械能。

經由混煉，PLGA樹脂和磷酸鈣微粒之間在分子等級下會產生何種關係尚未明瞭。由對利用本發明方法製造的生物可分解性纖維的樣品進行固態核磁共振(NMR)測定的結果可知，PLGA樹脂的羧基與β-TCP的鈣離子之間並未產生鍵結。NMR測定的結果如圖7(1)及(2)所示。

如果β-TCP沒有非晶相，則可以推測其未與PLGA樹脂產生鍵結。如果磷酸鈣粒子與生物可分解性樹脂基體反應後表面具有鍵結，則在作為骨再生用材料使用的情況下，其是否會對生物體造成影響，此在藥物審查時可能會有疑慮，因此β-TCP和PLGA樹脂之間沒有產生鍵結是有利的。

在混煉PLGA樹脂和β-TCP微粒的過程中，β-TCP微粒雖沒有與PLGA的分子鍵結，但因PLGA樹脂可完全包覆β-TCP微粒的周邊，可推測製成纖維時並不會發生β-TCP微粒從PLGA樹脂散落脫離的狀況。

(2)複合體的冷卻、固化

將上述調製出的複合體從捏合機取出後使其在常溫下冷卻固化。當被加熱的複合體在冷卻的過程中達到結晶化溫度Tc(PLLGA的Tc約是130℃)時，可以推測分散在複合體中的β-TCP微粒會成為晶核劑而在PLLGA樹脂發生晶體生長。

如果在捏合機中將軟化的PLGA樹脂和β-TCP微粒混煉，並施加熱能及機械能使β-TCP微粒分散，則在該過程中PLGA的分子末端部會增加而形成大量的成核位置，因此在冷卻複合體的過程中可以推測PLGA樹脂的晶體生長會以該大量的成核位置做為起點而進行。然而，由於PLGA是嵌段共聚物，特別是PDLGA原本就非晶性高且晶化速度緩慢，就算經過混 煉而有大量的成核位置形成，可以推測將β-TCP微粒作為晶核的晶體生長並不會大量進行。

(3)利用溶劑溶解複合體

將上述製造出的複合體投入溶劑溶液中，攪拌以溶解複合體而製備紡絲溶液。為了要作為靜電紡絲的紡絲溶液，複合體必須要大致上完全被溶劑溶解。因此為了將複合體溶解，期望使用磁力攪拌器等在溶劑液中攪拌4小時以上。

因氯仿對於生物可分解性樹脂的溶解性優良，並且在靜電紡絲的過程中可以使溶劑從纖維中有效率的蒸發，故適合作為本發明中的溶劑使用。

被溶劑溶解的紡絲溶液中，樹脂的濃度可根據需要而適當地選擇調整，在利用靜電紡絲法紡絲時以8重量%~10重量%為佳。

PLGA樹脂在被溶劑溶解後分子鏈會被解開並因失去分子鏈間的拘束力而分散，排列好的分子鏈被賦予了自由度。可以推測其後經過靜電紡絲並被除去了溶劑的生物可分解性纖維的生物可分解性樹脂的分子會隨著纖維的固化而再度排列。

<靜電紡絲>

將上述調製出的紡絲溶液填充到靜電紡絲裝置的注射器中，透過對噴嘴施加電荷而在一定的方法/條件下將紡絲溶液從噴嘴以纖維狀射出，藉此利用靜電紡絲紡出生物可分解性纖維。

作為本發明的靜電紡絲法，適合採用乾式-濕式-電場紡絲法(Dry-Jet-Wet-Electrospinning)。乾式-濕式-電場紡絲法是一種將纖維由噴嘴射 出，在飛行中溶劑蒸發而使固化的纖維射入收集槽中的乙醇液的液面，使纖維在液中沉澱並在收集槽內堆集成棉狀的方法。生物可分解性樹脂雖會被氯仿溶解而成為ES紡絲溶液，但因不溶於填滿收集槽的乙醇，纖維在液相中堆積。關於乾式-濕式-電場紡絲法在聚羥基丁酸酯/聚羥基戊酸酯共聚物超細纖維經由乾式-濕式-電場紡絲法之形成及形態之研究(Study on the Morphologies and Formational Mechanism of Poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate)Ultrafine Fibers by Dry-Jet-Wet-Electrospinning)，Shuqi等人，奈米材料雜誌，第2012卷，Hindwi出版公司，2012年8月(Journal of Nanomaterials Volume 2012 Hindwi Publishing Corporation October 2012)、日本特開2012-161363、以及美國專利第8853298號等中有詳細揭示。

在本發明中，從噴嘴射出的纖維在充滿乙醇溶液的收集容器中沉澱並堆積在收集容器的板上。在乙醇液中氯仿從生物可分解性纖維的表面被除去，其結果能防止堆積在收集板上的纖維彼此黏附，而能得到如圖1所示的具有蓬鬆感的棉狀物。由本發明的生物可分解性纖維組成的棉狀的骨再生用材料具有約0.001~0.1g/cm³的體密度。較佳為0.01~0.1g/cm³，更佳為0.01~0.04g/cm³。在圖3中顯示了本發明的骨再生用材料的使用範例。本發明的骨再生用材料的纖維的外徑在10~150μm的範圍內，且棉的體密度在上述範圍之內，故使用性優越。

當PLGA樹脂是非晶性高的PDLGA時，由於堆積在收集器中的纖維較柔軟，所以些微殘留在紡成的纖維表面上的氯仿會導致纖維互相黏附而無法維持彼此獨立的纖維形狀，其結果會造成較難將堆積在收集容器乙醇液中的纖維以棉狀物收回。為了解決此問題以從收集器中將PLGA纖 維作為棉收回，期望能盡快乾燥並從纖維表面除去氯仿。

<生物可分解性纖維>

圖2和圖4顯示利用本發明的靜電紡絲法製造的骨再生用材料的生物可分解性纖維的外觀照片。纖維的外徑並不統一，雖然大致在10~150μm的範圍內，但平均直徑較佳為10~50μm。一般來說以靜電紡絲法進行紡絲時纖維的外徑通常容易在數μm以下，與其相比本發明的骨再生用材料的生物可分解性纖維較粗。透過將纖維的外徑提高到10μm以上，可以在本發明的棉狀多孔體內部的纖維與纖維之間創造出用於讓細胞進入的空間(間隙)。

由本發明的生物可分解性纖維製成的骨再生用材料的水解速度快，在被植入人體內後立即開始分解，其後在數個月以內就會被吸收至體內而消失。

本發明的骨再生用材料的生物可分解性纖維在纖維表面形成有無數個超細微的孔洞。基於靜電紡絲法的紡絲過程中，在從噴嘴以纖維狀射出的紡絲溶液的揮發過程中，於纖維表面上形成細微孔洞。本發明的骨再生用材料透過在生物可分解性纖維上形成超細微孔洞，使所含有的陶瓷粒子(骨形成因子)與體液的接觸面積顯著增加，而能得到較高的骨形成能力。

<滅菌處理>

本發明的骨再生用材料較佳在透過靜電紡絲而形成為棉狀後，使用鑷子等分成需要的尺寸/重量，再以鋁包裝並施加滅菌處理。滅菌方法有輻射滅菌(γ射線，電子束)、環氧乙烷氣體滅菌、高壓蒸汽滅菌等。在本發明中適合使用基於γ射線的輻射滅菌。

實驗1

1)實驗1的內容

將PLLGA和PDLGA兩種樹脂各自與β-TCP微粒以不同的混合比例及混煉條件製成PLLGA複合體的樣本(1)~(4)及PDLGA複合體的樣本(5)~(7)，並在以氯仿溶解上述製成的複合體後作為靜電紡絲法的紡絲溶液嘗試紡絲。

(I)PLLGA-混煉

‧將PLLA/PGA的共聚物(PLLGA 85：15)與β-TCP微粒投入捏合機中，在185℃下加熱混煉而製成含有30重量%的PLLGA和70重量%的β-TCP微粒的複合體，將複合體溶於氯仿中並作為紡絲溶液樣本(1)。

‧將PLLA/PGA的共聚物(PLLGA 85：15)與β-TCP微粒投入捏合機中，在165℃下混煉而製成含有30重量%的PLLGA和70重量%的β-TCP微粒的複合體，將複合體溶於氯仿中並作為紡絲溶液樣本(2)。

‧將PLLA/PGA的共聚物(PLLGA 85：15)與β-TCP微粒投入捏合機中，在115℃下混煉而製成含有30重量%的PLLGA和70重量%的β-TCP微粒的複合體，將複合體溶於氯仿中並作為紡絲溶液樣本(3)。

‧將PLLA/PGA的共聚物(PLLGA 85：15)與β-TCP微粒投入捏合機中，在165℃下混煉而製成含有50重量%的PLLGA和50重量%的β-TCP微粒的複合體，將複合體溶於氯仿中並作為紡絲溶液樣本(4)。

(II)PDLGA-混煉

‧將PDLA/PGA的共聚物(PDLGA 85：15)與β-TCP微粒投入捏合機中，在140℃下混煉而製成含有30重量%的PDLGA和70重量%的β-TCP微粒的複合體，將複合體溶於氯仿中並作為紡絲溶液樣本(5)。

‧將PDLA/PGA的共聚物(PDLGA 85：15)與β-TCP微粒投入捏合機中，在165℃下混煉而製成含有30重量%的PDLGA和70重量%的β-TCP微粒的複合體，將複合體溶於氯仿中並作為紡絲溶液樣本(6)。

‧將PDLA/PGA的共聚物(PDLGA 85：15)與β-TCP微粒投入捏合機中，在165℃下混煉而製成含有30重量%的PDLGA和70重量%的β-TCP微粒的複合體，將複合體溶於氯仿中並作為紡絲溶液樣本(7)。

(Ⅲ)PDLGA-無混煉(對照實驗1)

‧將PDLA/PGA的共聚物(PDLGA 85：15)與β-TCP微粒投入填滿氯仿的容器內，以攪拌器攪拌約4小時而製成含有50重量%的PDLGA和50重量%的β-TCP微粒的複合體，將複合體溶於氯仿中並作為紡絲溶液樣本(8)或(9)，如圖4(2)所示，樣本(8)用兩段混煉，樣本(9)用一段混煉。

(Ⅳ)PLLA-熔融混煉(對照實驗2)

‧將30重量%的PLLA和70重量%的β-TCP微粒一起投入捏合機中並在185℃~190℃下加熱，在使PLLA熔融後的狀態下進行混煉而製成PLLA和β-TCP微粒的複合體。

<樣品製作用的材料>

‧β-TCP(Ca₃(PO₄)₂)：使用太平化學產業股份有限公司的β-TCP-100。使用將粒徑1.7mm以下的β-TCP粉碎為4μm左右的β-TCP粉碎物。

‧PLGA：使用Evonik公司製的LG855S作為PLLGA。

使用Purac公司製的PDLG8531作為PDLGA。

<樣品製作條件>

‧捏合機條件

捏合機：使用桌上型捏合機PBV-0.1(批式、真空式、雙臂型捏合機。股份有限公司入江商會提供)。

‧ES條件

ES裝置：NANON(股份有限公司MECC提供)

溶劑：氯仿

溶劑中的樹脂濃度：8~10重量%

擠出速度：15ml/h

針的粗度為18G，電壓為25kV，噴嘴到收集器的射出距離為25cm。收集容器中填滿乙醇液，接收經過靜電紡絲紡出的絲使之堆積。

2)實驗1的結果

實驗1的結果顯示於圖4(1)和(2)。

當將捏合機的加熱溫度設定為165℃並將PLLGA和β-TCP微粒投入捏合機中進行混煉時，可利用捏合機在作業黏度範圍內對PLLGA和β-TCP微粒施加熱能和機械能進行揉合。當將捏合機的加熱溫度設定為185℃進行混煉時，會使PLLGA的黏度過低，β-TCP微粒粉體無法與PLLGA樹脂良好的混合，使一部份的粉末殘留。相反的，當將捏合機的加熱溫度設定為115℃進行混煉時，會使PLLGA的黏度過高，而難以利用捏合機混合β-TCP微粒粉體和PLLGA樹脂。

與PLLGA相比PDLGA較容易因加熱而造成黏度變低，在165℃下加熱混煉時，有樹脂附著於捏合機的葉片而造成粉末無法被混合而殘留的傾向。若為了在相同的加熱溫度下將粉體與樹脂混合，將聚合物與粉末共同混煉的時間延長約3分鐘則可勉強混合。然而，將以該方式製成的 複合體溶於氯仿中並進行ES紡絲後得到的纖維較柔軟，在乾燥後難以形成為棉狀。

在對照實驗1中，將不經由捏合機進行混煉的PLLGA和β-TCP微粒在充滿氯仿的容器中攪拌約4小時，藉此可調製出在氯仿/樹脂的溶液中使β-TCP微粒分散到肉眼無法見到粉體粒子的程度的溶液。然而，在將該溶液作為紡絲溶液注入靜電紡絲裝置的注射器中，並施加電壓嘗試進行紡絲時，會無法基於泰勒錐現象紡絲，紡絲溶液被從噴嘴推出後向下掉落堆積成粗的纖維狀。

在對照實驗2中，將PLLA(熔點180℃)和β-TCP微粒粉體以30重量%/70重量%的比例投入捏合機中在設定溫度185℃~190℃下加熱，且在PLLA已熔融的狀態下旋轉捏合機的葉片進行混煉，此時已熔融的PLLA樹脂會附著到捏合機的內壁面上，使β-TCP微粒粉末無法與一部份的PLLA樹脂混合而殘留白色粉末。

3)實驗1的結果分析與評價

將PLGA樹脂軟化至作業黏度範圍內後與β-TCP微粒粉體混合，並在以捏合機混煉後於溶劑中溶解製成紡絲溶液的方法，在製作使β-TCP微粒粉體分散混合於PLGA中的複合體時非常有效。相反的，混煉時，若PLGA樹脂的黏度範圍比作業黏度範圍高或低，會造成粉體不易分散在PLGA樹脂中，而難以製作複合體，其結果導致於溶劑中溶解該複合體後會難以利用靜電紡絲法進行紡絲。

雖然相較於PLLGA，PDLGA的非晶性高，因此不容易成形加工，但使用本發明的方法可以在含有大量β-TCP微粒的狀態下以靜電紡 絲法進行紡絲。然而，紡絲而成的PDLGA纖維較為柔軟，會傾向於因些微殘留在纖維表面的氯仿而造成纖維互相黏著。因此，雖然在乙醇液中可以勉強使其堆積成棉狀，但從乙醇液中取出時就很難維持每一根都彼此獨立的纖維形狀。為了要從收集器回收棉狀的生物可分解性纖維，推測有必要儘快從纖維中除去氯仿使其乾燥。

實驗2

1)實驗2的內容

製備由PLGA和β-TCP組成的生物可分解性纖維的樣品(1)~(6)，測量各樣品的PLGA的結晶度及在水溶液中的崩壞性差異，以及NMR。

(1)70 β-TCP-30PLLGA(85：15)

(2)60 β-TCP-40PLLGA(85：15)

(3)50 β-TCP-50PLLGA(85：15)

(4)100PLLGA(85：15)

(5)70 β-TCP-30PDLGA(85：15)

(6)50 β-TCP-50PDLGA(85：15)

<樣品製作用的材料>

‧β-TCP(Ca₃(PO₄)₂)：使用太平化學產業股份有限公司的β-TCP-100。使用將粒徑1.7mm以下的β-TCP粉碎為4μm左右的β-TCP粉碎物。

‧PLGA：使用Evonik公司製的LG855S作為PLLGA(85：15)。使用Purac公司製的PDLG8531作為PDLGA(85：15)。

<樣品的製作條件>

‧捏合機條件

捏合機：桌上型捏合機PBV-0.1(股份有限公司入江商會提供)。

溫度：160℃

時間：將聚合物單獨混煉3分半，其後加入TCP並混煉11分，合計共混煉14分半。對於(6)50 β-TCP-50PDLGA(PDLGA 85：15)，則將聚合物和β-TCP同時投入捏合機中混煉14分半。

‧ES條件

ES裝置：NANON(股份有限公司MECC提供)

溶劑：氯仿

溶劑中的樹脂濃度：(1)~(4)為8重量%、(5)為16重量%、(6)為12重量%

電壓：(1)~(4)為20kV、(5)為28kV、(6)為25kV

擠出速度：15ml/h

針的粗度為18G，電壓為20~28kV，噴嘴到收集器的射出距離為25cm。收集容器中填滿乙醇液，接收經由靜電紡絲形成的絲使之堆積。

<DSC測定>

以DSC測量樣品(1)~(6)的結晶度。

<NMR測定>

藉由NMR檢查樣品(1)和(4)中PLGA的羧基與β-TCP的鈣離子之間是否形成配位鍵。

<在水溶液中的崩壞性測定>

將樣品(1)~(5)浸漬於氫氧化鈉水溶液中，評價浸漬既定時間後的棉的崩壞性。

‧溶液：5mmol/L氫氧化鈉水溶液

‧浸漬時間：0，3，6，8天

‧樣品重量各100mg

‧溶液量：20ml

‧在室溫下靜置

‧早晚翻轉容器，進行攪拌。

‧在浸漬當下及浸漬後的適當的時間點拍照，觀察外觀變化。

2)實驗2的結果

<DSC測定>

結果如圖6(1)和(2)所示。

<NMR測定>

結果如圖7(1)(2)所示。

<在水溶液中的崩壞性測定>

結果如圖5(1)~(5)所示。

將樣品(1)(30 PLLGA-70 β-TCP)浸漬於氫氧化鈉水溶液中，在經過浸漬時間：0，3，6，8天後觀察外觀變化，結果在浸漬開始6天後，棉的體積目視上減少至2/3左右，若輕輕地攪拌，可見到大量的短纖維在容器中擴散。在浸漬開始8天後，棉的體積目視上再減少至1/3左右，若輕輕地攪拌，可見到短纖維擴散至容器整體。

將樣品(2)(40 PLLGA-60 β-TCP)浸漬於氫氧化鈉水溶液中，在經過浸漬時間：0，3，6，8天後進行觀察，結果觀察到與樣品(1)大體上 相同的現象，但在浸漬開始後，棉的目視上的體積減少比樣品(1)慢，輕輕地攪拌時容器內的分散的短纖維也較樣品(1)少。

將樣品(3)(50 PLLGA-50 β-TCP)浸漬於氫氧化鈉水溶液中，在經過浸漬時間：0，3，6，8天後進行觀察，結果觀察到與樣品(1)(2)大體上相同的現象，但在浸漬開始後的棉的目視上的體積減少比樣品(2)更慢，輕輕地攪拌時容器內的分散的短纖維也較樣品(2)更少。

將樣品(4)(100PLLGA)浸漬於氫氧化鈉水溶液中，在經過浸漬時間：0，3，6，8天後進行觀察，結果在浸漬開始8天後，棉的體積目視上僅有些微的減少，輕輕地攪拌時容器內的分散的短纖維亦較少。

將樣品(5)(30 PDLGA-70 β-TCP)浸漬於氫氧化鈉水溶液中，在經過浸漬時間：0，3，6，8天後進行觀察，結果在浸漬開始3天後，大體上無法目視辨認出棉，輕輕地攪拌時短而細的纖維擴散至容器整體。此現象在經過6天，8天後更加明顯。

3)實驗結果的分析與評價

(i)差示掃描量熱法(DSC)測定

樣品的結晶度，在PLLGA/β-TCP中，PLLGA的含量越低β-TCP的含量越高時，結晶度越低。不含有β-TCP的PLLGA100%樣品的結晶度遠較含有β-TCP的樣品為高。

(ii)崩壞性測定

PLLGA/β-TCP樣品中，PLLGA的含量越低β-TCP的含量越高時，水解速率越快。該結果可推測是由於樣品的PLLGA的結晶度越低水解速率就越快。

(iii)NMR測定

測定PLGA(100)和TCP/PLGA(70-30)的¹³C CP/MAS-NMR光譜。

調整擴大羰基(C=O；~170ppm)周圍的相位，進行峰擬合。雖因雜訊多而不易辨認，但PLGA(100)與β-TCP/PLGA(70-30)仍可分離(高斯)出虛線所示的較寬的波峰和虛線所示的峰頂為170.4ppm的波峰。由於皆沒有觀察到磁場位移的波峰，因此可以判斷羧基未與Ca²⁺離子形成配位鍵。此外，雖然無法下定論，但虛線的分離波峰可能起因於高非晶性的波動。

本申請的實施例中，作為生物可分解性樹脂，雖採用乳酸和乙醇酸的比例為85比15的PLGA，但乳酸和乙醇酸的比例不限於此，亦包含75比25，50比50的比例。乙醇酸的比例越高，PLGA的非晶性越高，且以其生產出的生物可分解性纖維的水解速率越快。

使用本發明的方法製造的骨再生用材料除了可以單獨使用外，亦可在以棉材包住自體骨的狀態下填補在骨缺損處使用。由於本發明的骨再生用材料與自體骨具有高親和性，可在這個狀態下被填充到缺損處幫助骨形成。圖3顯示了以本發明的骨再生用材料包住自體骨的使用狀態。

使用本發明的方法製造的骨再生用材料，由於β-TCP微粒均勻地分散在生物可分解性纖維中，可推測PLGA的分解吸收和β-TCP的骨置換是同時並進並且持續發生的。

Claims (15)

1. 一種利用靜電紡絲法的由生物可分解性纖維組成的骨再生用材料的製造方法，其係利用靜電紡絲法來製造由生物可分解性纖維組成的骨再生用材料的方法，包含以下步驟：將PLGA樹脂投入捏合機中，一邊使該捏合機的葉片旋轉一邊進行加熱，藉此使該PLGA樹脂軟化至黏度達到10²~10⁷Pa‧s；一邊使該捏合機的葉片旋轉一邊將磷酸鈣微粒粉體投入該捏合機中，藉此混合該粉體與軟化的該PLGA樹脂；透過使該捏合機的葉片在該加熱狀態下持續旋轉，對該混合物施加熱能與機械能並進行混煉，藉此製備出該磷酸鈣微粒分散在該PLGA樹脂中的複合體；將該複合體冷卻固化；於溶劑中溶解冷卻固化後的該複合體並攪拌既定時間，藉此製備出該PLGA樹脂完全被該溶劑溶解、且該磷酸鈣微粒大致均勻分散在溶解了該PLGA樹脂的溶劑中的紡絲溶液；以及將該紡絲溶液注入靜電紡絲裝置的注射器中並施加電壓來進行靜電紡絲，藉此製造出一種該磷酸鈣微粒大致均勻地分散在其中的生物可分解性纖維。
2. 如申請專利範圍第1項所述的利用靜電紡絲法的由生物可分解性纖維組成的骨再生用材料的製造方法，其中，使該PLGA樹脂軟化至黏度達到10^3.2~10^3.6Pa‧s。
3. 如申請專利範圍第1或2項所述的利用靜電紡絲法的由生物可分解 性纖維組成的骨再生用材料的製造方法，其中，該磷酸鈣微粒為β-TCP微粒。
4. 如申請專利範圍第1項所述的利用靜電紡絲法的由生物可分解性纖維組成的骨再生用材料的製造方法，其中，將約30~50重量%的PLGA樹脂，約70~50重量%的磷酸鈣微粒投入該捏合機中進行混煉。
5. 如申請專利範圍第1項所述的利用靜電紡絲法的由生物可分解性纖維組成的骨再生用材料的製造方法，其中，在將該PLGA樹脂投入該捏合機中加熱到軟化至既定黏度並混煉既定時間後，將該磷酸鈣微粒粉末投入到該捏合機中的經過混煉的該PLGA樹脂之中，利用該捏合機在與進行該混煉時的溫度大致相同的溫度下，將該PLGA樹脂與該磷酸鈣微粒混煉既定時間。
6. 如申請專利範圍第1項所述的利用靜電紡絲法的由生物可分解性纖維組成的骨再生用材料的製造方法，其中，該PLGA樹脂是僅含左旋體的PLA與PGA的共聚物。
7. 如申請專利範圍第1項所述的利用靜電紡絲法的由生物可分解性纖維組成的骨再生用材料的製造方法，其中，該PLGA樹脂是混雜了左旋體與右旋體的PLA與PGA的共聚物。
8. 如申請專利範圍第1項所述的利用靜電紡絲法的由生物可分解性纖維組成的骨再生用材料的製造方法，其中，該PLGA樹脂的乳酸與乙醇酸的比例約為85~50：15~50。
9. 如申請專利範圍第3項所述的利用靜電紡絲法的由生物可分解性纖維組成的骨再生用材料的製造方法，其中，該β-TCP微粒的外徑約為0.5 ~4μm。
10. 如申請專利範圍第1項所述的利用靜電紡絲法的由生物可分解性纖維組成的骨再生用材料的製造方法，其中，該生物可分解性纖維的外徑約為10~150μm。
11. 如申請專利範圍第1項所述的利用靜電紡絲法的由生物可分解性纖維組成的骨再生用材料的製造方法，其中，該由生物可分解性纖維組成的骨再生用材料的堆積密度為約0.01~0.1g/cm3的棉狀。
12. 如申請專利範圍第1項所述的利用靜電紡絲法的由生物可分解性纖維組成的骨再生用材料的製造方法，其中，該PLGA樹脂的分子量約為6萬~60萬。
13. 如申請專利範圍第1項所述的利用靜電紡絲法的由生物可分解性纖維組成的骨再生用材料的製造方法，其中，該捏合機為雙臂型的桌上型捏合機。
14. 如申請專利範圍第1項所述的利用靜電紡絲法的由生物可分解性纖維組成的骨再生用材料的製造方法，其中，該捏合機為批式捏合機。
15. 如申請專利範圍第1項所述的利用靜電紡絲法的由生物可分解性纖維組成的骨再生用材料的製造方法，其中，該捏合機為真空式捏合機。