CN112980012A - 基于磁性纳米纤维的取向材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于磁性纳米纤维的取向材料及其制备方法和应用，将磁性纳米材料与纳米纤维材料结合，将混合溶液在磁场中交联并经磁场诱导形成取向凝胶，即得到基于磁性纳米纤维的取向材料。本发明利用磁场对磁性纳米纤维在成凝胶基质中预处理形成预设的取向结构，再经成凝胶基质交联、固化而固定预设的取向结构，所制备的取向材料可用于研究纳米‑微米‑宏观尺度下材料性质与细胞行为关系，揭示材料对细胞行为调控机制。

Description

基于磁性纳米纤维的取向材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及功能材料技术领域，尤其涉及一种基于磁性纳米纤维的取向材料及其制备方法和应用。
背景技术
细胞外基质(ECM)是仿生结构构建的核心要素。ECM不仅充当结构支撑作用，提供生物化学物质(如生长因子和表面化学)及生物物理线索(如纤维结构、亲水性及黏性)，还负责调节可溶性因子的扩散，介导细胞和微环境的机械性能信号传递，从生物、生物化学和生物物理等多因素调控细胞行为。天然细胞外基质在神经、角膜、心脏和肌腱等组织中具有高度定向的特征。为了模拟天然细胞外基质的纤维结构，越来越多的研究将纳米纤维加入到生物活性基质中。纳米纤维能够在形态及尺寸上模拟天然细胞外基质纤维，可以很好诱导细胞在其上的粘附与增殖。
目前制造纳米纤维的方法有很多，如拉伸法、模板聚合法、微相分离法、自组织法和静电纺丝法等。静电纺丝工艺是一种简单、有效的合成纳米纤维的方法，能够直接、连续地制备聚合物纳米纤维，具有实验条件温和、成本低廉、易操作、可以合成的材料种类多等优势。纺丝过程可控，可根据需要纺出各种形态、各种取向的纤维以满足多种性能的要求。通过静电纺丝法制得的纳米纤维具有纤度细、比表面积大、孔隙率高、长径比大、力学性能好等特点。
而磁性纳米纤维由于对磁场良好的响应性，可以在磁场诱导下形成取向。再与胶原蛋白、生物活性肽等活性成分结合可进一步引导细胞定向迁移，促进细胞黏附、增殖及分化，在神经、心肌、肌腱、骨组织再生及伤口愈合等领域中有广泛的应用。
磁性材料与纤维材料结合多用于取向静电纺丝薄膜或支架的制备，以研究纤维对细胞行为的影响以及磁场和取向共同作用下的细胞行为。但是该技术与静电纺紧密结合，静电纺一体成型的取向纳米纤维不具备取向结构设计性，无法对纤维取向结构灵活调控，无法实现如一定角度，梯度，放射状等取向结构的构建。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种基于磁性纳米纤维的取向材料及其制备方法和应用，本发明利用毫米级别长度的磁性丝素蛋白纳米纤维在磁场中的响应性构建多尺度仿生结构，可用于研究纳米-微米-宏观尺度下材料性质与细胞行为关系，揭示材料对细胞行为调控机制。
本发明将磁性纳米材料与纳米纤维材料结合，利用磁场对磁性纳米纤维在成凝胶基质中预处理形成预设的取向结构，再经成凝胶基质交联、固化而固定预设的取向结构。
本发明的技术方案如下：
一种基于磁性纳米纤维的取向材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将磁性丝素蛋白纳米纤维与浓度为0.1～30wt％的丝素蛋白溶液或光敏丝素蛋白溶液混匀后得到混合溶液，所述磁性丝素蛋白纳米纤维的直径为100～400nm，长度在1μm以上，所述磁性丝素蛋白纳米纤维与丝素蛋白溶液的质量比为1：100～100：0.1；
(2)将所述混合溶液中的磁性纳米纤维在磁场中经磁场诱导取向并交联，形成取向凝胶，即得到所述基于磁性纳米纤维的取向材料；
其中，磁性丝素蛋白纳米纤维包括丝素蛋白纤维以及分布于丝素蛋白纤维内部和/或表面的磁性纳米颗粒；磁性丝素蛋白纳米纤维的制备方法包括以下步骤：
采用静电纺丝法制备磁性丝素蛋白纳米纤维膜，然后将磁性丝素蛋白纳米纤维膜粉碎后得到磁性丝素蛋白纳米纤维。
进一步地，在步骤(2)中，交联方法包括超声凝胶法、PEG(聚乙二醇)凝胶法、HRP(辣根过氧化物酶)凝胶法或光交联凝胶法，其中，超声凝胶法时将混合溶液超声处理后得到溶胶后进行交联；PEG凝胶法是在混合溶液中加入PEG后进行交联，PEG与混合溶液中的丝素蛋白的质量比为1:2～4；HRP凝胶法是在混合溶液中加入HRP和过氧化氢后进行交联，HRP的添加量为5～40U，过氧化氢添加量为0.825～6.6mM；采用光交联凝胶法时，步骤(1)选用光敏丝素蛋白溶液制备混合溶液，并在混合溶液中加入引发剂后进行光交联；或者步骤(1)选用丝素蛋白溶液制备混合溶液，并在混合溶液中加入光敏剂后进行光交联。
进一步地，在步骤(2)中，磁场的构建方式包括利用平行永磁铁构建或通电螺线管构建，磁场的强度为0.02～0.1T；交联时，将待交联的溶液或溶胶置于磁场中。
磁性丝素蛋白纳米纤维具有磁响应性，即在外加磁场的作用下沿着磁场取向排列；形成取向凝胶后，在无磁场作用时，凝胶中的磁性丝素蛋白纳米纤维能够保持取向排布。
在本发明一具体实施方式中，步骤(2)包括以下步骤：
将步骤(1)得到的混合溶液进行超声处理；将超声处理后的溶胶放置在两块平行放置的永磁铁中间区域静置5～30分钟，使磁性纳米纤维在磁场作用下呈同向均一取向排列，1～6h后凝胶逐渐形成，取向结构固定。
优选地，永磁铁可以采用钕铁硼磁铁或铁钴镍磁铁。利用平行放置的永磁铁构建外加磁场进行磁性诱导，当两磁铁之间的距离较小，中间的区域磁场近似均匀。
在本发明一具体实施方式中，步骤(2)包括以下步骤：
将步骤(1)得到的混合溶液与PEG混合，通过下面的方式进行磁性诱导：制作一定规格的通电螺线管，通入直流电使轴线磁场强度达到0.02～0.1T。将螺线管竖直放置套在装有溶胶的烧杯外，由于有限长通电螺线管内部的轴向磁场近似是匀强磁场，但两端磁感应强度会略微减弱，因此将烧杯垫高使烧杯中的溶胶位于螺线管中部，同时在磁场作用过程中进行均匀搅拌，避免径向磁感应强度的影响，使纳米纤维受到相同的磁场力作用，沿磁场线方向取向排列，处理5～30min后可以得到取向凝胶。优选地，混合后成凝胶时间≤30分钟。PEF分子量为400～600，PEG与丝素蛋白质量比例1:2～4。
在本发明一具体实施方式中，步骤(2)包括以下步骤：
将步骤(1)得到的混合溶液与HRP、过氧化氢相混合，磁性诱导方式可采用平行永磁铁构建或通电螺线管构建的磁场，混合后成凝胶时间≤30分钟。HRP添加量5～40U，过氧化氢添加量0.825～6.6mM。
丝素蛋白含有酪氨酸，可通过HRP、H2O2作用，酶交联形成网状结构，固定磁性纳米纤维取向结构，形成取向凝胶。
在本发明一具体实施方式中，步骤(2)包括以下步骤：
将磁性丝素蛋白纳米纤维与浓度为2～8wt％的光敏丝素蛋白溶液和引发剂混匀后得到混合溶液，在紫外光照射下形成凝胶，成凝胶时间≤30分钟。磁性诱导方式与上述两种方式相同。
光交联丝素蛋白溶液制备方法包括以下步骤：将脱胶蚕丝用LiBr溶解后，加入甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)溶液反应得到SilMA光敏丝素蛋白溶液，对应引发剂为LAP，光源为强度3.5mJ/cm2的紫外光，引发剂添加比例1:25～75，。
在本发明一具体实施方式中，步骤(2)包括以下步骤：
将磁性丝素蛋白纳米纤维与浓度为2～8wt％的丝素蛋白溶液和生物光敏剂核黄素混合，经磁性诱导后在紫外灯下交联得到光固化丝素蛋白水凝胶。核黄素在紫外光的照射下，激发生成三线态，转移生成单线态氧为主的活性氧自由基。活性氧自由基可与各种分子发生反应，诱导丝素蛋白大分子中的氨基、苯酚基以及其他基团产生化学交联，获得光固化水凝胶。
进一步地，磁性丝素蛋白纳米纤维中，磁性纳米颗粒以及丝素蛋白的质量比为1:20～50；磁性纳米颗粒的粒径为10～30nm。
进一步地，磁性纳米颗粒为磁性丝素/Fe3O4复合纳米颗粒或不含丝素蛋白的磁性Fe3O4纳米颗粒。
进一步地，磁性丝素蛋白纳米纤维膜的制备方法包括以下步骤：
a1：将铁源或含铁复合金属源利用溶剂热法或化学共沉淀法制备磁性Fe3O4纳米颗粒；含铁复合金属源包括铁源和除铁源外的其他金属源；
a2：将磁性Fe3O4纳米颗粒、浓度为10～20wt％的丝素蛋白溶液和PEG混匀，得到静电纺丝液，将静电纺丝液进行静电纺丝，原位生成得到磁性丝素蛋白纳米纤维膜，再通过乙醇后处理稳定结构。
进一步地，在步骤a1中，铁源可以为亚铁盐和/或铁盐，优选FeCl3.6H2O和/或Fe(NO3)3·9H2O，其他金属源为Ni(NO3)2·6H2O、Zn(NO3)2·6H2O、Sr(NO3)2等。
采用溶剂热法制备磁性Fe3O4纳米颗粒方法如下：将铁源或含铁复合金属源在水热反应釜中经还原剂还原制得磁性Fe3O4纳米颗粒，其为超顺磁性纳米颗粒，具有磁响应性。还原剂可以为柠檬酸钠、醋酸钠、水合肼(N2H4·H2O)、DMF(二甲基甲酰胺)溶液、酒石酸钾、丙烯酸钠。
采用化学共沉淀法制备磁性Fe3O4纳米颗粒方法如下：将Fe2+和Fe3+的硫酸盐或盐酸盐溶液混合，用过量的氨水或NaOH溶液在一定温度和pH值下，高速搅拌进行沉淀反应，得到Fe3O4的纳米颗粒，具有磁响应性。这种方法制得的Fe3O4粒子细小、均匀、饱和磁化强度高。优选地，Fe2+和Fe3+的摩尔比为l：1.7～2.5，氨水浓度为25％～30％，NaOH溶液浓度为3～4mol/L。优选地，温度为80～100℃，pH值为10～13
进一步地，磁性Fe3O4纳米颗粒的直径小于等于20nm，具有超顺磁性。超顺磁纳米粒子没有矫顽力，对外磁场的磁感应几乎可以达到瞬间磁化和退磁。此外，超顺磁纳米粒子没有剩磁，可避免由于剩磁作用发生团聚，在溶液、纤维膜中都有均匀的分散和分布。
进一步地，在步骤a2中，先将丝素蛋白溶液溶解于质量分数为50％～70％的PEG溶液中再与磁性Fe3O4纳米颗粒，超声分散均匀得到静电纺丝液。
优选地，PEG分子量为400。
进一步地，磁性丝素蛋白纳米纤维膜的制备方法包括以下步骤：
将铁源、浓度为10～20wt％的丝素蛋白溶液和PEG混匀，得到静电纺丝液，将静电纺丝液进行静电纺丝，然后将得到的纺丝膜经还原剂发生还原反应，得到磁性丝素蛋白纳米纤维膜。优选地，铁源为1wt％氯化亚铁溶液或硝酸铁溶液，铁源与丝素蛋白的质量比为1:50～200。还原剂包括H2O2溶液和/或柠檬酸，铁元素与还原剂之间的摩尔比为1:0.8～3。
进一步地，磁性丝素蛋白纳米纤维膜的制备方法包括以下步骤：
b1：将铁源或含铁复合金属源利用溶剂热法或化学共沉淀法制备磁性Fe3O4纳米颗粒；含铁复合金属源包括铁源和除铁源外的其他金属源；
b2：将浓度为10～20wt％的丝素蛋白溶液和PEG混匀，得到静电纺丝液，将静电纺丝液进行静电纺丝，然后将得到的纺丝膜在磁性Fe3O4纳米颗粒的悬浮液中孵育3～12小时，丝素蛋白与磁性Fe3O4纳米颗粒通过之间的静电吸附作用、亲疏水相互作用、化学交联作用相结合，然后用高速离心机离心后洗涤，重复离心洗涤三次，得到磁性丝素蛋白纳米纤维膜。
本发明中，静电纺丝条件为：电压12～24kV，推动速度0.2～2.0mL/h，电场极距为12～20cm。
本发明中，浓度为2～8wt％的丝素蛋白溶液的制备方法如下：
首先将丝源进行脱胶，脱胶后用纯水搓洗至无滑腻感，放入通风橱中过夜干燥。接着，配置溶丝溶液，抽滤后将脱胶蚕丝浸入，用锡箔纸进行封口，放入烘箱中溶解，全部溶解后，放入透析袋中，在去离子水中透析36h以上，得到丝素蛋白溶液。
优选地，丝源可选用生丝或者蚕茧。
优选地，脱胶方法可选用碳酸钠脱胶、尿素脱胶、碱性蛋白酶脱胶、中性皂脱胶、酒石酸脱胶。
优选地，碳酸钠脱胶时间为15～120分钟。
优选地，溶丝溶剂：溴化锂、氯化钙、NaSCN、CaCl2-CH3CH2OH-H2O三元混合液。
优选地，溶丝时间1～24小时，溶丝温度45～200℃。
本发明中，浓度为10～20wt％的丝素蛋白溶液的制备方法如下：
方法一，直接干燥法：将浓度为2～8wt％的丝素蛋白溶液倒入广口烧杯中，在一定温度、湿度条件下干燥浓缩，得到丝素蛋白浓缩液。优选地，干燥的初期温度4～12℃，湿度40～80％下浓缩1～2天，后期不控制温度和湿度，浓缩3～5天。
方法二，PEG浓缩法：配制聚乙二醇(PEG)浓缩液，将浓度为2～8wt％的丝素蛋白溶液倒入透析袋(截留分子量3500)封口，放置于PEG浓缩液中进行浓缩。优选地，PEG分子量8000～20000，浓度10～30％，时间24～48h。
进一步地，将磁性丝素蛋白纳米纤维膜粉碎时，所采用的方法为机械剪碎法、高速匀浆处理法及超声分散处理法；其中，高速匀浆处理法的转速为4000～12000r/min，匀浆液中磁性丝素蛋白纳米纤维膜的浓度3％～12％；超声分散处理法功率为270～900W，时间为20～30min，超声液中磁性丝素蛋白纳米纤维膜浓度5％～10％。机械剪碎法可采用剪刀剪碎，剪碎尺寸大小为1～2mm×2～3mm。
本发明还要求保护一种采用上述制备方法所制备的基于磁性纳米纤维的取向材料，取向材料为纤维材料、膜材料或支架材料。
本发明还公开了上述基于磁性纳米纤维的取向材料在制备细胞生长培养材料或人工组织替代材料中的应用。其可用作细胞培养支架或体内组织再生和功能重建的人工材料。
上述基于磁性纳米纤维的取向材料作为细胞生长培养材料时，其方法包括以下步骤：
将细胞接种到基于磁性纳米纤维的取向材料上，进行常规培养。
优选地，细胞选用人骨髓间充质干细胞(hMSCs)或人真皮成纤维细胞(hFBs)，接种前分别采用含胎牛血清(10％v/v)的α-MEM培养基和加入10％胎牛血清、100U/mL链霉素/青霉素的DMEM培养基进行培养。
利用本发明构建的基于磁性纳米纤维的取向材料可研究材料性质与细胞行为关系，揭示材料对细胞行为调控机制。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明利用具有磁场响应性的磁性纳米纤维与丝素蛋白溶液或光敏丝素蛋白溶液混合后，在磁场诱导作用下形成取向凝胶，丝素蛋白溶液或光敏丝素蛋白溶液作为成凝胶基质，磁性纳米纤维与成凝胶基质相互匹配，不影响成凝胶基质交联成凝胶性质；同时成凝胶后可以固化所设计的取向结构。
本发明在制备基于磁性纳米纤维的取向材料时，使用的丝素蛋白是天然高分子材料，无毒、低细胞粘附、微弱或无抗原性，来源广泛，获得了食品药品监管局批准，可用作生物材料，使得取向材料的生物相容性好。
本发明制备的基于磁性纳米纤维的取向材料可作为细胞生长培养材料，拓展了取向和磁场对细胞行为影响的研究及其应用。且该细胞生长培养材料无毒可降解，适合生物细胞在其中粘附、增殖和取向生长，且具有稳定的有序取向结构，是体内组织再生和功能重建的理想材料。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细说明如后。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1。
采用静电纺丝法一步制备磁性纳米纤维，包括如下步骤：
S1，制备丝素蛋白溶液
(1)蚕丝脱胶：称取25.44g～60g无水Na2CO3溶解于12L即将沸腾的去离子水中，待其溶解后，将30g～60g生丝或者蚕茧放入其中煮沸15～120min，取出后，用去离子水对脱胶后得到的丝素蛋白纤维多次搓洗至无滑腻感，放入通风橱中过夜干燥。
上述脱胶方法还可选用尿素脱胶、碱性蛋白酶脱胶、中性皂脱胶、酒石酸脱胶。
(2)丝素蛋白溶解：配置9～9.5mol/L溴化锂溶液100mL，放于磁力搅拌器上快速搅拌溶解，然后使用抽滤机抽滤2～3次后，将脱胶蚕丝浸入，用锡箔纸进行封口，放入40～200℃烘箱内溶解1～24h，每隔1～3h震荡一次。全部溶解后，放入透析袋(截留分子量为3500Da)中，在去离子水中透析36～72h，每3～6h更换一次水，从而去除溶液中的盐离子，最后将透析好的丝素蛋白溶液用锡箔纸封口存放于4℃冰箱中备用。
上述溶丝溶剂还可选用NaSCN、CaCl2-CH3CH2OH-H2O(1：2：8)三元混合液。
(3)丝素蛋白溶液的浓度测定：采用称重法对得到的丝素蛋白溶液的浓度进行测定。取一个洁净干燥的称量船，称重并记录质量为W0(g)。向其中加入1mL左右制得的丝素蛋白溶液后称重并记录质量为W1(g)。将该盛有丝素蛋白溶液的称量船放入60℃烘箱中烘干至恒重，称重并记录质量记为W2(g)。最后根据如下公式计算即可获得该丝素蛋白溶液的浓度。上述方法得到的丝素蛋白溶液，浓度在2～8wt％。
Figure BDA0002947244550000071
S2，丝素蛋白溶液浓缩
称取100～300g聚乙二醇8000～20000，溶于去离子水，定容1L。将透析袋浸入去离子水30min，取出S1制得的丝素蛋白溶液，倒入透析袋(截留分子量3500)中封口，置于聚乙二醇溶液中，浓缩12～48h。
上述浓缩方法还可选用直接干燥法：将S1中制得的丝素蛋白溶液倒入广口烧杯中，初期在温度4～12℃，湿度40～80％条件下浓缩1～2天，后期不控制温度和湿度浓缩3-5天得到丝素蛋白浓缩液。适宜静电纺丝的丝素蛋白浓缩液浓度为10～20wt％。
S3：磁性纳米颗粒制备方法
溶剂热法制备超顺磁性的Fe3O4纳米颗粒：
将5～10mmol FeCl3·6H2O迅速加入到60～80mL乙二醇溶液中，搅拌至形成均一混合液后，再加入1.5～2g PEG-1500和40～50mmol CH3COONa·3H2O，继续搅拌至其完全溶解，将此混合液转移到100mL拥有聚四氟乙烯内胆的不锈钢水热反应釜中，于160～200℃反应8～12h，反应结束后自然冷却到室温。产物分别用乙醇和超纯水在8000rpm/min的转速下离心洗涤3次后置于60℃真空烘箱中干燥至恒重，获得具有超顺磁性的Fe3O4纳米颗粒。
铁源还可以为Fe(NO3)3·9H2O或者Ni(NO3)2·6H2O、Zn(NO3)2·6H2O和Fe(NO3)3·9H2O的复合或Fe(NO3)3·9H2O和Sr(NO3)2的复合；还原剂还可以为柠檬酸钠、醋酸钠、水合肼(N2H4·H2O)、DMF(二甲基甲酰胺)溶液、酒石酸钾、丙烯酸钠。
优选地，还可采用化学共沉淀法制备磁性纳米颗粒：
将摩尔比为l：1.7～2.5的FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O溶于除氧的超纯水中，在N2保护下加热并搅拌，待试剂完全溶解，温度达到80～100℃后，缓慢加入50mL NaOH溶液(3～4mol/L)调节至pH＝10～13，继续加热搅拌2～3h后，冷却至室温，黑色沉淀物用磁铁分离,然后先用超纯水清洗一次，再用无水乙醇反复洗涤至pH＝7～8。每次清洗时先加溶剂振荡，然后离心、弃上清液。最后将得到的Fe3O4纳米磁粒冷冻干燥备用。
优选地，上述铁源还可选择硫酸盐，可用浓度为25％～30％的氨水代替NaOH溶液。
上述两种方法制得的磁性纳米颗粒的直径小于等于20nm，均具有超顺磁性。
S4，混合磁性纳米颗粒与丝素蛋白浓缩液制备静电纺丝液
将S2中的丝素蛋白浓缩液溶解于50％～70％的PEG-400溶液中，配制成丝素蛋白浓度为5～10wt％的混合溶液，不断搅拌待其完全溶解后，加入S3中制得的磁性纳米颗粒，配成丝素蛋白浓度为0.1～0.5wt％的混合溶液，超声使其分散均匀得到静电纺丝液。
S5，静电纺丝制备磁性纳米纤维膜
将S4中的静电纺丝液装入针头直径为0.45～1mm、体积规格为2～20mL的注射器中待用。准备静电纺丝装置，连接推动器和高压设备，采用铝箔收集器与负极相连作为纳米纤维膜接收装置，调节静电纺丝参数，选用电压12～25kV，推动速度0.2～2.0mL/h，电场极距为12～20cm进行静电纺丝，纺丝时间为4～8h，在接收装置上获得磁性纳米纤维膜，用75％的乙醇溶液进行后处理4小时后自然晾干。
S6，磁性静电纺丝膜预处理
将S5中制得的磁性静电纺丝膜剪碎，先剪为尺寸大小约为2～3mm×3～5cm的细长条，再沿长度方向剪为1～2mm×2～3mm的碎块放进烧杯中。进行预处理，得到磁性纳米纤维。
也可采用高速匀浆机处理，转速4000～12000r/min，浓度3％～12％，匀浆时间为15分钟。
或者采用超声分散处理，功率270～900W，超声分散10～30min，浓度5％～10％。
以上步骤制得的磁性纳米纤维也具有磁响应性，即在外加磁场的作用下沿着磁场取向排列；在无磁场作用时，能够保持取向排布。
S7，将S6预处理后的静电纺磁性纳米纤维与S1制得的丝素蛋白溶液以质量比1:15～75混合搅拌均匀。
S8：混合溶液在磁场中交联并诱导形成取向凝胶
方法一，超声凝胶：将S7中的混合溶液装入10mL烧杯中进行超声处理，以20～25％振幅超声30s。
磁性诱导方式：在附近无其他磁性物体的水平桌面上放置聚四氟乙烯板，将两块钕铁硼磁铁或铁钴镍磁铁竖直放在板上，间距2.2～6cm，保持相互平行无角度正相对，磁场强度为0.03～0.1T。将超声处理后的溶胶立即放置在两块磁铁中间区域的聚四氟乙烯板上静置诱导5～30分钟，使磁性纳米纤维在磁场作用下呈同向均一线性排列，取向诱导后将置于37℃中1～6h，使之凝胶化，形成超声取向凝胶。
方法二，PEG凝胶；将S7中的混合溶液与40％～50％PEG-400～600混合于10mL烧杯混合摇匀，成凝胶时间≤30分钟。PEG与丝素蛋白质量比例1:2～4。
磁性诱导方式：加入PEG混合均匀后立即将烧杯放入自制的竖直放置的直径为6cm，长20cm，单位长度线圈匝数为1000～5000的通电螺线管中，用玻璃片将烧杯垫高使烧杯中的溶胶位于螺线管中部，通入8～16A的直流电流，轴线磁场强度约为0.02～0.1T，同时在磁场作用过程中用玻璃棒进行充分均匀搅拌，使纳米纤维受到相同的磁场力作用，沿磁场线方向取向排列，处理5～30min后可以得到PEG取向凝胶。
方法三，HRP凝胶：按每1mL 1％丝蛋白溶液:5U HRP:0.825mM H2O2的比例将S7中的混合溶液与HRP混合搅拌，加入PBS缓冲溶液调节pH为7.4，再加入与HRP等体积的不同浓度的H2O2，边加边搅拌，待过氧化氢滴加完毕后继续搅拌3min，使其混合均匀，成凝胶时间≤30分钟。磁性诱导方式与上述两种相同。
方法四，光交联凝胶：将424mM的甲基丙烯缩水甘油酯(GMA)单体加入到溶解1h的SF/LiBr混合液中，以300rpm的速度在60℃下反应3h，使之产生高产率反应。过滤后，使用分子量为12～14kDa的透析袋透析4天，每4h更换去离子水，然后置于-80℃冰箱中过夜，冷冻干燥后制得SilMA，以10～30w/v％的比例溶于5mL去离子水中，置于37℃的水浴锅中搅拌至完全溶解。在避光条件下，加入S6预处理后的静电纺磁性纳米纤维与0.4w/v％的光引发剂(LAP)继续搅拌，混合均匀。在4℃下将混合溶液静置至成胶后，进行与上述两种方式相同的磁性诱导，再置于强度为3.5m J/cm2强度的紫外光下交联5分钟得到光交联取向凝胶。
方法五，将S6预处理后的静电纺磁性纳米纤维与浓度为10～50mg/mL的SF、0.04～0.2mM的核黄素-5'-单磷酸钠盐(RB)溶液混合均匀，利用制氧机向其中持续通入氧气，进行与上述两种方式相同的磁性诱导，在波长为320-400nm的近紫外光下照射10～30min可得到光交联取向凝胶。
S9：磁性纳米纤维取向凝胶细胞行为研究。
以不含磁性纳米颗粒的丝素纳米纤维凝胶作为对照。使用含胎牛血清(10％v/v)的α-MEM培养基培养人骨髓间充质干细胞(hMSCs)或用加入10％胎牛血清、100U/mL链霉素/青霉素的DMEM培养基培养人真皮成纤维细胞(hFBs)，在温度为37℃、浓度为5％CO2的饱和湿度培养箱中培养，每三天换一次培养液，当细胞的生长密度达到80％-90％时，用胰蛋白酶将细胞从培养皿上消化下来,用低速离心机以800～1000r/min的转速离心清洗，加入适量培养基，调整细胞浓度为1.5～2.5×106cell/mL。将步骤S8制备的凝胶支架预先通过紫外和酒精消毒后，放置在培养皿中，每个样品接种10～20μL。为了使使细胞充分粘附、铺展，接种后的材料置于37℃的细胞培养箱内2h后，再加入培养基培养，每隔两天换液一次。分别培养1、3、7天，取样。选用Invitrogen公司的
Figure BDA0002947244550000101
试剂盒进行DNA的提取和细胞DNA含量测定；用ImageJ软件测量每个细胞的细胞核取向角。每组样品至少统计200个细胞以计算细胞核的取向角。
两种支架中hMSCs与hFBs细胞的增殖情况：培养1、3、7天后的DNA含量如下表所示：
表1支架上DNA含量
DNA含量(μg/mL) 培养1天后 培养3天后 培养7天后
hMSCs(有磁性) 2.515±0.067 2.813±0.046 6.477±0.081
hMSCs(无磁性) 2.228±0.119 2.671±0.015 5.571±0.124
hFBs(有磁性) 2.639±0.054 2.887±0.032 6.264±0.073
hFBs(无磁性) 2.473±0.086 2.722±0.041 5.613±0.107
两种支架中hMSCs与hFBs细胞的取向生长情况：接种培养7天后，两种细胞的细胞核取向角在0°～40°的细胞占比由表2所示，磁性纳米纤维的取向结构对细胞核的取向有显著影响，经过取向处理的细胞核取向角在0°～40°范围内的细胞占了80～90％，而不含磁性纳米颗粒的支架取向较弱，其取向角在0°～40°范围内的细胞只占了50～60％。
表2支架上细胞的取向生长情况
磁性纳米纤维支架 不含磁性纳米颗粒的支架
hMSCs 80～90％ 50～60％
hFBs 80～90％ 50～60％
以上结果表明本发明方法制备的磁性纳米纤维支架上细胞增殖、取向情况都要好于不含磁性纳米颗粒的支架。
实施例2
静电纺丝法二步制备磁性纳米纤维，包括如下步骤：
S1-S2与实施例1相同，省略实施例1的步骤S3。
S4中，向丝素蛋白溶液中加入1％氯化亚铁溶液，搅拌均匀后浓缩溶解于50％～70％的PEG-400溶液中，配制成纺丝液。氯化亚铁与丝素蛋白之间的质量比1:50～200。
S5中通过静电纺丝得到复合纳米纤维，再将纳米纤维于0.06％H2O2溶液中浸泡搅拌均匀，滴加3mol/L氢氧化钠溶液调节pH到11～13,升温到55℃，调节搅拌速度为60rpm,继续搅拌3h后停止加热,就可得到磁性丝素蛋白复合纳米纤维分散液，将烧杯放入超声清洗器中超声5min后在其下方放置磁铁，20min后，这些磁性纳米纤维聚集在烧杯底部，在磁场下去除上清液,用二次重蒸水反复清洗,直到磁性纳米纤维显中性。
还可选择硝酸铁溶液作为铁源，柠檬酸作为还原剂与复合纳米纤维在40℃下搅拌30min混合均匀，再逐滴加入纯氨水，调节pH＝7～10，68℃下搅拌4h，继续升温至92℃搅拌4h脱水，催化下反应得到磁性纳米纤维。硝酸铁与柠檬酸之间的比例1:0.8～3。
S6-S9都与实施例1相同。
实施例3
静电纺丝法三步制备磁性纳米纤维，包括如下步骤：
S1-S3与实施例1相同.
与一步法不同的是S4中先不加入步骤S3制备的磁性纳米颗粒。
S5中将形成的电纺纳米纤维浸泡在含磁性纳米颗粒(10～50％v:v)的悬浮液中孵育3小时以上，使丝素蛋白纳米纤维与磁性纳米颗粒通过静电吸附作用、亲疏水相互作用、化学交联作用充分结合，然后用25000r/min高速离心机离心后洗涤，重复离心洗涤三次，得到磁性丝素蛋白复合纳米纤维。
S6-S9都与实施例1相同。
以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于磁性纳米纤维的取向材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将磁性丝素蛋白纳米纤维与浓度为0.1～30wt％的丝素蛋白溶液或光敏丝素蛋白溶液混匀后得到混合溶液，所述磁性丝素蛋白纳米纤维的直径为100～400nm，长度在1μm以上，所述磁性丝素蛋白纳米纤维与丝素蛋白溶液的质量比为1：100～100：0.1；
(2)将所述混合溶液中的磁性纳米纤维在磁场中经磁场诱导取向并交联，形成取向凝胶，即得到所述基于磁性纳米纤维的取向材料；
其中，所述磁性丝素蛋白纳米纤维包括丝素蛋白纤维以及分布于所述丝素蛋白纤维内部和/或表面的磁性纳米颗粒；所述磁性丝素蛋白纳米纤维的制备方法包括以下步骤：
采用静电纺丝法制备磁性丝素蛋白纳米纤维膜，然后将所述磁性丝素蛋白纳米纤维膜粉碎后得到磁性丝素蛋白纳米纤维。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，交联方法包括超声凝胶法、PEG凝胶法、HRP凝胶法或光交联凝胶法，其中，所述超声凝胶法时将所述混合溶液超声处理后得到溶胶后进行交联；所述PEG凝胶法是在所述混合溶液中加入PEG后进行交联，PEG与混合溶液中的丝素蛋白的质量比为1:2～4；所述HRP凝胶法是在所述混合溶液中加入HRP和过氧化氢后进行交联，HRP的添加量为5～40U，过氧化氢添加量为0.825～6.6mM；采用光交联凝胶法时，步骤(1)选用光敏丝素蛋白溶液制备混合溶液，并在所述混合溶液中加入引发剂后进行光交联；或者步骤(1)选用丝素蛋白溶液制备混合溶液，并在所述混合溶液中加入光敏剂后进行光交联。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，磁场的构建方式包括利用平行永磁铁构建或通电螺线管构建，磁场的强度为0.02～0.1T；交联时，将待交联的溶液或溶胶置于所述磁场中。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述磁性丝素蛋白纳米纤维中，磁性纳米颗粒以及丝素蛋白的质量比为1:20～50，磁性纳米颗粒的粒径为10～30nm。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述磁性丝素蛋白纳米纤维膜的制备方法包括以下步骤：
a1：将铁源或含铁复合金属源利用溶剂热法或化学共沉淀法制备磁性Fe3O4纳米颗粒；所述含铁复合金属源包括铁源和除铁源外的其他金属源；
a2：将所述磁性Fe3O4纳米颗粒、浓度为10～20wt％的丝素蛋白溶液和PEG混匀，得到静电纺丝液，将所述静电纺丝液进行静电纺丝，原位生成得到所述磁性丝素蛋白纳米纤维膜。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述磁性丝素蛋白纳米纤维膜的制备方法包括以下步骤：
将铁源、浓度为10～20wt％的丝素蛋白溶液和PEG混匀，得到静电纺丝液，将所述静电纺丝液进行静电纺丝，然后将得到的纺丝膜经还原剂发生还原反应，得到所述磁性丝素蛋白纳米纤维膜。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述磁性丝素蛋白纳米纤维膜的制备方法包括以下步骤：
b1：将铁源或含铁复合金属源利用溶剂热法或化学共沉淀法制备磁性Fe3O4纳米颗粒；所述含铁复合金属源包括铁源和除铁源外的其他金属源；
b2：将浓度为10～20wt％的丝素蛋白溶液和PEG混匀，得到静电纺丝液，将所述静电纺丝液进行静电纺丝，然后将得到的纺丝膜在所述磁性Fe3O4纳米颗粒的悬浮液中孵育3～12小时，得到所述磁性丝素蛋白纳米纤维膜。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：将所述磁性丝素蛋白纳米纤维膜粉碎时，所采用的方法为机械剪碎法、高速匀浆处理法或超声分散处理法；其中，高速匀浆处理法的转速为4000～12000r/min，超声分散处理法功率为270～900W，时间为20～30min。
9.一种权利要求1-8中任一项所述的制备方法所制备的基于磁性纳米纤维的取向材料，所述取向材料为纤维材料、膜材料或支架材料。
10.权利要求9所述的基于磁性纳米纤维的取向材料在制备细胞生长培养材料或人工组织替代材料中的应用。
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