CN109836595A - 一种仿生软骨掺杂有序磁性纳米短纤维拼接双层水凝胶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种仿生软骨掺杂有序磁性纳米短纤维拼接双层水凝胶的制备方法。本发明利用静电纺丝技术制备含有磁性粒子的纳米纤维，利用高速剪切式匀浆机将纳米纤维切断获得短纤维；将短纤维与凝胶前驱液、交联剂混合，外磁场作用下，磁性短纤维有序排列；利用紫外光照使凝胶前驱液交联，得到掺杂有序磁性短纤维的水凝胶；取两块水凝胶按短纤维方向相互垂直的方式拼接，依靠两块水凝胶内磁性纳米粒子相互吸引获得拼接水凝胶；将拼接水凝胶浸在海藻酸钠溶液中，加氯化钙溶液使海藻酸钠溶液凝胶化，获得拼接双层水凝胶。本发明所述的拼接双层水凝胶具有与软骨组织相似的结构、良好的力学性能和磁性能，可促进细胞定向增殖和分化，用于软骨组织修复。

Description

一种仿生软骨掺杂有序磁性纳米短纤维拼接双层水凝胶的制 备方法

技术领域

本发明涉及生物医学工程领域，更确切地说，涉及一种仿生软骨掺杂有序磁性纳米纤维拼接双层水凝胶的制备方法。

背景技术

软骨具有优异的耐压缩、抗疲劳以及润滑性能，这与它特殊的结构特性密不可分。软骨由多糖基质、垂直取向排列的多层胶原纤维构成，各向异性的复合结构赋予其优异的性能。但是软骨内无血管，无法再生。目前临床治疗软骨缺损主要依赖于自体或异体移植，面临供源较少、易诱发免疫反应等问题。基于软骨的特殊结构及性能，可以制备与其结构相似的仿生水凝胶，得到具有优良耐压缩、抗疲劳性能的软骨修复或替代组织。仿生多层水凝胶对软骨组织的修复及再生具有十分重要的意义。

水凝胶作为一种含水量极高的高分子交联网络，能够较好地模拟天然软骨组织的结构，促进细胞良好生长。进一步地将纤维与水凝胶复合不仅可以从结构上模拟软骨组织，且相较于普通水凝胶来讲，复合纤维后水凝胶的力学性能得到极大提高。

Guilak等通过负压将海藻酸钠水凝胶引入到编织的纤维网络中，将纤维支架与水凝胶复合，显著提高了水凝胶的力学性能，在拉伸模量方面更是超过了人正常软骨组织。

Onur Bas等采用熔融静电纺丝技术制备聚己内酯纤维网络，以星形聚乙二醇/肝素/丝素复合作为软基质，制备的纤维凝胶复合材料能够模拟天然软骨的力学性能。

Animesh等利用三维快速成型技术将聚氨酯纤维浸入环氧树脂基凝胶中，得到纤维增强的凝胶，极大程度地提高了复合材料的强度和模量，降低了溶胀度。

Jun Liu等提出一种简单有效的方法，通过使用静电纺丝和超声处理技术来制备磁性纳米短纤维，具有良好的磁响应。磁性纳米短纤维在与细胞共培养时，在外界磁场作用下，可以对细胞施加力学刺激，从而可用于研究细胞的行为。

Laura De Laporte等利用外界磁场(100-300mT)诱导聚乳酸羟基乙酸共聚物磁性短纤维在可注射凝胶中排列，与细胞培养后发现该各向异性凝胶可以有效促进神经细胞取向以及增强钙信号。

已有研究表明通过电磁场刺激软骨细胞增殖、糖蛋白合成可以减轻骨关节炎患者的疼痛，促进软骨缺陷愈合。Fereidoon M.Jaberi等将圆柱形永磁体植入到兔股骨内侧髁关节承重面缺损处的内侧皮下，通过实验证实永磁体对骨和软骨有促进愈合作用。

Harsh D.Amin等通过研究中等强度静态磁场对体外人骨髓间充质干细胞向软骨形成分化的影响，发现磁场影响TGF-b信号通路进而诱导骨髓间充质干细胞分化，这一发现对于软骨组织修复工程具有重要的应用意义。

Wendelin J.Stark等也报道了通过外界磁场诱导磁性凝胶变形产生力学刺激，促进人体骨髓间充质干细胞朝软骨方向分化的研究成果。

天然软骨内部的双层相互垂直取向排列的胶原纤维赋予其独特的各向异性结构和优异的力学性能。水凝胶作为一种软物质，与人体天然软骨组织的性质十分相似，但是由于其自身力学性能较差，限制了水凝胶的应用。利用磁场诱导磁性纳米短纤维在水凝胶中有序排列可制备各向异性水凝胶，提高水凝胶力学性能；而且内有磁性纳米短纤维并按照纤维垂直方向进行拼接形成的双层水凝胶，可以高度模拟天然软骨组织的结构和性能。并且磁性粒子与外界磁场的联合应用对于软骨的愈合将具有更显著的促进作用。因此制备仿生软骨掺杂有序磁性纳米短纤维的拼接双层水凝胶，可从力学和生物学双方面促进缺损软骨组织的修复和再生，具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于克服水凝胶力学性能较差的缺点，制备掺杂有序磁性纳米短纤维拼接双层水凝胶，模拟天然软骨组织，具有优异耐压缩、抗疲劳性能，并为细胞生长提供磁性环境，有利于软骨组织的修复和再生。

本发明的目的是提供一种仿生软骨掺杂有序磁性纳米短纤维拼接双层水凝胶的制备方法，包括下列各步骤：

1)将磁性粒子和高分子溶液混合，室温下搅拌5小时，使磁性粒子分散均匀，获得浓度为15％-30％(质量/体积)的纺丝溶液，利用静电纺丝技术制备磁性纤维膜，并进行干燥；

2)将干燥后的磁性纤维膜剪成1×1cm²的小块，放入高速剪切式匀浆机中搅拌，得到磁性短纤维并干燥；

3)将干燥后的磁性纳米短纤维与凝胶前驱液以1:3-1:20(短纤维:凝胶前驱液)的比例混合，加入交联剂再次混合均匀，然后将混合溶液放置于磁场中以诱导磁性短纤维有序排列；

4)打开紫外灯照射3)所得混合溶液，获得掺杂有序磁性纳米短纤维的水凝胶；

5)将上述两块掺杂有序磁性短纤维的水凝胶以内部短纤维方向相互垂直排列的方式进行拼接，依靠二者内部所含磁性粒子的相互吸引，制备结合力较弱的拼接水凝胶；

6)将结合力较弱的拼接水凝胶浸泡在1％(w/v)海藻酸钠水溶液中，静置5小时，然后向溶液中缓慢滴加质量分数为2％的氯化钙溶液，海藻酸钠溶液形成凝胶，获得结合力增强的拼接双层水凝胶；

上述方法中所用静电纺丝技术静电纺丝过程中流速为0.2-0.5mL/h，电压为12-20kV，针头距离接收器的距离为10-20厘米。

上述方法中所用高分子溶液中的高分子为聚羟基乙酸乳酸共聚物、聚乳酸、聚己内酯中的一种。

上述方法中所述高分子溶液中的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、二甲基亚砜、二甲基酰胺、N-甲基吡咯烷酮、六氟异丙醇、氯仿、甲酸、甲醇、醋酸中的一种或多种。

上述方法中所述短纤维利用高速剪切式匀浆机制得，高速剪切式匀浆机的转速在10000-20000转之间，剪切时间为5-10分钟。

上述方法中所述匀浆过程所采用的溶剂为乙醇、丙醇、乙二醇中的一种。

上述方法中所述水凝胶前驱液为丙烯酰胺或丙烯酰胺接枝的明胶、壳聚糖、海藻酸钠、丝素蛋白中的一种，交联剂为N,N-亚甲基双丙烯酰胺。

上述方法中所述水凝胶前驱液在紫外光照射下进行交联，无需加入光引发剂。其中紫外光波长为200-300nm，照射时间为5-10分钟。

上述方法中所述的仿生软骨掺杂有序磁性纳米短纤维拼接双层水凝胶的制备方法，其特征在于，两块掺杂有序磁性纳米短纤维水凝胶以内部纤维相互垂直排列的方式通过内含的磁性粒子相吸得到拼接水凝胶。

上述方法中所述的仿生软骨掺杂有序磁性纳米短纤维拼接双层水凝胶的制备方法，其特征在于，磁性相吸的拼接水凝胶浸泡在海藻酸钠溶液中，加入氯化钙溶液后海藻酸钠溶液形成凝胶，获得拼接双层凝胶，其中海藻酸钠凝胶层的厚度可以通过添加的海藻酸钠溶液进行调节。

本发明与现有技术相比，其主要优点为：

1.掺杂有序磁性纳米短纤维的拼接双层水凝胶中的短纤维以互相垂直的方式排列，可以更好地从结构上模拟天然软骨组织；

2.掺杂有序磁性纳米短纤维的拼接双层水凝胶中的短纤维以互相垂直的方式排列可进一步改善水凝胶力学性能较弱的缺点，既有水平横向排列的纤维抵抗剪切形变又有垂直排列的纤维提供优异的耐压缩性能，从功能上模拟天然软骨组织的耐压缩、抗疲劳的力学性能；

3.磁性纳米短纤维中的磁性粒子具有较好的生物相容性和生物安全性，取向排列的磁性纳米纤维可以诱导细胞的定向生长增殖，同时也提供促进细胞增殖与分化的磁性环境，有良好的磁生物效应，在外磁场辅助作用下有助于软骨的再生和修复；

4.将两块掺杂有序磁性纳米短纤维水凝胶以纤维垂直的方式放置，利用相互吸引、交联组装获得拼接双层水凝胶的方式，操作灵活、可调控性强、技术简单、成本低，有望应用于软骨组织修复工程材料。

附图说明

图1为仿生软骨掺杂有序磁性纳米短纤维拼接双层水凝胶的制备示意图

图1中：1-磁性短纤维；2-磁性粒子；3-双层水凝胶

具体实施方式

下面将结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但该实施例并不限制本发明的保护范围。

实施例1：聚乳酸羟基乙酸共聚物/聚丙烯酰胺/海藻酸钠仿生软骨掺杂有序磁性纳米短纤维拼接双层水凝胶的制备

配制24％(质量/体积)聚乳酸羟基乙酸共聚物(分子量为10万)纺丝液，溶剂为N,N-二甲基甲酰胺与二氯甲烷的混合溶液(4/3，体积/体积)，将四氧化三铁磁性粒子与纺丝液混合(磁性粒子:高分子＝1:5，质量:质量)，室温下搅拌5小时，然后超声分散半小时，通过静电纺丝技术得到磁性纳米纤维膜，其中溶液流速为0.2mL/h，外加电压为12-14kV，针头到接收器距离为12厘米。将磁性纳米纤维膜剪成1×1cm²的小块。将1g剪好的短纤维膜与乙醇溶液混合，采用转速为15000转的高速剪切式匀浆机搅拌5分钟，得到的短纤维长度小于50微米。将搅拌后的磁性纳米短纤维室温干燥，将5mL浓度为8％的丙烯酰胺水溶液、0.1g交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺与1g干燥后的磁性纳米短纤维混匀，室温下将两块磁铁(15×88×40mm³，0.72T)放置混匀后的溶液两侧，两磁铁之间保持10厘米间距，保持1小时。然后，将发出245nm波长的紫外灯打开，照射溶液5分钟，照射期间，装置处于密闭体系内。结束之后，将获得的掺杂有序磁性纳米短纤维水凝胶取下。以纤维相互垂直排列的方式放置两块掺杂有序磁性纳米短纤维水凝胶，静置，两块水凝胶依靠内含的磁性粒子间的相互作用得到拼接水凝胶。将相互吸引后的拼接水凝胶整体浸泡在1％(w/v)的海藻酸钠溶液中5小时，缓慢滴加质量分数为2％的氯化钙溶液，至海藻酸钠凝胶化，即可得到聚乳酸羟基乙酸共聚物/聚丙烯酰胺/海藻酸钠仿生软骨掺杂有序磁性纳米短纤维拼接双层水凝胶。

实施例2：聚己内酯/聚丙烯酰胺接枝壳聚糖/海藻酸钠仿生软骨掺杂有序磁性纳米短纤维拼接双层水凝胶的制备

配制14％(质量/体积)聚己内酯纺丝液，溶剂为甲醇与氯仿的混合溶液(1/5，体积/体积)，将三氧化二铁磁性粒子与纺丝液混合(磁性粒子:高分子＝1:5，质量:质量)，室温下搅拌5小时，然后超声分散半小时，通过静电纺丝技术得到磁性纳米纤维膜，其中溶液流速为0.4mL/h，外加电压为15-19kV，针头到接收器距离为15厘米。将磁性纳米纤维膜剪成1×1cm²的小块，将1g剪好的短纤维膜与乙二醇溶液混合，采用转速为15000转的高速剪切式匀浆机搅拌5分钟，得到的短纤维长度小于50微米。将搅拌后的磁性纳米短纤维室温干燥，将5mL浓度为4％的丙烯酰胺接枝壳聚糖水溶液、0.05g交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺与1g干燥后的磁性纳米短纤维混匀，室温下将两块磁铁(15×88×40mm³，0.72T)放置混匀后的溶液两侧，两磁铁之间保持10厘米间距，保持1小时。然后，将发出245nm波长的紫外灯打开，照射溶液5分钟，照射期间，装置处于密闭体系内。结束之后，将获得的掺杂有序磁性纳米短纤维水凝胶取下。以纤维相互垂直排列的方式放置两块掺杂有序磁性纳米短纤维水凝胶，静置，两块水凝胶依靠内含的磁性粒子间的相互作用得到拼接水凝胶。将相互吸引后的拼接水凝胶整体浸泡在1％(w/v)的海藻酸钠溶液中5小时，缓慢滴加质量分数为2％的氯化钙溶液，至海藻酸钠凝胶化，即可得到聚己内酯/聚丙烯酰胺接枝壳聚糖/海藻酸钠仿生软骨掺杂有序磁性纳米短纤维拼接双层水凝胶。

Claims (8)

1.本发明涉及一种仿生软骨掺杂有序磁性纳米短纤维拼接双层水凝胶的制备方法，该双 层水凝胶高度模拟天然软骨组织结构，有利于细胞增殖和分化，可用于软骨组织工程。

一种仿生软骨掺杂有序磁性纳米短纤维拼接双层水凝胶的制备方法，其特征在于包括下列各步骤：

1)将磁性粒子和高分子溶液混合，室温下搅拌5小时，使磁性粒子分散均匀，获得浓度为15％-30％(质量/体积)的纺丝溶液，利用静电纺丝技术制备磁性纤维膜，并进行干燥；

2)将干燥后的磁性纤维膜剪成1×1cm²的小块，放入高速剪切式匀浆机中搅拌，得到磁性短纤维并干燥；

3)将干燥后的磁性纳米短纤维与凝胶前驱液以1:3-1:20(短纤维:凝胶前驱液)的比例混合，加入交联剂再次混合均匀，然后将混合溶液放置于磁场中以诱导磁性短纤维有序排列；

4)打开紫外灯照射3)所得混合溶液，获得掺杂有序磁性纳米短纤维的水凝胶；

5)将上述两块掺杂有序磁性短纤维的水凝胶以内部短纤维方向相互垂直排列的方式进行拼接，依靠二者内部所含磁性粒子的相互吸引，制备结合力较弱的拼接水凝胶；

6)将结合力较弱的拼接水凝胶浸泡在1％(w/v)海藻酸钠水溶液中，静置5小时，然后向溶液中缓慢滴加质量分数为2％的氯化钙溶液，海藻酸钠溶液形成凝胶，获得结合力增强的拼接双层水凝胶。

2.如权利要求1中所述的静电纺丝技术，其特征在于，所述静电纺丝过程中流速为0.2-0.5mL/h，电压为12-20kV，针头距离接收器的距离为10-20厘米。

3.如权利要求1所述的磁性纳米颗粒，其特征在于，所述磁性粒子为四氧化三铁或三氧化二铁中的一种。

4.如权利要求1所述的高分子溶液，其特征在于，所述高分子为聚羟基乙酸乳酸共聚物、聚乳酸、聚己内酯中的一种，溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、二甲基亚砜、二甲基酰胺、N-甲基吡咯烷酮、六氟异丙醇、氯仿、甲酸、甲醇、醋酸中的一种或多种。

5.如权利要求1所述磁性纳米短纤维的制备方法，其特征在于，所述短纤维采用高速剪切式匀浆机制得，且高速剪切式匀浆机的转速为10000-20000转/分钟，剪切时间为5-10分钟，溶剂为乙醇、丙醇、乙二醇中的一种。

6.如权利要求1所述的凝胶前驱液，其特征在于，所述溶液为丙烯酰胺或丙烯酰胺接枝的明胶、壳聚糖、海藻酸钠、丝素蛋白中的一种，交联剂为N,N-亚甲基双丙烯酰胺。

7.如权利要求1所述的磁场诱导磁性纳米短纤维有序排列的方法，其特征在于，所述磁场为由异极相对的条形磁铁、蹄形磁铁或者通电螺线管产生的匀强磁场，诱导短纤维进行有序排列。

8.如权利要求1所述的仿生软骨掺杂有序排列磁性纳米短纤维拼接双层水凝胶的制备方法，其特征在于，所述水凝胶在紫外光照射下进行交联，无需加入光引发剂，紫外光波长为200-300nm，照射时间为5-10分钟。