CN114652891A - 丝素基复合水凝胶支架及其制备方法与应用 - Google Patents

丝素基复合水凝胶支架及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种丝素基复合水凝胶支架及其制备方法与应用，制备方法包括如下步骤：分别制备0.1wt％‑1.0wt％的丝素微纳米纤维悬浮液和0.5wt％‑1.5wt％的多糖溶液；将制得的丝素微纳米纤维悬浮液与多糖溶液按预设比例混合均匀，得到混合液；再向混合液中加入交联剂反应，得到反应液；将反应液注入模具中，经冷冻干燥，得到丝素微纳米纤维多孔支架；将制得的丝素微纳米纤维多孔支架吸附0.5wt％‑2.0wt％的海藻酸钠溶液至饱和，并用二价阳离子交联后制得丝素基复合水凝胶支架。本发明的丝素基复合水凝胶支架具有丰富的孔结构、较好的机械强度及良好的生物相容性，能直接负载种子细胞用于组织工程，应用前景广泛。

Description

丝素基复合水凝胶支架及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，尤其涉及一种丝素基复合水凝胶支架及其制备方法与应用。
背景技术
水凝胶是一类极为亲水的三维网络结构凝胶，基于它在水中迅速溶胀并在此溶胀状态可以保持大量体积的水而不溶解的性能，常被应用于组织工程支架。
丝素蛋白是从蚕丝中提取的一种天然蛋白质纤维，其具有优异的机械性能、可加工性能、生物相容性。在过去的几十年中，丝素蛋白在组织工程、药物缓释等领域受到了广泛的关注，已经被用来开发成纤维、薄膜、支架、微球等形式的组织工程产品。
公开号为CN103819694B的专利提供了一种具有良好细胞相容性的丝素蛋白水凝胶的制备方法，将丝素蛋白水溶液和N-月桂酰肌氨酸钠溶液混合均匀，再加入超纯水调节浓度，静置后得到再生丝素蛋白水凝胶；该方法制备的丝素蛋白水凝胶虽然细胞相容性好，但所用原料为丝素蛋白水溶液，最终制备的水凝胶的孔隙之间的交联性差，使其整体机械性能偏差，不利于在组织工程支架方面的应用。
公开号为CN112316914A的专利提供了一种丝素微纳米纤维微球的制备方法，先使用混合溶液对丝素纤维进行热湿处理，经物理-机械分纤作用制备了丝素微纳米纤维悬浮液，再将制得的丝素微纳米纤维悬浮液与多糖溶液共混后，再进行交联反应，经静电喷射和冷冻干燥处理后，即得到丝素微纳米纤维微球；该方法制备的微球保留了丝素原纤优异力学性能，虽然在细胞培养领域有一定的优势，但仍需要体外快速扩增，不能直接负载大量种子细胞用于组织工程支架植入体内，临床应用仍然受制于需要体外细胞培养的冗长过程。
有鉴于此，有必要设计一种改进的丝素基复合水凝胶支架及其制备方法与应用，以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种丝素基复合水凝胶支架及其制备方法与应用，解决目前丝素基复合水凝胶支架机械性能和生物相容性差引起的不能直接负载种子细胞用于组织工程支架植入体内的问题。
为实现上述发明目的，本发明提供了一种丝素基复合水凝胶支架的制备方法，包括如下步骤：
S1.分别制备0.1wt％-1.0wt％的丝素微纳米纤维悬浮液和0.5wt％-1.5wt％的多糖溶液；
S2.将步骤S1制得的所述丝素微纳米纤维悬浮液与所述多糖溶液按预设比例混合均匀，得到混合液；再向所述混合液中加入交联剂反应，得到反应液；将所述反应液注入模具中，经冷冻干燥，得到丝素微纳米纤维多孔支架；
S3.将步骤S2制得的所述丝素微纳米纤维多孔支架吸附0.5wt％-2.0wt％的海藻酸钠溶液至饱和，并用二价阳离子交联后制得丝素基复合水凝胶支架。
作为本发明的进一步改进，步骤S3中所述二价阳离子为Ca2+。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述多糖为壳聚糖、淀粉、糖原、菊糖、琼脂、透明质酸、肝素、硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、魔芋中的一种或多种混合。
作为本发明的进一步改进，步骤S2中所述丝素微纳米纤维悬浮液与所述多糖溶液的溶质质量比为80:20-99.9:0.01，且步骤S2中所述混合液的总溶质的浓度为0.3wt％-1.0wt％。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中，所述丝素微纳米纤维悬浮液的制备方法包括如下步骤：
将脱胶后的丝素置于摩尔比为1:2:8的Ca(NO3)2/CH3CH2OH/H2O的三元混合溶液进行溶胀处理；再将经溶胀处理的丝素置于高速搅拌机中剪切破碎，经冷冻干燥后制得丝素微纳米纤维悬浮液。
作为本发明的进一步改进，所述溶胀处理温度为45-60℃，处理时间为2-8h。
作为本发明的进一步改进，所述高速搅拌机空载速度为36000r/min；所述剪切破碎处理的时间为10-30min。
作为本发明的进一步改进，步骤S2中，向所述混合液中加入交联剂的具体操作为：向所述混合液中依次加入吗啉乙磺酸、N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，且所述吗啉乙磺酸、N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐占所述混合液的质量百分数分别为10％、10％和20％。
本发明还提供了一种丝素基复合水凝胶支架，该丝素基复合水凝胶支架根据上述技术方案中任一技术方案制备得到。
本发明还提供了一种丝素基复合水凝胶支架的应用，用于直接负载种子细胞制成组织工程支架，并将所述组织工程支架植入体内；或者用于软骨修复领域。
本发明的有益效果是：
(1)本发明提供的一种丝素基复合水凝胶支架的制备方法，将丝素微纳米纤维悬浮液与多糖溶液交联共混制得丝素微纳米纤维多孔支架，其多孔材料作为丝素基复合水凝胶支架的支撑骨架，再将其吸附海藻酸钠溶液，用Ca2+交联后制得丝素基复合水凝胶支架。该方法通过调节丝素微纳米纤维悬浮液与多糖溶液的浓度及比例，将多糖作为粘合剂，使丝素微纳米纤维交联形成独特的微纳米纤维网络结构；通过调节海藻酸钠溶液的浓度，使海藻酸盐在丝素微纳米纤维多孔支架上发生交联形成水凝胶，进一步调整交联的网状结构及其孔径和孔隙率，形成适于种子细胞生长的特殊结构的高强度支架，为支架材料可以直接负载种子细胞提供前提条件。
(2)本发明提供的一种丝素基复合水凝胶支架的制备方法，基于天然丝素微纳米纤维的优异力学性能，将其先与多糖溶液交联共混，使丝素微纳米纤维和多糖分子间形成共价键，多糖的加入可以提供纤维之间的结合力，从而提高丝素微纳米纤维多孔支架的稳定性和机械性能，使其为负载海藻酸钠水凝胶提供前提条件。同时，本发明通过控制丝素微纳米纤维悬浮液与多糖溶液的浓度及质量比，能够对丝素微纳米纤维的结合方式和多孔材料的孔径及孔隙率进行调控，从而调控所得丝素基复合水凝胶支架的孔形态稳定性，进而调控其机械性能。
(3)本发明提供的一种丝素基复合水凝胶支架的制备方法，通过使用Ca(NO3)2/CH3CH2OH/H2O混合溶液对丝素进行溶胀处理，消除丝素纳米原纤间的内应力，再加以适当的物理机械搅拌作用，在保留纳米原纤的力学性能的同时尽量将丝素微纳米纤维破碎，能提高后续与多糖溶液的混合。
(4)本发明提供的一种丝素基复合水凝胶支架，具有丰富的孔结构、较好的机械强度及良好的生物相容性，其能够负载足够的海藻酸钠水凝胶为种子细胞提供良好的生存环境，为细胞在支架上进一步的增殖与黏附奠定了基础；可直接负载种子细胞用于组织工程，免去细胞体外培养步骤，在临床研究方面有重要意义。
(5)本发明提供的一种丝素基复合水凝胶支架，制备方法简单易行、成本较低，丝素微纳米纤维保留了原有丝素纤维的天然属性，并且有效提升其形态稳定性；本发明以较低的溶质含量制备出同时具有高机械性能、均匀孔隙率和良好生物相容性的丝素基复合水凝胶支架，使其在直接负载种子细胞方面有较好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1-4及对比例1制得的丝素微纳米纤维多孔支架的电子显微镜形貌图，标尺均为300μm。
图2为实施例5-6及对比例2制得的丝素微纳米纤维多孔材料的电子显微镜形貌图，标尺均为300μm。
图3分别为实施例1和实施例8-10制得的丝素基复合水凝胶支架的外观图。
图4为实施例1、实施例8-10和对比例3丝素基复合水凝胶支架的压缩测试曲线和杨氏模量图。
图5为实施例2与对比例3制备的支架细胞培养增殖与毒性检测结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述。
在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在附图中仅仅示出了与本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。
另外，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
本发明提供了一种丝素基复合水凝胶支架的制备方法，包括如下步骤：
S1.制备丝素微纳米纤维悬浮液和多糖溶液：
(a)将脱胶后的丝素置于摩尔比为1:2:8的Ca(NO3)2/CH3CH2OH/H2O的三元混合溶液中进行溶胀处理，其中，溶胀处理温度为45-60℃，处理时间为2-8h。再将经溶胀处理的丝素置于空载速度为36000r/min的高速搅拌机中剪切破碎10-30min，收集所得溶液，并将所得溶液经冷冻干燥，制得0.1wt％-1.0wt％的丝素微纳米纤维悬浮液，于4℃保存备用。
通过使用Ca(NO3)2/CH3CH2OH/H2O的三元混合溶液对脱胶后的丝素进行溶胀处理，能够消除丝素纳米原纤间的内应力，再加以适当的物理机械搅拌作用，在保留纳米原纤的力学性能的同时尽量将丝素微纳米纤维破碎(能提高后续与多糖溶液的混合)，制得丝素微纳米纤维悬浮液。
(b)称取适量的多糖，加入去离子水后，缓慢搅拌，制得0.5wt％-1.5wt％的多糖溶液，于4℃保存备用。
具体地，多糖为壳聚糖、淀粉、糖原、菊糖、琼脂、透明质酸、肝素、硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、魔芋中的一种或多种混合。
S2.制备丝素微纳米纤维多孔支架：
将步骤S1制得的丝素微纳米纤维悬浮液与多糖溶液按溶质质量比为80:20-99.9:0.01混合均匀，优选为90:10，得到混合液，且所得混合液的总溶质的浓度为0.3wt％-2.0wt％，优选为0.5wt％-0.8wt％。
再向混合液中依次加入吗啉乙磺酸、N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐交联剂充分反应，得到反应液。其中，吗啉乙磺酸、N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐占混合液的质量百分数分别为10％、10％和20％。
将反应液注入模具中，经冷冻干燥，得到丝素微纳米纤维多孔支架。
通过加入交联剂，使丝素微纳米纤维和多糖分子间通过共价键交联在一起，将多糖作为粘合剂，使得丝素微纳米纤维形成独特的微纳米纤维网络结构，从而提高丝素微纳米纤维多孔支架的稳定性和机械性能，使其为负载海藻酸钠水凝胶提供前提条件。
通过将制得的丝素微纳米纤维与多糖溶液交联共混后注入模具中，多糖的加入提高了丝素微纳米纤维之间的结合力，冷冻干燥，除去水分后，得到不溶于水且具有稳定多孔结构的丝素微纳米纤维多孔支架，为丝素基复合水凝胶支架提供支撑骨架。
S3.制备丝素基复合水凝胶支架：
将步骤S2制得的丝素微纳米纤维多孔支架置于0.4wt％-2.0wt％的海藻酸钠溶液中，优选为0.5wt％-1.5wt％，吸附海藻酸钠溶液至饱和，再用Ca2+交联后制得丝素基复合水凝胶支架。
海藻酸钠溶液进入丝素微纳米纤维多孔支架的孔隙中，占据了支撑骨架中原有的孔隙，通过Ca2+的加入，交联形成海藻酸盐水凝胶，使支撑骨架中重新产生孔隙。由于Ca2+与海藻酸的结合力远强于Na+与海藻酸的结合力，随着支撑骨架表面及内部的海藻酸钠与Ca2+不断发生离子交换反应，每分子的Ca2+可以与两分子的海藻酸的羧基结合，一方面，提高了海藻酸盐分子之间的键合力，从而提高海藻酸盐水凝胶的强度，进而提高丝素基复合水凝胶支架的强度；另一方面，海藻酸钙与多糖、丝素微纳米纤维三者的键合力更强(相比于海藻酸钠与多糖、丝素微纳米纤维三者的键合力更强)，使支撑骨架的各成分更牢固地结合在一起，形成特殊结构的支撑骨架，大幅度提升了丝素基复合水凝胶支架的机械强度。另外，海藻酸盐水凝胶的形成，使海藻酸盐固着于丝素微纳米纤维多孔支架的孔隙中，防止海藻酸盐的流失，为种子细胞长期提供良好的生存环境。
本发明还提供了一种丝素基复合水凝胶支架，该丝素基复合水凝胶支架根据上述技术方案中任一技术方案制备得到。
本发明还提供了一种丝素基复合水凝胶支架的应用，用于直接负载种子细胞制成组织工程支架，并将所述组织工程支架植入体内(具体操作为：将种子细胞置于海藻酸钠溶液中，再将含有种子细胞的海藻酸钠溶液负载入丝素微纳米纤维多孔支架的孔隙中，再通过Ca2+交联后，将负载了种子细胞的丝素基复合水凝胶支架植入体内)；或者用于软骨修复领域。
下面结合具体的实施例对本发明提供的丝素基复合水凝胶支架及其制备方法与应用进行说明。
实施例1
一种丝素基复合水凝胶支架的制备方法，包括以下步骤：
S1.制备丝素微纳米纤维悬浮液和多糖溶液：
(a)将硝酸钙、乙醇和水按照摩尔比为1:2:8的比例配置成三元溶液，将脱胶后的蚕丝按照1:250g/mL的浴比置于该三元溶液中，在60℃下处理6h；再将处理过的丝素纤维置于高速搅拌机中机械剪切15min，收集所得溶液，经冷冻干燥后制得丝素微纳米纤维悬浮液，于4℃保存备用。
(b)取0.5g透明质酸粉末，加入50mL去离子水中，缓慢搅拌8h后，得到质量分数为1.0wt％的透明质酸溶液，作为多糖溶液在4℃下密封保存备用。
S2.制备丝素微纳米纤维多孔支架：
将步骤S1制得的丝素微纳米纤维悬浮液与多糖溶液按照90:10的溶质质量比进行混合并充分搅拌，得到混合液，且所得混合液的总溶质的浓度为0.4wt％；再向混合液中加入预定量的吗啉乙磺酸、N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，使其占混合液的质量百分数分别为10％、10％和20％，充分反应后，得到反应液；将得到的反应液注入模具中，经冷冻干燥后，得到丝素微纳米纤维多孔支架。
S3.制备丝素基复合水凝胶支架：
将步骤S2制得的丝素微纳米纤维多孔支架置于0.5wt％的海藻酸钠溶液中，吸附海藻酸钠溶液至饱和；并用Ca2+交联后制得丝素基复合水凝胶支架。
其中，0.5wt％的海藻酸钠溶液的制备包括如下步骤：将0.5g海藻酸钠粉末，加入100mL去离子水中，缓慢搅拌后，得到质量分数为0.5wt％的海藻酸钠溶液，在4℃下密封保存备用。
实施例2-4及对比例1
实施例2-4及对比例1分别提供了一种丝素基复合水凝胶支架的制备方法，与实施例1相比，不同之处在于，步骤S2中所得混合液的总溶质的浓度不同，实施例1-4及对比例1对应的具体参数值如表1所示，其他与实施例1大致相同，在此不再赘述。
表1实施例1-4及对比例1对应的混合液的溶质质量百分数
Figure BDA0003557962900000081
Figure BDA0003557962900000091
按照各实施例提供的制备方法进行实验后可以发现，丝素微纳米纤维悬浮液与多糖溶液交联共混后，混合液总溶质的浓度的变化对制得的丝素基复合水凝胶支架的性能具有较大的影响。
对实施例1-4及对比例1制得的丝素微纳米纤维多孔支架的电子显微镜形貌进行表征，结果如图1所示。其中，a-e分别表示实施例1-4及对比例1制得的丝素微纳米纤维多孔支架的电子显微镜形貌图。
具体地，当混合液中总溶质的浓度为0.3wt％时，由图1a可以看出，实施例1制得的丝素微纳米纤维多孔支架的孔径较大，且孔壁为松散的纤维网状结构(此结构不利于种子细胞黏附)。这主要是因为混合液中总溶质的浓度较低时，冷冻干燥，使更多的水分蒸发，从而使丝素微纳米纤维多孔支架(即支撑骨架)的孔径较大，且不同的丝素微纳米纤维的交联不充分，导致支撑骨架机械性能差，负载海藻酸钠溶液并用Ca2+交联后，海藻酸盐水凝胶与支撑骨架中的丝素纤维、多糖的强结合力使原本的支撑骨架结构发生变形，使原本松散的纤维网状结构遭到更大的破坏，使支撑骨架的纤维发生断裂，最终制得的复合水凝胶支架的机械强度差，不能直接植入体内。
随着混合液中总溶质浓度的升高，由图1b-1d可以看出，实施例2-4制备的丝素微纳米纤维多孔支架的孔径减小，孔壁由松散的网状结构变为致密的纤维网络。这主要是因为，随着混合液中总溶质浓度的升高，冷冻干燥，水分蒸发较少，使支撑骨架的孔径较小，而且不同丝素微纳米纤维的交联程度不断提高，纤维之间交联更充分，形成的网状结构更致密，另外使制得的丝素基复合水凝胶支架中纤维之间的结合强度不断提高，使支撑骨架具有更高的形态稳定性，进而使制备的复合水凝胶支架的机械强度不断提高。但随着负载海藻酸钠溶液并用Ca2+交联的进行，海藻酸盐水凝胶、与支撑骨架中的丝素纤维、多糖的结合后，使整个支撑骨架的交联程度发生变化，孔径进一步减小，且海藻酸盐水凝胶占据了支撑骨架中的大量孔隙，这使得实施例4(丝素微纳米纤维多孔支架的孔径已经较小)制备的复合水凝胶支架中几乎没有孔隙结构，不利于种子细胞的生长与粘附。
但当混合液中总溶质浓度增加至2.0wt％时，由图1e可以看出，对比例1制备的丝素微纳米纤维多孔支架形成部分片状结构，孔径及孔隙率均减少。这主要是因为，当混合液的总溶质浓度过高时，丝素微纳米纤维开始缠结在一起，甚至成片状结构，导致其孔径及孔隙率降低。随着负载海藻酸钠溶液并用Ca2+交联的进行，该支撑骨架不利于海藻酸盐水凝胶、丝素纤维和多糖三者之间的进一步结合，不能形成适于种子细胞生产的特殊结构。
由此可知，通过调节混合液中总溶质的浓度(即丝素微纳米纤维悬浮液与多糖溶液混合液的浓度)，能够对制得的丝素基复合水凝胶支架的内部形貌进行调控，进而对形成的丝素基复合水凝胶支架的结构进行调控，以满足不同的应用需求。
因此，为使制得的丝素基复合水凝胶支架同时具有较高的稳定性和孔隙率，即使制得的丝素基复合水凝胶支架不仅具有较强的机械性能，且有利于种子细胞的生长与粘附，本发明优选混合液的总溶质质量百分数为0.5wt％-0.8wt％。
实施例5-6及对比例2
实施例5-6及对比例2分别提供了一种丝素基复合水凝胶支架的制备方法，与实施例2相比，不同之处在于，步骤S2中丝素微纳米纤维悬浮液与多糖溶液的溶质质量比不同，实施例5-6及对比例2中对应的丝素微纳米纤维悬浮液与多糖溶液的溶质质量比如表2所示。
表2实施例5-6及对比例2对应的丝素微纳米纤维悬浮液与多糖溶液的溶质质量比
Figure BDA0003557962900000101
Figure BDA0003557962900000111
按照各实施例提供的制备方法进行实验后可以发现，丝素微纳米纤维悬浮液与多糖溶液的溶质质量比，对制得的丝素基复合水凝胶支架的性能具有较大的影响。
对实施例5-6及对比例2制得的丝素微纳米纤维多孔支架的电子显微镜形貌进行表征，结果如图2所示。其中，f-h分别表示实施例5-6及对比例2制得的丝素微纳米纤维多孔支架的电子显微镜形貌图。
具体地，随着多糖含量的增加(实施例5-6及对比例2)，由图2f-h可以看出，丝素微纳米纤维多孔支架的孔径不断减小，纤维的交联程度不断增加。这主要是因为，随着多糖含量的增加，丝素微纳米纤维表面包裹的多糖更多，使其包裹更充分，不仅更有利于丝素微纳米纤维之间的交联，而且纤维之间的结合强度增加，使得网状结构更加牢固，使丝素微纳米纤维多孔支架的机械性能提高，进而提高丝素基复合水凝胶支架的机械强度。
由图2f可知，实施例5的丝素微纳米纤维多孔支架的孔径偏大，负载海藻酸钠溶液并用Ca2+交联后，海藻酸盐水凝胶与支撑骨架中的丝素纤维、多糖的强结合力使原本的支撑骨架结构发生变形较大，使孔结构发生较大变化，使最终制得的复合水凝胶支架的结构发生变化，使其机械强度差，不能直接植入体内且负载海藻酸盐水凝胶后的孔径不均匀，不利于种子细胞的生长。
由图2g可知，实施例6的丝素微纳米纤维多孔支架的交联程度较大，孔径已经较小，随着负载海藻酸钠溶液并用Ca2+交联的进行，最终制备的复合水凝胶支架中几乎没有孔隙结构，不利于种子细胞的生长与粘附。
当多糖含量过量时(对比例2)，由图2h可以看出，丝素微纳米纤维开始缠结，多孔材料的孔壁形成部分片状结构，不利于种子细胞的生长与粘附。这主要是因为，多糖含量过量时，丝素纤维表面包裹着大量的多糖，过多的多糖使纤维的交联程度增加，甚至使丝素微纳米纤维开始缠结。负载海藻酸钠溶液并用Ca2+交联后，过多的多糖使海藻酸盐水凝胶直接与多糖结合，改变了海藻酸盐水凝胶、丝素纤维及多糖三者之间的结合形式，使最终得到的丝素基复合水凝胶支架的结构发生较大变化，且几乎没有孔隙，不利于种子细胞的生长。
由此可知，通过调节丝素微纳米纤维悬浮液与多糖溶液的溶质质量比，能够对制得的丝素基复合水凝胶的支撑骨架进行调控，以满足不同的应用需求。
因此，为使制得的丝素基复合水凝胶支架具有稳定的结构和较高的孔隙率，即使制得的丝素基复合水凝胶支架不仅具有较强的机械性能，且有利于种子细胞的生长与粘附，本发明优选丝素微纳米纤维悬浮液与多糖溶液的溶质质量比为90:10。
实施例7-10及对比例3
实施例7-10及对比例3分别提供了一种丝素基复合水凝胶支架的制备方法，与实施例2相比，不同之处在于，步骤S3中海藻酸钠溶液的浓度不同，实施例7-10及对比例3中对应的海藻酸钠溶液的浓度如表3所示，对比例3即不负载海藻酸钠水凝胶，为单纯的丝素微纳米纤维多孔材料。
表3实施例7-10及对比例3对应的海藻酸钠溶液的质量百分数
实施例/对比例 海藻酸钠溶液的质量百分数/wt％
实施例1 0.5％
实施例7 0.4％
实施例8 1.0％
实施例9 1.5％
实施例10 2.0％
对比例3 0.0％
如图3所示，i-l分别为实施例1和实施例8-10制得的丝素基复合水凝胶支架的外观图。
实验发现，当海藻酸钠溶液的浓度为0.4wt％时(实施例7)，所得丝素基复合水凝胶支架的机械性能较差，且不能为种子细胞提供良好的生存环境。这主要是因为，海藻酸钠溶液的浓度较低时，达到饱和时，支撑骨架中吸附的海藻酸钠较少，用Ca2+交联后，生成的海藻酸盐水凝胶与丝素纤维、多糖的交联不充分，不能形成三者均匀结合的体系，使最终制备的素基复合水凝胶支架机械强度差，施加轻微外力就会导致复合水凝胶支架形态破裂。另外，低浓度的营养液也不利用种子细胞的生长。
随着海藻酸钠溶液的浓度增加(实施例1、8、9)，所得丝素基复合水凝胶支架的机械性能有所提高，且能为种子细胞提供良好的生存环境，有利于种子细胞直接负载。这主要是因为，随着海藻酸钠溶液的浓度增加，一方面，海藻酸钠溶液更容易与Ca2+发生离子交换，形成网状结构的凝胶，此时，海藻酸盐水凝胶与丝素纤维、多糖之间发生充分的交联，且三者之间的结合力较强，为丝素基复合水凝胶支架提供支撑力，增加其机械性能。另一方面，三者结合后为丝素基复合水凝胶支架提供了新的孔隙结构，有利于种子细胞的生长。
当海藻酸钠溶液的浓度为2.0wt％时(实施例10)，将丝素微纳米纤维吸附海藻酸钠至饱和时，支撑骨架中吸附大量的海藻酸钠，将原本的孔隙全部占据，用Ca2+交联后，虽然制得的复合水凝胶的机械性能增强，但大量高浓度的海藻酸盐水凝胶与丝素纤维、多糖发生过多的交联，使其结构发生严重变形，且将所有的孔隙均占据，不利于种子细胞在支架上的生长。
因此，为使制得的丝素基复合水凝胶支架可以作为种子细胞的良好载体，本发明优选海藻酸钠溶液的浓度为0.5wt％-1.5wt％。
如图4所示，为实施例1、实施例8-10和对比例3的压缩性能测试图。当丝素微纳米纤维多孔支架上不负载海藻酸钠水凝胶时，多孔支架的机械性能较差。随负载海藻酸钠水凝胶浓度的增加，丝素基复合水凝胶支架的机械性能越来越好，杨氏模量越来越大，进一步说明海藻酸钠水凝胶的加入使丝素基复合水凝胶支架的机械性能得到改善。
如图5所示，为细胞培养增殖与毒性检测结果。分别将相同量的种子细胞接种到对比例3及实施例2制备的支架上进行培养。由图5可知，细胞在对比例3及实施例2制备的支架上均可以生长(OD值可以反应种子细胞的数量及活性)，说明二者均具有良好的生物相容性；但随着培养时间的增加，对比例3的细胞很快处于衰减期，而实施例2的细胞依然处于快速增长阶段，且增长速度基本处于稳定，细胞在丝素基复合水凝胶支架上生长的更持久(第7天，实施例2的细胞数量几乎为对比例3的两倍)，说明丝素基复合水凝胶支架的生物相容性更优，这主要是因为，海藻酸盐水凝胶的存在，为种子细胞提供了优越的水凝胶环境，使海藻酸盐、丝素纤维及多糖三者之间形成具有合适孔隙的空间网状结构，该结构不易随环境的变化而变化，为细胞的生长提供长期稳定的条件。由此说明，丝素基复合水凝胶支架更适合作为细胞载体，直接负载种子细胞，并植入体内。
细胞活力检测的具体操作为：分别在培养1d、3d、7d后，弃去培养基。用PBS轻轻冲洗样品3次，向空白组中加入500uL完全培养基作为对照，实验组每孔加入500uL的细胞活力检测液(现配现用，向完全培养基中加入10％CCK-8配成细胞活力检测液)，放入培养箱中继续培养3h。轻轻吹打培养基，然后吸出培养基至1.5mL离心管中，并以1000r/min离心5min。取上清液加入96孔板，每孔100uL，用酶标仪检测450nm下的吸光度，无细胞组作为背景值扣除。其中，CCK-8是一种常用于细胞增殖活力的试剂，主要利用CCK-8中含有的WST-8被细胞线粒体内的脱氢酶还原为具有高浓度水溶性的橙黄色甲瓒产物Formazan，而这种物质的数量与活细胞数量成正比。
需要说明的是，本领域技术人员应当理解，在步骤S1中，溶胀处理过程的处理温度可以在45-60℃之间进行调整，处理时间可以是2-8h；剪切破碎处理的时间可以在10-30min之间进行调整；在步骤S2中，使用的多糖可以是壳聚糖、淀粉、糖原、菊糖、琼脂、透明质酸、肝素、硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、魔芋中的一种或多种混合，都能够达到相同的技术效果，均属于本发明的保护范围。
综上所述，本发明提供的一种丝素基复合水凝胶支架及其制备方法与应用，通过调节丝素微纳米纤维悬浮液与多糖溶液的浓度及比例，使丝素微纳米纤维间发生不同程度的交联，形成独特的微纳米纤维网络结构，进而调整丝素基复合水凝胶支架的机械强度和孔径及孔隙率；通过调节海藻酸钠溶液的浓度，使海藻酸盐、丝素纤维及多糖三者之间发生交联，进一步调整交联的网状结构及其孔径和孔隙率，形成适于种子细胞生长的特殊结构的高强度支架，为支架材料可以直接负载种子细胞提供前提条件。基于天然丝素微纳米纤维的优异力学性能，将其先与多糖溶液交联共混，使丝素微纳米纤维交联在一起，形成独特的微纳米纤维网络结构，从而提高丝素微纳米纤维多孔支架的稳定性和机械性能。该丝素基复合水凝胶支架具有丰富的孔结构、较好的机械强度及良好的生物相容性，其能够负载足够的海藻酸钠水凝胶为种子细胞提供良好的生存环境，为细胞在支架上进一步的增殖与黏附奠定了基础；可直接负载种子细胞用于组织工程，免去细胞体外培养步骤，在临床研究方面有很大意义。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种丝素基复合水凝胶支架的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1.分别制备0.1wt％-1.0wt％的丝素微纳米纤维悬浮液和0.5wt％-1.5wt％的多糖溶液；
S2.将步骤S1制得的所述丝素微纳米纤维悬浮液与所述多糖溶液按预设比例混合均匀，得到混合液；再向所述混合液中加入交联剂反应，得到反应液；将所述反应液注入模具中，经冷冻干燥，得到丝素微纳米纤维多孔支架；
S3.将步骤S2制得的所述丝素微纳米纤维多孔支架吸附0.5wt％-2.0wt％的海藻酸钠溶液至饱和，并用二价阳离子交联后制得丝素基复合水凝胶支架。
2.根据权利要求1所述的丝素基复合水凝胶支架的制备方法，其特征在于：步骤S3中所述二价阳离子为Ca2+。
3.根据权利要求1所述的丝素基复合水凝胶支架的制备方法，其特征在于：步骤S1中所述多糖为壳聚糖、淀粉、糖原、菊糖、琼脂、透明质酸、肝素、硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、魔芋中的一种或多种混合。
4.根据权利要求1所述的丝素基复合水凝胶支架的制备方法，其特征在于：步骤S2中所述丝素微纳米纤维悬浮液与所述多糖溶液的溶质质量比为80：20-99.9:0.01，且所述混合液的总溶质的浓度为0.3wt％-1.0wt％。
5.根据权利要求1所述的丝素基复合水凝胶支架的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述丝素微纳米纤维悬浮液的制备方法包括如下步骤：
将脱胶后的丝素置于摩尔比为1:2:8的Ca(NO3)2/CH3CH2OH/H2O的三元混合溶液进行溶胀处理；再将经溶胀处理的丝素置于高速搅拌机中剪切破碎，经冷冻干燥后制得丝素微纳米纤维悬浮液。
6.根据权利要求5所述的丝素基复合水凝胶支架的制备方法，其特征在于：所述溶胀处理温度为45-60℃，处理时间为2-8h。
7.根据权利要求5所述的丝素基复合水凝胶支架的制备方法，其特征在于：所述高速搅拌机空载速度为36000r/min；所述剪切破碎处理的时间为10-30min。
8.根据权利要求4所述的丝素基复合水凝胶支架的制备方法，其特征在于：步骤S2中，向所述混合液中加入交联剂的具体操作为：向所述混合液中依次加入吗啉乙磺酸、N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，且所述吗啉乙磺酸、N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐占所述混合液的质量百分数分别为10％、10％和20％。
9.一种丝素基复合水凝胶支架，其特征在于：该丝素基复合水凝胶支架根据权利要求1-8中任一项权利要求所述的制备方法制备得到。
10.一种权利要求1-8中任一权利要求所述的制备方法制得的丝素基复合水凝胶支架或权利要求9所述的丝素基复合水凝胶支架的应用，其特征在于：所述丝素基复合水凝胶支架用于直接负载种子细胞制成组织工程支架，并将所述组织工程支架植入体内；或者用于软骨修复领域。
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