CN109096501A - 一种丝素三维多孔支架及其制备方法 - Google Patents

一种丝素三维多孔支架及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种丝素三维多孔支架的制备方法以及用该方法制备的丝素三维多孔支架，制备方法包括以下步骤：蚕丝纤维脱胶制备丝素蛋白；将丝素蛋白溶于盐‑酸二元溶液中并静置得到丝素蛋白溶液，加入多糖溶解并静置得到丝素蛋白多糖共混溶液；共混溶液透析制备丝素水凝胶；水凝胶冷冻干燥制得丝素三维多孔支架。该方法操作简单，流程短，制备的支架孔径可调，具有良好的机械性能和吸水性，可为生物医用材料领域提供一系列替代材料。

Description

一种丝素三维多孔支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种丝素三维多孔支架及其制备方法。
背景技术
目前，水凝胶已成为生物材料、生物医药和结构生物学等领域一类重要的载体。传统上，双网状结构水凝胶、纳米复合材料水凝胶以及拓扑结构水凝胶等虽具有优异的机械性能，但是大多需要复杂的合成、组装和交联工序，流程长，同时无法避免有毒溶剂的使用和综合性能的降低。如大多数的合成水凝胶生物相容性差，且在降解过程中其降解产物具有潜在的毒性，制约了大多数合成水凝胶在生物医药领域的应用。
丝素蛋白质是一类具有我国特色优势的重要资源，已被研究用于化妆品30余年，而蚕丝手术缝合线的使用已超过100年。近年来再生丝素凝胶的研究和应用被广泛报道，如作为药物和生长因子缓释载体、骨填充材料和细胞培养支架等。自然条件下，丝素蛋白质溶液的凝胶化过程缓慢，需要3-7天；而采用物理方法，一般需要剧烈的机械作用，造成丝素蛋白质平均分子量降低，所得凝胶材料机械性能差；采用金属离子或化学试剂诱导丝素溶液凝胶化转变可加快凝胶速度，但无法避免使用化学试剂或有毒溶剂，恶化了丝素凝胶材料在生物医学领域的应用。因此，制备兼具良好的机械性能和生物相容性又避免使用有毒化学试剂的快速丝素凝胶，是当前丝素蛋白质凝胶研究开发的热点，可为人体软骨及其他软组织的重建和修复提供一种新型支架材料。
在丝素水凝胶网络结构中，丝素大分子链之间发生类似“交联”的效果。水凝胶内的微观形态通常呈现出三维网络结构，且网络内的孔结构参数可随丝素溶液浓度的变化而调节，为细胞的粘附、迁移、生长和增殖提供了适宜的空间微环境，为组织修复和重建提供模板。因此，制备具有合适微观孔结构的丝素凝胶，促进细胞的生命活动和物质的有效运转，是实现丝素凝胶组织工程成功的关键。
中国发明专利公开号CN106310349A，公开日2017年1月11日，公开了一种再生丝素蛋白凝胶膜。与本发明的区别在于：基于该制备方法，丝素凝胶只能形成二维的致密膜材料，可加工性差，难以形成三维网络结构的强韧丝素水凝胶，作为生物医用材料的使用受到了限制；其次，本发明中所述的凝胶组分与公开号CN106310349A所述凝胶的组分不同，本发明丝素凝胶中添加了多糖；再次，与本发明相比，该凝胶膜吸水和保水性能较差，为致密的膜材料，无法进行营养物质的转运和吸收。
因此，迫切需要一种制备丝素水凝胶的新方法，在不使用有毒化学试剂及交联剂的同时，高效制备兼具良好的生物相容性、吸水性和适宜的机械性能的组织修复新材料。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有良好相容性、优异机械性能和强吸水性、制备工艺简单的丝素三维多孔支架及其制备方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种丝素三维多孔支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)脱胶：将蚕丝纤维脱胶得到丝素蛋白；
(2)溶丝：配制盐浓度为30～100g/L的盐-酸二元溶液，将所述丝素蛋白加入到所述盐-酸二元溶液中溶解并静置得到丝素蛋白溶液；
(3)溶糖：将多糖加入到所述丝素蛋白溶液中溶解并静置得到丝素蛋白多糖共混溶液；
(4)丝素水凝胶制备：将所述丝素蛋白多糖共混溶液透析得到丝素水凝胶；
(5)支架制备：将所述丝素水凝胶冷冻干燥制得丝素三维多孔支架。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
进一步，所述步骤(1)中的具体步骤为：将蚕丝纤维在0.05～1wt％的脱胶盐水溶液中煮沸20-30min，洗涤，将上述过程重复2～3次后，60℃烘干24h，扯松备用，所述脱胶盐为Na2CO3或NaHCO3或(NH4)2SO4中的一种。
进一步，所述盐-酸二溶液中的盐为Ca(NO3)2、CaCl2、LiBr中的任一种，酸为盐酸、甲酸中的任一种，所述盐酸的浓度大于等于35％，所述甲酸的纯度大于等于98％，所述步骤(2)中所述丝素蛋白溶解时手动摇动，溶解的时间为10-30min，静置温度为室温，静置时间为1～4h，所述丝素蛋白溶液中所述丝素蛋白的浓度为30～200g/L。
进一步，所述丝素蛋白溶液中所述丝素蛋白的浓度为60～150g/L。
进一步，所述步骤(3)中加入的多糖与所述丝素蛋白的质量比为0.375～1：1，静置时间为1～4h。
进一步，所述多糖为壳聚糖、肝素、葡聚糖、透明质酸、魔芋多糖、硫磺软骨素、淀粉、淀粉衍生物和纤维素中的任一种。
进一步，所述步骤(4)中透析的时间为10～50h。
进一步，所述步骤(5)中冷冻干燥的时间为20～48h。
本发明还提供了根据上述方法制备得到的丝素三维多孔支架。
本发明采用中性盐及强挥发性的酸溶解丝素纤维和多糖，透析形成丝素水凝胶的过程中由溶剂置换促进丝素蛋白大分子构象转变，进而形成丝素水凝胶。
本发明的丝素三维多孔支架及其制备方法具有如下优点：
1、本发明的制备方法操作简单，流程短，透析阶段丝素蛋白大分子构象转变，形成β-折叠结构，经透析后可直接形成凝胶类物质，无需添加交联剂；
2、多糖的添加可以增加丝素三维多孔支架的孔径，冻干后形成的支架上有微纳米纤维网附着，后期更有利于细胞的粘附与增殖；
3、可以根据丝素蛋白的浓度大小来调节形成的丝素三维多孔支架的孔径；
4、形成的丝素三维多孔支架具有良好的生物相容性、优异的机械性能、强吸水性以及良好的可加工性，可为生物医用材料领域提供一系列替代材料。
附图说明
图1为本发明实施例3中丝素三维支架的扫描电镜图，标尺为100μm；
图2为本发明实施例3中丝素三维支架的扫描电镜图，标尺为2μm；
图3为本发明丝素三维支架的FTIR结果图；
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
(1)脱胶：将蚕丝纤维置于质量分数为0.05wt％的Na2CO3水溶液中煮沸30min，用去离子水充分洗涤，将上述过程重复三次后，置于60℃烘箱中烘干24h扯松备用；
(2)溶丝：分别称取、量取CaCl2和甲酸(纯度大于98％)，配制盐浓度为30g/L的CaCl2-甲酸溶液，称取3g丝素蛋白加入100mL CaCl2-甲酸溶液中手动摇晃10～30min，室温下静置1h，得到丝素蛋白溶液；
(3)溶糖：称取2g透明质酸加入到丝素蛋白溶液中，手动摇晃均匀，室温下静置3h，得到丝素蛋白多糖共混溶液；
(4)丝素水凝胶制备：将上述丝素蛋白多糖共混溶液注入透析模具中，经过10～50小时透析得到丝素水凝胶；
(5)支架制备：将上述得到的水凝胶在-20～-80℃下冷冻干燥20～48h得到丝素三维多孔支架。
实施例2
(1)脱胶：将蚕丝纤维置于质量分数为0.05wt％的Na2CO3水溶液中煮沸30min，用去离子水充分洗涤，将上述过程重复三次后，置于60℃烘箱中烘干24h扯松备用；
(2)溶丝：分别称取、量取CaCl2和甲酸(纯度大于98％)，配制盐浓度为100g/L的CaCl2-甲酸溶液，称取6g丝素蛋白加入100mL CaCl2-甲酸溶液中手动摇晃10～30min，室温下静置1h，得到丝素蛋白溶液；
(3)溶糖：称取5g透明质酸加入到丝素蛋白溶液中，手动摇晃均匀，室温下静置3h，得到丝素蛋白多糖共混溶液；
(4)丝素水凝胶制备：将上述丝素蛋白多糖共混溶液注入透析模具中，经过10～50小时透析得到丝素水凝胶；
(5)支架制备：将上述得到的水凝胶在-20～-80℃下冷冻干燥20～48h得到丝素三维多孔支架。
实施例3
(1)脱胶：将蚕丝纤维置于质量分数为0.05wt％的Na2CO3水溶液中煮沸30min，用去离子水充分洗涤，将上述过程重复三次后，置于60℃烘箱中烘干24h扯松备用；
(2)溶丝：分别称取、量取CaCl2和甲酸(纯度大于98％)，配制盐浓度为50g/L的CaCl2-甲酸溶液，称取10g丝素蛋白加入100mL CaCl2-甲酸溶液中手动摇晃10～30min，室温下静置1h，得到丝素蛋白溶液；
(3)溶糖：称取5g透明质酸加入到丝素蛋白溶液中，手动摇晃均匀，室温下静置3h，得到丝素蛋白多糖共混溶液；
(4)丝素水凝胶制备：将上述丝素蛋白多糖共混溶液注入透析模具中，经过10～50小时透析得到丝素水凝胶；
(5)支架制备：将上述得到的水凝胶在-20～-80℃下冷冻干燥20～48h得到丝素三维多孔支架。
实施例4
(1)脱胶：将蚕丝纤维置于质量分数为0.1wt％的Na2CO3水溶液中煮沸30min，用去离子水充分洗涤，将上述过程重复三次后，置于60℃烘箱中烘干24h扯松备用；
(2)溶丝：分别称取、量取CaCl2和盐酸(浓度大于35％)，配制盐浓度为50g/L的CaCl2-盐酸溶液，称取15g丝素蛋白加入100mL CaCl2-盐酸溶液中手动摇晃10～30min，室温下静置4h，得到丝素蛋白溶液；
(3)溶糖：称取15g硫磺软骨素加入到丝素蛋白溶液中，手动摇晃均匀，室温下静置3h，得到丝素蛋白多糖共混溶液；
(4)丝素水凝胶制备：将上述丝素蛋白多糖共混溶液注入透析模具中，经过10～50小时透析得到丝素水凝胶；
(5)支架制备：将上述得到的水凝胶在-20～-80℃下冷冻干燥20～48h得到丝素三维多孔支架。
实施例5
(1)脱胶：将蚕丝纤维置于质量分数为0.25wt％的NaHCO3水溶液中煮沸30min，用去离子水充分洗涤，将上述过程重复三次后，置于60℃烘箱中烘干24h扯松备用；
(2)溶丝：分别称取、量取CaCl2和盐酸(纯度大于35％)，配制盐浓度为50g/L的CaCl2-盐酸溶液，称取20g丝素蛋白加入100mL CaCl2-盐酸溶液中手动摇晃10～30min，室温下静置3h，得到丝素蛋白溶液；
(3)溶糖：称取7.5g透明质酸加入到丝素蛋白溶液中，手动摇晃均匀，室温下静置3h，得到丝素蛋白多糖共混溶液；
(4)丝素水凝胶制备：将上述丝素蛋白多糖共混溶液注入透析模具中，经过10～50小时透析得到丝素水凝胶；
(5)支架制备：将上述得到的水凝胶在-20～-80℃下冷冻干燥20～48h得到丝素三维多孔支架。
性能测试
对本发明实施例1-5制得的三维多孔支架进行性能测试，测定支架的杨氏模量、吸水性，通过SEM测定支架孔径及观察孔径壁上覆盖的微纳米纤维网。
其中实施例1-5的杨氏模量、吸水性、孔径如下表所示：
图1和图2为实施例3中丝素三维支架的电镜扫描图，其中图1的标尺为100μm，图2的标尺为2μm；图3为该支架的FT IR结果。
由以上数据及图片可知，通过本发明的制备方法制备丝素三维支架，随着丝素浓度的增加，支架的杨氏模量增加，孔径减小，即可以根据丝素的浓度调节支架的机械性能以及孔径，并且该支架具有良好的机械性能和吸水性，支架的孔径壁上覆盖有微纳米纤维网。丝素蛋白特定构象特征峰β-折叠的位置(cm-1)为1620～1635cm-1(酰胺I)、1530cm-1附近(酰胺II)、1230～1235cm-1(酰胺III)。因此，该支架存在大量的β-折叠。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种丝素三维多孔支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)脱胶：将蚕丝纤维脱胶得到丝素蛋白；
(2)溶丝：配制盐浓度为30～100g/L的盐-酸二元溶液，将所述丝素蛋白加入到所述盐-酸二元溶液中溶解并静置得到丝素蛋白溶液；
(3)溶糖：将多糖加入到所述丝素蛋白溶液中溶解并静置得到丝素蛋白多糖共混溶液；
(4)丝素水凝胶制备：将所述丝素蛋白多糖共混溶液透析得到丝素水凝胶；
(5)支架制备：将所述丝素水凝胶冷冻干燥制得丝素三维多孔支架。
2.根据权利要求1所述的一种丝素三维多孔支架的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的具体步骤为：将蚕丝纤维在0.05～1wt％的脱胶盐水溶液中煮沸20-30min，洗涤，将上述过程重复2～3次后，60℃烘干24h，扯松备用，所述脱胶盐为Na2CO3或NaHCO3或(NH4)2SO4中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种丝素三维多孔支架的制备方法，其特征在于，所述盐-酸二元溶液中的盐为Ca(NO3)2、CaCl2、LiBr中的任一种，酸为盐酸、甲酸中的任意一种，所述盐酸的浓度大于等于35％，所述甲酸的纯度大于等于98％，所述步骤(2)中所述丝素蛋白溶解时手动摇动，溶解的时间为10-30min，静置温度为室温，静置时间为1～4h，所述丝素蛋白溶液中所述丝素蛋白的浓度为30～200g/L。
4.根据权利要求3所述的一种丝素三维多孔支架的制备方法，其特征在于，所述丝素蛋白溶液中所述丝素蛋白的浓度为60～150g/L。
5.根据权利1所述的一种丝素三维多孔支架的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中加入的多糖与所述丝素蛋白的质量比为0.375～1:1，静置时间为1～4h。
6.根据权利要求5所述的一种丝素三维多孔支架的制备方法，其特征在于，所述多糖为壳聚糖、肝素、葡聚糖、透明质酸、魔芋多糖、硫磺软骨素、淀粉、淀粉衍生物和纤维素中的任一种。
7.根据权利要求1所述的一种丝素三维多孔支架的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中透析的时间为10～50h。
8.根据权利要求1所述的一种丝素三维多孔支架的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中冷冻干燥的时间为20～48h。
9.一种丝素三维多孔支架，其特征在于，通过权利要求1-8任一项所述的方法制备得到。
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