BRPI0708422A2 - Método para formar um compósito, compósito, métodos para promover a proliferação celular no compósito, para inibir a proliferação celular e para recuperar células do compósito, uso de um compósito, e , métodos para fixar um compósito a um tecido, para remover o crescimento celular, para induzir a geleificação in situ dentro dos poros de uma espuma de alginato, para prevenir a adesão de tecido a tecido adjacene e para formar uma espuma absorvente seca - Google Patents

Abstract

MéTODO PARA FORMAR UM COMPóSITO, COMPóSITO, METODOS PARA PROMOVER A PROLIFERAçãO CELULAR NO COMIPóSITO, PARA INIBIR A PROLIFERAçãO CELULAR E PARA RECUPERAR CéLULAS DO COMIPóSITO, USO DE UM COMIPóSITO, E, METODOS PARA FIXAR UM COMPóSITO A UM TECIDO, PARA PROMOVER O CRESCIMENTO CELULAR, PARA INDUZIR A GELEIFICAçãO IN SITU DENTRO DOS POROS DE UMA ESPUMA DE ALGINATO, PARA PREVENIR A ADESãO DE TECIDO A TECIDO ADJACENTE E PARA FORMAR UMA ESPUMA ABSORVENTE SECA A invenção refere-se a compósitos compreendendo um polissacarídeo geleificado dentro de poros de uma espuma, métodos depreparação e usos dos mesmos, por exemplo em aplicações biomédicas como meios de cultura de células e implantes, sistemas de distribuição de liberação controlada, aplicações em alimentos, aplicações industriais, e aplicações de cuidado pessoal, como cosméticos e higiene oral. Os compósitos da presente invenção são simples de formular usando algumas etapas e são utilizáveis para aprisionar componentes sensíveis ao calor, como células, fármacos, aromas ou fragrâncias dentro do gel de polissacarídeo. Além disso, a invenção provê um compósito capaz de imobilizar suavemente os componentes frágeis, como células vivas, sem expor estes componentes às forças de cisalhamento.

Description

MÉTODO PARA FORMAR UM COMPÓSITO, COMPÓSITO,MÉTODOS PARA PROMOVER A PROLIFERAÇÃO CELULAR NOCOMPÓSITO, PARA INIBIR A PROLIFERAÇÃO CELULAR E PARARECUPERAR CÉLULAS DO COMPÓSITO, USO DE UM COMPÓSITO,E, MÉTODOS PARA FIXAR UM COMPÓSITO A UM TECIDO, PARAPROMOVER O CRESCIMENTO CELULAR, PARA INDUZIR AGELEIFICAÇÃO IN SITU DENTRO DOS POROS DE UMA ESPUMA DEALGINATO, PARA PREVENIR A ADESÃO DE TECIDO A TECIDOADJACENTE E PARA FORMAR UMA ESPUMA ABSORVENTE SECA"Este pedido reivindica o benefício de pedido provisório US no.60/777 869, depositado em lo. de março de 2006; pedido provisório US no.60/ 872 844, depositado em 5 de dezembro de 2006, e pedido provisório USno. 60/ 874. 174, depositado em 11 de dezembro de 2006.

Esta invenção refere-se a um compósito compreendendo umpolissacarídeo geleificado dentro dos poros de uma espuma, métodos depreparação do compósito e usos dos mesmos. O compósito é particularmenteutilizável em aplicações biomédicas por exemplo meios de cultura de célulase implantes, sistemas de distribuição de liberação controlada, aplicações emalimentos, aplicações industriais, e aplicações de cuidado pessoal incluindocosméticos e higiene oral.

US 5 948 429 (Bell) descreve métodos para a preparação deespumas de biopolímero revestido incluindo espumas de biopolímero dereticulação por radiação ultravioleta, opcionalmente lavando com tampãoestéril seguido por água deionizada para aumentar a resistência à tração, eentão revestindo com um colágeno não reticulado.

WO 0154735 A2 (Bentz) descreve esponjas infundidas em gelonde um precursor de gel composto de uma solução de proteína oupolissacarídeo modificado e um agente de reticulação, se requerido, étipicamente adicionado para uma esponja antes de sua transição para umaconsistência de gel sólido. A iniciação de gel pode ser desencadeadaenzimaticamente, termicamente, foto-quimicamente, ou quimicamente. Aqui,no entanto, o agente formador de gel não é integrado na matriz de espumamas adicionado à matriz.

US 6 306 169 (Lee) descreve um implante biomecânicocompreendendo dois componentes de matriz, üm sendo um implante decolágeno e o outro um gel alginato hidratado que exerce uma pressão deintumescimento. O implante compreende uma população de células. Aofabricar o compósito, uma solução de alginato de sódio pode ser levada aintumescer por imersão em solução salina para criar forças de tração entre oalginato e a matriz de colágeno. A construção do compósito pode então serimersa em uma solução contendo um sal de um cátion divalente para induzir areticulação do alginato para formar um gel hidratado.

US 6__203 845 (Qin) descreve um método para formar umhidrogel desidratado (poroso) por dispersão das fibras contendo cátion emuma solução aquosa de um precursor de hidrogel incorporando umplastificante para formar um hidrogel e então desidratar o hidrogel.

US 6 656 974 (Renn) descreve uma material de espumaabsorvente compreendendo uma forma reticulada sólida de um polímeroaniônico e fibras ou outros particulados poliméricos que tem cátions doadospara efetuar a reticulação do polímero aniônico. As fibras permanecem naespuma final para atuar como um reforço. Não se tem sugestão de que aespuma final é ainda reagida para produzir um outro produto nem que aespuma contém outros cátions apropriados para doação a outros reagentes.

Uma necessidade permanece para prover um produtoapropriado para uso por exemplo em controle de feridas, engenharia detecido, regeneração de tecido e imobilização de células. Os presentesinventores verificaram que um compósito possuindo uma combinaçãoexcelente de características pode ser produzido por formação de umcompósito compreendendo uma espuma tendo poros e um gel formado in situdentro dos poros da espuma.

Em um aspecto, a invenção provê um método para formar umcompósito compreendendo uma espuma e um gel formado in situ dentro dosporos da espuma, o método compreendendo prover uma espuma tendo poros ecuja espuma compreende um polímero, preferivelmente um polímeroreticulável, e íons formadores de gel para formar um gel, contatar umcomponente líquido com referida espuma, referido componente líquidocompreendendo um polissacarídeo solúvel tendo sítios de geleificaçãocapazes de formar um gel quando do contato com referidos íons formadoresde gel, pelo que, quando do contato com os referidos íons, um gelcompreendendo o polissacarídeo solúvel é formado dentro dos poros dareferida espuma.

Com vantagem, o gel no compósito tem uma boa integridadeestrutural para seu uso pretendido, por exemplo o gel não vaza da espumasalvo se desejado. O compósito tem uma excelente combinação decaracterísticas físicas como comparado com hidrogéis conhecidos e ocompósito pode ser empregado para transportar componentes funcionais, porexemplo fármacos e populações celulares e proporciona características dedistribuição desejáveis, por exemplo liberação do material a ser liberado. Aliberação pode ser desencadeada em qualquer modo apropriado, por exemplopor contato com um solvente, por mudança de temperatura ou pormanipulação mecânica. O compósito pode ser empregado com vantagem paraimobilizar células.

O compósito pode ser produzido por um método in situ em quea espuma é empregada em seu local pretendido e então o polissacarídeosolúvel é adicionado à espuma de modo a formar o compósito in situ. ?Aespuma pode ser conformada ante de ou durante o uso, como desejado. Aespuma pode ser fixada a um substrato com um prendedor, por exemplo umasutura, e o polissacarídeo solúvel então adicionado à espuma para produzir ogel e formar o compósito. Como desejado, o compósito pode ser formado eentão fixado a um substrato usando um prendedor, por exemplo uma sutura.

Os materiais sensíveis à temperatura podem ser incorporadosde modo apropriado no compósito à medida que o compósito éapropriadamente formado por um processo em ou próximo da temperaturaambiente. O método da invenção não precisa incluir uma etapa de secagemem temperatura elevada ou reduzida, por exemplo, uma etapa de secagem porcongelamento, apesar disto poder ser incluído, se desejado. A opção de evitara secagem do compósito, especialmente em temperatura elevada, comvantagem permite a produção de um compósito que o material sensível àtemperatura incorporado pode ser distribuído de modo uniforme e nãodesativado ou alterado.

O método inclui, de modo apropriado, a absorção de umcomponente líquido contendo um polissacarídeo em uma espuma tendo porosonde os íons formadores de gel são incorporados na espuma, e a geleificaçãodo polissacarídeo dentro dos poros da espuma. O polissacarídeo nocomponente líquido é reativo de modo apropriado com os íons formadores degel na espuma de modo a formar o gel.

Em um terceiro aspecto, a invenção é dirigida para umcompósito produzido pelo método da invenção.

Em um outro aspecto, a invenção provê o uso de umcompósito produzido de acordo com o método da invenção.

O compósito compreende um gel formado in situ dentro daestrutura da espuma e o gel é disperso dentro da espuma. O compósito éparticularmente apropriado para uso em aplicações médicas, por exemplo emcontrole de feridas, engenharia de tecido e regeneração de tecido eimobilização de células.

De modo apropriado, o compósito tem um pHfisiologicamente compatível. A espuma ou o gel podem ser degradáveis eambos são preferivelmente degradáveis. A espuma e o gel podem serdegradáveis sob as mesmas ou diferentes condições ou em taxas diferentes outempos dentro do corpo humano ou animal.

O compósito compreendendo um gel de polissacarídeoformado in situ dentro dos poros da espuma é preparado por adição de umcomponente líquido contendo um polissacarídeo em uma espuma que temporos e íons formadores de gel incorporados dentro da espuma assiminduzindo a geleificação do polissacarídeo.

As espumas apropriadas incluem as tendo redes de porosabertos preferivelmente tendo um tamanho de poro de 5 a 1000 mícrons, maispreferivelmente na faixa de 25 a 500 mícrons, capaz de absorver umcomponente líquido adicionado contendo um polissacarídeo em seus poros.As espumas apropriadasj>ara uso na presente invenção tem poros abertos empelo menos uma superfície e desejavelmente tem poros interconectados parapermitir o transporte do polissacarídeo absorvido dentro da espuma e/ouefetivamente aumenta o volume do componente líquido que pode serabsorvido.

A espuma é de modo apropriado intumescível epreferivelmente pode absorver até 30 vezes seu peso, mais preferivelmente de1 a 20 vezes seu peso de um líquido, por exemplo uma solução fisiológicaaquosa ou uma solução de polissacarídeo. A espuma pode ter umadistribuição homogênea ou heterogênea de tamanhos de poros. Nem todos osporos são requeridos para absorver o componente líquido.

De modo apropriado, a espuma, o compósito ou umdispositivo contendo o compósito é esterilizada, preferivelmente porirradiação γ, Ε-feixe, óxido de etileno, autoclavagem ou contato da espumacom álcool antes da adição do componente líquido ou contatando com gasesNOx, esterilização com plasma de gás hidrogênio. A esterilização não deveser empregada se ela afetar de modo adverso o compósito, ou um componentefuncional contido no compósito.

O polímero na espuma pode ser reticulável ionicamente oucovalentemente mas não precisa ser reticulável desde que o polissacarídeosolúvel é reticulável com o polímero na espuma ou com um componente daespuma, por exemplo os íons formadores de gel.

Em uma forma de realização preferida, as espumas sãobiopolímeros que são derivados de plantas ou animais. Estas espumas podemser feitas de acordo com os processos da técnica anterior, por exemplo comodescrito em US 5 888 987 (Hayes) ou WO 2005023323 (Gaserod), US 6 203845 (Qin) ou US 6 656 974 (Renn).

Os íons formadores de gel na espuma estão presentes emquantidade suficiente para formar um gel com pelo menos uma porção dopolissacarídeo.

Os íons formadores de gel para reagir com o componentelíquido compreendendo o polissacarídeo podem ser incorporados durante apreparação da espuma ou adicionados à espuma preferivelmente antes daadição do componente líquido. Os íons formadores de gel podem serincorporados ao serem dispersos dentro de uma mistura, preferivelmente umamistura de biopolímeros, antes da formação da mistura em uma espumaúmida ou adicionados à espuma formada. Opcionalmente, os íons formadoresde gel adicionais podem ser adicionados ao compósito compreendendo umaespuma e o gel compreendendo o polissacarídeo adicionado. Os íonsformadores de gel podem ser incorporados na espuma ou mistura ao fazer aespuma por exemplo por lavagem ou embebimento da espuma com umasolução de íon geleificantes que não dissolver a espuma. A solução emexcesso pode ser removida por compressão.

Ao prover íons formadores de gel suficientes na espuma antesda adição do componente líquido compreendendo o polissacarídeo, umcompósito tendo um gel formado através de pelo menos uma parte do volumedo compósito pode ser fixado.

Em um outro aspecto, a invenção provê um compósito cloretode metileno uma espuma, preferivelmente uma espuma compreendendo umbiopolímero, em que a espuma tem poros e compósito íons formadores de geldistribuídos, preferivelmente substancialmente uniformemente distribuídosatravés da espuma e um gel compreendendo um polissacarídeo em que o gelestá localizado dentro dos poros da espuma e interage com a espuma.

Preferivelmente, os íons formadores de gel estão presentes empelo menos alguns dos poros internos da espuma em vez de somente nosporos da superfície. Os íons formadores de gel são preferivelmentesubstancialmente uniformemente distribuídos na espuma. Ao prover íonsformadores de gel na espuma antes da introdução do componente líquidocompreendendo um polissacarídeo, o polissacarídeo por interagir com os íonsmodo que em adição do componente líquido compreendendo o polissacarídeo,um gel se forma em pelo menos parte de e preferivelmente através desubstancialmente todo o volume interno da espuma.

A interação entre o gel e a espuma pode ser química através deligação entre a espuma e o polissacarídeo por meio dos íons formadores degel formando "pontes". A interação pode ser física através do gel ser retidonos poros da espuma por intertravamento físico do gel e espuma.

A espuma compreende íons formadores de gel e quando daadição do líquido contendo o polissacarídeo, o polissacarídeo pode penetrarcom vantagem no interior da espuma via poros e canais na espuma e reagircom os íons formadores de gel de modo a formar o compósito. Deste modo, ogel é formado através de pelo menos uma parte do volume interno da espuma.A adição do polissacarídeo à espuma antes da incorporação dos íonsformadores de gel é desvantajosa em que ao adicionar os referidos íons, areação pode prova ocorrer em ou próximo da superfície da espuma assimformando uma camada de gel que pode impedir a penetração dos referidosíons no volume interno da espuma. Além disso, o gel e o compósito pode ser,de modo não desejável, não homogêneos.

Em uma forma de realização preferida, o compósitocompreende um gel substancialmente homogêneo.

Em uma forma de realização, o polímero usado para a matrizde espuma compreende um polissacarídeo que é geleificado com íonsformadores de gel. Em uma forma de realização preferida, a espumacompreende um biopolímero reticulado opcionalmente contendo um agenteespumante por exemplo como descrito em WO 2005023323.

A espuma preferivelmente compreende um polissacarídeo e/ouum polissacarídeo quimicamente modificado. Os polissacarídeos modificadospor exemplo polissacarídeos copulados com peptídeos, são preparados pormeios bem conhecidos na arte. Por exemplo, os alginatos modificados sãodescritos em US 6 642 363 (Mooney). Os polissacarídeos copulados compeptídeos são preferidos para uso por exemplo em imobilização de célulaspara promover a proliferação celular e diferenciação celular. Ospolissacarídeos copulados em peptídeos são preferivelmente empregados emcombinação com polissacarídeos não modificados.

A espuma é preferivelmente espuma absorvente seca.

Em uma forma de realização preferida, a invenção provê ummétodo para formar uma espuma absorvente seca tendo uma rede de porosabertos e poros e compreendendo íons formadores de gel para a geleificação esubseqüentemente a solução de polissacarídeo adicionada cujo métodocompreende:

a) formar uma espuma úmida a partir de uma dispersão aquosacompreendendo um polissacarídeo, e um agente espumante e opcionalmenteum ou mais dentre um plastificante, um agente reticulante e um modificadorde pH;b) misturar a espuma da dispersão aquosa, opcionalmente poragitação mecânica;

c) opcionalmente realizar uma ou mais etapas de:

i) moldar ou conformar a espuma; e

ii) formar uma espuma reticulada a partir da espuma;

d) secar a espuma para formar uma espuma seca contendoporos abertos; e

e) adicionar íons formadores de gel em uma ou mais das etapasa) a d) ou após a etapa d).

Em uma forma de realização especialmente preferida, os íonsformadores de gel são adicionados na etapa a) para prover uma distribuiçãosubstancialmente uniforme dos referidos íons formadores de gel em toda aespuma.

Os modificadores de pH conhecidos para reduzir ou aumentaro pH e plastificantes podem ser empregados, por exemplo, como descritos emWO 2005023323.

A espuma pode ser seca por secagem em ar e como desejadopode ser submetida a moldagem, conformação ou compressão.

A espuma usada na presente invenção é preferivelmente umpolissacarídeo. Os exemplos de polissacarídeos apropriados para a produçãoda espuma incluem alginatos, pectinas, carragenanos, hialuronatos, quitosanae misturas dos mesmos. Os alginatos, quitosana e hialuronatos sãopolissacarídeos preferidos.

A espuma pode ser preparada usando uma espuma únicapreferivelmente ou alternativamente de uma estrutura heterogêneacompreendendo espumas de diferente densidade ou tamanho de poro, eregiões espuma e não espuma.

Os polissacarídeos apropriados para uso na presente invençãoincluem os que são solúveis em um solvente, como água e podem serformados em um gel por interação com íons formadores de gel. Os exemplosde polissacarídeos apropriados incluem alginatos, pectinas, carragenanos,quitosana, hialuronatos, e misturas dos mesmos desde o polissacarídeosozinho ou em uma mistura com outro polissacarídeo possa formar um gel.Os alginatos são um polissacarídeo preferido para uso na presente invenção.

Os alginatos são sais de ácido algínico. O ácido algínico, que éisolado de algas marinhas, é um ácido poliurônico feito de dois ácidosurônicos: ácido D-manurônico e ácido L-gulurônico. A relação de ácidomanurônico e ácido gulurônico varia com fatores como as espécies de algas,idade da planta, e parte da alga marinha (por exemplo caule, folha). O ácidoalgínico é substancialmente insolúvel em água. Ele forma sais solúveis emágua com metais alcalinos, como sódio, potássio e lítio; magnésio; amônio; eos cátions amônio substituídos derivados de aminas inferiores, como metilamina, etanol amina, dietanol amina, e trietanol amina. Os sais são solúveisem meio aquoso acima de pH4, mas são convertidos em ácido algínicoquando o pH é abaixado abaixo de cerca de pH4. Um gel de alginatoinsolúvel em água, termo-irreversível, é formado na presença de íonsformadores de gel, por exemplo cálcio, bário, estrôncio, zinco, cobre (+2),alumínio e suas misturas, em concentrações apropriadas. Os géis alginatopodem ser solubilizados por embebimento em uma solução de cátionssolúveis ou agentes quelantes para os íons formadores de gel, por exemploEDTA, citrato e outros.

Os sais de alginato insolúveis em água, em que o cátionprincipal é cálcio são encontrados em folhagem e hastes de algas marinhas daclasse Phaeophyceae, cujos exemplos são Fucus vesiculosus, Fucus spiralis,Ascophyllum nodosum, Macrocystis pyhfera, Alaria esculenta, Ecloniamaxima, Lessonia nigrescens, Lessonia trabeculata, Laminaria japonica,Durvillea antarctica, Laminaria hyperborea, Laminaria longicruris, Laminariadigitata, Laminaria saccharina, Laminaria cloustoni, e Saragassum sp. Osmétodos para a recuperação de ácido algínico e seus sais solúveis em água,especialmente alginato de sódio, de fontes naturais são bem conhecidos e sãodescritos, por exemplo, em Green, Pat. No. U.S. 2,036,934, e Le Gloahec, Pat.U.S. No. 2,128,551.

Em uma outra forma de realização, o polímero compreendequitosana. A quitosana é um polissacarídeo linear compreendendo β (l->4)ligado 2-acetamido-2-desoxi-D-glucopiranose (GlcNAc) e 2- amino-2-desoxi-D- glucopiranose (GlcN). A quitosana é um derivado N-desacetilado dequitina, que consiste quase que completamente de β (1~>4) ligado 2-acetamido-2-desoxi-D- glucopiranose (GlcNAc). Comercialmente, aquitosana é feita por N-desacetilação alcalina de quitina. O processo dedesacetilação heterogêneo combinado com a remoção de componenteinsolúvel resulta em um produto de quitosana que possui uma distribuiçãoaleatória de unidades de GlcNAc e GlcN ao longo da cadeia do polímero. Ogrupo amino em quitosana tem um valor pKa aparente de cerca de 6,5 e umpH abaixo deste valor, o grupo amino livre será protonizado de modo que osal de quitosana dissolvido em solução irá transportar uma carga positiva.Conseqüentemente, quitosana é capaz de reagir com componentesnegativamente carregados, isto sendo uma função direta da densidade decarga positiva da quitosana.

Com vantagem, a natureza catiônica de quitosana provê umapropriedade bioadesiva. Além disso, quitosana pode precipitar célulasvermelhas do sangue devido à sua carga negativa proporcionando benefíciosna formação de coágulos sangüíneos e na redução do nível de fibrina durantea cicatrização assim reduzindo a formação de tecido de cicatriz. A quitosanapode ser degradada por lisozima e outras enzimas relacionadas ocorrendo emum corpo de mamífero, por exemplo no corpo humano. Em uso, a quitosanaem uma espuma da presente invenção será degradada de modo apropriado porlisozima encontrada em mamíferos em saliva, lágrimas, soro do sangue, efluido intersticial. Um compósito tendo uma espuma de quitosana pode serempregado com vantagem em controle de feridas, como um bioadesivo e emoutras aplicações no corpo humano ou animal. A degradação enzimáticapermite que a espuma seja projetada de tal modo que o produto pode realizarsua função e então ser removido do corpo através da degradação.

Pectina é um polissacarídeo de ocorrência natural encontradonas raízes, hastes, folhas e frutos de várias plantas, especialmente a casca defrutas cítricas, como limões, limas, toranjas e laranjas. As pectinas contémunidades poliméricas derivadas de ácido D-galacturônico. Os produtoscomerciais incluem pectina de elevado teor de metóxi e pectina de baixo teorde metóxi (e derivados como pectinas amidadas), onde 20-60% das unidadesderivadas de ácido D-galacturônico dependendo da fonte da pectina, sãoesterificados com grupos metila. Pectato (pectinato) é pectina completamentedes-esterificada com até 20% das unidades derivadas de ácido D-galacturônico.

Carragenano refere-se a um geralmente de galactanossulfatados que podem ser extraídos de algas marinhas vermelhas. Oscarragenanos são cadeias lineares de unidades de D-galactopiranosil unidascom ligações alternantes (1 ->3) α-D e (1 -> 4) β-D- glicosídicas. Oscarragenanos podem, em parte, ser distintos pelo grau e posição de sulfatação.A maior parte das unidades de açúcar ter um ou dois grupos sulfatoesterificados em um grupo hidroxila em carbonos C-2 ou C-6. Oscarragenanos apropriados incluem kapa carragenano, iota carragenano, ekappa II carragenano e misturas dos mesmos. Os carragenanos de sódio sãosolúveis em temperatura ambiente. Os carragenanos podem ser preparadoscom baixos teores de íons formadores de gel por técnicas bem conhecidas. Osgéis de carragenano são termorreversíveis. Os níveis maiores de íonsformadores de gel podem aumentar a temperatura em que o gel pode serfundido. Os kappa carragenanos produzem géis rígidos fortes enquanto iotacarragenanos são elásticos e complacentes. Os kappa II carragenanos que sãocopolímeros de kappa e iota formam géis fracos. Os íons formadores de gelpara carragenanos específicos são bem conhecidos na técnica e incluempotássio e cálcio. Os lambda carragenanos não forma géis em água maspodem ser utilizáveis em misturas, por exemplo para modificar aspropriedades mecânicas do gel resultante. Um carragenano preferido é iotacarragenano. O iota carragenano tem uma unidade de repetição de D-galactose-4-sulfato-3,6- anidro-D-galactose-2-sulfato provendo um teor deéster sulfato de cerca de 25 a 34%.

Um outro biopolímero preferido compreende ácido hialurônico

(HA), sais do mesmo e hialuronato modificado. O hialuronato de sódio é umglicosaminoglicano abundante encontrado na matriz extracelular de pele,juntas, olhas e a maior parte dos órgãos e tecidos de todos os animaissuperiores. HA não derivado de animal pode ser fermentado a partir deStreptococcus zooepidemicus. O ácido hialurônico de uma fonte não animal épreferido para uso na presente invenção. O ácido hialurônico é um copolímerolinear composto de (β-1,4) ligado D-glucuronato (D) e (p-l,3)-N-acetil-D-glucosamina (Ν). A estrutura helicoidal de hialuronato pode coletaraproximadamente 1000 vezes seu peso em água. Estas características dão àmolécula propriedades fisicoquímicas vantajosas assim como funçõesbiológicas distintas e é desejável usar como um bloco de construção para osmateriais biocompatíveis e biointerativos na liberação de fármacos,engenharia de tecidos e visco suplementação.

O ácido hialurônico ou hialuronato é um componente naturalem organismos de mamíferos e é enzimaticamente biodegradável porhialuronidases. A meia-vida de hialuronato em tecido endotelial é menor doque um dia, e a circulação natural do polímero em adultos é deaproximadamente 7 g por dia. Uma modificação covalente suave a moderadade hialuronano irá aumentar a estabilidade in vivo e tempo de retenção de diasaté meses ou um ano.

Os hialuronatos modificados apropriados incluem os contendoporções covalentemente ligadas aos hialuronatos e podem incluir por exemplohialuronatos copulados em peptídeos. Um hialuronato modificado preferidode modo apropriado tem um grupo carboxila covalentemente modificado e/ougrupo hidroxila nas unidades de monômero DeN respectivamente. Oshialuronatos modificados podem ser adaptados sob medida por seleção deporções e sua concentração nos hialuronatos modificados para adicionar,modificar ou alterar as propriedades ou funcionalidades dos hialuronatoscomo capacidade de reticulação, solubilidade, taxa de biodegradabilidade ou acapacidade de ligar, por exemplo, células específicas, fármacos ou peptídeos.

O ácido hialurônico desempenha, como se pensa, um papelimportante nos estágios iniciais de cicatrização de tecido conectivo ecicatrização de feridas fetais sem cicatriz e regula a mobilidade, adesão eproliferação de células e é especialmente utilizável em aplicações deengenharia de tecidos e regeneração de tecidos.

Os polissacarídeos modificados, também conhecidos comoderivados de polissacarídeos, podem ser empregados em aplicações dapresente invenção, desde que eles sejam reativos com os íons formadores degel. Por exemplo, o alginato pode ser reagido com um óxido de alquileno,como óxido de etileno ou óxido de propileno, para formar um glicol alginato.

O glicol é ligado ao alginato através dos grupos carboxila. Tipicamente, oalginato é reagido com óxido de propileno para formar alginato de propilenoglicol (PGA). A preparação de alginato de propileno glicol é descrito emStrong, patente US 3 9 48 881, Pettitt, patente US no. 3 772 266 e Steiner,patente US 2 426 125. Preferivelmente, o alginato de propileno glicol tem umgrau de esterificação de cerca de 40% a cerca de 95%, mais preferivelmentecerca de 70% a 95%. As misturas de alginatos de propileno glicol dediferentes pesos moleculares também podem ser usadas. Os íons alumínio sãoapropriados para a geleificação de glicol alginatos.

Preferivelmente, a espuma é preparada de modo apropriadousando um misturador, por exemplo um misturador de cozinha equipado comum batedor de metal para aerar uma solução aquosa do polímero paraproduzir a espuma junto com outros componentes como plastificantes porexemplo, glicerina e sorbitol.

Um agente espumante pode ser incluído na dispersão aquosapara ajudar na espumação. Quando presente o agente espumante produz, demodo apropriado, uma espuma úmida resistente ao colapso da espuma. Oagente espumante pode ser um material único ou uma mistura de materiaisque auxiliam na espumação. O agente espumante pode ser um agenteespumante polimérico, um tensoativo ou uma mistura dos mesmos.

Os agentes espumantes poliméricos como hidrocolóidestensoativos, são geralmente preferidos para a maior parte das aplicaçõesbiológicas porque eles são mais difíceis de lixiviar da espuma geleificadaresultante como os tensoativos. Os exemplos de hidrocolóides apropriadosincluem metil celulose, hidroxipropil metil celulose, (HPMC), hidróxi propilcelulose, (HPC), hidroxi etil celulose, (HEC), alginatos de albumina e glicol,como alginato de propileno glicol. Para algumas aplicações, pode ser vantajoso adicionar um polissacarídeo adicional, por exemplo um derivado decelulose, como carboximetil celulose, além do agente espumante. O agenteespumante polimérico é preferivelmente solúvel em água de modo que umaespuma geleificada homogênea é produzida. Os agentes espumantes solúveisem água preferidos incluem albumina e hidroxi propil metil celulose, como eles produzem bolhas pequenas que resultam em poros finos na espuma.

Quando as espumas reticuladas secas contendo níveis elevadosde cálcio são embebidas em água, a estrutura da espuma tipicamente nãorompe devido ao nível elevado de reticulação da espuma. No entanto, oscomponentes solúveis na espuma, incluindo agente espumante solúvel emágua, como hidroxipropil metil celulose, podem difundir da espuma. Estaperda de agente espumante pode ser reduzida ou evitada em, por, umaaplicação de cicatrização de feridas, pelo uso de um agente espumante quenão é solúvel sob condições de uso. Alguns agentes espumantes formam géisna temperatura do corpo, por exemplo metil celulose forma géis acima de 35°C. Quando usando uma espuma que compreende metil celulose como oagente espumante em uma aplicação em que a espuma está na temperatura docorpo, a metil celulose irá permanecer no estado geleificado e permanecer naespuma e contribuir para a resistência no estado úmido da espuma.

Quando um agente espumante polimérico como hidróxi propilmetil celulose é usado, a concentração do agente espumante polimérico nadispersão aquosa é tipicamente de cerca de 0,5% em peso e a cerca de 6% empeso, preferivelmente de cerca de 1% em peso e a cerca de 4% em peso, maispreferivelmente de cerca de 1,5% e a cerca de 2% em peso. Isto produz umaespuma que compreende de cerca de 3% em peso e a cerca de 37% em peso,preferivelmente de cerca de 6% em peso e a cerca de 25% em peso, maispreferivelmente de cerca de 6% e a cerca de 12,5% em peso, do agenteespumante polimérico, exclusivo de água e qualquer aditivo ou aditivos quepodem estar presentes na espuma.

Para algumas aplicações, um tensoativo, com ou sem umagente espumante polimérico adicionado, pode ser usado como o agenteespumante. Os tensoativos são bem conhecidos dos versados na arte e sãodescritos, por exemplo, em McCutcheon's Detergents and Emulsifiers., eLaughlin, patente U.S. número 3.929.678, incorporada aqui por referência. Ostensoativos não iônicos são tipicamente produtos de condensação de umcomposto aromático alifático orgânico hidrofóbico ou alquila e óxido deetileno e/ou óxido de propileno hidrofílico. O comprimento da cadeia depoliéter resultante pode ser ajustado para alcançar o equilíbrio desejado entreas propriedades hidrofóbicas e hidrofílicas. Os tensoativos não iônicosincluem, por exemplo, etoxilatos de alquil fenóis contendo de cerca de 8 a 18átomos de carbono em um grupo alquila de cadeia reta ou ramificada, como t-octil fenol e t-nonil fenol com cerca de 5 a 30 moles de óxido de etileno, porexemplo, condensado de nonil fenol com cerca de 9,5 moles de óxido deetileno, condensado de dinonil fenol com cerca de 12 moles de óxido deetileno; alcoóis etoxilados e propoxilados, especialmente C10-20 álcoois, com 2a 100 moles de óxido de etileno e/ou óxido de propileno por mole de álcool,especialmente etoxilatos de alcoóis primários contendo de cerca de 8 a 18átomos de carbono em uma configuração de cadeia reta ou ramificada comcerca de 5 a 30 moles de óxido de etileno, por exemplo, os etoxilatos deálcool decílico, álcool cetílico, álcool laurílico, ou álcool miristílico;etoxilatos de alcoóis alifáticos secundários contendo de 8 a 18 átomos decarbono em uma configuração de cadeia reta ou ramificada com 5 a 30 molesde óxido de etileno; condensação de alcoóis alifáticos contendo de cerca de 8e a cerca de 20 átomos de carbono com óxido de etileno e óxido de propileno;polietileno glicol e óxido de polietileno; óleo de rícino etoxilado(CREMOPHOR® CO 40); óleo de rícino hidrogenado etoxilado; óleo de cocoetoxilado; lanolina etoxilada; óleo de sebo etoxilado; álcool de sebo etoxilado;e etoxilatos de ésteres sorbitano como monolaurato de polioxietilenosorbitano (TWEEN® 20), monopalmitato de polioxietileno sorbitano(TWEEN® 40), monoestearato de polioxietileno sorbitano (TWEEN® 60),monooleato de polioxietileno sorbitano (TWEEN® 80), e trioleato depolioxietileno sorbitano (TWEEN® 85). Para aplicações físicas, comocurativos para feridas, quando um tensoativo é incluído na espuma geleificadaseca, tensoativos não iônicos, como os etoxilatos de ésteres sorbitano, sãopreferidos. Exemplos de tensoativos aniônicos são estearato de sódio, cetilsulfato de sódio, lauril sulfato de sódio, lauril sulfato de amônio, lauril sulfatode trietanolamina, miristil sulfato de sódio, e estearil sulfato de sódio,dodecilbenzenosulfonato de trietanol amina, sulfonato de dodecilbenzeno desódio, sulfato de éter polioxietileno laurílico, e sulfato éter de polioxietilenolaurílico. Um tensoativo aniônico preferido é lauril sulfato de sódio (dodecilsulfato de sódio). Tensoativos catiônicos incluem, por exemplo, sais deamônio quaternário, como cetil brometo de trimetilamônio, cloreto de lauriltrimetil amônio, cloretos de alquil benzil metil amônio, brometos de alquilbenzil dimetil amônio, brometo de cetil piridínio, e sais de halogeneto depolioxietilalquilaminas quaternizados. Os tensoativos zwiteriônicos tambémpodem ser usados.

Quando o tensoativo é usado com um agente espumantepolimérico, um tensoativo utilizável é um éster de sorbitano, como tensoativoTWEEN® 20. Quando um tensoativo, como tensoativo TWEEN® 20, é usadocom um agente espumante polimérico, a espuma geleificada seca podecompreender de cerca de 0,05% em peso a 1,0% em peso, tipicamente 0,1%em peso a 0,5% em peso, do tensoativo. No entanto, para certas aplicações,como aplicações para o cuidado oral, em que um tensoativo, como, porexemplo, lauril sulfato de sódio, é usado sem um agente espumantepolimérico, a espuma geleificada seca pode compreender de cerca de 0,5%em peso a 5,0% em peso, tipicamente 1,5% em peso a 3,0% em peso, dotensoativo, exclusivo de água e qualquer aditivo ou aditivos, como sílica ououtros abrasivos ou agentes de polimento, que podem estar presentes na espuma.

Os componentes de um compósito de acordo com a invençãopara tratamento do corpo humano ou animal são desejavelmentebiocompatíveis e opcionalmente biodegradáveis.

A própria espuma pode ser usada como um produto nasmesmas aplicações como o compósito da invenção.

Os íons formadores de gel apropriados para uso na presenteinvenção incluem íons monovalentes e polivalentes, preferivelmente íonsdivalentes e/ou trivalentes, ou uma mistura de íons capazes de formar um gelcom o polissacarídeo ou que não formam um sal solúvel com opolissacarídeo. Os íons formadores de gel para polissacarídeos específicos sãoconhecidos da literatura. Para alginatos, os cátions polivalentes apropriadosincluem, por exemplo, cálcio (2+), bário (2+), estrôncio (2+), ferro (2+), zinco(2+), cobre (2+), e alumínio (3+). Os cátions preferidos são cátions de metaldivalente, mais preferivelmente o cátion cálcio (2+). Um cátion monovalente,como potássio, pode não ser considerado como um íon geleificante para umalginato porque o alginato de potássio é um sal alginato solúvel; no entanto, ocátion potássio pode ser um íon geleificante apropriado para kappacarragenano ou kappa II carragenano. Onde o sal polissacarídeo épositivamente carregado, por exemplo, quitosana, íons formadores de gelnegativamente carregados, por exemplo fosfato podem ser empregados.

Um sal ou combinação de sais que provê os íons formadoresde gel ou mistura de íons formadores de gel desejados pode ser usado comoos íons formadores de gel. Os íons formadores de gel podem ser incorporadosna espuma ou durante a preparação ou subseqüentemente adicionados àespuma antes da adição do líquido com o polissacarídeo. As soluções delavagem típicas para a espuma de polissacarídeo tem cerca de 30 mM a cercade 200 mM, mais preferivelmente de 50 a 100 mM, de um sal geleificantesolúvel em água, como cloreto de cálcio, cloreto de bário, ou cloreto deestrôncio. De modo apropriado, a taxa de geleificação pode ser controladapara retardar a geleificação por uso de sais pouco solúveis sob condições depH em que eles são lentamente solubilizados, ou por uso de íons formadoresde gel solúveis em combinação com sequestrantes. A lavagem ouembebimento pode ser usada para modificar as propriedades do compósitoonde os íons formadores de gel adicionais podem ser adicionados parareforçar ou endurecer o compósito e também controlar a proliferação celular,enquanto outros tratamentos como sequestrantes ou íons não formadores degel podem ser usados para enfraquecer ou dissolver o compósito. Os géis dealginato podem ser dissolvidos por adição de uma solução aquosa de citrato,EDTA ou hexametafosfato. Os tratamentos de lavagem para uso com célulasvivas podem ser isotônicos. As propriedades do compósito podemconseqüentemente ser adaptadas sob medida como desejado.

Os íons formadores de gel podem ser capazes de formar umgel com o polímero da espuma e/ou polissacarídeo solúvel. Os íonsformadores de gel podem formar ligações entre a espuma e o polissacarídeosolúvel. Preferivelmente, os "íons formadores de gel" na espuma sãodonatáveis para o polissacarídeo e estão presentes na espuma em um nívelcomo que pelo menos alguns dos sítios de geleificação do polissacarídeo sãoocupados quando do contato com o componente líquido para a espuma. Demodo apropriado, os íons formadores de gel podem estar presentes na espumaem um nível sub-estequiométrico, estequiométrico ou super- estequiométrico,com relação aos sítios na espuma para a ligação dos íons formadores de geldesde que suficientes íons formadores de gel estejam presentes para ocuparpelo menos alguns dos sítios de geleificação no polissacarídeo a seradicionado.

Em uma forma de realização, os íons formadores de gel nãosão capazes de formar um gel com o polímero da espuma.

Em outro aspecto, a espuma pode compreender um excesso deíons formadores de gel com relação aos sítios de geleificação nopolissacarídeo solúvel. Pelo menos alguns dos íons formadores de gel podemser incorporados na espuma antes da adição de um polissacarídeo solúvel queentão geleifica por interação com os íons formadores de gel dentro daestrutura da espuma.

A concentração dos íons formadores de gel pode sercontrolada de modo que o gel resultante contenha polissacarídeo com sítios degeleificação que não são completamente reagidos com os íons formadores degel; isto é, os íons formadores de gel ou mistura de íons formadores de gelestão presentes em uma quantidade molar menor do que a requerida parasaturar 100% dos sítios de geleificação do polissacarídeo. Por exemplo,quando íons formadores de gel suficientes, como íon cálcio, estão presentespara reagir com todos os sítios de geleificação disponíveis (por exemplo, unidades de ácido L-gulurônico no caso de alginato, unidades de ácido D-galacturônico no caso de substâncias de pectina), o polímero formador de gelé 100% saturado. A quantidade de cátion requerida para completamentesaturar os sítios de geleificação de alginato, por exemplo, deve serconsiderada como sendo 1 mol de cátion divalente por 2 moles de ácido L- gulurônico no alginato ou 1 mol de cátion trivalente por 3 mols de ácido L-gulurônico no alginato quando somente um cátion divalente ou somente umcátion trivalente é usado na geleificação. Quando uma mistura de cátiondivalente ou cátions e um cátion trivalente ou cátions é usada, as quantidadesrequeridas para saturar o alginato podem ser determinadas porque um cátion divalente ocupa dois sítios de geleificação e um cátion trivalente ocupa trêssítios de geleificação. Assim, qualquer quantidade menor do que esta éconsiderada como sendo uma quantidade menor do que a requerida paracompletamente saturar os sítios de geleificação do alginato. De modoapropriado, os íons formadores de gel presentes na espuma são suficientes para saturar cerca de 5% a 250%, mais apropriado 5% a 200%,preferivelmente cerca de 35% a 150%, ainda mais preferivelmente cerca de50% a 100%, dos sítios de geleificação do polissacarídeo.

A própria espuma pode ser preparada usando umpolissacarídeo e também requer íons formadores de gel. NO caso onde tanto a espuma como o polissacarídeo se baseiam nos mesmos íons formadores degel, a espuma sozinha pode ter uma saturação inicial quando preparada, porexemplo, de 150%, no entanto, quando polissacarídeo adicional é adicionadocomo um líquido e absorvido nos poros da espuma, alguns dos íonsformadores de gel são usados para geleificar o polissacarídeo adicionado.Neste caso, a saturação do polissacarídeo adicionado é calculada com base naquantidade total dos íons formadores de gel e a quantidade total de sítios degeleificação para tanto o polissacarídeo na espuma como o polissacarídeoadicionado formando os géis nos poros.

Para alginato, a resistência dos géis formados por reação doalginato com os cátions polivalentes está relacionada com o peso moleculardo alginato, o teor de ácido gulurônico (teor de "G") do alginato assim comoo arranjo dos ácidos gulurônico e manurônico na cadeia do polímero. Alémdisso, o tamanho do pro, a espessura da espuma, a concentração de alginato, onível de íons formadores de gel e o tipo de íons empregados tambémcontribuem para a resistência. O teor de G do alginato é de modo apropriadopelo menos cerca de 30%, preferivelmente cerca de 40% a cerca de 90%, emais preferivelmente cerca de 50% a cerca de 80%. O alginato derivado de,por exemplo, Lessonia trabeeulata e dos caules de Laminaria hiperbórea temum teor de G elevado e pode, preferivelmente, ser usado para formar asespumas geleificadas da invenção. Os alginatos completamente saturados comum teor de G elevado dão géis com a maior resistência mecânica.

A quantidade de cátion divalente, como cálcio, requerida parareagir estequiometricamente com estes blocos de G, pode ser calculada paracada tipo de alginato por consideração de que duas unidades de ácidogulurônico mais um cátion divalente são requeridos para criar uma reticulaçãoiônica. A quantidade de cálcio requerida para a saturação estequiométrica deuma solução de alginato de sódio a 1% é dada na seguinte tabela:

<table>table see original document page 23</column></row><table>

Uma lista de vários alginatos comercialmente disponíveis, suaspropriedades e suas fontes é encontrada em Shapiro, patente US 6 334 968,tabela 1, coluna 16, linha 49, a coluna 17, linha 18, incorporado aqui porreferência. As misturas ou mesclas de alginatos, por exemplo alginatos dediferentes pesos moleculares e/ou teor de G, podem ser usados como opolímero formador de gel.

A saturação completa (100% de saturação) dos sítios degeleificação ocorre quando a composição contém 1 mol de cátion divalentepor 2 mols de unidades de ácido L-gulurônico. Por exemplo, uma solução decerca de 15 mM de íon cálcio é requerida para saturar 100% uma solução a1% de alginato de sódio extraído das hastes de Laminaria hiperbórea, umasolução de cálcio de cerca de 12 mM é requerida para 100% saturar uma solução a 1% de alginato de sódio extraída de folhas (folhagem) de Laminariahiperbórea, e uma solução de cerca de 14 mM de íons cálcio é requerida para100% saturar uma solução a 1% de alginato de sódio extraída de Lessoniatrabeculata. Assim, quando alginato é usado como o polímero formador degel, a composição formadora de gel preferivelmente compreende 0,2 a 0,915 mM de cátion divalente, preferivelmente 20% a 90% de íon cálcio (2+), por 2mM de unidades de ácido L- gulurônico presentes no alginato. Quandousando um sal pouco solúvel como os íons formadores de gel, a extensão dereticulação pode ser controlada por controle ou da quantidade do agentegeleificante, por exemplo carbonato de cálcio, e/ou a quantidade de agente solubilizante, por exemplo um modificador de pH como glucono delta-lactona, presente durante a formação do gel. Preferivelmente, pode-se ter umarelação estequiométrica entre o modificador de pH e o agente de geleificaçãocomo que substancialmente todos os íons formadores de gel estejamdisponíveis.

Quando todos os sítios de geleificação no polissacarídeo nãosão saturados com íons formadores de gel, os sítios restantes são ocupadospor íons não reticulantes. Se desejado, íons ativos, como cátion Ag(l+) podeser usado para ocupar alguns ou todos dos sítios restantes. Scherr, US2003/0021832 Al, descreve que alginato de prata pode ser usado para otratamento de queimaduras, feridas, lesões ulceradas, e estados patológicosrelacionados.

O componente líquido apropriado para adição à espumacontém o polissacarídeo dissolvido em um solvente, tipicamente água.

Os exemplos de polissacarídeos solúveis apropriados para aprodução do gel a partir do polissacarídeo solúvel incluem alginatos, pectinas,carragenanos, hialuronatos, quitosana,e misturas dos mesmos. Os alginatos,quitosana e hialuronatos são polissacarídeos solúveis preferidos.

A taxa de absorção do componente líquido e a taxa degeleificação do polissacarídeo podem impactar a estrutura do compósito. Ataxa de absorção e a capacidade absortiva do componente líquido irãodepender das características da espuma como o tamanho do poro e volume,características do polissacarídeo como composição, e peso molecular, epropriedades do componente líquido com relação à absorção como aconstrução dos sólidos e viscosidade. Quando a viscosidade do componentelíquido impacta sua capacidade de ser rapidamente absorvido na espuma,pode ser apropriado usar uma concentração menor do alginato ou usar umalginato de um peso molecular menor.

Os fatores que afetam a resistência mecânica do gel incluem aconcentração do polissacarídeo, peso molecular do polissacarídeo, acomposição química, a mistura dos diferentes componentes do polissacarídeo,como apropriado, por exemplo a relação de alginatos ricos em M e ricos emG, o tipo e nível dos íons formadores de gel e outros componentes do gel. Aresistência do gel pode ser adequada por manipulação destes parâmetros deacordo com a aplicação pretendida. De modo apropriado, a viscosidade docomponente líquido é de cerca de 5 mPas a cerca de 1000 mPas, maistipicamente cerca de 8 mPas a 600 mPas, mais preferivelmente cerca de 10mPas a 200 mPas. O componente líquido é preferivelmente completamenteabsorvido nos poros da espuma salvo se for desejado criar uma camada de gelem somente uma parte da espuma, por exemplo sobre a superfície da espuma.O líquido deve ser suficiente geleificado de modo que fique retido nos porospara evitar material não geleificado ou parcialmente geleificado de vazar daespuma salvo se for desejado somente revestir os poros.

A formação de gel irá depender da quantidade e tipo de íonsformadores de gel, características de polissacarídeo como composição e pesomolecular e propriedades do componente líquido com relação à absorçãocomo concentração de sólidos, e viscosidade; e a proporção relativa de líquidopara o volume de poro disponível. Em algumas formas de realização, olíquido será absorvido, o polissacarídeo começa a geleificar, e o gel irá encheros poros. Outras formas de realização, por exemplo, uma porção substancialdo polissacarídeo pode geleificar como um revestimento sobre as paredes doporo à medida que o líquido é absorvido.

Um polissacarídeo preferido é alginato. Quando se usa alginato, o líquido tipicamente compreende cerca de 0,5 % em peso a cerca de10 % em peso, preferivelmente cerca de 1 % em peso a cerca de 6 % em peso.Um peso molecular médio ponderai apropriado é cerca de 4.000 daltons, a500 000 daltons, preferivelmente 4000 a 300 000 daltons. Como usado aqui, opeso molecular médio ponderai é determinado usando cromatografia deexclusão de tamanho com detecção de varredura de luz laser de ângulomúltiplo (SEC-MALS).

O líquido contendo o polissacarídeo pode ainda incluir umcomponente funcional que é disposto de modo apropriado em, por exemplo,aprisionado em um gel de polissacarídeo. Qualquer componente funcional pode ser adicionado desde que ele não evite que o componente liquido sejaabsorvido na espuma ou o polissacarídeo de formar um gel. O componentefuncional pode ser um líquido ou um sólido e, se insolúvel, é disperso comopartículas finas no líquido. Os componentes desejáveis a serem dispostos nogel incluem agentes benéficos como aromas, fragrâncias, medicamentosfarmacêuticos e veterinários, enzimas, modificadores do crescimento eprobióticos, células vivas, incluindo células de plantas, células de animais ecélulas humanas, leveduras, bactérias e outros. A incorporação de fármacos,particulados, células, agregados multicelulares, tecido, e outros, pode requereruma misturação suave na solução de polissacarídeo, preferivelmente dealginato. O componente pode incluir materiais sensíveis ao calor, comocélulas, fármacos, aromas ou fragrâncias, que podem, se desejado, ser depoisliberados do gel.

Quando presente, o componente funcional é selecionado deacordo com o uso pretendido do compósito. O compósito atua, de modoapropriado, como um veículo para o componente funcional, liberado ocomponente em uso. O compósito pode ser adequado sob encomenda paraliberar o componente em um modo particular, particularmente onde ocomponente funcional é um fármaco. O "perfil de liberação" do componentepode ser imediato, liberação rápida, liberação controlada ou liberação pulsátil,como desejado.

Em algumas formas de realização,é desejado liberar ocomponente aprisionado do gel. A liberação pode ser obtida por atrito físicodo gel, extração do gel, ou dissolução do gel, ou por simples difusão ouvazamento do gel. O processo selecionado para liberar o componente dependeda aplicação e a natureza do componente a ser liberado e deve incluir aaplicação de energia mecânica ou sônica, temperatura ou mudança de pH, ouadição de agentes de "des-geleificação" como agentes quelantes.

Os compósitos da presente invenção são utilizáveis emaplicações biomédicas, como matrizes de cultura celular, implantes dearmação de engenharia de tecido, e sistemas de distribuição de liberaçãocontrolada, para fármacos, biológicos, antibióticos, e agentes probióticos, epara aplicações em alimentos, aplicações industriais, e aplicações de cuidadopessoal, como cosméticos e higiene ora.Em uma forma de realização, a invenção provê um métodopara preparar os compósitos estéreis tendo células, fármacos ou particuladosimobilizados nos géis dentro de uma espuma de alginato estéril, seca, em umaou duas etapas fáceis.

As aplicações para os compósitos de alginato estéril incluemimobilização das células e/ou proliferação das células para aplicações decultura de tecido in vitro ou in vivo, terapia celular e órgãos artificiais, umsistema de distribuição usado in vivo para a liberação controlada, para ocontrole de feridas, ou como uma camada anti-adesão in vivo.

Os dispositivos para implante em humanos tem, de modoapropriado, um teor de endotoxina de menos que 350 EU por dispositivo. Ospolissacarídeos ultrapuros possuindo um baixo teor de endotoxinas porexemplo menos que 350 EU/g,. preferivelmente menos que 100 EU/g, podemser usados, ou para a espuma ou como o polissacarídeo solúvel, ou ambos,como apropriado, dependendo de se a estrutura é destinada a implante emanimais e humanos vivos. Por exemplo, quando alginatos são usados paraimplante dentro do corpo humano, os alginatos de modo apropriado tem umteor de endotoxina de menos do que 100 EU/g.

Em uma forma de realização preferida, o compósito tem umteor de endotoxina menor do que 10 EU/g.

Os compósitos da presente invenção são utilizáveis emcrescimento de tecido e engenharia de tecido em que o tecido funcional écriado usando células semeadas em armações tri-dimensionais que provêemum gabarito para guiar o crescimento de tecido novo e assegurar que osnutrientes alcancem as células e produtos de refugo sejam removido. Ocompósito da presente invenção pode ser engenheirado para facilitar ocrescimento para dentro desejado e sofrer degradação em um modocontrolável e previsível. Por exemplo, quando tecidos recentementedesenvolvidos propagam através do compósito, o compósito degrada de modoapropriado e provê calibre para nova formação de tecido. Os compósitostambém podem ser feitos que estimulam as interações específicas com célulasimobilizadas e/ou células na área onde o compósito é implantado., porexemplo, por liberação de moléculas interagindo com as células e fatores decrescimento, por exemplo para regeneração de osso, nervos, pele e cartilagem.O compósito pode liberar fatores de crescimento para encorajar o crescimentopara dentro das células com base em uma geometria desejada e a degradaçãocontrolada do implante permite que o tecido de osso regenerado se torneportador de carga. O compósito da presente invenção pode ser projetado parapromover ou inibir a proliferação de células, como apropriado, por uso deíons cálcio ou íons estrôncio, como os íons formadores de gel,respectivamente.

As células imobilizadas no compósito podem ser implantadasem animais em que o gel atua como uma barreira imune e evita a detecçãopelo sistema imune, assim permitindo o implante de xenoenxertos. De modoapropriado, estrôncio pode ser usado como íons formadores de gel quando ascélulas animais são desejadas para implante (xenoenxertos) porque quandousando este tipo de órgão artificial, é importante que as células não cresçamfora do compósito implantado e se tornem expostas ao sistema imune. Ocompósito também pode ser usado para estabelecer xenoenxertos de células,tumor e tecido em animais para, por exemplo, pesquisa de câncer. Aimobilização de agregados multicelulares, como ilhotas de Langerhans, nocompósito, permite que referidos agregados multicelulares sejam implantadosem animais ou humanos sem rejeição imune e estes agregados de célulasimplantadas podem então funcionar como um órgão artificial produzindo, porexemplo, insulina.

As culturas de células podem ser usadas para fabricar muitosmateriais biológicos, por exemplo enzimas, hormônios, imunobiológicos(como anticorpos monoclonais, interleucinas, linfocinas) e agentes anticâncer.As células podem ser cultivadas em compósitos de acordo com a invençãopara aumentar o número total de células. Por exemplo, as células isoladas deum paciente podem ser cultivadas em um compósito da invenção paraaumentar o número de células, as células podem então ser recuperadas docompósito e usadas em aplicações de engenharia de tecidos. As culturas decélulas em um compósito de acordo com a invenção podem ser tambémusadas para explorar, caracterizar e especificar a diferenciação celular e ocrescimento para produzir tecido como estruturas. Por exemplo, as células sãoafetadas pelo estresse externo e modificar a elasticidade dos materiais decompósito (gel/ espuma) pode influenciar a expressão dos genes.

As células produzidas in vitro no compósito podem serrecuperadas de modo apropriado da cultura usando um agente de recuperação.Os agentes de recuperação apropriados incluem citrato de sódio ou outro salsolúvel de ácido cítrico, EDTA sódico ou outro sal solúvel de EDTA, ouhexametafosfato.

Sem desejar se limitar por teoria, acredita-se que a rigidez docompósito e do gel em que as células são imobilizadas são fatores importantespara o crescimento das células porque parece que as propriedades mecânicasdo gel regulam as proliferação, e a diferenciação foi observada com base notipo de células. A rigidez do gel (como medida, por exemplo, por móduloelástico) em que a célula é fixada determina a grandeza da força gerada apartir do exoesqueleto e a extensão do espalhamento celular que se segue. Aspropriedades dos géis de alginato são variadas por concentração do alginato,saturação dos íons formadores de gel, e tipo de íons formadores de gel. Alémdisso, os alginatos podem ser quimicamente modificados para aumentar asseqüências de peptídeos para adesão celular, como as seqüências de peptídeode adesão celular como tripeptídeo RGD.

Os compósitos de acordo com a invenção podem ser usados notratamento do corpo humano ou animal para evitar a adesão entre tecidos. Asintervenções cirúrgicas podem causar conglutinação ou crescimento junto detecidos, por exemplo entre os músculos, entre músculos e tendões ou nervosou outros tecidos. Para evitar este crescimento de tecidos indesejado, umacamada anti-adesão pode ser inserida entre os músculos, músculos e tendõesou nervos para cobrir a ferida e evitar a formação de aderências pós-operativas durante o processo de cicatrização. Os compósitos da presenteinvenção podem ser formulados para uso como uma camada anti-adesão porseleção de materiais por exemplo uma espuma de hialuronato no compósito eíons geleificantes que retardam ou evitam o crescimento celular e a intrusãona camada anti-adesão assim evitando a adesão entre os tecidos durante acicatrização. Os compósitos podem ser engenheirados a partir de materiaisbiodegradáveis que dissolvem á medida que a ferida cicatriza (por variaçãoapropriada da quantidade de íons reticulantes, tipo de polímero, concentraçãode polímero) e são degradadas ou excretadas do corpo.

Dependendo das propriedades de formulação, o compósitopode ser formulado para degradar durante vários períodos de tempo e assimliberar materiais imobilizados como agentes terapêuticos ou agentes deregeneração de tecido. Um uso preferido da invenção é no reparo de tecidoem que material orgânico ou inorgânico pode ser imobilizado dentro docompósito e atuar como uma armação para a regeneração do tecido. Um talexemplo deve ser a inclusão de hidroxiapatita no gel dentro da espuma eentão implantado em ou fixado a um defeito do osso a fim de induzir aregeneração do osso no compósito espuma / gel. Outro tal exemplo deve ser ainclusão de substâncias atraentes de células ou quimiotáticas dentro docompósito seguido por implante do compósito em um sítio de dano ao tecidoa fim de promover a regeneração do tecido.

Quando compósitos devem ser usados como aplicações deliberação controlada por exemplo, de fármacos, fatores de crescimento,nutracêuticos, aromas ou fragrâncias, as propriedades mecânicas e químicaspodem ser modificadas para liberação apropriada no meio desejado.

<table>table see original document page 32</column></row><table>Meio de crescimentoCélulas MDCK

GDL

Glicerina

Hanks'

HPMCIsoton II

Kit de teste vivo/morto

Manitol

MDCK

Água MQNaCl

NaHCO3

Na2HPO4

Na-trifosfato

NOVATACH RGDNO V ATACH VAPG

calor (20 minutos a 56 0C), 3,7 g/l de NaHCO3,ml/l de aminoácidos não essenciais, 10 ml/lde solução de penicilina-estreptomicina, 1,4mg/l de puromicina e Água MQ.meio essencial mínimo de Eagle (MEM) paracélulas MDCK (M0643)(Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA).Adicionado FBS a 10% inativado por calor (20minutos a 56 0C), 10 ml/l de solução depenicilina/estreptomicina,. 2,2 g/l de NaHCO3 eÁgua MQ.

Glucono δ-lactona (Roquette, Alessandria,Itália)

Glycerin, Ph. Eur. (VWR Prolabo, Leuven,Bélgica)

Solução de sal balanceada de modificada porHank; com NaHCO3; sem fenol vermelho,cloreto de cálcio e cloreto de magnésio (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Alemanha)Pharmacoat 603, tipo de substituição 2910,Hypromellose USP, (hidroxipropilmetilcelulose)(Shin-Etsu Chemical Co. Ltd., Japão)Diluente COULTER® ISOTON® II (BeckmanGoulter, Krefeld, Alemanha)Kit de viabilidade/citotoxidade para células deanimal (Invitrogen, Molecular Probes, Eugene,Oregon, USA)

D-manitol 98% (Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Steinheim, Alemanha)

Linhagem de célula de rim canino Madin Darby(ATCC #CCL-34)Água MilliQ

cloreto de sódio, p.a., (Merck, Darmstadt,Alemanha)

bicarbonato de sódio (Sigma-Aldrich ChemieGmbH, Steinheim, Alemanha)

Fosfato de hidrogênio dissódico, art: 30427(Riedel-de Hãen, Seelze, Alemanha)

trifosfato de sódio pentabásico (T5883-500G)Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim,Alemanha)

alginato PRONOVA UP MVG copulado apeptídeo, batelada: CBIFMC01A02122005,filtrado estéril e liofilizado. Seqüência peptídeo:GRGDSP. Relação de peptídeo: alginato 9.11:1

alginato PRONOVA UP MVG copulado apeptídeo, batelada: CBIFMC02A02122605,filtrado estéril e liofilizado. Seqüência peptídeo:VAPG. Relação de peptídeo: alginato 13.5:1<table>table see original document page 34</column></row><table><table>table see original document page 35</column></row><table>Uma solução aquosa de alginato foi preparada e colocada delado. Carbonato de cálcio foi disperso na água (25 gramas a menos do que aquantidade mostrada na tabela 1) em um recipiente de misturação. Glicerina,sorbitol especial, a solução aquosa de alginato, e HPMC foram adicionadosno mesmo recipiente e a dispersão foi misturada com um misturador decozinha Hobart equipado com um batedor de metal em velocidade médiadurante um minuto para assegurar homogeneidade. A misturação continuouum adicional de sete minutos em alta velocidade antes de adicionar umasolução de GDL recentemente misturada (isto é, o GDL mais 25 gramas deágua) e ainda misturando em alta velocidade durante 1 minuto, que deu umadensidade de espuma úmida resultante de 0,25 g/ml (como determinado apartir do peso de espuma úmida requerido para encher um recipiente de 100ml). As espumas foram moldadas em moldes de 2 mm de altura revestidoscom um protétor de banco Versi-Dry com o lado do polietileno para a espuma(Nalgene Nunc International, NY, USA) e mantidas não cobertas durante 60minutos em temperatura ambiente antes da secagem a 80 0C em um forno desecagem durante 30 minutos. AS folhas secas de espumas pareceram umpouco diferentes à medida que variaram em tamanho de poro e espessura.

Como a taxa de geleificação do material de espuma úmida está correlacionadacom a saturação com íons formadores de gel, coalescência de poros iráocorrer na maior parte para as espumas saturadas mais baixas.

Curativos adesivos circulares com um diâmetro de 2,1 cmforam estampados das folhas de espuma seca. Alguns dos adesivos de espumadas espumas 111% saturadas foram autoclavados a 121 0C durante 20minutos.

A espuma foi preparada para teste mecânico por colocação deum curativo adesivo de espuma em um disco de Petri com um diâmetro de 3,5cm e adição de 4 ml de uma solução fisiológica modelo (2,5 mM de CaCl2 e 9mg/ml de NaCl). A espuma foi mantida nesta solução durante 5 minutos antesde ser transferida para um reômetro de alta resolução Bohlin CVO 120. Aespuma foi colocada entre placas serrilhadas (PP 25) com um calibre de 500μm antes das medidas de oscilação. As varreduras de tensão foram realizadascom uma tensão sob cisalhamento aplicada de 0,5 Pa a 50 Pa. A freqüênciafoi fixada a 1 Hz. A varredura foi realizada três vezes para cada adesivo deespuma. O módulo elástico, G', lido na região viscoelástica linear (G'iin) éregistrado na tabela 2. Testes foram realizados em duas temperaturasdiferentes. A temperatura da solução fisiológica adicionada, temperaturadurante intumescimento, e durante as medidas foi ou 20°C ou 37°C.

Tabela 2: G'ijn de composições de espuma em duas temperaturas (n = 3).

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* n = 6

Os dados mostram um aumento em módulo elástico como uma função de quantidadeaumentada de íons formadores de gel. Condições de autoclavagem não parecem afetar omódulo de espuma a 111% de saturação.

Exemplo 2

Este exemplo mostra como íons formadores de gel difundemda espuma para uma solução de alginato adicionada e assim induzem ageleificação. O módulo elástico foi medido como uma função de tempodepois a solução de alginato foi adicionada para descrever a cinética degeleificação e o aumento em elasticidade do material.

Um compósito foi preparado a partir de discos de espuma seca(2,1 cm em diâmetro) das mesmas espumas saturadas a 66% e 111%preparadas no exemplo 1 e 250 μΐ 1% PRONOVA UP LVG (99 mPas) pordistribuição uniforme da solução por adição em gotas de uma pipeta sobre asuperfície do topo da espuma. Toda a solução de alginato adicionada foiabsorvida e ela encheu os poros através da espuma. Os íons cálcio presentesem espumas saturadas a 66% e 111%, 43% e 71% da quantidade total dealginato no compósito. O compósito foi transferido para o reômetro 5 minutosapós adição da solução de alginato. O calibre foi fixado a 300 μηι e afreqüência e força foram mantidas constantes a 1 Hz e 0,001 respectivamente.O módulo de elasticidade, G, do compósito como uma função de tempo éapresentado na tabela 3.

Tabela 3: G como uma função de tempo após adição de solução de alginatopara as espumas

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Os resultados mostram um aumento em módulo elástico comouma função de tempo para ambas as espumas, que indicam a difusão de íonsformadores de gel a partir da espuma de alginato para a solução de alginatoadicionada e a geleificação resultante. Os valores de G aumentam rápido ealcançam um patamar após 60 minutos para a espuma 111% saturada. Para aespuma 66% saturada os valores G são inferiores, aumentam mais lentamentee os resultados indicam que a difusão não foi completada dentro dos 105minutos com o teste.

Exemplo 3

Este exemplo mostra como a elasticidade dos biomateriaiscompósitos pode ser modificada com uso de espumas contendo quantidadesvariando de íons formadores de gel e por adição de soluções de alginato comteor de G e peso molecular diferentes.

As espumas testadas eram uma espuma 111% saturada e umaespuma 111% saturada que foi autoclavada de exemplo 1, e uma nova espuma155% saturada preparada como no exemplo 1 exceto usando uma mistura decarbonato de cálcio onde metade do CaCO3 foi substituída com um CaCO3com diâmetro de partícula maior (HuberCAL 250 Elite, 8,7 μιη). Esta espumatem poros um pouco maiores do que a espuma 155% saturada de exemplo 1 efoi capaz de absorver mais solução de alginato com uma viscosidade maior. Adensidade no estado úmido da espuma 155% saturada foi de 0,24 g/ml. Discosde espuma (2,1 cm de diâmetro) como exemplo 1 foram colocados em discosde petri e adicionados na superfície do topo 250 μΐ de solução de alginatocom uso de uma pipeta. Toda a solução de alginato adicionada foi absorvida eencheu os poros através das espumas. Os discos contendo espumas com asolução de alginato adicionada foram mantidos em temperatura ambientedurante 60 minutos e então 4 ml da solução fisiológica modelo foramadicionados. Após 5 minutos, o disco foi transferido para o reômetro e umavarredura de tensão foi realizada como descrito no exemplo 1 exceto o calibrefoi fixado a 300 μπι. Os Ciin medidos para estas amostras são apresentados natabela 4. O teor de G do PRONOVA UP LVG é de cerca de 67% (G elevado)enquanto PRONOVA SLM 20 contém cerca de 43% G (M elevado). Asamostras de alginato com a viscosidade inferior foram preparadas pordegradação do peso molecular do alginato por autoclavagem de soluções a1% e 2% do PRONOVA SLM 20 e PRONOVA UP LVG, respectivamente,durante 20 minutos a 121 0C.

Tabela 4: G' Hn de compósitos com concentração de alginato variando dasolução de alginato adicionada para dois pesos moleculares (1% deviscosidade) de alginato com M elevado

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(* η = 5)

Tabela 5: G'Hn de compósitos com concentração variando da solução dealginato adicionada para dois pesos moleculares (1% de viscosidade) dealginato com G elevado

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(* η = 5)

Os dados mostram que os compósitos com o módulo elásticomaior em ambos alginatos a 1,0% e 0,5% adicionados foram de espumas155% saturadas com o alginato de G elevado adicionado. O peso moleculardo alginato é de importância para ambos alginatos de G elevado e de Melevado como o módulo elástico G'iin diminuiu com as viscosidadesdecrescentes, exceto para a concentrações de alginato a 0,75% e abaixo para oalginato de G elevado onde resultados similares foram obtidos. Em geral, omódulo elástico G'ün diminui à medida que a concentração do alginatoadicionado diminuiu para ambas as espumas 155% e 111% saturadas, e paraos quatro alginatos diferentes. Exceções foram observadas para os alginatosde viscosidade baixa em concentrações menores. O módulo elástico G'iin docompósito não foi alterado por autoclavagem da espuma.

Exemplo 4

Este exemplo mostra como a elasticidade do materialcompósito é influenciada por lavagem do compósito em uma soluçãocontendo íons formadores de gel adicionais.

Discos de espuma seca (diâmetro de cerca de 2,1 cm) a partirda espuma 111% saturada no exemplo 1 foram colocados em discos de Petri e250 microlitros de PRONOVA UP LVG a 1% (99 mPas) foram adicionadospara a superfície do topo das espumas e mantidos em temperatura ambiente60 minutos. Então os compósitos foram incubados em 4 mililitros de umasolução 50 mM de CaCl2 ou uma solução 50 mM de SrCl2. Após 5 minutos asolução contendo íons formadores de gel extras foi substituída com soluçãofisiológica modelo e após mais 5 minutos foi o Cun medido como descrito noexemplo 1. Outra amostra que não recebeu quaisquer íons formadores de gelextras adicionados teve a solução fisiológica modelo adicionada 60 minutosdepois do alginato ser adicionado, e o G'Hn foi medido após 5 minutos deintumescimento. Os resultados são apresentados na tabela 6.

Tabela 6: Módulo G'nn de compósitos preparados com e sem lavagem emuma solução contendo íons formadores de gel extras (n = 3).

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Os dados mostram um aumento de quatro a quase seis vezesem módulo elástico G'iin por lavagem dos compósitos com uma soluçãocontendo íons cálcio ou estrôncio respectivamente. Um valor maior foi obtidopara os compósitos lavados na solução contendo íons estrôncio que criaramuma rede de gel mais rígida do que o compósito lavado com íons cálcio.

Exemplo 5

Este exemplo mostra como a proliferação e viabilidade decélulas MDCK (rim canino Madin Darby) imobilizadas em alginato sãoinfluenciadas por variação da saturação de cálcio da espuma de alginato, e oefeito de adicionar íons formadores de gel adicionais para o compósito após aimobilização de célula.

Duas espumas de alginato diferentes foram preparadascom íons cálcio suficientes para saturar 100% e 200% dos sítios degeleificação do alginato. As formulações de espuma úmida são apresentadasna tabela 7.Tabela 7: Formulações de espuma úmida.

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Uma solução aquosa de alginato foi preparada. Então o CaCO3foi disperso na água como listado acima, exceto para 25 g, em um recipientede misturação.

Glicerina, sorbitol especial, a solução de alginato aquoso eHPMC foram adicionadas no mesmo recipiente e a dispersão foi misturadacom um misturador de cozinha Hobart equipado com um batedor de metal emvelocidade média durante 1 minuto para assegurar homogeneidade. Para aespuma 100% saturada, a misturação continuou durante 3 minutos em altavelocidade. GDL foi então dissolvido nos restantes 25 g de água e adicionadona espuma úmida. A dispersão foi ainda misturada em alta velocidade durante30 segundos. A densidade no estado úmido resultante da espuma 100% foi de0,23 g/ml. Para a espuma 200% saturada, o tempo de misturação em altavelocidade foi de 3,5 minutos antes da adição de GDL e então adicionalmente15 segundos de misturação em alta velocidade. Espuma a 200% tem umadensidade no estado úmido de 0,26 g/ml. Ambas as espumas foram moldadasem moldes revestidos com teflon de 1 mm de altura e mantidas não cobertasdurante 15 minutos em temperatura ambiente antes da secagem a 80 0C emum forno de secagem durante 30 minutos.

Discos (diâmetro = 3,6 cm) foram cortados a partir das folhasde espuma seca com um escalpelo e embaladas separadamente. Os discos deespuma foram então autoclavados a 121 0C durante 20 minutos.

Alginato estéril (PRONOVA SLG 100) foi dissolvido em meiode crescimento celular (MEM) em solução a 1% de alginato. A solução dealginato e uma suspensão de células MDCK em meio de crescimento forammisturadas em uma concentração final de 0,8% de alginato e 200 000células/ml. Os discos de espuma de alginato foram transferidos paracavidades em uma placa de 6 cavidades (Nunclon®, Nalgene NuncInternational), onde eles foram ajustados intimamente no tamanho dacavidade. 1,0 ml da suspensão de célula alginato foi distribuído em gotas comuma pipeta em cada um das espumas e os compósitos de alginato foramincubados a 37 0C durante 20 minutos. Os íons cálcio presentes na espuma100% e 200% saturada foram suficientes para saturar 67% e 133% dos sítiosde geleificação da quantidade total de alginato, respectivamente. Metade dasamostras receberam então um tratamento pós lavagem por adicionar dasmesmas a cerca de 5 ml de uma solução aquosa contendo 50 mM de CaCl2 e104 mM de NaCl. Após 10 minutos, a solução de sal foi substituída com meiode crescimento celular. Para o meio de crescimento celular, as amostrasrestantes foram adicionados após os 20 minutos de incubação. Os compósitosde alginato com as células imobilizadas foram mantidos a 37 0C e meio decrescimento foi trocados três vezes em uma semana.

Quantificação de proliferação e viabilidade celular forammedidas após tempos diferentes após imobilização. As células imobilizadasforam isoladas por transferir os compósitos de alginato para tubos decentrífuga contendo cerca de 8 ml de solução de citrato isotônico (50 mM decitrato trissódico diidratado e 104 mM de NaCl). Os tubos foramregularmente suavemente virados até o compósito ser dissolvido com cerca de2-10 minutos, e então centrifugado a 13 000 rpm durante 5 minutos. Ossobrenadantes foram despejados e as pelotas contendo as células foram re-colocadas em suspensão em 1,0 ml 250 mM de manitol. Três amostras decada uma de 100 microlitros, 80 microlitros, e 50 microlitros das pelotas re-colocadas em suspensão foram então transferidas para cavidades em umaplaca de 96cavidades (Nuncion®, Nalgene Nunc International). Então zero, 20microlitros, e 50 microlitros de manitol respectivamente foram adicionados(isto é, para encher cada cavidade em um total de 100 microlitros) e entãomais 100 microlitros de reagente vivo/morto. O reagente vivo/morto foilevado a 5 ml de solução de manitol (250 mM), 20 microlitros de solução deetídio (2 mM) e 5 μΐ de solução de calceína (4 mM). Curvas padrões forampreparadas a partir de células viáveis e fixadas em etanol dentro da faixa de 0-IO6 células.

A proliferação e viabilidade celular foram medidas com uso deuma leitora de microplaca Cytofluor. Os filtros usados para calceína foram485 nm (excitação) e 530 nm (emissão), e para etídio foram 530 nm(excitação) e 620 nm (emissão).

Tabela 8: Viabilidade e proliferação celular como uma função de tempo decompósitos variados (n = 3, ± SEM).

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Os dados na tabela 8 mostram que a etapa de lavagemadicionando íons cálcio extras (que provê uma rede de gel mais rígida)promove a proliferação celular. Como o número de células aumentou duranteo passar do tempo, viabilidade celular diminuída foi observada.

Investigação os compósitos em um microscópio fluorescenteapós o seu embebimento no reagente vivo/morto mostrou que as amostras decompósitos lavados tinham um maior espalhamento das células.

Exemplo 6

Este exemplo mostra como a proliferação e viabilidade celularde células mioblastos de crescimento rápido de camundongo (células C2C12)são afetadas pela etapa de lavagem após a imobilização celular e o efeito dotipo de íons formadores de gel nas soluções de lavagem.

Uma espuma de alginato foi feita com cálcio como íonsformadores de gel, suficiente para saturar o alginato por 155%. A formulaçãode espuma úmida é apresentada na tabela 9.

Tabela 9: Formulação de espuma úmida. _

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A espuma úmida foi preparada como descrito no exemplo 5, exceto misturação de alta velocidade durante 7 minutos antes da adição deGDL dissolvido em 30 g da água total seguido por um adicional de 30segundos de misturação em alta velocidade. A densidade de espuma úmidaresultante foi de 0,29 g/ml e a espuma foi moldada em um molde de 2 mm deprofundidade revestido com protetor de banco Versi-Dry com o lado depolietileno para a espuma. A espuma foi então mantida não coberta emtemperatura ambiente durante 1 hora antes de ser seca em um forno desecagem a 80 0C durante 30 minutos.

Discos (diâmetro = 2,1 cm) foram estampados das folhas deespuma seca e embalados separadamente. Os discos de espuma foram entãoautoclavados a 121 0C durante 20 minutos.

As espumas de alginato estéreis foram transferidas paracavidades em uma placa de 12 cavidades (Nunclon®, Nalgene NuncInternational), onde elas se ajustam intimamente no tamanho da cavidade. 300μΐ de uma solução de alginato a 1% (PRONOVA SLG 20) contendo 25.000células foram distribuídos em gotas com uma pipeta para a espuma. Asespumas foram então incubadas durante 20 minutos a 37 0C. Os íons cálciopresentes na espuma foram suficientes para saturar a quantidade total dealginato no compósito por 97%. Meio de crescimento (D-MEM) foiadicionado em um terço das espumas. Cerca de 2 mililitros de uma soluçãoisotônica de cálcio (50 mM de CaCl2 e 250 mM de manitol) foramadicionados para metade das espumas restantes, enquanto a outra metade dasespumas restantes recebeu uma solução isotônica de estrôncio (50 mM deSrCl2 e 250 mM de manitol). As soluções de geleificação foram substituídascom meio de crescimento após cerca de 2-5 minutos. As espumas com ascélulas imobilizadas foram mantidas a 37 0C e o meio de crescimento foitrocado três vezes em uma semana.

Quantificação de proliferação e viabilidade celular forammedidas duas vezes, em 1 dia e em 10 semanas após imobilização (figura 2).

As células imobilizadas foram isoladas como descrito no exemplo 5, excetoque soluções des-geleificação diferentes foram usadas para os testes de 1 dia e10 semanas. As espumas testadas 1 dia após a imobilização celular foramdissolvidas em 10 ml de uma solução contendo 50 mM de citrato e 250 mMde manitol. As espumas testadas 10 semanas após a imobilização celularforam dissolvidas em 10 ml de solução de Hanks contendo 50 mM de citratoadicionado. As pelotas de célula recuperadas foram dispersas em 1 ml dereagente vivo/morto(feito de 4 ml Isoton II, 1 ml de iodeto de propídio (85μg/ml) e 20 μΐ de calceína (1 mg/ml). Duas gotas foram adicionadas em umacâmara de contagem Burker para contagem das células em um microscópiofluorescente, enquanto o resto da dispersão celular foi filtrado através de umamalha de náilon de 60 μηι e então cinco minutos após recolocação emsuspensão, as células foram analisadas com uso de um citômetro de fluxoElite Coulter EPICS.

Tabela 10: Proliferação e viabilidade de células C2C12 em três compósitosdiferentes apresentados como a média de 3 ou 4 compósitos ± SEM.

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Os resultados mostram um aumento do número de célula totalem todos três compósitos. A proliferação de células C2C12 é o mais altamentepromovido para células imobilizadas nos compósitos que foram lavados comuma solução contendo íons cálcio adicionais após a imobilização celular. Ascélulas de crescimento mais lento foram as células imobilizadas noscompósitos que foram lavados com uma solução contendo íons estrôncio apósimobilização celular.

Investigação dos compósitos em um microscópio fluorescentemostrou que as células imobilizadas nos compósitos lavados com íons cálcioforam esticadas e cresceram tanto sobre como através da estrutura. As célulasimobilizadas nos compósitos lavados com íons estrôncio foram visíveis comocélulas únicas ou agrupamentos pequenos.

Exemplo 7

Este exemplo mostra como a proliferação e viabilidade celularde condrócitos humanos são afetados por variação da fonte de íonsformadores de gel na espuma de alginato, a etapa de lavagem apósimobilização celular e o efeito dos íons formadores de gel diferentes nassoluções de lavagem.

As espumas de alginato foram feitas com cálcio ou estrôncio como o íon geleificante suficiente para saturar o alginato por 155% e 105%respectivamente. As formulações de espuma úmida são apresentadas na tabela 11.

Tabela 11: Formulação de espuma úmida.

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As espumas úmidas foram preparadas como descrito noexemplo 6, exceto usando 8 minutos com misturação em alta velocidade antes da adição de GDL dissolvido em 30 g de água da água total e usando 45segundos de misturação de alta velocidade final. As densidades de espumaúmida resultantes foram de 0,30 g/ml e as espumas foram moldadas emmoldes de 2 mm de profundidade revestidos com protetor Versi-Dry. Asespumas foram então mantidas não cobertas em temperatura ambiente durante1 hora antes de serem secas em um forno de secagem a 80 0C durante 30minutos.

Preparação de disco de espuma alginato estéril e adição decélulas para as espumas foram feitas como descrito no exemplo 7 exceto que300 μl de uma solução de alginato a 1% (PRONOVA SLG 20) com 195.000 células/ml foram adicionados nas espumas. Os íons formadores de gelpresentes foram suficientes para saturar o total de G-monômeros nos alginatospor 97% e 63% para a espuma geleificada com íons cálcio e a espumageleificada com íon estrôncio respectivamente.

Quantificação de proliferação e viabilidade celular forammedidas duas vezes, em 2 semanas e 11 semanas após imobilização de célulasnas espumas de alginato geleificadas com íons cálcio (espumas de Ca), e umavez após 13 semanas para as espumas de alginato geleificadas com íonsestrôncio (espumas de Sr) e tais dados são mostrados na tabela 12. As célulasimobilizadas foram isoladas como descrito no exemplo 6, exceto 15 ml desolução de des-geleificação (Hanks com 50 mM de citrato) foram usadas paraas espumas de Sr. A preparação de amostra para quantificação celular e usodo citômetro de fluxo foram como descritos no exemplo 6.

Tabela 12: Proliferação e viabilidade de condrócitos em seis compósitosdiferentes apresentados como a média de 3 ou 4 compósitos ± SEM.

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Os resultados descritos na tabela 12 mostram que as matrizesde alginato em compósitos lavados com solução de íon cálcio tem pelo menosduas vezes tantas células após 11 semanas como os outros compósitos. Istoindica proliferação celular promovida devido ao íon cálcio adicional e/ou seuefeito de prover uma matriz de gel mais rígida. Os resultados tambémmostram uma proliferação celular inibida para as células imobilizadas emmatrizes em compósitos lavados em solução de íon estrôncio. As tendênciassimilares foram observadas para as espumas de estrôncio. As espumas deestrôncio lavadas com íon cálcio mostraram o maior crescimento celular dasséries de espuma de estrôncio. As espumas de estrôncio sem lavagem oulavadas com a solução contendo estrôncio mostraram pouco ou nenhumaumento no número de célula total. Uma morte celular aumentada foiobservada com o passar do tempo à medida que as células proliferaram. Asmaiores porcentagens de células viáveis foram observadas nos compósitoscontendo as células de crescimento mais lento. Investigação dos compósitosem um microscópio fluorescente mostrou que as células imobilizadas noscompósitos lavados com cálcio esticaram e cresceram tanto sobre comoatravés da estrutura. As células imobilizadas nos compósitos lavados comíons estrôncio foram visíveis como células únicas ou agrupamentos pequenos.

Exemplo 8

Este exemplo mostra como biomateriais compósitos podem serusados como uma matriz provendo a liberação controlada de um materialimobilizado e como o perfil de liberação pode ser modificado como umafunção do tamanho do material imobilizado.

As espumas de alginato testadas foi iguais como apresentadasno exemplo 1 e tem cálcio incorporado suficiente para saturar 111% dos sítiosde geleificação do alginato. Os discos de espuma com um diâmetro de 1,0 cmforam estampados com um furador de cortiça. Uma solução de alginato aquosaa 1,1% foi feita de PRONOVA UP LVG (FP-502-04). Esta solução dealginato foi diluída com Água MQ e uma solução com dextrano fluorescente(6,25 mg/ml) para dar quatro soluções diferentes variando em concentraçãode alginato e tipo de dextrano fluorescente como apresentado na tabela 13. 80μΐ de uma solução contendo alginato e dextrano fluorescente foram pipetadossobre um disco de espuma de alginato e após 10 minutos a solução foicompletamente absorvida na espuma. O cálcio presente na espuma de alginatofoi suficiente para saturar os sítios de geleificação no alginato de quantidadetotal na solução e a espuma por 62%. A quantidade de dextrano fluorescenteadicionado em cada um dos discos de espuma foi de 45,63 μg. Os discos deespuma foram mantidos em temperatura ambiente somente cobertos comfolha de alumina para evitar a luz. Cada um dos discos de espuma foi entãoseparadamente transferido em um tubo contendo 10 ml de Hanks. Os tubosforam horizontalmente agitados em aproximadamente 20 rpm e as amostrasde 100 μΐ foram coletadas para quantificação de dextrano fluorescente quepoderia ter vazado do compósito. A concentração de dextrano fluorescentenas amostras coletadas e soluções padrões (dextrano fluorescente 10 kDa e -70 kDa diluído em Hanks) foram analisadas com uso de leitora de microplacaCytofluor. Os filtros usados foram 485 nm (excitação, largura de banda 20nm) e 530 nm (emissão, largura de banda 25 nm). As curvas padrão foramfeitas de ambos os tipos de dextranos fluorescentes com cinco paralelas nafaixa de 0 mg/ml a 0,01 mg/ml. As curvas de configuração deram coeficientesde correlação R = 0,998 e R = 0,979 para 10 kDa e 70 kDa respectivamente.

As amostras foram coletadas 5-, 15-, 30-, 45-, 60-, 90-, 120- e150 minutos depois dos discos serem transferidos em solução de Hanks. Após150 minutos os valores medidos alcançaram um patamar. Com o uso decurvas de configuração não lineares descritas por

f(t)=100-100e_kt (k: taxa

constante, t: tempo), e programas de cálculo em GraFit Workspace, os meio-tempos foram determinados. Os resultados são apresentados na tabela 13.

Tabela 13: Discos de espuma de alginato adicionados com soluções (V = 80μΐ/disco, η = 3).

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Os resultados mostram uma diferença significante na taxa deliberação entre os dois pesos moleculares de dextrano fluorescente. Osresultados também indicam uma liberação mais rápida de ambos dextranosimobilizados em concentrações inferiores de alginato.

Exemplo 9

Este exemplo mostra a imobilização de células em espumas dealginato e o uso de alginatos copulados a peptídeo para promover proliferaçãocelular.

A espuma de alginato usada neste exemplo foi adicionada comcálcio suficiente para saturar 125% do alginato. A formulação de espumaúmida é apresentada na tabela 14.

Tabela 14: Formulação de espuma úmida.

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A espuma foi feita como descrito no exemplo 1, exceto que adensidade no estado úmido foi de 0,24 g/ml e a espuma foi moldada em ummolde de 2 mm revestido com teflon. O equipamento usado foi oudespirogeneizado por tratamento térmico a 250 0C durante 4 horas ou lavadoem 1 M de NaOH. A espuma seca foi esterilizada por irradiação gama (dose:29,5 kGy).

Discos de espuma estéreis (diâmetro = 2,1 cm) foramestampados com uso de um furador de cortiça e transferidos para cavidadesem uma placa de 12 cavidades. Tabela 15 apresenta três misturas diferentesde células (C2C12) e alginato que foram preparados. As células foramcolocadas em suspensão em meio de crescimento (DMEM) e quantificadascom uso de um uma câmara de contagem de células Burker. Alginato regular(PRONOVA SLG 20, batelada: 221105) foi dissolvido em DMEM, enquantoalginatos copulados a peptídeo (NOVATACH VAPG e NOVATACH RGD)foram dissolvidos em 250 mM de manitol. As densidades de peptídeocopulado para os alginatos foram medidas para serem de 0,045 μπιοΐβ/π^sólido e 0,031 ^ols/mg sólido para NOVATACH VAPC e NOVATACHRGD respectivamente (medido por método de aminoácido).

Tabela 15: Suspensões para imobilização de células.

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Cada suspensão tem uma concentração de alginato total de1,0%. 250 μΐ das suspensões apresentadas na tabela 15 foram adicionados acada disco de espuma, suspensões diferentes para discos diferentes. O cálciona espuma é suficiente para saturar os monômeros G na quantidade total dealginato com 77%. A concentração de peptídeo em cada disco foi de 0,025μιτιοίε e a quantidade de células foi de 25 000 por disco. A suspensão foigotejada sobre a espuma com uso de uma pipeta. A espuma absorveu toda asolução adicionada e a espessura após hidratação foi de cerca de 1,2 mm. Asespumas foram após adição de suspensão de célula transferidas para umincubador e mantidas a 37 0C durante 20 minutos. Então metade dos discos deespuma foram adicionados com cerca de 2,5 ml de DMEM enquanto a outrametade foi adicionada com cerca de 2,5 ml de uma solução isotônica de 50mM de CaCl2 e 250 mM de manitol. Após cerca de cinco minutos, a soluçãocontendo cálcio adicionada às espumas obteve esta solução substituída comDMEM.

Após dois dias as células foram isoladas como descrito noexemplo 5, exceto que os discos de espuma foram dissolvidos em umasolução contendo 50 mM de citrato trissódico e 250 mM de manitol. Aspelotas de células após centrifugação foram re-colocadas em suspensão em600 μl 250 mM de manitol. Três amostras de cada de 100 μl e 80 μl daspelotas re-colocadas em suspensão foram então transferidas em cavidades emuma placa de 96 cavidades. Então zero e 20 μl de manitol respectivamenteforam adicionados (isto é, para encher cada cavidade a um total de 100 μl) eentão mais 100 μl de reagente vivo/morto. O reagente vivo/morto foi feito de5 ml de solução manitol (250 mM), 20 μl de solução etídio (2 mM) e 5 μl desolução calceína (4 mM). Curvas padrões foram preparadas de células viáveise fixadas em etanol dentro da faixa de 0 - 10^5 células. As curvas deconfiguração deram coeficientes de correlação R = 0,988 e R = 0,984 paracélulas viáveis e mortas respectivamente.

A quantificação de células viáveis isoladas de cada disco deespuma foi realizada com uso de leitora de microplaca Cytofluor comodescrito no exemplo 5. Os resultados são apresentados na tabela 16. Os sinaispara células mortas foram cerca de um valor de controle em branco para todasas amostras de modo que estes dados não são mostrados.

Tabela 16: Viabilidade e proliferação celular como uma função de tempo paraos compósitos diferentes, (n = 3, ± SEM)

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Os dados na tabela 16 indicam que NOVATACH RGDpromove no máximo a proliferação celular.

Exemplo 10

Este exemplo apresenta um método para produzir espumas dequitosana e suas características relacionadas com densidade e absorção.

Uma solução aquosa contendo 4% de sal de quitosana foipreparada usando PROTASAN CL 210 (214). 77,0 g de água MQ e 14,0 g desorbitol (seco) foram adicionados um recipiente de misturação e o sorbitol foidissolvidos por redemoinho suave do recipiente. 100 g da solução dequitosana, 6,0 g de glicerina e 3,0 g de HPMC foram adicionados ao mesmo recipiente de misturação. A dispersão foi misturada com um misturador decozinha Hobart equipado com um batedor de metal em velocidade médiadurante um minuto para assegurar homogeneidade. A misturação continuouem alta velocidade durante 2,5 minutos. A densidade no estado úmido foimedida como sendo de 0,23 g/ml (determinado do peso de espuma úmida requerida para encher um recipiente de 100 ml). A espuma úmida foi moldadaem moldes de 2 mm e 4 mm de altura revestidos com Teflon e então colocadaem um forno de secagem a 80 0C durante 30 minutos e 60 minutos,respectivamente.

Outra espuma foi feita pelo procedimento como acima, mas a espuma úmida foi moldada em um molde de 8 mm de profundidade. Aespuma foi seca a 80 0C durante 1 hora e então 3 horas a 40 0C.

As espumas secas resultantes eram flexíveis e macias com umarede de poros abertos. Quando água foi adicionada na espuma, ela foiimediatamente absorvida e a espuma expandiu significantemente. A espumahidratada reteve sua forma, mas foi relativamente fraca na espuma úmida quenão pode ser transferida em um pedaço ao se elevar um canto. A compressãoda espuma seca antes da hidratação não afetou de modo notável a taxa deabsorbância da espuma ou capacidade de absorção.

Para medir a capacidade de absorção, pedaços de espumaforam cortados em 3,5 cm por 3,5 cm com uso de um de um escalpelo. Umpedaço de espuma foi pesado e colocado em uma malha (diâmetro 0,71 mm) esolução de sal balanceada de Hanks, como uma solução fisiológica modelo,foi adicionado usando uma pipeta. Excesso de líquido foi adicionado e asespumas ficaram transparentes. Quando não se notou mais gotejamento dopedaço de espuma, o peso da espuma úmida foi medido. A densidade noestado seco e a capacidade de absorção para as três espumas diferentes forammedidas, e os resultados são apresentados na tabela 17

Tabela 17: Densidade no estado seco e capacidade de absorção de umasolução fisiológica modelo de espumas de quitosana de espessura diferente (n= 3, ± desvio padrão).

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Exemplo 11

Este exemplo apresenta um material de espuma de duascamadas feito compreendendo espuma de alginato como a primeira camada eespuma de quitosana como uma segunda camada fixada na espuma dealginato. Este tipo de compósito pode ser usado para modificar a integridade,resistência, biodegradação e capacidade de absorção da espuma de quitosana.

Uma espuma de alginato foi feita por primeiro preparação deuma solução aquosa contendo alginato a 4% (PRONOVA UP MVG). 111,2 gda solução de alginato foram transferidos para um recipiente de misturação.Para o mesmo recipiente 6,0 g de glicerina, 18,0 g de sorbitol especial, 3,0 gde HPMC, 0,85 g de CaCO3 (suficiente para saturar os resíduos gulurônicosno alginato com 125%) e 33,3 g de água MQ foram adicionados. A dispersãofoi misturada com um misturador de cozinha Hobart equipado com um batedor de metal em velocidade média durante 1 minuto e 30 segundos paraassegurar homogeneidade. A misturação continuou em alta velocidadedurante 7 minutos antes de uma solução de GDL recentemente misturada de2,69 g de GDL e 25,0 g de água MQ foram adicionados. A misturaçãocontinuou em alta velocidade durante 1 minuto, que resultou em uma espumacom uma densidade no estado úmido de 0,23 g/ml. A espuma úmida foimoldada em moldes de 4 mm e 2 mm de altura revestidos com protetor debanco Versi-Dry com o lado de polietileno para a espuma (Nalgene NuncInternational, NY, USA) e mantidas não cobertas durante 60 minutos emtemperatura ambiente.

Então espuma de quitosana úmida foi adicionada no topo dasespumas de alginato úmidas geleificadas em camadas de 2 mm e 4 mm (poraumento da altura do molde) no topo das espumas de alginato geleificadas de2 mm e 4 mm de espessura, respectivamente. A espuma de quitosana foi feitacomo descrito no exemplo 10 exceto 18,0 g de Sorbitol especial foram usadosem vez de sorbitol seco e 73,0 g de água MQ foram adicionados nestaespuma. O tempo de misturação em velocidade média foi de 2 minutos eentão 3 minutos de misturação de alta velocidade, que resultou em umaespuma com uma densidade no estado úmido de 0,22 g/ml. Os moldes com asduas espumas em camadas foram então colocados em um forno de secagem a80 0C durante 1,5 horas antes ele foi transferido para um forno a 37 0C e asecagem continuada durante a noite.

As espumas secas resultantes eram macias e flexíveis com umarede de poros abertos. Os poros na parte de espuma de alginato eram menoresdo que na espuma feita a partir de quitosana. Não foi possível separar os doistipos de espuma após secagem. Cada uma das camadas de espuma absorveuágua instantaneamente (o tempo de absorção da primeira gota adicionada foimenor do que 1 segundo para a espuma de quitosana e cerca de 3 segundospara a espuma de alginato) e elas permaneceram fixadas após hidratação. Aparte de alginato hidratada da espuma hidratada tinha uma resistência à traçãoelevada enquanto a parte de quitosana hidratada era muito fraca. Os pedaçosda espuma de quitosana hidratada quebraram quando um dedo foi empurradocontra o lado da espuma de quitosana ou quando a espuma de quitosana foiesticada ao se empurrar contra o lado reverso (espuma de alginato). A falhanão foi deslaminação.

Exemplo 12

Este exemplo descreve um método para a reticulação de umaespuma de quitosana para a tornar mais estável com relação à biodegradação eprover uma maior integridade no estado úmido.

Uma espuma de quitosana foi feita como descrito no exemplo11 exceto que os tempos de misturação foram de 1,5 minutos e 4,5 minutosem média e alta velocidade respectivamente. A densidade de espuma úmidaresultante foi de 0,20 g/ml. A espuma úmida foi moldada em moldes de 2 mme 4 mm de profundidade. Então uma solução 100 mM de trifosfato de Nacheio em um frasco para pulverização com o bocal ajustado para dar gotículasfinas. A solução de trifosfato de Na foi pulverizada sobre as espumas úmidascerca de 50 ml e 100 ml para 2 mm e o 4 mm respectivamente. As espumasúmidas absorveram alguma parte da solução pulverizada, de modo que aadição foi realizada várias vezes com menos que um minuto entre cadaadição. As espumas úmidas foram então secas em um forno de secagem a 800C durante 1 hora e 2 horas para as espumas moldadas nos moldes 2 mm e 4mm respectivamente.

As espumas secas eram macias, flexíveis e tinham uma rede deporos abertos. As espumas absorveram água instantaneamente e elasdeformaram menos em hidratação e eram mais fortes do que as espumas dequitosana não reticuladas no exemplo 10.

Exemplo 13

Este exemplo mostra que uma espuma de quitosana contendoíons geleificantes terá a capacidade de induzir geleificação de uma solução dequitosana externamente adicionada in situ.

Discos de espuma (diâmetro = 2,1 cm) foram estampados comuso de um perfurador de cortiça da espuma moldada no molde de 4 mm dealtura apresentado no exemplo 12.. Um disco de espuma foi então colocadona placa serrilhada no mesmo reômetro como usado no exemplo prévio. Aodisco foi então adicionada a solução em excesso de ou água MQ ou umasolução de quitosana a 1,0% (PROTOSAN UP CL 213). A placa superior(PP25) foi abaixada em um calibre de 500 μπι e uma varreduras de tensão foirealizada com uma tensão de cisalhamento aplicada de 0,5 Pa a 50 Pa. Asmedições de oscilação foram iniciadas cerca de três minutos após adição desolução. A freqüência foi fixada a 1 Hz. A varredura foi realizada duas vezespara cada curativo adesivo de espuma. O módulo elástico, G', lido na regiãoviscoelástica linear (G'ijn) e o ângulo de fase são registrados na tabela 18.

Tabela 18: G'nn e ângulo de fase medidos para as espumas de quitosanareticuladas adicionadas com a solução de quitosana e água

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Com base em ambos os módulos elásticos e o ângulo de faseindica-se que os resultados na tabela propriedades mais semelhantes a gel daespuma após adição de solução de quitosana.

Exemplo 14

Este exemplo mostra como o tempo de misturação equantidade de ar incorporado nas espumas de quitosana afetam aspropriedades de espuma diferentes.

As espumas de quitosana foram preparadas como descrito noexemplo 10 exceto tempos de misturação diferentes foram usados para obterdensidades de espuma diferentes. Todos os ingredientes de espuma para criaruma espuma úmida foram misturados em velocidade média durante 1,5minutos. Então misturação em alta velocidade foi continuada durante 1minuto com uma densidade no estado úmido resultante 0,45 g/ml. Cerca demetade da espuma foi moldada em moldes de 4 mm e 2 mm de altura. Então aespuma restante foi misturada em alta velocidade durante um minutoadicional. A densidade no estado úmido resultante foi de 0,29 g/ml e o restoda espuma foi moldado como acima. Um procedimento similar como acimafoi repetido exceto para o tempo de misturação em alta velocidade foramprimeiro 45 segundos e o segundo 4 minutos e 45 segundos. As densidades noestado úmido foram de 0,52 g/ml e 0,18 g/ml respectivamente. As duasespumas com densidades no estado úmido maiores criaram uma película finana superfície contra o molde. Isto foi devido à coalescência dos poros àmedida que a espuma seca mais lentamente próxima do fundo. A densidadeda espuma seca foi determinada por estampagem dos discos, a partir daespuma moldada no molde de 4 mm de altura, com um diâmetro de 1 cm comuso de um furador de cortiça e pesando os mesmos. As densidades e espessuramedidas por um calibrador das espumas diferentes são apresentadas na tabela

18. As espumas também foram caracterizadas por seu módulo elástico, G'Hn,com os mesmos ajustes do reômetro como descrito no exemplo 10 exceto afaixa de tensão aplicada foi de 0,5 Pa a 18 Pa, e que três varreduras em cadapedaço de espuma foram realizadas. Os resultados são incluídos na tabela 19,apresentando os valores médios das duas últimas varreduras para três espumasdiferentes com um diâmetro de 1 cm. Os pedaços de espuma foram mantidosem 2 ml de solução de Hanks cerca de cinco minutos antes de seremtransferidas para o reômetro. A resistência à tração das espumas secas foimedida com uso de um analisador de textura SMS e garras de tração A/TG. Aforça requerida para esticar a espuma a 0,5 mm/s até ruptura foi lida e a forçamáxima e a distância esticada quando ela se rompeu são registradas na tabela

19. Os pedaços de espuma tinham a forma de osso cortadas com uso de umescalpelo com as dimensões de 3,15 cm de comprimento, 1,75 cm de larguranas extremidades e 1,25 cm de largura no centro, o início se estreitando 1 cma partir das extremidades. A espuma foi cortada nesta forma para assegurar aruptura no meio da espuma e não onde ela foi fixada com as garras.Aproximadamente 0,3 cm de cada extremidade do pedaço de espuma foiusado para prender a mesma nas garras.

Tabela 19: Espumas de quitosana de densidade diferente e suas propriedades,(n = 3, ± SEM) (A espuma com densidade no estado úmido de 0,23 g/ml é aespuma de exemplo 10)

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A tabela mostra que as espumas com as densidades no estadoúmido maiores colapsaram principalmente devido à coalescência. Foi tambémobservado que as espumas tinham tamanho de poro crescente por aumento dadensidade no estado úmido. A resistência à tração e o módulo elásticodiminuíram por quantidades aumentadas de ar. Também, a elasticidade dosmateriais apresentada como o comprimento em que o material pode seresticado antes de romper diminui por diminuição da densidade no estadoúmido. Os três materiais menos densos tinham cerca de da mesmaelasticidade.

Exemplo 15

Este exemplo descreve a preparação de uma espuma de ácidohialurônico (HA) com íons cálcio incorporados. Também a capacidade dasespumas de doar estes íons para induzir a geleificação de uma solução dealginato externamente adicionada é mostrada.

Uma solução aquosa contendo 2,5% HA foi preparada ecolocada de lado. 49,65 g de água MQ, 2,35 g de CaCl2*2H20 e 10,5 g desorbitol (seco) foram adicionados a um recipiente de misturação e osingredientes secos foram dissolvidos por turbilhão suave do recipiente. 130 gda solução HA, 4,5 g de glicerina e 3,0 g de HPMC foram adicionados aomesmo recipiente de misturação. A dispersão foi então misturada com ummisturador de cozinha Hobart equipado com um batedor de metal emvelocidade média durante dois minutos para assegurar homogeneidade. Amisturação continuou em alta velocidade durante 3 minutos e 50 segundos. Adensidade no estado úmido foi medida como sendo de 0,21 g/ml (determinadado peso da espuma seca requerida para encher um recipiente de 100 ml). Aespuma úmida foi moldada em moldes de 2 mm e 4 mm de altura revestidoscom teflon e então colocados em um forno de secagem a 80 0C durante 50minutos.

Com o uso de um furador de cortiça, discos de espuma(diâmetro = 2,1 cm) foram estampados da espuma moldada em molde de 4mm de altura. Uma solução de alginato a 1,0% e 0,5% foi preparada dePRONOVA SLG 20 (batelada: 221105) por adição de água MQ. Um disco deespuma seca foi colocado em um reômetro de alta resolução Bohlin CVO 120entre as placas serrilhadas (PP25). Então 350 μΐ da solução alginato foramadicionados com uso de uma pipeta. O teor de cálcio no disco de espuma ésuficiente para saturar os resíduos da geleificação do alginato adicionado emsolução a 124% e 248% para a 1,0% e 0,5% respectivamente. Após umminuto a solução de alginato é absorvida e a espuma é fechada para sercompletamente hidratada. A placa superior foi então abaixada a um calibre de500 fim e as medidas do módulo elástico, G', foram iniciadas. A freqüência,força e temperatura foram fixadas a 1 Hz, 0,001 e 20 0C respectivamente. Osresultados são apresentados na tabela 20.

Tabela 20: Módulo elástico, G', como uma função de tempo após adição deágua e soluções de alginato para a espuma de HA com íons cálcioincorporados.

<table>table see original document page 62</column></row><table><table>table see original document page 63</column></row><table>

O aumento de G' durante os minutos logo após a adição dasolução de alginato confirma a doação de íons geleificantes e que uma reaçãode geleificação tinha sido iniciada. A diferença no valor G' entre as trêssoluções confirma que um gel está sendo criado e que o gel mais forte écriado a partir da solução de alginato mais concentrada.

Exemplo 16

Este exemplo descreve a preparação de uma espuma HA comíons fosfato incorporados. Também a capacidade das espumas de doar estesíons para induzir a geleificação de uma solução de quitosana externamenteadicionada é mostrada.

A espuma de HA foi feita como descrito no exemplo 15,exceto que a fonte de cálcio foi substituída com 2,27 g de Na2HPO4 e aquantidade de água usada foi 49,7 g. O tempo de misturação em altavelocidade foi de 3 minutos que deu uma densidade no estado úmido de 0,17g/ml. As espumas moldadas em moldes de 2 mm e 4 mm foram mantidas noforno de secagem a 80°C durante 45 min e 75 min respectivamente.

Os mesmos parâmetros para medidas reológicas como descritono exemplo A foram usados. Água e solução de quitosana a 1,0% foramadicionadas em quantidade em excesso. Os valores descrevendo o móduloelástico, G', e ângulo de fase nivelados nos valores são apresentados na tabela 21.

Tabela 21: Módulo elástico, G', e ângulo de fase de espumas de HAreidratadas com íons fosfato incorporados.

<table>table see original document page 63</column></row><table>Os resultados indicam que a solução de quitosana adicionada àespuma adquire um comportamento mais semelhante a gel e é mais rígida doque a água MQ adicionada à espuma.

Exemplo 17

Este exemplo descreve a preparação de uma espuma dequitosana que contém íons cálcio. O cálcio imobilizado na espuma dequitosana induziu a geleificação in situ de uma solução de alginato quando elefoi absorvido pela espuma de quitosana seca. Estas estruturas podem serusadas em aplicações biomédicas para imobilização celular ou para prover aliberação controlada de fármacos imobilizados, enzimas, hormônios, etc.

Uma espuma de quitosana foi feita compreendendo as mesmasquantidades e ingredientes como no exemplo 11 exceto que 2,35 g de águaMQ foram substituídos com 2,35 g de CaCl2 *2H20 (80 mM). Uma espumaúmida com uma densidade no estado úmido de 0,20 g/ml foi feita pormisturação em velocidade média e alta durante 1,5 minutos e 6 minutosrespectivamente. A espuma úmida foi moldada em moldes de 2 mm e 4 mmde altura como descrito acima. Então elas foram colocadas em um forno desecagem a 80 0C durante 1,5 horas. As espumas secas eram macias e flexíveiscom uma rede de poros abertos e uma densidade no estado seco de 0,039 ±0,001 g/cm. A espuma absorveu água instantaneamente e tinha umaintegridade no estado úmido similar às espumas da mesma espessura noexemplo 10. Esta espuma expandiu menos quando a solução de Hanks foiadicionada a esta espuma comparada com as espumas do exemplo 10. Acapacidade de absorção da solução de Hanks para este espuma foi medidacomo sendo 16,8 ±1,9 g/g de espuma (valor médio de três amostras ± desviopadrão (SD)). Os poros desta espuma foram um pouco mais largos do que aespessura de 4 mm de espessura do exemplo 10, isto pode ser descrito pormaior coalescência devido a uma viscosidade diminuída da quitosana devidoà resistência iônica da solução.Discos de espuma, a partir da espuma moldada em bandejas de4 mm de altura, foram estampados com o uso de um furador de cortiça comum diâmetro de 2,1 cm. Um disco de espuma seca foi colocado em umreômetro de alta resolução Bohlin CVO 120 entre placas serrilhadas (PP25).Então 500 μΐ de uma solução de alginato a 1% (PRONOVA UP LVG) foramadicionados como o uso de uma pipeta. O teor de cálcio no disco de espuma ésuficiente para saturar os resíduos de geleificação do alginato adicionado por96%. Após um minuto, a solução alginato é absorvida e a espuma é fechadapara ser completamente hidratada. A placa superior foi abaixada a um calibrede 1.000 mm e as medidas do módulo elástico, G', foram iniciadas. Afreqüência, força e temperatura foram fixadas a 1 Hz, 0,001 e 20 0Crespectivamente. Os resultados são apresentados na tabela 22.Tabela 22: O módulo elástico, G', como uma função de tempo para asespumas de quitosana adicionadas com a solução de alginato e água (n = 3).

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O valor elevado de G' para os discos de espuma adicionadoscom a solução de alginato e o aumento em G' durante os minutos logo após aadição, confirma a doação de íons formadores de gel à espuma de quitosanaadicionada com a solução de alginato.

Claims (57)

1. Método para formar um compósito, caracterizado pelo fatode compreender prover uma espuma tendo poros e compreendendo umpolímero e íons formadores de gel para formar um gel, contatar umcomponente líquido com a referida espuma, referido componente líquidocompreendendo um polissacarídeo solúvel tendo sítios de geleificaçãocapazes de formar um gel quando do contato com os referidos íons, em quequando do contato com os referidos íons um gel compreendendo opolissacarídeo solúvel é formado dentro dos poros da referida espuma.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a espuma é esterilizada.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que pelo menos uma porção dos íons formadores degel é incorporada na espuma por lavagem ou imersão da espuma em umasolução contendo íons formadores de gel e então removendo a solução emexcesso.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a espuma compreende umbiopolímero.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a espuma compreende umpolissacarídeo selecionado dentre um alginato, uma pectina, um carragenano,um hialuronato, quitosana ou mistura dos mesmos.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a espuma compreende um alginatomodificado.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a espuma compreende um alginatomodificado com pelo menos uma seqüência de peptídeos de adesão celular.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o polímero na espumacompreende um alginato e o peso molecular médio do referido alginato é decerca de 10 kDa a cerca de 500 kDa.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que o peso molecular médio do alginato na espuma é de cerca de 50kDa a cerca de 300 kDa.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o polímero na espumacompreende um alginato e o alginato tem um teor de G de mais do que 20%.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que os íons formadores de gel estãopresentes em uma quantidade molar equivalente a pelo menos 10% dos sítiosde geleificação do polissacarídeo solúvel.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que os íons formadores de gel estãopresentes em uma quantidade molar equivalente a 5% a 250% dos sítios degeleificação do polissacarídeo solúvel.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que os íons formadores de gelcompreende íons cálcio e os íons geleificantes estão presentes em umaquantidade molar equivalente a 5% a 200 dos sítios de geleificação dopolissacarídeo solúvel.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que os íons formadores de gelcompreendem íons estrôncio e os íons geleificantes estão presentes em umaquantidade molar equivalente a pelo menos 5% a 200% dos sítios degeleificação do polissacarídeo solúvel.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que os íons formadores de gelcompreendem íons bários e os íons geleificantes estão presentes em umaquantidade molar equivalente a pelo menos 5% a 200% dos sítios degeleificação do polissacarídeo solúvel.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo solúvel tem umaconcentração em peso de cerca de 0,2% a cerca de 10% no referido líquidocompreendendo o polissacarídeo solúvel.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo solúvel tem umaconcentração em peso de cerca de 0,5% a cerca de 5% no referido líquidocompreendendo o polissacarídeo solúvel.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo no componentelíquido é selecionado dentre o grupo consistindo de alginato, quitosana,carragenano, hialuronato e pectina e misturas dos mesmos.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que o polissacarídeo compreende um alginato.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que o alginato tem um teor de endotoxina de menos do que 100EU/g se usado para compósitos de espuma/gel a serem implantados no corpohumano.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo solúvelcompreende alginato com um peso molecular médio de cerca de 4000 Daltonsa cerca de 500.000 Daltons.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o polímero no componente líquidocompreende um alginato e o alginato tem um teor de G de cerca de 20% acerca de 80%.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o polímero no componente líquidocompreende um alginato e o alginato tem um teor de M de pelo menos 20%.

24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o referido componente líquido temuma viscosidade de cerca de 2 mPas a cerca de 500 mPas.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato de que o componente líquido tem uma viscosidade de cerca de 10mPas a cerca de 200 mPas.

26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o referido componente líquidoainda compreende um componente funcional.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizadopelo fato de que o componente funcional é selecionado dentre o grupoconsistindo de um aroma, uma fragrância, um particulado, células, agregadosmulticelulares, um agente terapêutico, um agente de regeneração de tecido,um fator de crescimento e um nutracêutico.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que o referido componente líquido é inerte a ou estabiliza ocomponente funcional.

29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo contém umaseqüência de peptídeos de adesão celular.

30. Compósito, caracterizado pelo fato de compreender umaespuma com um gel dentro dos poros da referida espuma, referido compósitosendo obtenível pelo método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes.

31. Compósito, caracterizado pelo fato de compreender:i) uma espuma em que a espuma tem poros e compreende íonsformadores de gel distribuídos através de pelo menos uma parte da espuma;ii) um gel compreendendo um polissacarídeo em que o gel estálocalizado dentro dos poros da espuma e interage com a espuma.

32. Compósito caracterizado pelo fato de compreender umaespuma com poros, a espuma tendo íons formadores de gel em que um gel depolis está presente em pelo menos alguns dos poros.

33. Compósito de acordo com qualquer uma dasreivindicações 30 a 32, caracterizado pelo fato de que a espuma absorve de 1a 30 vezes seu peso de um líquido selecionado dentre o grupo de água, umasolução fisiológica, uma solução de polissacarídeo solúvel, e uma solução depolissacarídeo compreendendo um componente funcional.

34. Compósito de acordo com qualquer uma dasreivindicações 30 a 33, caracterizado pelo fato de que o módulo elástico docompósito é de 0,1 kPa a 1000 kPa.

35. Compósito de acordo com qualquer uma dasreivindicações 30 a 34, caracterizado pelo fato de que a espuma e/ou opolissacarídeo compreende um polissacarídeo ultrapuro possuindo um teorbaixo de endotoxinas.

36. Compósito de acordo com qualquer uma dasreivindicações 30 a 35, caracterizado pelo fato de que o gel de polissacarídeoainda compreende um componente funcional.

37. Compósito de acordo com a reivindicação 36,caracterizado pelo fato de que o componente funcional é selecionado dentre o grupo compreendendo um aroma, uma fragrância, um particulado, células,agregados multicelulares, um agente terapêutico, um agente de regeneraçãode tecido, um fator de crescimento e um nutracêutico.

38. Compósito de acordo com a reivindicação 37,caracterizado pelo fato de que o componente funcional compreende células.

39. Compósito para inibir a proliferação celular caracterizadopelo fato de compreender o compósito como definido em a reivindicação 38,em que o íon formador de gel compreende íon bário, íon estrôncio, oumisturas dos mesmos.

40. Compósito para promover a proliferação celular,caracterizado pelo fato de compreender o compósito como definido emqualquer uma das reivindicações 37 a 39, em que o íon formador de gelcompreende íon cálcio.

41. Compósito caracterizado pelo fato de ser produzido pelométodo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 29, em que aespuma compreende um alginato, o compósito ainda compreendendo umcomponente funcional selecionado dentre um ativo farmacêutico e/ou umagente anti-adesivo.

42. Método para promover a proliferação celular no compósitodefinido como definido em qualquer uma das reivindicações 37 a 40,caracterizado pelo fato de compreender lavar o compósito com uma solução,ajustada por pressão osmótica neutral para células vivas, e cuja soluçãocontém íons formadores de gel.

43. Método de acordo com a reivindicação 42, caracterizadopelo fato de que o íon formador de gel é selecionado de modo que a etapa delavagem modifica uma propriedade mecânica do compósito.

44. Método de acordo com a reivindicação 42 ou 43,caracterizado pelo fato de que a solução usada para lavar o compósito contémum sal selecionado dentre um sal de cálcio, um sal de bário e um sal deestrôncio em uma concentração de cerca de 5 mM a cerca de 200 mM.

45. Método para inibir a proliferação celular, caracterizadopelo fato de compreender formar um compósito por um método comodefinido em qualquer uma das reivindicações 1 a 29 em que o componentelíquido compreende células, referido polissacarídeo sendo geleificado dentrodos poros da espuma em que o íon formador de gel compreende íon estrôncio.

46. Método para recuperar células do compósito definido nareivindicação 38, caracterizado pelo fato de compreender contatar umasolução aquosa compreendendo um agente de recuperação com o gelcompreendendo o polissacarídeo solúvel em que a referida solução aquosa éajustada para prover uma pressão osmótica neutral para células vivas.

47. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizadopelo fato de que o agente de recuperação compreende citrato de sódio ououtro sal solúvel de ácido cítrico, EDTA sódico ou outro sal solúvel deEDTAj ou hexametafosfato.

48. Uso de um compósito como definido em qualquer uma dasreivindicações 30 a 41, caracterizado pelo fato de ser como uma matriz paraimobilização e/ou proliferação celular para uma aplicação em cultura detecido in vitro ou uma aplicação em engenharia de tecido in vivo..

49. Uso de um compósito como definido em qualquer uma dasreivindicações 30 a 41, caracterizado pelo fato de que o compósito aindacompreende um agente terapêutico para prover liberação controlada in vivodo agente ativo em um corpo humano ou animal.

50. Uso de um compósito como definido em qualquer uma dasreivindicações 30 a 41, caracterizado pelo fato de que o compósito aindacompreende um componente para uso no controle de uma ferida para prover ocontrole da ferida in vivo.

51. Método para fixar um compósito acordo com qualqueruma das reivindicações 30 a 41 a um tecido, caracterizado pelo fato de ser porfixação da espuma ao referido tecido, a referida espuma tendo poros abertos eíons formadores de gel, adicionando um líquido compreendendo umpolissacarídeo solúvel e reagindo o polissacarídeo com os íons formadores de gel.

52. Método para fixar um compósito como definido emqualquer uma das reivindicações 30 a 41 a tecido, caracterizado pelo fato decompreender fixar o compósito ao tecido por meio de uma sutura.

53. Método para promover o crescimento celular caracterizadopelo fato de compreender implantar um compósito produzido por um métodocomo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 29 e em que a espumacompreende alginato em um corpo humano ou animal para o fim deestabelecer o crescimento celular.

54. Método para induzir a geleificação in situ dentro dos porosde uma espuma de alginato caracterizado pelo fato de compreender adicionarum componente líquido compreendendo um alginato solúvel e água a umaespuma de alginato de poros abertos geleificada tendo íons formadores de gelincorporados na mesma; e reagir o alginato solúvel com referidos íonsformadores de gel à medida que a espuma absorve o líquido, assim formandoum gel dentro dos poroso.

55. Método para prevenir a adesão de tecido a tecidoadjacente, caracterizado pelo fato de compreender aplicar ao tecido umcompósito como definido em qualquer uma das reivindicações 30 a 41, demodo que ele provê uma barreira entre o tecido e o tecido adjacente.

56. Método para formar uma espuma absorvente seca tendouma rede de poros abertos e poros e compreendendo íons formadores de gelpara a geleificação de uma solução de polissacarídeo subseqüentementeadicionada, caracterizado pelo fato de compreender:a) formar uma espuma úmida a partir de uma dispersão aquosacompreendendo um polissacarídeo, e um agente espumante e opcionalmenteum ou mais dentre um plastificante, um agente reticulante e um modificadorde pH;b) misturar a espuma da dispersão aquosa, opcionalmente poragitação mecânica;c) opcionalmente realizar uma ou mais etapas de:i) moldar ou conformar a espuma; eii) formar uma espuma reticulada a partir da espuma;d) secar a espuma para formar uma espuma seca contendoporos abertos; eadicionar íons formadores de gel em uma ou mais das etapas a)a d) ou após a etapa d).

57. Método de acordo com a reivindicação 56, caracterizadopelo fato de que a espuma de polissacarídeo compreende um hialuronato.