CN102380129A

CN102380129A - 一种透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖多孔支架材料及其制备方法

Info

Publication number: CN102380129A
Application number: CN2011103371480A
Authority: CN
Inventors: 陈庆华; 董会; 王静; 陈佳; 黄明华
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2011-10-31
Filing date: 2011-10-31
Publication date: 2012-03-21
Anticipated expiration: 2031-10-31
Also published as: CN102380129B

Abstract

本发明涉及用于软骨缺损修复的一种透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖多孔支架材料的制备方法，属于生物医学材料领域。本发明采用透明质酸钠、魔芋葡甘聚糖两种材料，以不同的配比以及魔芋葡甘聚糖的交联，通过冷冻干燥法制得一种透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖多孔支架材料。本发明反应条件温和，步骤简单，成本低廉；人体骨髓间充质干细胞在支架材料中分布均匀，且生长繁殖状况良好；同时此支架材料的孔径、孔隙率、抗压强度、吸水率、降解率等可以通过调节透明质酸钠、魔芋葡甘聚糖、交联剂的含量及冷冻干燥条件来调节，从而得到满足要求的多孔支架材料，该材料可用于软骨修复领域。

Description

一种透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖多孔支架材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及用于软骨缺损修复的一种透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖多孔支架材料及其制备方法，属于生物医学材料领域。

背景技术

关节软骨主要包括蛋白多糖，胶原，其他蛋白类如连接蛋白，透明质酸等，且其再生和自我修复能力差。目前临床常用的关节软骨损伤修复方法有微骨折、软骨下钻孔、自体骨软骨移植和同种异体骨软骨移植等。自体骨软骨移植（镶嵌成形术），安全，有效，是临床最常用的治疗方法，但此方法会给患者带来新的局部病损并且其来源有限，无法用于修复直径超过2cm的软骨缺损，大大限制了其应用。同种异体骨软骨移植来源广泛，但是存在病原传播和排异反应的可能。微骨折经常用于修复损伤的关节软骨，此技术通过骨髓刺激形成纤维样软骨组织，但存在生物力学特性差，短期出现退变的问题。软骨组织工程学的出现和发展为治疗关节软骨疾病和缺损开辟了一种新的途径，在关节软骨治疗方面显示出巨大的潜力。

软骨组织工程学的基本原理是：将体外培养的软骨细胞或骨髓间充质干细胞吸附于生物相容性好、可被机体降解吸收的支架材料上，此支架材料为干细胞提供生存空间，使细胞获得足够的营养物质，进行气体交换，并使细胞按预制形态的三维支架生长，然后将形成的细胞-生物复合材料植入软骨缺损部位，随着支架材料在体内的降解吸收，细胞在支架上不断增殖、分化，形成新的具有一定功能和形态的组织，从而对病损组织或器官修复与功能重建。其中支架材料是组织工程的关键要素之一。目前用于修复关节软骨的组织工程支架材料有透明质酸、胶原、糖苷聚糖、白蛋白、几丁质、魔芋葡甘聚糖、藻酸盐、蚕丝蛋白、纤维蛋白、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乙二醇、聚乙内酯聚氨酯等。但现今的软骨组织工程支架材料都存在如体内吸收过快或过慢，生物相容性较差，支架表面的结构对细胞的生长的不利影响等缺陷。众多因素的影响使组织工程软骨移植未能达到满意的结果，迄今为止，尚未找到一种理想的软骨细胞培养支架。

透明质酸（Haluronic acid, HA）是一种酸性粘多糖，它广泛存在于动物和人体的生理活性物质，在人皮肤、关节滑膜液、脐带、房水及眼玻璃体中均有分布。透明质酸有多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。由于透明质酸易分解，故商品化的透明质酸一般为其钠盐，即透明质酸钠（Hyaluronate Sodium, HS）。透明质酸钠在医药方面已得到广泛应用——可用作眼科人工晶体植入手术的粘弹剂、骨性关节炎风湿性关节炎等关节手术的填充剂，作为媒介在滴眼液中广泛应用，可用于药物控释，还可用于预防手术后粘连和促进皮肤伤口的愈合。但是大量的研究表明，透明质酸钠在直接植入或与生理系统结合使用时的用量不宜过多，故其用作组织工程材料的成分时需要与其它高分子材料复合。

魔芋葡甘聚糖(Konjac glucomannan, KGM)是一种提取自魔芋块茎的pH值敏感性多糖，可以通过调节系统的pH值来控制KGM的凝胶产生时间和凝胶度，这种特性对控制支架材料的机械性能、生物降解性能及其与其他材料的复合非常有利。此外，由于KGM良好的生物相容性，是理想的组织工程支架材料和药物控释材料。除上述特点外，由于KGM可获得孔结构丰富且孔径可调的三维网状结构，具有良好的持水能力、生物相容性和降解性，且其与透明质酸（钠）的微观结构、理化性质十分相似，故能与透明质酸（钠）很好地复合。另外，由于KGM来源较广，成本低廉，与昂贵的透明质酸（钠）复合后可降低支架材料的成本。

迄今为止，文献已经报道采用透明质酸参与的支架有：透明质酸-胶原、透明质酸-壳聚糖、透明质酸-聚己内酯、透明质酸-聚苯乙醇、透明质酸-明胶-壳聚糖等，但还没有利用透明质酸、魔芋葡甘聚糖两种材料的优点符合制备的透明质酸-魔芋葡甘聚糖多孔支架材料。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖两种生物材料的多孔支架材料及其制备方法，解决现有支架材料性能不理想、成本高等问题。

本发明的技术方案是：透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖多孔支架材料由透明质酸钠与魔芋葡甘聚糖两种材料组成，透明质酸钠与魔芋葡甘聚糖的质量比为1：100～1:5。

本透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖多孔支架材料的制备方法是：

（1）按透明质酸钠与水的质量比为1:2000～1:20，将透明质酸钠溶于水中，搅拌使其充分溶解，然后将碱性溶液加入溶液中；

（2）交联：按透明质酸钠与魔芋葡甘聚糖的质量比为1:100～1:5，将魔芋葡甘聚糖加入步骤（1）得到的材料中，搅拌至凝胶状态；

（3）将步骤（2）得到的材料密封后在温度为50℃～90℃的水浴中熟化12～48h，将材料取出，然后将水浴温度降至15℃～50℃时，再将材料放入水浴中脱碱直至产物pH为7；取出材料，在温度为-10℃～-40℃条件下低温冷冻和干燥1h～48h，制得SH/KGM多孔支架材料。

所述步骤（1）中，碱性溶液为浓度为0.1～1vol%%的NH₃·H₂O或浓度为0.1～1vol%%的NaOH溶液，加入量按碱性溶液与水的体积比为1:5000～1:100。

所述步骤（3）中制得的SH/KGM多孔支架材料，在103.4kPa（1.05kg/cm2）蒸汽压下，温度达到121.3℃，高压灭菌进行消毒后备用。

本发明提供的HA/KGM多孔支架材料，经消毒后，置于干燥皿中保存备用。通过电镜扫描检测等方法来确定支架的孔径大小、孔分布情况、孔隙率。通过参照国标GB/1041-92对支架的抗压强度进行测定。通过干燥后重量与充分吸水后重量的比较，测定支架吸水率。利用XRD分析出支架的晶体结构和结晶程度。用傅立叶转换红外光谱仪对支架的结构组成及化学基团的变化进行分析。选择生理盐水作为材料的降解介质，研究材料的体外降解行为。将支架材料修剪为5mm×5mm×1mm的样品。将制备好的片状样品消毒，在粘连蛋白溶液中浸泡数小时后，放入置有BMSCs的培养液(DMEM/F12)中体外培养7d(培养条件为37℃、饱和湿度、空气环境中CO₂浓度为5%)。利用扫描电镜进行单位面积细胞数量统计，取连续5个视场为统计样本，初步统计，每平方毫米面积中的细胞数量。

本发明将用透明质酸、魔芋葡甘聚糖两种材料交联而成HA/KGM多孔支架材料，其中的KGM通过脱乙酰基交联形成三维网络结构，而HA通过与KGM形成氢键等结合而共同形成三维多孔支架，不仅降低了透明质酸支架材料的成本，而且具备了透明质酸、魔芋葡甘聚糖支架材料两者的共同特点，具有以下优点：

1、HA/KGM多孔支架材料孔径主要为100～250μm，适合营养物质的运输传送与细胞的移动生长，平均复合软骨组织工程的要求；

2、HA/KGM多孔支架材料孔隙率高于75%，满足组织工程支架材料高孔隙率的要求；

3、HA/KGM多孔支架材料的抗压强度高于0.5MP，满足支架材料在植入前后的力学要求，且与天然关节软骨压应力为0.5～1.0MPa的范围是相适应的；

4、HA/KGM多孔支架材料的吸水率高于1000%，作为支架材料来讲，高的吸水率也可以有效的防治创面积液的形成，有利于创面愈合，符合软骨组织工程支架材料的要求；

5、HA/KGM多孔支架材料的孔贯穿性较好，BMSCs在支架上分布均匀，生长增殖状态良好。

附图说明

图1为本发明HA/KGM多孔支架材料的制备工艺流程图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例，对本发明做进一步阐述，但本发明的保护范围不限于所述内容。

实施例1：由透明质酸钠与魔芋葡甘聚糖两种材料组成，透明质酸钠与魔芋葡甘聚糖的质量比为1：100。

参见图1，本透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖多孔支架材料的制备方法是：

（1）按透明质酸钠与水的质量比为1:2000，将透明质酸钠溶于水中，搅拌使其充分溶解，然后将碱性溶液加入溶液中；碱性溶液为浓度为0.1vol%%的NH₃·H₂O溶液，加入量按碱性溶液与水的体积比为1:267。

（2）交联：按透明质酸钠与魔芋葡甘聚糖的质量比为1:100，将魔芋葡甘聚糖加入步骤（1）得到的产物中，搅拌至凝胶状态；

（3）将步骤（2）得到的材料密封后在温度为70℃的水浴中熟化24h，将材料取出，然后将水浴温度降至30℃时，再将材料放入水浴中脱碱直至产物溶液pH值为7；取出材料，在温度为-30℃条件下低温冷冻和干燥24h，制得SH/KGM多孔支架材料。在103.4kPa（1.05kg/cm2）蒸汽压下，温度达到121.3℃时，将SH/KGM多孔支架材料进行高压灭菌消毒后备用。

实施例2：由透明质酸钠与魔芋葡甘聚糖两种材料组成，透明质酸钠与魔芋葡甘聚糖的质量比为1：80。

（1）按透明质酸钠与水的质量比为1:100，将透明质酸钠溶于水中，搅拌使其充分溶解，然后将碱性溶液加入溶液中；碱性溶液为浓度为0.8vol%%的NaOH溶液，加入量按碱性溶液与水的体积比为1:5000。

（2）交联：按透明质酸钠与魔芋葡甘聚糖的质量比为1:80，将魔芋葡甘聚糖加入步骤（1）得到的产物中，搅拌至凝胶状态；

（3）将步骤（2）得到的产物密封后在温度为50℃的水浴中熟化12h将材料取出，然后将水浴温度降至15℃时，将材料放入水浴中脱碱直至产物溶液pH值为7；取出材料，在温度为-10℃条件下低温冷冻和干燥1h，制得SH/KGM多孔支架材料。在103.4kPa（1.05kg/cm2）蒸汽压下，温度达到121.3℃时，将SH/KGM多孔支架材料进行高压灭菌消毒后备用。

实施例3：由透明质酸钠与魔芋葡甘聚糖两种材料组成，透明质酸钠与魔芋葡甘聚糖的质量比为1：5。

（1）按透明质酸钠与水的质量比为1:20，将透明质酸钠溶于水中，搅拌使其充分溶解，然后将碱性溶液加入溶液中；碱性溶液为浓度为1vol%%的NH₃·H₂O溶液，加入量按碱性溶液与水的体积比为1:100。

（2）交联：按透明质酸钠与魔芋葡甘聚糖的质量比为1:5，将魔芋葡甘聚糖加入步骤（1）得到的产物中，搅拌至凝胶状态；

（3）将步骤（2）得到的产物密封后在温度为90℃的水浴中熟化48h，将材料取出，然后将水浴温度降至50℃时，再将材料放入水浴中脱碱直至产物溶液pH值为7；取出材料，在温度为-20℃条件下低温冷冻和干燥48h，制得SH/KGM多孔支架材料。在103.4kPa（1.05kg/cm2）蒸汽压下，温度达到121.3℃时，将SH/KGM多孔支架材料进行高压灭菌消毒后备用。

实施例4：由透明质酸钠与魔芋葡甘聚糖两种材料组成，透明质酸钠与魔芋葡甘聚糖的质量比为1：70。

（1）按透明质酸钠与水的质量比为1:1500，将透明质酸钠溶于水中，搅拌使其充分溶解，然后将碱性溶液加入溶液中；碱性溶液为浓度为0.3vol%%的NH₃·H₂O溶液，加入量按碱性溶液与水的体积比为1:3000。

（2）交联：按透明质酸钠与魔芋葡甘聚糖的质量比为1:70，将魔芋葡甘聚糖加入步骤（1）得到的产物中，搅拌至凝胶状态；

（3）将步骤（2）得到的产物密封后在温度为60℃的水浴中熟化18h，然后将水浴温度降至40℃时水浴脱碱直至产物溶液pH值为7；取出材料，在温度为-40℃条件下低温冷冻和干燥10h，制得SH/KGM多孔支架材料。在103.4kPa（1.05kg/cm2）蒸汽压下，温度达到121.3℃时，将SH/KGM多孔支架材料进行高压灭菌消毒后备用。

Claims

1.一种透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖多孔支架材料，其特征在于：由透明质酸钠与魔芋葡甘聚糖两种材料组成。

2.根据权利要求书1所述的透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖多孔支架材料，其特征在于：透明质酸钠与魔芋葡甘聚糖的质量比为1：100～1:5。

3.一种透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖多孔支架材料的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（2）按透明质酸钠与魔芋葡甘聚糖的质量比为1:100～1:5，将魔芋葡甘聚糖加入步骤（1）得到的材料中，搅拌至凝胶状态；

（3）将步骤（2）得到的材料密封后水浴熟化，然后将材料取出，待温度下降后，再将材料放入水浴中脱碱直至产物溶液pH值为7；取出材料，先低温冷冻，然后再冷冻干燥，制得SH/KGM多孔支架材料。

4.根据权利要求3所述的透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖多孔支架材料的制备方法，其特征在于：碱性溶液为浓度为0.1～1vol%的NH₃·H₂O或浓度为0.1～1vol%的NaOH溶液，加入量按碱性溶液与水的体积比为1:5000～1:100。

5.根据权利要求3所述的透明质酸钠和魔芋葡甘聚糖多孔支架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中水浴熟化温度为50℃～90℃，时间为12～48h；水浴脱碱温度为15℃～50℃，时间为1h～48h。

6.根据权利要求3所述的透明质酸钠/魔芋葡甘聚糖多孔支架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中低温冷冻和干燥的温度为-10℃～-40℃，时间为1h～48h。