CN101632841A - 含海藻酸盐、糖胺聚糖和胶原的组织工程支架及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于组织工程支架的技术领域，具体提供了一种含海藻酸盐、糖胺聚糖和胶原的组织工程支架及其制备方法。本发明提供的组织工程支架主要由以下质量配比的原料制成：包括5～30％壳聚糖，5～30％胶原，5～30％海藻酸盐，0.1～3％透明质酸，0.01～0.05％交联剂，0.1～3％硫酸软骨素，5～20％聚乙烯醇和三蒸水。作为优选，还包括适量细胞生长因子、纤维连接蛋白和层粘连蛋白。本发明的组织工程支架可加工塑形，制备不同形态和厚度的制品，成型方法易操作，原材料易得不贵，能进行规模产业化生产。

Description

含海藻酸盐、糖胺聚糖和胶原的组织工程支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及组织工程支架材料，具体涉及一种含海藻酸盐、糖胺聚糖和胶原的组织工程支架及其制备方法。

背景技术

组织器官由于意外事故、疾病、遗传及衰老等导致的缺损或功能丧失，是影响人类寿命和生存质量的首要问题。当人体某一部位的组织器官受到创伤，医学临床上可采用的治疗方法是自体移植、同种异体移植或异种移植。但是，这些方法存在供体不足、免疫排斥反应、手术费用高等缺点。大量患者因缺乏合适的供体和有效的器官替代物，得不到医治而死亡。因此，如何实现受损组织器官的修复与再生，如何实现其功能的恢复一直是临床医学亟待解决的难题，组织工程技术的兴起和发展为其开辟了新的治疗前景。

组织工程的基本要素包括种子细胞、支架材料以及细胞生长因子。

组织工程支架是种子细胞粘附、生长和迁移的载体，不但起着决定新生组织或器官形状大小的作用，更重要的是为细胞增殖提供营养、进行气体交换、排除废物的场所。生长因子对细胞增殖以及组织或器官的修复和再生都有重要的促进作用，可以诱导和刺激细胞增殖、维持细胞存活等。在组织工程中，多孔支架起到细胞外基质的作用，是对细胞外基质的结构和功能的仿生。

理想的组织工程多孔支架必须满足以下要求：

(1)良好的生物相容性，无明显的细胞毒性、炎症反应和免疫排斥反应；

(2)可控的生物降解与吸收性，降解与吸收速率应与细胞或组织生长速率相适应；

(3)合适的孔尺寸、高孔隙率(＞90％)和相互贯通的孔形态，以利于细胞的种植、粘附与迁移；

(4)可塑的三维外形，以获得所需要的组织或器官形状；

(5)高的表面积和合适的表面理化性质，有利于细胞粘附、增殖和分化以及负载生长因子等生物信号分子；

(6)一定的机械强度，在体内生物力学微环境中保持结构稳定性和完整性，并为植入细胞提供合适的微应力环境。

目前，国内外研究制备的组织工程支架普遍存在组分配比单一，应用范围小，降解和吸收速度的可控性差，在支架中不能形成三维立体贯通多孔结构，不能根据相应的细胞类型调节孔的尺寸、体积和密度，不能全方位的满足组织工程支架综合性能的要求，难以适合多种组织器官细胞的生长繁殖，不能加工塑形，制备不同形态和厚度的制品。

发明内容

针对现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种含海藻酸盐、糖胺聚糖和胶原的组织工程支架。

本发明的另一目的在于提供一种简单且易于工业化生产的上述组织工程支架的制备方法。

本发明的目的通过以下的技术方案实现：一种组织工程支架，主要由以下重量配比的原料组分的制成：

壳聚糖              5～30％

胶原                5～30％

海藻酸盐            5～30％

透明质酸            0.1～3％

生物蛋白交联剂      0.01～0.1％

硫酸软骨素          0.1～3％

聚乙烯醇            5～20％

余量为三蒸水。

为使本发明具有更好的性能：

组份中还包括细胞生长因子、纤维连接蛋白和层粘连蛋白，它们在原料混合物中的最终质量浓度分别为：5ng/ml～130ng/ml、1ng/ml～120ng/ml和1ng/ml～120ng/ml；所述的质量浓度为细胞生长因子、纤维连接蛋白和层粘连蛋白的质量与其余组分组成的反应混合物的体积的比例。

其中细胞生长因子包括成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子(TGF-β1)、骨形成蛋白(BMPs)、血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子(EGF)或是它们当中两种或两种以上的混合物。

另外，上述组分中：聚乙烯醇的分子量优选10000～100000；壳聚糖的分子量优选100000～1000000，脱乙酰度65％～100％。

所述的海藻酸盐通常使用海藻酸钠；生物蛋白交联剂可用本领域公知的具有胶原交联作用的交联剂，如炭二亚胺等。

本发明还提供上述组织工程支架的制备方法：具体包括以下步骤：

(1)将所述配比的壳聚糖和胶原分别溶于4＜pH＜6的盐酸溶液或醋酸溶液，所述配比的硫酸软骨素、透明质酸和海藻酸盐在室温下分别溶于三蒸水；所述配比的聚乙烯醇溶于85～100℃三蒸水；

(2)将充分混合均匀的壳聚糖和胶原混合液缓慢地加入硫酸软骨素、透明质酸、聚乙烯醇和海藻酸盐混合液中，添加余量三蒸水，在室温下搅拌1～2hr，使各组份充分混合均匀；

(3)将混合液注入模具中，35～45℃烘干或置于-20～-100℃冷冻干燥机冻干；

(4)将干燥制品浸泡于1～10％氯化钙溶液中，使组分中的直链海藻酸钠转变为网状交联的海藻酸钙，然后用5～10％氢氧化钠溶液中和酸性，三蒸水浸泡清洗获得产品。

该方法中，所述步骤(2)中还可加入细胞生长因子、纤维连接蛋白和层粘连蛋白，使它们在原料组份混合物中的质量浓度分别为：5ng/ml～130ng/ml、1ng/ml～120ng/ml和1ng/ml～120ng/ml；所述细胞生长因子优选为成纤维细胞生长因子bFGF、表皮生长因子TGF-β1、骨形成蛋白BMPs、血管内皮生长因子VEGF和表皮生长因子EGF中的任一种或是两种以上的混合物；聚乙烯醇的分子量优选10000～100000；壳聚糖的分子量优选100000～1000000，脱乙酰度65％～100％。

细胞生长因子、纤维连接蛋白和层粘连蛋白优选的加入方法是：在原步骤(2)得到的混合液中，在室温下用微量移液管缓慢滴加细胞生长因子，纤维连接蛋白、层粘连蛋白，搅拌0.5～1hr。

本发明的作用原理为：

糖胺聚糖(GAG)广泛存在于人和动物的软骨、肌腱、韧带、角膜和血管壁等组织中，各类胶原纤维、细胞膜、胞外纤维、和弹性蛋白纤维周围的无定形基质等都含有GAG，所以GAG在体内具有广泛而重要的作用。由于GAG是多聚阴离子聚糖，可以吸引阳离子和水分子而形成凝胶，赋予组织弹性和韧性，对关节具有润滑作用。

GAG多为己糖醛酸和己糖胺交替出现的长链多聚物，其重复单元结构如下：

R、R’＝H或SO₃H

根据两主要组分的差异、硫酸化的程度和位置不同分为透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角质素、肝素、甲壳素及其脱乙酰衍生物壳聚糖等。GAG对软骨细胞、成纤维细胞、角膜内皮细胞的粘附、生长增殖均有优良的作用，并且可以调节细胞粘附，所以作为天然生物材料的GAG具有良好的细胞亲和性。

胶原是哺乳动物体内结缔组织的主要成分，属于细胞外基质(ECM)的结构蛋白质，约占哺乳动物总蛋白的1/3，结缔组织的强度和韧性主要依靠它来维持，它具有支撑器官和保护肌体的功能，也是组成细胞间质的最重要功能蛋白质。其中I型胶原占生物体总胶原量的90％，普遍分布于肌体的各部分，主要为皮肤、肌腱、韧带、软骨及骨等组织或器官中，具有很强的抗张能力，胶原在组织工程中因具有好的生物相容性与生物降解性、无抗原性、能促进细胞生长等优点，被广泛用于生物可降解缝线、人造皮肤、伤口敷料、人造腱及血管等方面。

但是，由于胶原在体内降解速度快、机械性能较差，胶原干燥后质地脆，难以成膜等缺点，使其作为细胞支架的功能受到限制。因此，可以通过物理、化学交联和复合其他材料等方法来提高胶原的机械性能和改善其降解速度。物理交联不引入毒性物质，但不能获得均一、理想的交联强度。化学交联虽然可以得到均一、理想的交联强度，但常用甲醛、戊二醛等作为交联剂，对组织细胞的培养易引起不良反应。所以，采用无毒医用生物交联剂和聚乙烯醇补强剂，可以改善胶原的机械强度和降解速度。

海藻酸盐(ALGNa)是从褐藻类的海带或马尾藻中提取的一种多糖碳水化合物，是美国食品药品管理局(FDA)批准用于生物医学领域的天然生物材料之一。是由1，4-聚-β-D-甘露糖醛酸和a-L-古罗糖醛酸组成的一种线型聚合物，是海藻酸衍生物中的一种，其分子链上含有大量的羟基和羧基。海藻酸钠用二价Ca离子作为交联剂，可形成交联的海藻酸钙聚合物，具有好的亲水性，营养物质易于渗透扩散，海藻酸钙为表面光滑柔韧和顺应性较好的半透明状生物膜，是一种理想的膜引导组织再生材料，它具有可降解性且膜降解时间与组织再生时间同步；具有微孔结构或体液通透性，生物相容性优良，无毒性和过敏性反应；海藻酸盐有着广泛的应用，如人工软骨材料、药物缓释系统、人工细胞微囊化、抗凝血型材料等方面。

胶原在体内的降解产物是小分子的氨基酸和小链段的多肽，糖胺聚糖的降解产物是小分子的多糖链，大量的临床应用和研究结果已证实，这些降解产物对受体不会产生排斥和其它不良反应，它们可作为受体的营养成分被逐步吸收和代谢。

生长因子对组织器官细胞的培养、生长繁殖及与组织器官细胞外和细胞间基质的结合有极大的影响，不同组织器官细胞生长因子之间的协同效应和用量对组织器官细胞的生长繁殖可进行调控，其中成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子(TGF-β1)，和表皮生长因子(EGF)对组织器官细胞的生长繁殖、细胞间的正常融合及与基质的结合均有促进作用。bFGF可促进组织器官细胞增殖，TGF-β1可刺激组织器官细胞产生多型胶原，EGF可使细胞增殖和迁移，促进蛋白合成。生长因子的存在可加速细胞的生长繁殖，对的组织器官重建起着极为关键的作用。

本发明利用天然生物大分子海藻酸盐-糖胺聚糖-胶原为组织工程支架主要成分，采用无毒医用生物交联剂和补强剂，调控海藻酸盐、糖胺聚糖和胶原的用量配比整合不同类型和用量的细胞生长因子，通过致孔剂浸出法、气体发泡法、冷冻干燥法和冷激光技术致孔法，构建适于多种组织器官细胞生长的组织工程支架。

本发明与现有技术相比具有如下的有益效果：

(1)本发明根据仿生原理研制组织工程支架，其组份配比采用天然基质胶原、糖胺聚糖与海藻酸盐整合细胞生长因子与生物活性大分子，促进组织器官细胞间的正常融合及与组织工程支架的结合。

(2)根据不同种类的组织器官细胞，选择不同的细胞生长因子(成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF-β1)、骨形成蛋白(BMPs)、血管内皮生长因子(VEGF))和生物活性大分子(纤维粘连蛋白(FN)和层粘蛋白(LM))生长因子的存在可加速细胞的生长繁殖。

(3)本发明获得的组织工程支架，采用无毒医用生物交联剂和补强剂，使体内外降解吸收的速率与组织器官细胞生长速率相匹配；可在引导人体组织器官细胞沿材料的支架生长繁殖，为人体组织器官的修复构建提供模板。支架可自行降解和被自体吸收，与新生组织相融合或成为人体组织器官的组成部分。

(4)本发明采用气体发泡法、冷冻干燥法和冷激光技术致孔法，构建三维多孔组织工程支架。可调节孔的尺寸、体积和密度，在支架中形成贯通多孔结构，适于组织器官细胞在体内外生长，可引导细胞在其三维立体多孔结构中粘附生长。

(5)本发明获得的组织工程支架物理性能与人体组织器官相仿，含水率60％～95％，膨胀率100％～500％，抗张强度(湿态)3～15Mpa，扯断伸长率300％～500％，孔径5～300μm。

(6)本发明的组织工程支架可加工塑形，制备不同形态和厚度的制品，成型方法易操作，原材料易得不贵，能进行规模产业化生产。

具体实施方式：

下面结合具体的实施方式进一步说明本发明，但本发明的实施方式不限于此。

壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸、硫酸软骨素、聚乙烯醇来源于英国BS Chemical Technology、德国ACROS ORGANICS和美国Sigma生化试剂公司，成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF-β1)、骨形成蛋白(BMPs)、血管内皮生长因子(VEGF))和生物活性大分子(纤维粘连蛋白(FN)和层粘蛋白(LM)来源于美国Sigma生化试剂公司

实施例1

组织工程支架由以下原料组份制成，涉及的百分数为重量百分数：

壳聚糖：          5％

胶原：            30％

海藻酸钠：        5％

透明质酸：        0.1％

碳二亚胺：        0.01％

硫酸软骨素：      0.1％

聚乙烯醇：        20％

余量三蒸水；

并添加有以下质量浓度的生长因子和活性物质：(质量浓度为下述物质的质量与上述原料混合物体积的比例，下同)

细胞生长因子：    65ng/ml

纤维连接蛋白：    70ng/ml

层粘连蛋白：      25ng/ml

其中细胞生长因子的组成为：成纤维细胞生长因子(bFGF)15ng/ml、表皮生长因子(EGF)25ng/ml、转化生长因子(TGF-β1)30ng/ml；

上述组织工程支架由以下步骤制备：

(1)称取所述配比的壳聚糖、胶原分别溶于4＜pH＜6的盐酸溶液；硫酸软骨素、透明质酸和海藻酸盐在室温下分别溶于三蒸水；聚乙烯醇溶于85～100℃三蒸水；

(2)将充分混合均匀的壳聚糖和胶原混合液缓慢地加入所述配比的硫酸软骨素、透明质酸、聚乙烯醇和海藻酸盐混合液中，添加余量三蒸水，在室温下搅拌1～2hr，加入交联剂，使各组份充分混合均匀；在室温下用移液管缓慢滴加细胞生长因子，纤维连接蛋白、层粘连蛋白，搅拌0.5～1hr。

(3)将混合液注入模具中，35℃烘干或置于-20～-100℃℃冷冻干燥机冻干。

本发明获得的组织工程支架具有如下性质：含水率80％，膨胀率100％，透光率80％，抗张强度(湿态)3Mpa，扯断伸长率300％，35℃烘干获得孔径5～100μm的组织工程支架。

将上述制得的组织工程支架进行动物体内埋植实验分别于2个月、4个月、5个月、6个月、11个月后取出染色后作病理切片光镜下观察，无炎症细胞，。植入材料能与组织器官细胞相容，降解产物在受体中与细胞相互融合成为一体，没有排斥反应，胶原纤维定向排列整齐透明，在材料植入部位产生细胞，形成密集的细胞生长区域，可见有新生未分化成熟的纤维母细胞样细胞，6个月可见材料降解产物已完全被吸收代谢。

将传代培养好的细胞用10％FBS+DMEM培养液调整细胞浓度至5.0×10⁴/ml左右；将约1ml/孔的细胞悬液接种在24孔板中的组织工程支架上，置37℃、5％CO₂及饱和湿度环境下培养，成纤维细胞和表皮细胞3～7天后可在组织工程支架上正常生长。

实施例2

壳聚糖：          15％

胶原：            5％

海藻酸钠：        10％

透明质酸：        0.1％

碳二亚胺：        0.01％

硫酸软骨素：      0.1％

聚乙烯醇：        20％

余量三蒸水；

实施例3

组织工程支架由以下原料组份制成，涉及的百分数为重量百分数：

壳聚糖：          30％

胶原：            5％

海藻酸钠：        25％

透明质酸：        3％

碳二亚胺：        0.1％

硫酸软骨素：      0.5％

聚乙烯醇：        5％

细胞生长因子：    130ng/ml

纤维连接蛋白：    60ng/ml

层粘连蛋白：      25ng/ml

余量三蒸水。

上述组织工程支架由以下步骤制备：

(1)按上述配比称取壳聚糖、胶原分别溶于4＜pH＜6的醋酸溶液，硫酸软骨素、透明质酸和海藻酸盐在室温下分别溶于三蒸水；聚乙烯醇溶于85～100℃三蒸水。

(2)将充分混合均匀的壳聚糖和胶原混合液缓慢地加入所述配比的硫酸软骨素、透明质酸、聚乙烯醇和海藻酸盐混合液中，添加余量三蒸水，在室温下搅拌1～2hr，加入交联剂，使各组份充分混合均匀；

(3)将混合液注入模具中，置于-20～-100℃冷冻干燥机冻干；

获得的组织工程支架具有如下性质：。

实施例4

组织工程支架由以下原料组份制成，涉及的百分数为重量百分数：

壳聚糖：          30％

胶原：            5％

海藻酸钠：        25％

透明质酸：        3％

碳二亚胺：        0.1％

硫酸软骨素：      0.5％

聚乙烯醇：        5％

细胞生长因子：    130ng/ml

纤维连接蛋白：    60ng/ml

层粘连蛋白：      25ng/ml

余量三蒸水。

并添加有以下质量浓度的生长因子和活性物质：

细胞生长因子：    130ng/ml

纤维连接蛋白：    60ng/ml

层粘连蛋白：      25ng/ml

其中细胞生长因子的组成为：成纤维细胞生长因子(bFGF)55ng/ml、转化生长因子(TGF-β1)20ng/ml、血管内皮生长因子(VEGF))55ng/ml

上述组织工程支架由以下步骤制备：

(1)按上述配比称取壳聚糖、胶原分别溶于4＜pH＜6的醋酸溶液，硫酸软骨素、透明质酸和海藻酸盐在室温下分别溶于三蒸水；聚乙烯醇溶于85～100℃三蒸水。

(2)将充分混合均匀的壳聚糖和胶原混合液缓慢地加入所述配比的硫酸软骨素、透明质酸、聚乙烯醇和海藻酸盐混合液中，添加余量三蒸水，在室温下搅拌1～2hr，加入交联剂，使各组份充分混合均匀；在室温下用微量移液管缓慢滴加细胞生长因子，纤维连接蛋白、层粘连蛋白，搅拌0.5～1hr。

(3)将混合液注入模具中，置于-20～-100℃冷冻干燥机冻干；

获得的组织工程支架具有如下性质：含水率70％，膨胀率200％，抗张强度(湿态)3Mpa，扯断伸长率300％，冷冻干燥获得孔径50～300μm的组织工程支架。

实施例5

组织工程支架由以下原料组份制成，涉及的百分数为重量百分数：

壳聚糖：          10％

胶原：            15％

海藻酸钠：        30％

透明质酸：        0.5％

碳二亚胺：        0.03％

硫酸软骨素：      1％

聚乙烯醇：        7％

余量三蒸水。

并添加有以下质量浓度的生长因子和活性物质：

细胞生长因子：    80ng/ml

纤维连接蛋白：    1ng/ml

层粘连蛋白：      1ng/ml

其中细胞生长因子的组成为成纤维细胞生长因子(bFGF)35ng/ml、转化生长因子(TGF-β1)20ng/ml和骨形成蛋白(BMPs)25ng/ml。

上述组织工程支架由以下步骤制备：

(1)按上述配比称取壳聚糖、胶原分别溶于4＜pH＜6的醋酸溶液；硫酸软骨素、透明质酸和海藻酸盐在室温下分别溶于三蒸水；聚乙烯醇溶于85～100℃三蒸水；

(2)将充分混合均匀的壳聚糖和胶原混合液缓慢地加入上述配比的硫酸软骨素、透明质酸、聚乙烯醇和海藻酸盐混合液中，添加余量三蒸水，在室温下搅拌1～2hr，加入交联剂，使各组份充分混合均匀；在室温下用微量移液管缓慢滴加细胞生长因子，纤维连接蛋白、层粘连蛋白，搅拌0.5～1hr。

(3)将混合液注入模具中，置于-20～-100℃冷冻干燥机冻干。

获得的组织工程支架具有如下性质：含水率70％，膨胀率200％，，抗张强度(湿态)3Mpa，扯断伸长率300％，冷冻干燥获得孔径50-300μm的组织工程支架。

实施例6

组织工程支架由以下原料组份制成，涉及的百分数为重量百分数：

壳聚糖：          15％

胶原：            20％

海藻酸钠：        20％

透明质酸：        1％

碳二亚胺：        0.05％

硫酸软骨素：      1.5％

聚乙烯醇：        9％

余量三蒸水。

并添加有以下质量浓度的生长因子和活性物质：

细胞生长因子：    75ng/ml

纤维连接蛋白：    40ng/ml

层粘连蛋白：      55ng/ml

其中细胞生长因子的组成为成纤维细胞生长因子(bFGF)35ng/ml、转化生长因子(TGF-β1)40ng/ml。

上述组织工程支架由以下步骤制备：

(1)按上述配比称取壳聚糖、胶原分别溶于4＜pH＜6的盐酸溶液；硫酸软骨素、透明质酸和海藻酸盐在室温下分别溶于三蒸水；聚乙烯醇溶于85～100℃三蒸水；

(2)将充分混合均匀的壳聚糖和胶原混合液缓慢地加入所述配比的硫酸软骨素、透明质酸、聚乙烯醇和海藻酸盐混合液中，添加余量三蒸水，在室温下搅拌1～2hr，加入交联剂，使各组份充分混合均匀；在室温下用微量移液管缓慢滴加细胞生长因子，纤维连接蛋白、层粘连蛋白，搅拌0.5～1hr。

(3)将混合液注入模具中，置于35～45℃烘干，激光制孔获得孔径200μm。

获得的组织工程支架具有如下性质：含水率95％，膨胀率300％，抗张强度(湿态)13Mpa，扯断伸长率300％，激光制孔获得孔径250μm的组织工程支架。

实施例7

组织工程支架由以下原料组份制成，涉及的百分数为重量百分数：

壳聚糖：          20％

胶原：            25％

海藻酸钠：        10％

透明质酸：        1.5％

碳二亚胺：        0.07％

硫酸软骨素：      2％

聚乙烯醇：        10％

余量三蒸水。

并添加有以下质量浓度的生长因子和活性物质：

细胞生长因子：    120ng/ml

纤维连接蛋白：    100ng/ml

层粘连蛋白：      120ng/ml

其中细胞生长因子的组成为成纤维细胞生长因子(bFGF)30ng/ml、转化生长因子(TGF-β1)25ng/ml、骨形成蛋白(BMPs)35ng/ml、血管内皮生长因子(VEGF)30ng/ml

上述组织工程支架由以下步骤制备：

(1)按所述配比称取壳聚糖、胶原分别溶于4＜pH＜6的醋酸溶液；2％硫酸软骨素、1.5％透明质酸和10％海藻酸盐在室温下分别溶于三蒸水；10％聚乙烯醇溶于85～100℃三蒸水；

(2)将充分混合均匀的壳聚糖和胶原混合液缓慢地加入硫酸软骨素、透明质酸、聚乙烯醇和海藻酸盐混合液中，添加余量三蒸水，在室温下搅拌1～2hr，加入交联剂，使各组份充分混合均匀；在室温下用微量移液管缓慢滴加细胞生长因子，纤维连接蛋白、层粘连蛋白，搅拌0.5～1hr。

(3)将混合液注入模具中，置于35～45℃烘干激光制孔。

获得的组织工程支架具有如下性质：含水率95％，膨胀率300％，，抗张强度(湿态)13Mpa，扯断伸长率300％，激光制孔获得孔径150μm的组织工程支架。

实施例8

组织工程支架由以下原料组份制成，涉及的百分数为重量百分数：

壳聚糖：          25％

胶原：            10％

海藻酸钠：        15％

透明质酸：        2％

碳二亚胺：        0.09％

硫酸软骨素：      3％

聚乙烯醇：        15％

细胞生长因子：    90ng/ml

纤维连接蛋白：    50ng/ml

层粘连蛋白：      35ng/ml

余量三蒸水。

并添加有以下质量浓度的生长因子和活性物质：

细胞生长因子：    90ng/ml

纤维连接蛋白：    50ng/ml

层粘连蛋白：      35ng/ml

其中细胞生长因子的组成为成纤维细胞生长因子(bFGF)20ng/ml、转化生长因子(TGF-β1)25ng/ml、骨形成蛋白(BMPs)35ng/ml、血管内皮生长因子(VEGF)10ng/ml

上述组织工程支架由以下步骤制备：

(1)配制25％壳聚糖、10％胶原分别溶于4＜pH＜6的盐酸溶液，3％硫酸软骨素、2％透明质酸和15％海藻酸盐在室温下分别溶于三蒸水；15％聚乙烯醇溶于85～100℃三蒸水；

(2)将充分混合均匀的壳聚糖和胶原混合液缓慢地加入硫酸软骨素、透明质酸、聚乙烯醇和海藻酸盐混合液中，添加余量三蒸水，在室温下搅拌1～2hr，加入交联剂，使各组份充分混合均匀；在室温下用微量移液管缓慢滴加细胞生长因子，纤维连接蛋白、层粘连蛋白，搅拌0.5～1hr。

(3)将混合液注入模具中，采用氮气气体发泡法制孔。

获得的组织工程支架具有如下性质：含水率95％，膨胀率300％，，抗张强度(湿态)13Mpa，扯断伸长率300％，氮气气体发泡法制孔获得孔径130μm的组织工程支架。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1、一种含海藻酸盐、糖胺聚糖和胶原的组织工程支架，其特征在于主要由以下重量配比的原料组分的制成：

壳聚糖           5～30％

胶原             5～30％

海藻酸盐         5～30％

透明质酸         0.1～3％

生物蛋白交联剂   0.01～0.05％

硫酸软骨素       0.1～3％

聚乙烯醇         5～20％

余量为三蒸水。

2、根据权利要求1所述含海藻酸盐、糖胺聚糖和胶原的组织工程支架，其特征在于：还包括细胞生长因子、纤维连接蛋白和层粘连蛋白，它们在原料组份混合物中的质量浓度分别为：5ng/ml～130ng/ml、1ng/ml～120ng/ml和1ng/ml～120ng/ml。

3、根据权利要求2所述含海藻酸盐、糖胺聚糖和胶原的组织工程支架，其特征在于：所述细胞生长因子为成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、骨形成蛋白、血管内皮生长因子和表皮生长因子中的任一种或是两种以上的混合物。

4、根据权利要求1～3中任一项所述含海藻酸盐、糖胺聚糖和胶原的组织工程支架，其特征在于：所述聚乙烯醇的分子量为10000～100000；所述壳聚糖的分子量为100000～1000000，脱乙酰度65％～100％。

5、权利要求1所述含海藻酸盐、糖胺聚糖和胶原的组织工程支架的制备方法，其特征在于包括以下具体步骤：

(1)将所述配比的壳聚糖和胶原分别溶于4＜pH＜6的盐酸溶液或醋酸溶液，所述配比的硫酸软骨素、透明质酸和海藻酸盐在室温下分别溶于三蒸水；所述配比的聚乙烯醇溶于85～100℃三蒸水；

(2)将充分混合均匀的壳聚糖和胶原混合液缓慢地加入硫酸软骨素、透明质酸、聚乙烯醇和海藻酸盐混合液中，添加余量三蒸水，在室温下搅拌1～2hr，使各组份充分混合均匀；

(3)将混合液注入模具中，35～45℃烘干或置于-20～-100℃冷冻干燥机冻干；

(4)将干燥制品浸泡于5～10％氢氧化钠溶液中和酸性，三蒸水浸泡清洗获得产品。

6、权利要求2或3所述含海藻酸盐、糖胺聚糖和胶原的组织工程支架的制备方法，其特征在于：

(1)将所述配比的壳聚糖和胶原分别溶于4＜pH＜6的盐酸溶液或醋酸溶液，所述配比的硫酸软骨素、透明质酸和海藻酸盐在室温下分别溶于三蒸水；所述配比的聚乙烯醇溶于85～100℃三蒸水；

(2)将充分混合均匀的壳聚糖和胶原混合液缓慢地加入硫酸软骨素、透明质酸、聚乙烯醇和海藻酸盐混合液中，添加余量三蒸水，在室温下搅拌1～2hr，使各组份充分混合均匀；在室温下用微量移液管缓慢滴加细胞生长因子，纤维连接蛋白、层粘连蛋白，搅拌0.5～1hr；

(3)将混合液注入模具中，35～45℃烘干或置于-20～-100℃冷冻干燥机冻干；

(4)将干燥制品浸泡于5～10％氢氧化钠溶液中和酸性，三蒸水浸泡清洗获得产品。

7、权利要求4所述含海藻酸盐、糖胺聚糖和胶原的组织工程支架的制备方法，其特征在于：

(1)将所述配比的壳聚糖和胶原分别溶于4＜pH＜6的盐酸溶液或醋酸溶液，所述配比的硫酸软骨素、透明质酸和海藻酸盐在室温下分别溶于三蒸水；所述配比的聚乙烯醇溶于85～100℃三蒸水；

(2)将充分混合均匀的壳聚糖和胶原混合液缓慢地加入硫酸软骨素、透明质酸、聚乙烯醇和海藻酸盐混合液中，添加余量三蒸水，在室温下搅拌1～2hr，使各组份充分混合均匀；在室温下用微量移液管缓慢滴加细胞生长因子，纤维连接蛋白、层粘连蛋白，搅拌0.5～1hr；

(3)将混合液注入模具中，35～45℃烘干或置于-20～-100℃冷冻干燥机冻干；

(4)将干燥制品浸泡于5～10％氢氧化钠溶液中和酸性，三蒸水浸泡清洗获得产品。