CN109402047A - 促组织粘附和生长生物粘合剂及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种促组织粘附和生长生物粘合剂，包括组织粘附物、组织生长添加物、组织垂体抽取物、通透剂。该促组织粘附和生长生物粘合剂对组织具备非常好促粘附和促生长作用，一方面促进组织粘附在组织载体如聚氯乙烯(PVC)，另一方面促进已粘附在载体上的组织生长，具有重要的生物医药领域的应用价值。

Description

促组织粘附和生长生物粘合剂及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体的，本发明涉及与一种促组织粘附和生长生物粘合剂及其制备方法和用途。
背景技术
粘合剂具有胶接功能，按其材料性质可分为化学粘合剂和生物粘合剂。化学粘合剂包括：氰基丙烯酸酯类粘合剂；聚氨酯类粘合剂；有机硅系粘合剂等。其中氰基丙烯酸酯类粘合剂是发现最早、应用最广泛的化学粘合剂。生物粘合剂主要包括纤维蛋白粘合剂(FS)。纤维蛋白粘合剂是应用最早、最广泛的生物粘合剂。目前生物粘合剂主要应用于临床的品种即医用生物粘合剂，是一种用于防止组织粘连、止血、手术中防止空气和体液泄漏的生物医学材料，其主要成份是纤维蛋白。由于化学粘合剂往往存在粘结部位弹性差、对活体组织产生异物反应以及潜在的化学毒性等缺点，而天然生物质材料大多具有良好的生物相容性和低免疫原性，因此，后者更加受到研究者的青睐。但是，纤维蛋白产品大多是从人的血浆中提取制得，具有传染疾病的风险，并且人血浆来源少，成本高，价格昂贵，而异体来源的纤维蛋白容易引起人体的免疫反应，同样具有传播病毒的风险，限制了临床推广应用。为了解决纤维蛋白来源局限的问题，目前，人们多用重组技术来生产纤维蛋白，其粘结强度低，尤其在湿润条件下更低，目前只能与传统的缝合法并用提高粘结强度。但纤维蛋白产品仍将是使用最广的手术粘合剂之一。明胶基粘合剂也是一类重要的生物粘合剂，粘合强度高，但往往会与其它材料复合使用，导致材料的生物相容性、可降解性和使用安全性受到影响，需要进一步优化。
组织和细胞贴壁是这些组织和细胞培养和生长的基础，贴壁依赖性组织和细胞在培养表面上贴附和铺展的过程。是否贴壁主要取决于：组织和细胞本身生物学特性；组织和细胞与培养载体表面接触概率；组织和细胞与培养载体表面相容性。在组织和细胞培养过程中，如果这些组织和细胞与培养载体不相容、不接触、不贴壁、不粘附等，这些组织和细胞是非常难以培养和生长。人们试图使用血清中的冷析蛋白和纤维粘连蛋白，或者一些化学物质，等等，其效果均不太佳。
因此，现有的生物粘合剂产品及制备方法仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种促组织粘附和生长生物粘合剂，该促组织粘附和生长生物粘合剂对组织具备非常好促粘附和促生长作用，一方面促进组织粘附在组织载体如聚氯乙烯(PVC)，另一方面促进已粘附在载体上的组织生长。该生物粘合剂能够有利于组织和细胞与载体接触，组织和细胞粘附到载体上，并更有利于贴壁依赖性组织和细胞易于贴壁、粘附、培养和生长。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种促组织粘附和生长生物粘合剂，根据本发明的实施例，该促组织粘附和生长生物粘合剂包括：组织粘附物、组织生长添加物、组织垂体抽取物和通透剂。
发明人意外发现，本发明的促组织粘附和生长生物粘合剂具备非常好的通透性、富含水性；双向性进行水分子可自由进入，小分子物质和气体如氧和二氧化碳可以自由通过；该促组织粘附和生长生物粘合剂既可促进组织粘附到载体上，又有利于组织的生长；该促组织粘附和生长生物粘合剂与组织有非常好的相容性，而且对组织无任何毒性作用。具有重要的生物医药领域的应用价值。
根据本发明的实施例，该生物粘合剂中所含的组织粘附物包括1～20质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白，1～10质量份的明胶和基质胶，1～10质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素，1～10质量份的藻酸盐，1～10质量份的聚乙二醇，1～10质量份的细胞基质。
根据本发明的具体实施例，所述组织粘附物包括8质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白，4质量份的明胶和基质胶，4质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素，4质量份的藻酸盐，4质量份的聚乙二醇，2质量份的细胞基质。
根据本发明的具体实施例，所述组织粘附物包括1质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白，1质量份的明胶和基质胶，1质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素，1质量份的藻酸盐，1质量份的聚乙二醇，1质量份的细胞基质。
根据本发明的具体实施例，所述组织粘附物包括20质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白，10质量份的明胶和基质胶，10质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素，10质量份的藻酸盐，10质量份的聚乙二醇，10质量份的细胞基质。
根据本发明的实施例，所述胶原蛋白与所述蚕丝蛋白的质量比为1：1。
根据本发明的实施例，所述明胶与所述基质胶的质量比为1：1。
根据本发明的实施例，所述壳聚糖、所述透明质酸与所述硫酸软骨素的质量比为1：1：1。
根据本发明的实施例，该促组织粘附和生长生物粘合剂中所含的组织生长添加物为选自组织血管内皮细胞提取物、组织上皮细胞提取物的至少一种。
根据本发明的实施例，所述组织血管内皮细胞提取物为选自人、小鼠、大鼠、兔、猪、牛、羊的血管内皮细胞提取物中的至少一种。
根据本发明的具体实施例，所述组织血管内皮细胞提取物的添加量为促组织粘附和生长生物粘合剂总量的1质量％～20质量％，优选为10质量％。
根据本发明的实施例，所述组织上皮细胞提取物为选自人、小鼠、大鼠、兔、猪、牛、羊的细胞提取物中的至少一种。
根据本发明的具体实施例，所述组织上皮细胞提取物的添加量为促组织粘附和生长生物粘合剂总量的1质量％～20质量％，优选为10质量％。
根据本发明的实施例，该促组织粘附和生长生物粘合剂中所含的组织垂体抽取物为1～8质量份，优选为4质量份。
根据本发明的具体实施例，所述组织垂体抽取物为选自人、小鼠、大鼠、兔、猪、牛、羊的组织垂体抽取物中的至少一种。
根据本发明的具体实施例，所述组织垂体抽取物为促组织粘附和生长生物粘合剂总量的1质量％～10质量％，优选为4质量％。
根据本发明的实施例，该促组织粘附和生长生物粘合剂中所含的通透剂为1～10质量份，优选为6质量份。
根据本发明的具体实施例，所述通透剂为选自碳酸氢铵和碳酸铵中的至少一种。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备促组织粘附和生长生物粘合剂的方法，根据本发明的实施例，该方法包括：将所述组织粘附物、组织生长添加物、组织垂体抽取物、通透剂在水环境或常规细胞基础培养基下相接触，以制备得到本发明所述促组织粘附和生长生物粘合剂。本发明的制备工艺简便、无需特殊的大型设备、原料容易获得、价格合理、成本低廉，易于实现产业化。
根据本发明的实施例，本发明用于制备促组织粘附和生长生物粘合剂，所述的水环境为双蒸水。
根据本发明的实施例，本发明用于制备促组织粘附和生长生物粘合剂，所述的常规细胞基础培养基为选自DMEM、MEM、RPMI1640、DMEM/F12培养基中的一种。
根据本发明的实施例，本发明制备促组织粘附和生长生物粘合剂的方法进一步包括：
(1)在反应器中，将所述组织粘附物加入双蒸水中，机械搅拌均匀；
(2)加入所述组织生长添加物，机械搅拌均匀；
(3)加入所述组织垂体抽取物，机械搅拌均匀；
(4)加入所述通透剂，机械搅拌均匀；
(5)冷却，即得。
根据本发明的实施例，所述步骤(1)～(4)的加入过程均是缓慢加入。
根据本发明的实施例，所述步骤(1)～(4)的搅拌过程中，搅拌转速均为100r～150r/min。
根据本发明的实施例，所述搅拌的时间均为10min～30min。
根据本发明的实施例，所述步骤(1)在加入所述组织粘附物或组织生长添加物或组织垂体抽取物或通透剂之前，先将双蒸水保持至30摄氏度～55摄氏度，优选为37摄氏度。
根据本发明的实施例，所述步骤(5)冷却至室温，优选为20摄氏度～26摄氏度。
根据本发明的具体实施例，本发明的制备方法为：
(1)取双蒸水100～300ml质量倒入500ml的反应容器中，将反应容器放在机械搅拌器上加热至55摄氏度～65摄氏度；
(2)组织粘附物：依次缓慢加入1～20质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白(质量比1：1)，1～10质量份的明胶和基质胶(质量比为1：1)，1～10质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素(质量比1：1：1)、1～10质量份的藻酸盐、1～10质量份的聚乙二醇、1～10质量份的细胞基质到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速100r～150r/min,搅拌时间10min～30min；
(3)组织生长添加物：缓慢依次加入质量百分比为1％～20％的组织生长添加物，进行机械搅拌，搅拌转速100r～150r/min,拌时间10min～30min；
(4)组织垂体抽取物：缓慢加入1～8质量份的组织垂体抽取物到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速100r～150r/min,搅拌时间10min～30min；
(5)通透剂：缓慢加入1～10质量份的通透剂到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速100r～150r/min,搅拌时间10min～30min；
(6)均匀后，将冷却至室温(22摄氏度～26摄氏度)。即得本发明所述促组织粘附和生长生物粘合剂。
发明人对本发明所制备得到的促组织粘附和生长生物粘合剂采用常规方法进行检测：应用检测技术本发明所制备得到的促组织粘附和生长生物粘合剂，性状呈胶冻状物质样；含水量为40％～80％(对促组织粘附和生长生物粘合剂进行干燥后对比前后重量)；pH值为6.8～7.6(应用pH值检测仪或检测条对促组织粘附和生长生物粘合剂进行pH值检测)。
检测本发明所制备得到的促组织粘附和生长生物粘合剂有效期：将促组织粘附和生长生物粘合剂于4摄氏度条件下保存1年后，仍可将保存后的促组织粘附和生长生物粘合剂用于组织、原代细胞、细胞系的培养和生长。结果发现该促组织粘附和生长生物粘合剂的有效期可达1年。
在本发明的第三方面，本发明提出了前面所述促组织粘附和生长生物粘合剂在体外培养种属组织的用途。根据本发明的实施例，所述种属组织和细胞的来源为人、小鼠、大鼠、兔、猪、牛、羊。
根据本发明的实施例，所述种属组织为选自人肺组织、大鼠肺组织、小鼠肺组织、大兔肺组织、大鼠平滑肌组织、小鼠肝组织和大兔肾组织中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述种属原代细胞为选自人组织源性血管内皮细胞、人组织源性上皮细胞、小鼠组织源性肺上皮细胞、大鼠组织源性肝细胞和大兔组织源性平滑肌细胞中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述种属细胞系为选自人肺癌细胞A549、人肝癌细胞HepG2、人结直肠癌细胞HT-29、人巨噬细胞RAW264.7中的至少一种。
在本发明的第四方面，本发明提出了前面所述促组织粘附和生长生物粘合剂在促组织粘附和生长试剂盒中的用途。该促组织粘附和生长的试剂盒包含本发明所述的促组织粘附和生长生物粘合剂。
根据本发明实施例的促组织粘附和生长生物粘合剂，可以实现下列优点至少之一：
(1)该促组织粘附和生长生物粘合剂具有通透性、富含水性、含有组织和细胞生长的必须基础的营养物质和因子，具有组织和细胞培养生长添加剂的作用，其保质有效期长，在4摄氏度条件下可保存1年；
(2)该促组织粘附和生长生物粘合剂对培养的组织和细胞无任何刺激性、无毒性作用、有利于组织和细胞培养的相容性，对培养的组织和细胞有促进生长作用；
(3)该促组织粘附和生长生物粘合剂具有通透性，允许水份和物质可以进行自由交换；易于药物或小分子物质或大分子物质等自由的通过促组织粘附和生长生物粘合剂而进入培养组织和细胞中，有利于培养组织和细胞多方位的接触药物或小分子物质或大分子物质等；
(4)该促组织粘附和生长生物粘合剂具有富含水性，含有水相界面的载体，不易损伤培养的组织和细胞；
(5)该促组织粘附和生长生物粘合剂双面的水份和物质可以进行自由交换，便于培养液经过促组织粘附和生长生物粘合剂而进入培养组织和细胞中，避免在细胞培养器皿或方瓶上与相其接触的组织面和细胞面在接受培养液的程度，同与培养器皿或方瓶非接触的组织面和细胞面构成差异。
(6)该促组织粘附和生长生物粘合剂可以提升组织和细胞粘附功能，促进组织和细胞培养，加快细胞生长，防止细胞死亡或凋亡，也防止细胞的融合或吞噬，提高组织和细胞培养和生长的成功率；
(7)该促组织粘附和生长生物粘合剂可以稳定所培养组织和细胞的增殖和分化过程，稳定组织中细胞群体的非整倍体染色体组成，从而保持前一代培养组织中的细胞特性与传代后下一代培养细胞的特性一致。
(8)该促组织粘附和生长生物粘合剂可保持培养组织和细胞的生物学体系，稳定培养组织和细胞的生长状态，适于应用在药物筛选、药物疗效评价、药物适应症评估、药物毒性和副作用评价、药物配伍等的检测和分析中；
(9)该促组织粘附和生长生物粘合剂可以防止组织中细胞长期多代培养传代后，造成其对与原生环境完全不同的塑料培养皿或培养方瓶环境的适应从而使基因组成和行为发生改变；同时也可以防止组织中细胞长期多代培养传代后而造成细胞分子生物学和分子遗传学的改变。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。另外，如果没有明确说明，在下面的实施例中所采用的所有试剂均为市场上可以购得的，或者可以按照文本或已知的方法合成的，对于没有列出的反应条件，也均为本领域技术人员容易获得的。
生物材料来源：组织和细胞培养所用的培养皿、培养方瓶、常用实验用耗材购于Corning公司；组织和细胞培养液购于Invitrogen公司；组织、原代细胞、细胞系分别购于Invitrogen公司、ScieCells公司、中国科学院细胞保藏中心。
实验动物来源于湖北省疾病预防控制中心。
实施例1、40％含水量的促组织粘附和生长生物粘合剂的制备
(1)取双蒸水100ml质量倒入500ml的反应容器中，将反应容器放在机械搅拌器上保持至30摄氏度；
(2)组织粘附物：依次缓慢加入1质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白(质量比1：1)，1质量份的明胶和基质胶(质量比为1：1)，1质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素(质量比1：1：1)、1～5质量份的藻酸盐、1质量份的聚乙二醇、1质量份的细胞基质到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速100r/min,搅拌时间30min；
(3)组织生长添加物：缓慢依次加入质量百分比为1％的组织生长添加物，进行机械搅拌，搅拌转速100r/min,拌时间30min；
(4)组织垂体抽取物：缓慢加入1质量份的组织垂体抽取物到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速100r/min,搅拌时间30min；
(5)通透剂：缓慢加入1质量份碳酸氢铵到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速100r/min,搅拌时间30min；
(6)均匀后，冷却至20摄氏度。即得促组织粘附和生长生物粘合剂。
(7)对促组织粘附和生长生物粘合剂进行干燥后对比前后重量，其含水量为40％；应用pH值检测仪或检测条对促组织粘附和生长生物粘合剂进行pH值检测，其pH值为6.8。
实施例2、60％含水量的促组织粘附和生长生物粘合剂的制备
(1)取双蒸水200ml质量倒入500ml的反应容器中，将反应容器放在机械搅拌器上保持至37摄氏度；
(2)组织粘附物：依次缓慢加入8质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白(质量比1：1)，4质量份的明胶和基质胶(质量比为1：1)，4质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素(质量比1：1：1)、4质量份的藻酸盐、4质量份的聚乙二醇、2质量份的细胞基质到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速120r/min,搅拌时间20min；
(3)组织生长添加物：缓慢依次加入质量百分比为10％的组织生长添加物，进行机械搅拌，搅拌转速120r/min,搅拌时间20min；
(4)组织垂体抽取物：缓慢加入4质量份组织垂体抽取物到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速120r/min,搅拌时间20min；
(5)通透剂：缓慢加入6质量份碳酸氢铵到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速120r/min,搅拌时间20min；
(6)均匀后，冷却至25摄氏度。即得促组织粘附和生长生物粘合剂。
(7)对促组织粘附和生长生物粘合剂进行干燥后对比前后重量，其含水量为60％；应用pH值检测仪或检测条对促组织粘附和生长生物粘合剂进行pH值检测，其pH值为7.2。
实施例3、80％含水量的促组织粘附和生长生物粘合剂的制备
(1)取双蒸水300ml质量倒入500ml的反应容器中，将反应容器放在机械搅拌器上保持至55摄氏度；
(2)组织粘附物：依次缓慢加入20质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白(质量比1：1)，10质量份的明胶和基质胶(质量比为1：1)，10质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素(质量比1：1：1)、10质量份的藻酸盐、10质量份的聚乙二醇、10质量份的细胞基质到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速150r/min,搅拌时间10min；
(3)组织生长添加物：缓慢依次加入质量百分比为20％的组织生长添加物，进行机械搅拌，搅拌转速150r/min,搅拌时间10min；
(4)组织垂体抽取物：缓慢加入8质量份组织垂体抽取物到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速150r/min,搅拌时间10min；
(5)通透剂：缓慢加入10质量份碳酸铵到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速150r/min,搅拌时间10min；
(6)均匀后，冷却至26摄氏度。即得促组织粘附和生长生物粘合剂。
(7)对促组织粘附和生长生物粘合剂进行干燥后对比前后重量，其含水量为80％；应用pH值检测仪或检测条对促组织粘附和生长生物粘合剂进行pH值检测，其pH值为7.6。
实施例4、培养组织贴壁情况
将实施例2所制得的60％含水量的促组织粘附和生长生物粘合剂放入组织细胞培养皿或方瓶底部，将组织块种植在促组织粘附和生长生物粘合剂上，加入培养液(细胞培养液成份为：1、DMEM/F12；2、添加剂：胰岛素、转铁蛋白、L-谷氨酰铵、表皮生长因子、血管生长因子；3、10％胎牛血清；4、青霉素、链霉素)进行培养。定期(第1、2、3、4、5天)观察组织块粘附和生长状态。
具体操作时，促组织粘附和生长生物粘合剂用量依据6孔板34.8mm、12孔板22.1mm、24孔板15.6mm、48孔板10.2mm、96孔板4.5mm而定，含有促组织粘附和生长生物粘合剂培养皿或方瓶放置50摄氏度～55摄氏度组织细胞培养箱中10分钟～30分钟。例如人肺组织、大鼠平滑肌组织、小鼠肝组织和大兔肾组织块，可为1×1×1mm大小(1mm3)，将组织块种植在96孔板中进行培养，加入培养液(细胞培养液成份为：1、DMEM/F12；2、添加剂：胰岛素、转铁蛋白、L-谷氨酰铵、表皮生长因子、血管生长因子；3、10％胎牛血清；4、青霉素、链霉素)进行原代细胞培养。定期(第1、3、5、7、9天)观察组织块贴壁状态，结果如表1所示。
另一方面，采用上述组织块培养方法，唯一区别在于培养皿或方瓶中没有使用促组织粘附和生长生物粘合剂，例如组织块可为1×1×1mm大小(1mm3)，将组织块种植在96孔板中进行培养，加入培养液(细胞培养液成份为：1、DMEM/F12；2、添加剂：胰岛素、转铁蛋白、L-谷氨酰铵、表皮生长因子、血管生长因子；3、10％胎牛血清；4、青霉素、链霉素)进行原代细胞培养。定期(第1、2、3、4、5天)观察组织块贴壁状态，结果如表2所示。
表1组织块贴壁情况(应用促组织粘附和生长生物粘合剂)
组织块/培养天数 1天 3天 5天 7天 9天
人肺组织 83/90 79/90 74/90 67/90 55/90
小鼠肝组织 70/90 66/90 54/90 47/90 42/90
大鼠平滑肌组织 85/90 71/90 67/90 58/90 54/90
兔肾组织 84/90 75/90 65/90 54/90 47/90
表2组织块贴壁情况(未应用促组织粘附和生长生物粘合剂)
组织块/培养天数 1天 3天 5天 7天 9天
人肺组织 90/90 88/90 86/90 83/90 81/90
小鼠肝组织 90/90 85/90 78/90 74/90 72/90
大鼠平滑肌组织 90/90 89/90 87/90 86/90 86/90
兔肾组织 90/90 88/90 86/90 84/90 84/90
结果表明：
应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养人肺组织第9天组织块贴壁率90％；未应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养人肺组织第9天组织块贴壁率61％。
应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养小鼠肝组织第9天组织块贴壁率80％；未应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养小鼠肝组织第9天组织块贴壁率47％。
应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养大鼠平滑肌组织第9天组织块贴壁率96％；未应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养大鼠平滑肌组织第9天组织块贴壁率60％。
应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养兔肾组织第9天组织块贴壁率93％；未应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养兔肾组织第9天组织块贴壁率52％。
实施例5、培养组织周围细胞生长情况
将实施例2所制得的60％含水量的促组织粘附和生长生物粘合剂放入组织细胞培养皿或方瓶底部，将组织块种植在促组织粘附和生长生物粘合剂上，加入培养液(细胞培养液成份为：1、DMEM/F12；2、添加剂：胰岛素、转铁蛋白、L-谷氨酰铵；3、10％胎牛血清；4、青霉素、链霉素)进行培养。定期(第1、2、3、4、5天)观察组织块粘附和生长状态。
具体操作时，促组织粘附和生长生物粘合剂用量依据6孔板34.8mm、12孔板22.1mm、24孔板15.6mm、48孔板10.2mm、96孔板4.5mm而定，含有促组织粘附和生长生物粘合剂培养皿或方瓶放置50摄氏度～55摄氏度组织细胞培养箱中10分钟～30分钟。例如人肺组织、大鼠平滑肌组织、小鼠肝组织和大兔肾组织，可为1×1×1mm大小(1mm3)，将组织块种植在96孔板中进行培养，加入培养液(细胞培养液成份为：1、DMEM/F12；2、添加剂：胰岛素、转铁蛋白、L-谷氨酰铵；3、10％胎牛血清；4、青霉素、链霉素)进行培养。定期(第1、2、3、4、5天)观察组织块周围细胞生长状态，结果如表3所示。
另一方面，采用上述组织块培养方法，唯一区别在于培养皿或方瓶中没有使用促组织粘附和生长生物粘合剂，例如人肺组织、大鼠平滑肌组织、小鼠肝组织和大兔肾组织，可为1×1×1mm大小(1mm3)，将组织块种植在96孔板中进行培养，加入培养液(细胞培养液成份为：1、DMEM/F12；2、添加剂：胰岛素、转铁蛋白、L-谷氨酰铵；3、10％胎牛血清；4、青霉素、链霉素)进行培养。定期(第1、2、3、4、5天)观察组织块周围细胞生长状态，结果如表4所示。
表3组织块周围细胞生长情况(应用促组织粘附和生长生物粘合剂)
细胞数/培养天数 1天 2天 3天 4天 5天
人肺组织 9 29 102 239 587
小鼠肝组织 0 12 46 132 234
大鼠平滑肌组织 4 22 92 256 485
兔肾组织 5 25 89 279 516
表4组织块周围细胞生长情况(未应用促组织粘附和生长生物粘合剂)
细胞数/培养天数 1天 2天 3天 4天 5天
人肺组织 7 31 62 152 215
小鼠肝组织 0 16 42 74 132
大鼠平滑肌组织 4 12 35 105 173
兔肾组织 0 8 25 93 182
结果表明：
应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养人肺组织第5天组织块周围细胞数是未应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养人肺组织第5天组织块周围细胞数的2.73倍。
应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养小鼠肝组织第5天组织块周围细胞数是未应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养小鼠肝组织第5天组织块周围细胞数的1.77倍。
应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养大鼠平滑肌组织第5天组织块周围细胞数是未应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养大鼠平滑肌组织第5天组织块周围细胞数的2.80倍。
应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养兔肾组织第5天组织块周围细胞数是未应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养兔肾组织第5天组织块周围细胞数的2.83倍。
应用促组织粘附和生长生物粘合剂，第5天组织块周围细胞活力(平均值)：人肺组织周围细胞活力94％；大鼠平滑肌组织周围细胞活力95％；小鼠肝组织周围细胞活力96％；大兔肾组织块周围细胞活力92％。
未应用促组织粘附和生长生物粘合剂，第5天组织块周围细胞活力(平均值)：人肺组织周围细胞活力86％；大鼠平滑肌组织周围细胞活力84％；小鼠肝组织周围细胞活力83％；大兔肾组织块周围细胞活力85％。
实施例6、培养原代细胞生长情况
将实施例2所制得的60％含水量的促组织粘附和生长生物粘合剂放入组织细胞培养皿或方瓶底部，将组织块种植在促组织粘附和生长生物粘合剂上，加入培养液(细胞培养液成份为：1、DMEM/F12；2、添加剂：胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、血管生长因子、L-谷氨酰铵；3、10％胎牛血清；4、青霉素、链霉素)进行培养。定期(第1、2、3、4、5天)观察组织块粘附和生长状态。
具体操作时，促组织粘附和生长生物粘合剂用量依据6孔板34.8mm、12孔板22.1mm、24孔板15.6mm、48孔板10.2mm、96孔板4.5mm而定，含有促组织粘附和生长生物粘合剂培养皿或方瓶放置50摄氏度～55摄氏度组织细胞培养箱中10分钟～30分钟。人组织源性原代血管内皮细胞、小鼠组织源性原代肺上皮细胞、大鼠组织源性原代肝细胞和大兔组织源性原代平滑肌细胞在96孔板中进行培养，加入培养液(细胞培养液成份为：1、DMEM/F12；2、添加剂：胰岛素、转铁蛋白、L-谷氨酰铵；3、10％胎牛血清；4、青霉素、链霉素)进行培养。定期(第1、2、3、4、5天)观察组织块周围细胞生长状态，结果如表5所示。
另一方面，采用上述组织块培养方法，唯一区别在于培养皿或方瓶中没有使用促组织粘附和生长生物粘合剂，人组织源性原代血管内皮细胞、小鼠组织源性原代肺上皮细胞、大鼠组织源性原代肝细胞和大兔组织源性原代平滑肌细胞在96孔板中进行培养，加入培养液(细胞培养液成份为：1、DMEM/F12；2、添加剂：胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、血管生长因子、L-谷氨酰铵；3、10％胎牛血清；4、青霉素、链霉素)进行培养。定期(第1、2、3、4、5天)观察组织块周围细胞生长状态，结果如表6所示。
表5原代细胞生长情况(×103)(应用促组织粘附和生长生物粘合剂)
表6原代细胞生长情况(×103)(未应用促组织粘附和生长生物粘合剂)
结果表明：
应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养人血管内皮细胞第5天组织块周围细胞数是未应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养人血管内皮细胞第5天组织块周围细胞数的2倍。
应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养小鼠肺上皮细胞第5天组织块周围细胞数是未应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养小鼠肺上皮细胞第5天组织块周围细胞数的1.57倍。
应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养大鼠肝细胞第5天组织块周围细胞数是未应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养大鼠肝细胞第5天组织块周围细胞数的1.8倍。
应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养兔平滑肌细胞第5天组织块周围细胞数是未应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养兔平滑肌细胞第5天组织块周围细胞数的1.43倍。
应用促组织粘附和生长生物粘合剂，第5天组织块周围细胞活力(平均值)：人血管内皮细胞活力96％；小鼠肺上皮细胞活力93％；大鼠肝细胞活力95％；兔平滑肌细胞活力94％。
未应用促组织粘附和生长生物粘合剂，第5天组织块周围细胞活力(平均值)：人血管内皮细胞活力89％；小鼠肺上皮细胞活力88％；大鼠肝细胞活力86％；兔平滑肌细胞活力82％。
实施例7、培养细胞系生长情况
将实施例2所制得的60％含水量的促组织粘附和生长生物粘合剂放入组织细胞培养皿或方瓶底部，将组织块种植在促组织粘附和生长生物粘合剂上，加入培养液(细胞培养液成份为：1、DMEM；2、10％胎牛血清；3、青霉素、链霉素)进行培养。定期(第1、3、5天)观察组织块粘附和生长状态。
具体操作时，促组织粘附和生长生物粘合剂用量依据6孔板34.8mm、12孔板22.1mm、24孔板15.6mm、48孔板10.2mm、96孔板4.5mm而定，含有促组织粘附和生长生物粘合剂培养皿或方瓶放置50摄氏度～55摄氏度组织细胞培养箱中10分钟～30分钟。A549、HT-29、HepG2、RAW264.7细胞系在96孔板中进行培养，加入培养液(细胞培养液成份为：1、DMEM；2、10％胎牛血清；3、青霉素、链霉素)进行培养。定期(第1、3、5天)观察组织块周围细胞生长状态，结果如表7所示。
另一方面，采用上述组织块培养方法，唯一区别在于培养皿或方瓶中没有使用促组织粘附和生长生物粘合剂，A549、HT-29、HepG2、RAW264.7细胞系在96孔板中进行培养，加入培养液(细胞培养液成份为：1、DMEM/F12；2、添加剂：胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、血管生长因子、L-谷氨酰铵；3、10％胎牛血清；4、青霉素、链霉素)进行培养。定期(第1、2、3、4、5天)观察组织块周围细胞生长状态，结果如表8所示。
表7细胞系生长情况(×103)(应用促组织粘附和生长生物粘合剂)
表8细胞系生长情况(×103)(未应用促组织粘附和生长生物粘合剂)
结果表明：
应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养A549细胞第3天组织块周围细胞数是未应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养A549细胞第3天组织块周围细胞数的1.75倍。
应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养HT-29细胞第3天组织块周围细胞数是未应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养HT-29细胞第3天组织块周围细胞数的1.39倍。
应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养HepG2细胞第3天组织块周围细胞数是未应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养HepG2细胞第3天组织块周围细胞数的2.14倍。
应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养RAW264.7细胞第3天组织块周围细胞数是未应用促组织粘附和生长生物粘合剂培养RAW264.7细胞第3天组织块周围细胞数的2.15倍。
应用促组织粘附和生长生物粘合剂，第5天组织块周围细胞活力(平均值)：A549细胞活力97％；HT-29细胞活力96％；HepG2细胞活力98％；RAW264.7细胞活力95％。
未应用促组织粘附和生长生物粘合剂，第5天组织块周围细胞活力(平均值)：A549细胞活力91％；HT-29细胞活力90％；HepG2活力细胞88％；RAW264.7细胞活力89％。
同理，应用本发明的实施例1及实施例3得到的促组织粘附和生长生物粘合剂，应用于实施例4-实施例7的实验中，也起到了本发明相同的技术效果。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种促组织粘附和生长生物粘合剂，其特征在于，包括组织粘附物、组织生长添加物、组织垂体抽取物、通透剂。
2.根据权利要求1所述的促组织粘附和生长生物粘合剂，其特征在于，所述组织粘附物包括1～20质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白，1～10质量份的明胶和基质胶，1～10质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素，1～10质量份的藻酸盐，1～10质量份的聚乙二醇，1～10质量份的细胞基质；
任选的，所述组织粘附物包括8质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白，4质量份的明胶和基质胶，4质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素，4质量份的藻酸盐，4质量份的聚乙二醇，2质量份的细胞基质；
任选的，所述组织粘附物包括包括1质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白，1质量份的明胶和基质胶，1质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素，1质量份的藻酸盐，1质量份的聚乙二醇，1质量份的细胞基质；
任选的，所述组织粘附物包括20质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白，10质量份的明胶和基质胶，10质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素，10质量份的藻酸盐，10质量份的聚乙二醇，10质量份的细胞基质；
任选的，所述胶原蛋白与所述蚕丝蛋白的质量比为1：1；
任选的，所述明胶与所述基质胶的质量比为1：1；
任选的，所述壳聚糖、所述透明质酸与所述硫酸软骨素的质量比为1：1：1。
3.根据权利要求1所述的促组织粘附生物粘合剂，其特征在于，所述组织生长添加物为选自组织血管内皮细胞提取物、组织上皮细胞提取物的至少一种，
任选的，所述组织血管内皮细胞提取物为选自人、小鼠、大鼠、兔、猪、牛、羊的血管内皮细胞提取物中的至少一种；
任选的，所述组织血管内皮细胞提取物的添加量为促组织粘附生物粘合剂总量的1质量％～20质量％，优选为10质量％；
任选的，所述组织上皮细胞提取物为选自人、小鼠、大鼠、兔、猪、牛、羊的细胞提取物中的至少一种；
任选的，所述组织上皮细胞提取物的添加量为促组织粘附和生长生物粘合剂总量的1质量％～20质量％，优选为10质量％。
4.根据权利要求1所述的促组织粘附和生长生物粘合剂，其特征在于，所述组织垂体抽取物为1～8质量份，优选为4质量份；
任选的，所述组织垂体抽取物为选自人、小鼠、大鼠、兔、猪、牛、羊的组织垂体抽取物中的至少一种；
任选的，所述组织垂体抽取物为促组织粘附和生长生物粘合剂总量的1质量％～10质量％，优选为4质量％。
5.根据权利要求1所述的促组织粘附和生长生物粘合剂，其特征在于，所述通透剂为1～10质量份，优选为6质量份；
任选的，所述通透剂为选自碳酸氢铵和碳酸铵中的至少一种。
6.一种制备权利要求1～5任一项所述的促组织粘附和生长生物粘合剂的方法，其特征在于，包括：
将所述组织粘附物、组织生长添加物、组织垂体抽取物、通透剂在水环境或常规细胞基础培养基下相接触；
任选的，所述的水环境为双蒸水；
任选的，所述的常规细胞基础培养基为选自DMEM、MEM、RPMI1640、DMEM/F12培养基中的一种。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法进一步包括：
(1)在反应器中，将所述组织粘附物加入双蒸水中，机械搅拌均匀；
(2)加入所述组织生长添加物，机械搅拌均匀；
(3)加入所述组织垂体抽取物，机械搅拌均匀；
(4)加入所述通透剂，机械搅拌均匀；
(5)冷却，即得。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)～(4)的加入过程均是缓慢加入；
任选的，所述步骤(1)～(4)的搅拌过程中，搅拌转速均为100r～150r/min，所述搅拌的时间均为10min～30min；
任选的，所述步骤(1)在加入所述组织粘附物之前，先将双蒸水保持至30摄氏度～55摄氏度，优选为37摄氏度；
任选的，所述步骤(5)冷却至室温，优选为20摄氏度～26摄氏度。
9.权利要求1～5任一项所述的促组织粘附和生长生物粘合剂在体外培养种属组织中的用途；
任选的，所述种属组织为选自人肺组织、大鼠肺组织、小鼠肺组织、大兔肺组织、大鼠平滑肌组织、小鼠肝组织和大兔肾组织中的至少一种；
任选的，所述种属细胞系为选自人肺癌细胞A549、人肝癌细胞HepG2、人结直肠癌细胞HT-29、人巨噬细胞RAW264.7中的至少一种。
10.一种促组织粘附和生长试剂盒，其特征在于包含权利要求1～9任一项所述的促组织粘附和生长生物粘合剂。
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