KR20090075503A

KR20090075503A - 생분해성 다공성 하이브리드 담체의 제조방법 및 이를이용하여 제조된 인공장기

Info

Publication number: KR20090075503A
Application number: KR1020080001380A
Authority: KR
Inventors: 강길선; 고연경; 김순희; 임지예
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2008-01-04
Filing date: 2008-01-04
Publication date: 2009-07-08

Abstract

본 발명은 히알루론산을 함유한 생분해성 다공성 하이브리드 담체의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 인공장기에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 히알루론산 수용액 및 생분해성 고분자 용액를 함유한 유기용매를 혼합한 후, 유화동결건조하여 생분해성 다공성 하이브리드 담체를 제조하는 방법과 이를 이용하여 제조된 인공장기에 관한 것이다. 생체 및 조직적합성과 친수성이 뛰어난 히알루론산을 함유한 생분해성 다공성 하이브리드 담체는 세포가 부착 및 증식할 수 있는 환경을 제공하고, 세포의 성장이 완결된 후에는 자연적으로 생분해되어 인공장기 조직의 재생에 유용한 효과가 있다.

히알루론산, 생분해성 다공성 하이브리드 담체, 유화동결건조법, 인공장기

Description

생분해성 다공성 하이브리드 담체의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 인공장기{A　method for manufacturing biodegradable porous hybrid scaffolds and artificial organ}

본 발명은 생체조직적합성과 친수성이 뛰어난 히알루론산 수용액, 생분해성 고분자를 함유한 유기용매를 혼합하여 유화동결건조함으로써, 세포가 부착 및 증식할 수 있는 환경을 제공하고, 세포가 성장을 완결한 후에는 자연적으로 생분해됨으로써 인공장기 조직의 재생에 유용한 효과가 있고, 제조방법이 간단한 효과가 있는 히알루론산을 함유한 생분해성 다공성 하이브리드 담체의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 인공장기에 관한 것이다.

조직공학(Tissue Engineering)은 생명과학과 공학의 개념이 합쳐져서 탄생한 새로운 첨단 학문 분야로서, 생체조직 및 장기를 체외에서 생산하고 이를 체내에 이식함으로써 인체의 기능을 유지, 향상 또는 복원하는 것을 그 목적으로 하고 있다. 기본적인 조직공학 기법을 요약해 보면, 먼저 환자의 몸에서 필요한 조직 을 약간 채취하고 그 조직편으로부터 세포를 분리한 다음 분리된 세포를 배양을 통하여 필요한 양만큼 증식시키고 다공성 생분해성 고분자 담체에 심어 일정기간 체외에서 배양한 뒤, 이 세포/고분자 구조물을 다시 인체 내에 이식하는 것이다. 이식 후 세포들은 신생 혈관이 형성될 때 까지는 체액의 확산에 의해 산소와 영양분을 공급받다가 인체내에서 혈관이 자라 들어와 혈액의 공급이 이루어지면 세포들이 증식 및 분화하여 새로운 조직 및 장기를 형성하고 고분자 담체는 분해되어 없어지게 된다.

따라서 조직공학의 연구는 우선 생체조직과 유사한 생분해성 고분자 기질 또는 담체를 인공적으로 제조하는 일에서부터 시작된다. 인체 조직의 재생을 위해 사용되는 기질 또는 담체 재료의 주 요건은 조직세포의 유착과 증식이 잘 되어야 하며 분화된 세포의 기능이 보전되어야 하며, 또한 체내에 이식된 후에도 주위 조직과 융화가 잘 되어야 하며, 염증 반응이 없고, 일정 기간이 지난 후 스스로 분해하여 이물질로 남지 않아야 한다.

조직공학적 인공장기에 사용되는 생체재료는 재료의 특성에 따라서 다양하게 분류될 수 있으며 재료 원료의 생성에 따라 천연에서 존재하는 물질인 천연재료와 인간이 합성하여 만든 합성재료로 나눌 수 있다. 또한 생체내에서 물이나 효소들에 의한 분해 여부에 따라서 비분해성 재료와 생분해성 재료로 나눌 수 있다. 특히, 합성고분자 재료로는 폴리에스테르 계열의 폴리락트산(poly(lactic acid), PLA), 폴리글리콜산(poly (glycolic acid), PGA), 폴리락트산-글리콜산 공중합체(poly(lactide-co-glycolide), PLGA), 폴리하이드록시뷰티릭 산(poly(hydroxybutyric acid), PHB), 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리안하이드라이드(polyanhydride, PA), 폴리시아노아크릴레이트(polycianoacrylate, PCA), 폴리다이옥사논(polydioxanon) 및 폴리포스파젠(polyphosphazen)등의 상기의 재료는 우수한 생분해성 및 생흡수성의 특성으로 인해 인공장기를 위한 담체의 재료로 널리 사용되고 있다. 상기의 합성고분자는 천연고분자에 비하여 물성이 우수하고 분해기간의 조절이 가능한 장점을 가지고 있으나 체내에서 면역반응이 야기되고, 소수성의 표면으로 인해 세포의 부착이 어려운 단점을 가진다. 또한, 천연고분자로는 전분(starch), 덱스트린(dextrin), 헤파린(heparin), 피브린(fibrin), 키틴(chitin), 키토산(chitosan), 알긴산(alginic acid), 구연산(citric acid), 콘드로이틴(chondroitin), 케라틴 설페이트(keratin sulfate), 아가로오스(agarose) 및 젤라틴(gelatin)등의 재료가 널리 사용되고 있으며 이는 세포의 부착을 돕고 독성이 적은 장점이 있으나 기계적 강도가 약하고 분해속도의 조절이 어려운 단점이 있다. 한편, 상기 합성재료와 천연재료가 갖는 단점들을 상호보완하기 위하여 이들을 하이브리드화 하려는 시도가 꾸준히 지속되고 있으며, 다양한 방법을 통해 연구가 진행되고 있다.

상기의 고분자 재료를 사용하여 담체를 제조하는 방법에는 용매/입자추출법(solvent casting/particulate leaching), 용매증발법(solvent evaporation), 방사(spinning), 기체팽창법(gas expansion), 상분리법(phase separation) 및 유화동결건조법(emulsion freeze-drying method) 등이 있으며 특히 앞서 언급한 유화동결건조법은 담체 내부의 기공 및 전체기공도를 조절할 수 있으며 별도의 세척과정이 필요하지 않기 때문에 수용성의 재료, 약물 및 생리활성물질 등을 손실없이 담지시킬수 있는 장점이 있다.

따라서 본 발명자들은 유화동결건조법에 의하여 생분해성 고분자 용액과 물을 사용해 다공성 생분해성 인공장기 및 이의 제조방법을 제안한 바 있었다[대한민국특허 제201,874호]. 그러나 대한민국특허 제201,874호에 따른 제조방법의 경우에는 사용된 합성 생분해성 고분자의 표면성질이 소수성이기 때문에 생분해성 고분자 담체에 배양액과 세포들이 스며들지 않고 세포가 성장하지 않는 단점이 있었다.

또한 본 발명의 발명자들은 물과 유기용매로 이루어진 유화용액에 생분해성 고분자와 생리활성물질을 첨가하여 혼합한 후, 유화동결건조법으로 제조함으로써 제조된 다공성 생분해성 인공장기 및 이의 제조방법을 제안한 바 있었다[대한민국특허 제358,080호]. 그러나 대한민국특허등록 제358,080호에 따른 제조방법의해 제조된 담체의 경우 천연유래 재료를 포함하지 않기 때문에 파종된 세포의 생존, 부착 및 증식에 있어 불리한 측면이 있으며, 또한 생착한 세포로부터 합성되는 조직이 지지체에 축적되고 주위 조직과 융합(integration)이 상대적으로 용이하지 않은 부분이 있다. 따라서 이러한 세포 및 생체 조직적합성의 향상을 위해 천연유래 재료를 합성 고분자에 추가적으로 적용하여 이를 개선할 필요가 있었다.

본 발명은 세포가 부착 및 증식할 수 있는 환경을 제공하고, 수분함유능력을 증진시키며, 세포의 성장을 촉진시키는 생분해성 다공성 하이브리드 담체의 제조방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 히알루론산과 생리활성물질의 손실이 없고, 생리활성물질들이 포함될 경우, 이들이 변성하지 않는 생분해성 다공성 하이브리드 담체의 제조방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 생체 적합성이 우수하고, 세포조직의 재생에 유용한 인공장기를 제공하는 데 그 목적에 있다.

본 발명은 조직공학용 생분해성 다공성 하이브리드 담체를 제조하는 방법에 있어서, 생분해성 고분자를 함유한 유기용매 50 ~ 90 부피%에 생체적합성과 생활성을 제공하기 위한 용도로써 히알루론산 수용액 10 ~ 50 부피%를 첨가하여 제조된 혼합용액을 몰드(mold)에 투입하여 유화동결건조하는 것을 특징으로 하는 생분해성 다공성 하이브리드 담체의 제조방법을 제공한다.

또한, 상기 제조방법에 의한 생분해성 다공성 담체를 이용하여 제조된 것을 특징으로 하는 인공장기를 제공한다.

본 발명에 따른 히알루론산을 함유한 생분해성 다공성 하이브리드 담체의 제조방법은 담체의 생체 적합성을 우수하게 하고, 세포의 부착과 세포외기질의 발현이 우수한 생분해성 다공성 하이브리드 담체를 제공하고, 제조 과정 중에 히알루론산 또는 생리활성물질의 손실이 없고, 제조방법이 간단하여 경제적인 효과가 있다.

또한, 상기 방법으로 제조된 히알루론산을 함유한 생분해성 다공성 담체는 산소, 이산화탄소 및 영양인자 등과 같은 물질의 전달이 효과적으로 이루어져 더 나은 세포의 성장과 증식의 제공에 효과적이다.

또한, 세포의 성장이 완결된 후에는 자연적으로 물이나 효소에 의해 분해 또는 흡수되므로 체내에 잔존하지 않는 효과가 있고, 또한, 상기 분해속도를 손쉽게 조절할 수 있는 효과가 있다.

본 발명은 기존의 조직공학용 담체로서 사용되어 온 생분해성 합성고분자 담체를 대신하여 천연재료를 복합화함으로써 월등한 표면 적심성(wettability)을 가져 세포의 파종에 매우 유리한 조건을 갖게 되고, 세포의 점착이나 성장이 보다 우수하며, 싸이토카인류와 같은 생리활성물질을 더 포함하는 경우에는 이들의 서방화로 인한 조직재생이 보다 우수해지는 등의 개선된 효과가 있는 생분해성 다공성 하이브리드 담체의 제조방법과 이를 이용하여 제조된 인공장기에 관한 것이다.

본 발명의 발명자들은 대한민국특허등록 제358,080호에서 물과 유기용매로 이루어진 유화용액에 생분해성 고분자와 생리활성물질을 첨가하여 혼합한 후, 유화동결건조함으로써 제조된 다공성 생분해성 인공장기 및 이의 제조방법을 제안한 바 있었다. 그러나 본 발명에서는 생분해성 고분자를 유기용매에 혼합한 후, 히알루론산 수용액과 혼합하여 담체를 제조한 것으로써 상기 등록된 발명과는 다르게 담체에 천연유래 재료를 첨가하여 생체적합성의 특성을 증진시키고 친수성을 부여하고자한 데에 기술적인 특징이 있다. 또한, 본 발명에서는 담체가 가지는 친수성 및 생체적합성을 개선한 인공장기를 제조하기 위하여 생분해성 고분자 중에서도 히알루론산을 선택 사용한 담체의 제조 방법에 그 특징이 있다.

종래의 제조방법을 통해 히알루론산을 함유한 담체를 제조하게 되면 대부분의 히알루론산은 담체에 포함되지 않고 쉽게 손실이 되는 단점이 있으나, 세척과정이 없고 상대적으로 저온에서 수행하는 유화동결건조법을 사용함으로써 히알루론산의 손실없이 담체를 제조할 수 있는 효과를 얻을 수 있고, 제조된 담체는 생활성, 친수성 및 생체적합성의 효과를 얻을 수 있으며, 이러한 담체를 이용한 인공장기를 사용함으로써, 제조된 인공장기와 세포사이의 상호관계에서의 세포 및 조직 적합성이 월등하여 조직에 재생에 유리한 효과를 얻을 수 있으며, 히알루론산을 사용함으로써 세포의 부착과 증식 및 세포의 분화와 이동에도 유리한 효과를 꾀할 수 있다.

이로써 상기 대한민국특허등록 제358,080호의 제조방법과는 기술 구성 및 효과상의 차이가 있는 것이다. 따라서 통상의 당업자 판단하였을 때, 본 발명은 상기 발명과 완전히 다른 발명임이 자명하다.

또한, 생분해성 고분자로서, 히알루론산을 단독으로 사용하여 담체를 제조하 는 경우에는 여타의 화학물질이 첨가되지 않아 세포 및 조직에 미치는 독성이 낮고, 세포의 증식 및 분화를 유도하는 등의 장점이 있었으나, 상기 단독으로 쓰인 히알루론산 담체는 역학적 물성이 매우 약하여 in vitro 실험에서 3일 이내에 분해가 되는 등 세포로부터 필요한 세포외 기질이 발현되기에 충분한 시간적 여유를 제공하지 못하는 문제점이 있었다. 그러나, 본 발명의 합성고분자/히알루론산 담체는 합성재료와 천연유래 재료의 특성을 동시에 갖으며, 생분해기간을 충분히 연장하는 효과가 있어 세포 및 조직의 성장이 가능한 충분한 기간을 제공하는 등의 생분해기간을 충분히 더 연장시킬 수 있는 효과가 있다.

본 발명에 따른 제조방법에서는 상기한 히알루론산을 필수성분으로 함유하고 있는바, 히알루론산은 1934년, K. Meyer에 의해 소의 눈의 유리체로부터 분리된 생체재료(다당)로서, 세포외 매트릭스의 주성분으로 잘 알려져 있다. 히알루론산은 D-글루쿠론산과 N-아세틸글루코사민이 β(1→3) 글리코시드 결합에 의해 연결된 2 당 단위로 이루어지는 글루코사미드글리칸의 일종으로써, 기존의 전분, 덱스트린, 헤파린, 피브린, 키틴, 키토산, 알긴산, 구연산, 콘드로이틴, 케라틴 설페이트, 아가로오스 및 젤라틴 등의 천연유래 재료가 가지는 생체적합성 및 생분해성의 특징을 갖는다. 특히, 친수성이 강한 히알루론산은 많은 양의 물을 포함할 수 있고, 세포 사이의 간격을 메워주는 기질 역할을 수행하며, 조직이 역학적 힘에 견딜 수 있게 한다. 상기 히알루론산으로 인해 조직은 겔과 같은 수용액상의 특성을 갖게 되고 이는 여러 가지 분자들의 이동을 조절하는 체(molecular sieve)의 역할을 수행하게 된다. 또한 히알루론산은 세포 외에 존재하는 효소, 성장인 자, 및 싸이토카인류와 같은 생물인자들과 쉽게 결합하여 이들의 분포와 활성도를 조절하는 역할을 수행하기 때문에 본 발명에서는 히알루론산을 생분해성 고분자로서가 아니라, 친수성과 생활성에 기여하는 표면 개질제로 사용한 것이 특징이다.

이러한 히알루론산은 추가적으로 그 화학적, 물리적 구조에 종간의 차이가 없고, 인간도 대사계를 가지고 있으므로 면역성, 독성의 측면에서 매우 안전한 생체재료(Biomaterials) 이다. 예를 들어, 히알루론산은 관절액의 주성분의 하나로서, 그 점탄성 효과 또는 염증 억제 효과에 의해 관절의 진통 효과를 발휘한다. 실제로, 히알루론산을 주성분으로 한 약물이 변형성 관절증, 만성 관절 류머티즘 등의 관절증 치료약으로 이미 시판되어 사용되고 있다(예를 들어, 스베닐 (상품명): 제조판매 중외제약주식회사). 이렇게 의학적으로 유리한 히알루론산을 생분해성 다공성 하이브리드 담체에 친수성 및 생활성 부여의 용도로 적용시킴으로써, 이 후, 인공장기에 생체적합성을 증진시키는 특성을 부여할 수 있게 되는 것이다.

이상과 같이, 본 발명은 안전성, 생분해성, 체내 안정성 모두가 우수한 상기 히알루론산을 생분해성 담체의 표면에 친수성 부여하기 위한 첨가제의 역할로 포함시킨 생분해성 다공성 하이브리드 담체의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 인공장기를 제공한다. 본 발명에 따른 인공장기는 일정크기 분포의 다공도를 가지고 있는 스폰지 형태의 생분해성 고분자로 이루어진 것으로, 인체 내에 이식되어 배양액과 세포들이 생분해성 담체에로 쉽게 스며들어 조직세포의 성장 및 회복이 가능하고, 일정기간이 경과하면 가수분해에 의하여 서서히 생분해되면서 인체에 흡 수된다. 따라서 인체에 축적될 우려가 전혀 없으며, 인공장기 중에 포함된 생리활성물질들이 변성된다거나 또는 제조과정 중에 물 및 여타 용매가 흘러나올 염려가 전혀 없는 장점이 있다. 또한 생리활성물질을 추가적으로 첨가한 경우에는 원하는 기간동안 이를 서서히 방출시키는 즉, 서방화할 수 있는 기능이 부여되어 있어 세포성장속도가 일정하게 유지되는 우수성을 가지고 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서 사용하는 생분해성 고분자는 세포의 부착과 성장에 적합한 다공을 갖고, 세포의 이주 및 세포외 기질의 발현에 도움을 주며, 일정기간이 경과하면 생체내에서 자연적으로 분해, 흡수되어 인체에 축적될 우려가 전혀 없는 특성을 갖는 것이다[R. Langer, J. P. Vacanti, Science, 260, 920, 1993]. 상기와 같은 특성을 가진 생분해성 합성 고분자는 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(poly (PGA), 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA), 폴리하이드록시뷰티릭산(PHB), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리안하이드라이드(PA), 폴리시아노아크릴레이트(PCA), 폴리다이옥사논(polydioxanon) 및 폴리포스파젠(polyphosphazen) 중에서 선택된 1종 이상의 것을 사용할 수 있다.

또한 상기의 생분해성 다공성 지지체 제조를 위하여 생분해성 합성 고분자 이외에도 생분해성 천연 고분자를 추가로 적용할 수 있다. 이러한 천연 고분자로는 생체 친화성이 우수하고, 당분야에서 일반적으로 사용되는 것으로 특별히 한정하지는 않으나, 구체적으로 알지네이트, 히알루론산, 키토산, 키틴, 콜라겐, 라미닌, 헤파린, 피브린, 콘드로이친 설페이트, 아가로오스 및 젤라틴 중에서 선택된 1종 이상의 것을 사용하는 것이 좋다. 이들 생분해성 고분자는 가수분해 및 인체내의 여러 효소에 의해 일정기간이 경과하면 자연 생분해되는 것으로 밝혀져 있다[Langer. R Vancanti J. P., Science 260, 920, 1993; X.S. Wu, En encyclopedic Handbook of Biomaterials and Bioengineering, pp 1015, Marcel Dekker, NY, 1995].

상기의 천연유래 재료 중 하나인 히알루론산은 글루코스아미노글라이칸(GAG)이라는 다당류의 일종으로 여타의 재료와 비교하였을 경우 단백질과 화학적 결합을 이루는 것이 아니기 때문에 분리가 쉬워 손쉽게 사용할 수 있는 장점이 있다. 또한, 이 긴 선형 다당류 사슬은 곁사슬이 없고, 상당한 강성도(stiffness)를 가지고 있으며 랜덤코일을 형성하기 때문에 흡수율과 밀접한 관계가 있다. 이러한 다량의 수분을 함유하는 특징은 히알루론산의 가장 중요한 특성 중 하나이며 히알루론산보다 더 큰 수분 흡수율을 가진 고분자는 알려지지 않고 있다.

일정농도의 히알루론산은 점탄성과, 유사가소성(pseudoplasticity)을 갖는 바, 이것 또한 히알루론산만이 가지고 있는 특징이다. 예를 들면 같은 GAG 종류인 헤파린, 콘드로이친 설페이트, 케라틴 설페이트 등은 점성을 가진 용액으로 만들 수 있으나 점성용액을 제조하기 위해서는 상당히 높은 농도가 요구된다. 하지만 원하는 수준의 탄성은 고농도에서는 불가능하기 때문에, 상기 예시한 물질을 점탄성과 유사가소성을 가진 용액으로 제조할 수는 없다. 따라서 케라틴 설페이트, 헤파린, 콘드로이친 설페이트 등의 여타 GAG와 비교하였을 경우, 히알루론산은 우수한 점탄성과 유사가소성을 가져, 생역학적인 환경을 제공하기 때문에, 주 어지는 압력 및 하중을 견딜 수 있게 하고, 세포가 생장하는데 필요한 물질들의 이입을 도우며 세포의 성장을 돕는 구조적 기능을 제공한다. 따라서, 본 발명에서는 용질의 수송, 세포의 이주와 기능 및 분화 등의 역할을 충분히 담당할 수 있게 함으로써, 여타 천연유래 재료가 제공하기 어려운 환경을 제공하는 히알루론산을 반드시 포함하는 조직공학적 담체를 제공하게 된 것이다 [Young Soo Soh, Polymer(korea), 12, 484, 1988; E. A. Balazs and P. Band, Cosmetics & Toiletries, 99, 1984].

상기 생분해성 고분자 용액을 효과적으로 유화동결건조하기 위해서는 유기용매를 사용하는 것이 화학적 안정성의 측면에서 바람직하다. 이러한 유기 용매로는 일반적으로 사용되는 것으로 특별히 한정하지는 않으나, 구체적으로 아세토니트릴, 디클로로메탄, 클로로포름, 테트라하이드로퓨란 및 디옥산 중에서 선택된 1종 이상의 것을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 인체조직세포의 성장, 혈관성장, 감염방지 등의 여러 가지 신기능성을 부여할 목적으로 수용액 및 히알루론산 수용액에 생리활성물질인 사이토카인류를 추가적으로 사용할 수 있다.

본 발명에서는 다공성의 인공장기용 담체를 제조하기 위하여 생분해성 고분자 물질과 수용성 용액을 유화시키는 것이 필요한 바, 상기 유화를 위한 유기-수용성 용매 유화용액으로써 PLGA/MC 유기용매 및 히알루론산 수용액을 사용한 데에 본 발명의 특징이 있는 것이다.

상기 생리활성물질은 과립구대식세포집락자극인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), 변환성장인자(Transforming growth factor, TGF), 섬유아세포성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 인슐린유사성장인자(insulin-like growth factor, IGF), 상피성장인자(epidermal growth factor, EGF), 혈관내피성장인자(vascular endotherial growth factor, VEGF), 뉴로트로핀(neurotrophin, NT)류, 혈소판유래성장인자(platelet drived growth factor, PDGF), 줄기세포인자(stem cell factor, SCF), 간세포성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 각질세포성장인자(keratinocyte growth factor, KGF)등의 성장인자, 뼈형성단백질(bone morphogenic protein, BMP)류 인터루킨(interlukin, IL) 1 ~ 17 및 인터페론(interferon, INF) 중에서 선택된 1종 이상의 것을 사용할 수 있다. 이러한 사이토카인류는 세포의 분화와 증식 및 이주를 자극하는 등의 생물학적 효과가 있는 것으로 밝혀져 있다.[K. Masuda, H. S. An, The Spine Journal, 4, 330S, 2004; S. Cohen, J. Biol. Chem., 237, 1555, 1962; P. Zumstein, et al., J. Biol. Chem., 262, 11252, 1987]

본 발명의 유화동결건조법을 수행하기 위해서는 인체 특정부위의 장기형태의 몰드(mold)가 필요하다. 몰드는 테프론, 폴리에틸렌, 초고분자량 폴리에틸렌등의 재질로 제작될 수 있으며, 원하는 장기의 형태에 따라 그 모양을 변화시킬 수 있다. 이러한 몰드를 제작할 때, 유의해야할 사항은 유화상태의 생분해성 고분자가 부착되지 않아야 한다는 점이다. 예컨대, 몰드의 재질을 스테인레스스틸, 구리, 알루미늄, 폴리메틸아크릴레이트, 폴리카보네이트 등의 것으로 제작하였을 경우에는 이들이 생분해성 고분자와 부착하는 성질이 강하기 때문에 유화동결건조 법을 적용한 경우, 다공성 형태의 생분해성 고분자가 몰드에 강하게 접착되어 몰드로부터 쉽게 분리가 일어나지 않게 되는 문제점이 발생한다.

본 발명의 주안점인 유화동결건조법을 이용하여 히알루론산을 함유한 생분해성 다공성 하이브리드 담체를 제조하기 위해서는 도 1과 같은 과정으로 이루어진다. 이러한 본 발명에 따른 생분해성 다공성 하이브리드 담체의 제조과정을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 히알루론산을 함유한 생분해성 다공성 하이브리드 담체의 제조방법은 0.003 ~ 27 중량% 농도의 생분해성 고분자를 함유한 유기용매 50 ~ 90 부피% 및, 0.001 ~ 3 중량% 농도의 히알루론산 수용액 10 ~ 50 부피%를 초음파 또는 균질혼합기를 통하여 완전히 혼합시킨 혼합용액을 제조하는 1 단계 및 상기 혼합용액을 몰드(mold)에 투입하여 이하, 보다 구체적으로는 - 90 ~ - 78 ℃의 온도 및 3 ~ 8 Torr의 압력에서 유화동결건조하는 2 단계를 포함하여 이루어진다. 이 때, 상기 혼합용액은 히알루론산 수용액에 0.0001 ~ 0.5 중량%의 농도로 함유된 생리활성물질인 사이토카인류를 더 포함할 수 있다. 이러한 생리활성물질의 농도가 0.0001 중량% 미만이 경우에는 싸이토카인의 포함용량이 극소량이므로 방출량을 검출하는데 있어서 어려운 문제점이 발생하고, 0.5 중량%를 초과하면 제조 시 수용액의 성분이 크기 때문에 충분히 유화된 용액을 제조하기 힘든 문제점이 발생하므로, 0.01 ~ 0.1 %의 농도가 되도록 첨가하는 것이 특히, 바람직하다. 이로써 생리활성물질을 서방화하는 생분해성 다공성 하이브리드 담체를 제조하게 되는 것이다.

상기 히알루론산 수용액은 10 ~ 50 부피%를 함유하는 바, 상기 함량이 10 부 피% 미만인 경우에는 눈에 띄는 친수성의 효과를 기대하기 어렵고, 함량이 50 부피% 초과한 경우에는 기계적 강도가 매우 낮아 쉽게 부스러지고, 높은 히알루론산 함량으로 인해 생분해성이 가속화되는 등의 문제점이 발생하므로 상기한 함량범위를 유지하는 것이 좋다. 또한 상기 히알루론산 수용액에 있어서 히알루론산은 0.001 ~ 3 중량% 농도를 포함하는 바, 농도가 0.001 % 농도 미만이 경우에는 포함되는 히알루론산의 양이 매우 극소량으로 친수성의 부여를 꾀하기 어려운 문제점이 발생하고, 3 중량% 농도를 초과하면 고점도의 히알루론산 용액이 생성되므로 제조되는 담체의 다공이 매우 조밀하여 닫힌 다공구조를 갖는 문제점이 발생하므로, 상기 농도범위를 유지하는 것이 좋다.

또한 상기 생분해성 고분자 용액를 함유한 유기용매를 제조하는데 있어서, 생분해성 고분자 용액의 용해방법은 생분해성 고분자를 유기용매와 생체활성물질이 용해된 물이 혼합되어 있는 유화용액에 용해시키거나, 유기용매에 용해시킨 후 생체활성 물질이 용해된 물을 첨가하거나, 또는 생체활성물질이 용해된 물에 용해시킨 후 유기용매를 첨가시킬 수도 있다. 생분해성 고분자의 용해방법이나 유기용매의 선택은 그 특성 및 상황에 따라 이 분야에서 잘 알려져 있는 통상의 방법에 의해 다양화할 수 있다.

상기 생분해성 고분자 용액를 함유한 유기용매는 50 ~ 90 부피%를 함유하는 바, 상기 함량이 50 부피% 미만인 경우에는 제조되는 담체의 기공의 크기가 세포의 정상적인 성장을 유도하지 못할 정도로 커지며 물성이 낮아지는 문제점이 발생하고, 함량이 90 부피%를 초과한 경우에는 제조되는 담체의 틀을 형성하는 생분해성 고분자의 밀도가 높아 담체의 기공의 밀도가 너무 치밀하며 세포의 성장과 이행이 불가능한 작은 기공크기를 갖는 담체가 제조되는 문제점이 발생하므로 상기한 함량범위를 유지하는 것이 좋다. 또한 상기 전체유화용액에 대하여, 생분해성 고분자는 0.003 ~ 27 중량% 농도로 용해시키고, 더욱 바람직하기로는 1.5 ~ 20 중량% 농도로 용해시킨다. 그 농도가 0.003 중량% 농도 미만이면 생분해성 고분자의 농도가 너무 낮아서 다공성의 조직상태가 너무 약하게 되며, 27 % 농도를 초과하면 조직상태가 너무 치밀하여 조직세포의 성장이 방해될 수 있다. 이 때, 제조하고자 하는 인공장기의 종류에 따라 기공의 크기, 기공크기분포도, 공극률 등은 다양하게 변화시킬 수 있으며, 이는 사용된 생분해성 고분자, 유기용매 및 물의 조성비율을 조절함으로써 가능하다.

상기와 같은 조성으로 구성된 분산상의 완전 유화용액을 미리 액체질소에서 냉각된 원하는 장기모양의 몰드에 넣고, 액체질소 내에서 급속냉동시킨 후, - 90 ~ - 78 ℃ 온도, 5 ~ 8 Torr 압력 조건하에서 동결건조시킨다. 이 때, 동결건조 온도가 상기 범위보다 높은 경우에는 히알루론산 및 생리활성물질이 변성이 일어나는 등의 문제점이 발생하고, 낮은 경우에는 그 만큼의 낮은 온도가 필요하기 때문에 여타 다른 장비가 필요하게 되는 등의 경제적인 문제점이 발생한다. 또한 압력이 상기 범위보다 높은 경우에는 담체에 뒤틀림 및 수축현상이 일어나는 등의 문제점이 발생하고, 낮은 경우에는 담체 고유의 형상을 유지되지 않는 문제점이 발생하므로 상기 범위의 조건에서 동결건조하는 것이 바람직하다.

마지막으로, 상기 동결건조된 다공질체를 몰드로부터 분리하게 되면 본 발명 이 목적으로 하고 있는 히알루론산을 함유한 생분해성 다공성 담체를 얻을 수 있는 것이다.

이상에서와 같이 간단하고 별도의 세척과정이 없는 유화동결건조법을 이용함으로써, 수용성인 히알루론산 또는 생리활성물질의 손실이 없고, 생리활성물질들이 변성하지 않는 생분해성 다공성 하이브리드 담체를 제조할 수 있었다. 이러한 제조방법을 이용하여 제조된 생분해성 다공성 인공장기를 위한 상기 담체는 원하는 인체장기 형태의 몰드를 사용하였기 때문에 원하는 형태를 자유자재로 얻을 수 있고, 기공크기, 기공분포도 및 다공도 등은 고분자를 함유한 유기용매와 히알루론산 수용액의 함량을 적절히 조절함으로써 조절이 가능한 장점이 있다. 또한 인체내에 이식된 조직공학적 인공장기를 위한 담체는 생분해성 고분자의 분자량과 사용된 생분해성 고분자 종류에 따라서 임의로 조절이 가능한 장점이 있다. 또한, 생분해성 고분자 유기용매에 히알루론산을 특정 함량 비율로 첨가함으로써, 담체 고유의 역할을 부여하기 위한 최적의 생분해기간을 설정하고, 이입된 세포를 지탱하는 지지체로서의 물성을 제공하는 역할을 제공하여 종래의 생분해성 고분자가 갖는 긴 분해기간의 문제점을 해결한 것이다. 또한 생리활성물질이 흘러나오는 서방성 기간은 생리활성 물질의 종류 및 첨가량에 따라서 손쉽게 조절이 가능한 장점이 있다.

또한, 본 발명에 따른 히알루론산을 함유한 생분해성 다공성 담체는 공극과 공극사이가 상호 연결되어 있고, 일정한 크기의 공극을 가지고 있으며 종래의 히알루론산을 포함하지 않은 담체보다 더 큰 공극 및 전체기공도를 제공하여 산소, 이 산화탄소 및 영양인자 등과 같은 물질의 전달이 효과적으로 이루어져 더 나은 세포의 성장과 증식의 제공에 효과적이다.

상기 제조방법에 의한 생분해성 다공성 담체를 이용하여 제조된 인공장기는 인공혈관, 인공요도관, 인공소장, 인공기관지, 인공간, 인공신장, 인공골, 인공 말초 및 중추신경, 인공방광, 인공힘줄 및 인공연골 등 조직세포의 성장 및 회복이 가능한 신체장기라면 모두 적용이 가능하다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같은바, 본 발명이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

폴리락트산-글리콜산 공중합체(락트산:글리콜산 몰비 = 75 : 25, 분자량 90,000 g/mole) 0.35 g을 3.5 mL의 메틸렌클로라이드에 골고루 용해시킨, 10 중량 % 농도의 생분해성 고분자를 함유한 유기용매 혼합용액과 1 중량% 농도의 히알루론산 하이드로겔 수용액을 70 : 30의 부피비로 혼합한 후, 초음파분쇄기를 이용하여 약 30 W에서 50초 동안 혼합하여 완전유화용액을 제조하였다. 이 유화용액은 액체질소에서 미리 냉각된 테플론 재질의 몰드에 재빨리 붓고, 약 - 196 ℃의 액체질소에 담구어 급속동결시켰다. 상기 유화용액을 부어 급속동결시킨 테프론 몰드를 하루동안 급속냉동기에서 약 - 80 ℃에서 방치한 후, 동결건조기를 사용하여 약 - 78 ℃의 온도 및 5 Torr 압력 조건에서 동결건조하였다. 건조된 생분해성 다공성 담체를 몰드에서 분리하면 도 2와 같은 형태의 인공척수를 얻을 수 있었다.

상기 히알루론산을 함유한 생분해성 다공성 담체의 표면, 내부 및 바닥면의 전자현미경사진은 도 3에 나타내었다. 또한, 상기 히알루론산을 함유한 생분해성 다공성 담체의 기공크기, 기공크기분포 및 총기공면적등의 담체로서 갖추어야 할 물리적 물성을 측정하기 위하여 수은 포로시미터 [porosimeter, AutoPore II 9220, Micromeritirics]를 이용하여 측정하였고, 이들의 결과는 도 4에 나타내었다.

히알루론산의 첨가로 인한 수분보유능력 및 친수성의 변화를 도 5에 나타내었으며, 이는 지지체의 초기무게를 먼저 측정하고 10 mL의 물에 담체를 넣어 일정시간후 그 무게를 측정하여 그 무게의 변화를 퍼센트(%)로 나타낸 것이다. 또한 엠티티 (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT) 분석법을 통한 세포독성의 평가를 도 6에 나타내었다.

실시예 2 및 3

폴리락트산-글리콜산 공중합체(락트산:글리콜산 몰비 = 75 : 25, 분자량 90,000 g/mole) 0.35 g을 3.5 mL의 메틸렌클로라이드에 골고루 용해시킨, 10 중량 % 농도의 생분해성 고분자를 함유한 유기용매 혼합용액과 1 중량% 농도의 히알루론산 하이드로겔 수용액을 90 : 10(실시예2)의 부피비 및 50 : 50(실시예 3)의 부피비로 혼합한 후, 초음파분쇄기를 이용하여 약 30 W에서 50초 동안 혼합하여 완전유화용액을 제조하였다. 이하 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.

실시예 4

폴리히드록시뷰티르산(분자량 15,000 g/mole) 0.35 g을 3.5 mL의 클로로포름에 골고루 용해시킨, 10 중량 % 농도의 생분해성 고분자를 함유한 유기용매 혼합용액과 1 중량% 농도의 히알루론산 하이드로겔 수용액을 70 : 30의 부피비로 혼합한 후, 초음파분쇄기를 이용하여 약 30 W에서 50초 동안 혼합하여 완전유화용액을 제조하였다. 이하 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.

실시예 5

폴리카프로락톤(분자량 37,000 g/mole) 0.525 g을 3.5 mL의 디옥산에 골고루 용해시킨, 15 중량 % 농도의 생분해성 고분자를 함유한 유기용매 혼합용액과 1 중량% 농도의 히알루론산 하이드로겔 수용액을 70 : 30의 부피비로 혼합한 후, 초음파분쇄기를 이용하여 약 30 W에서 50초 동안 혼합하여 완전유화용액을 제조하였다. 이하 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.

실시예 6

폴리락트산-글리콜산 공중합체(락트산:글리콜산 몰비 = 75 : 25, 분자량 90,000 g/mole) 0.35 g을 3.5 mL의 메틸렌클로라이드에 골고루 용해시킨, 10 중량 % 농도의 생분해성 고분자를 함유한 유기용매 혼합용액과 1 중량% 농도의 히알루론산 하이드로겔 수용액에 생리활성물질인 과립구대식세포집락자극인자(GM-CSF)가 상기 수용액에 대하여 0.003 및 0.013 중량% 농도가 되도록 각각 50 ng(질량단위) 및 200 ng을 첨가한 혼합 수용액을 70 : 30의 부피비로 혼합한 후, 초음파분쇄기를 이용하여 약 30 W에서 50초 동안 혼합하여 완전유화용액을 제조하였다. 이하 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.

담체에 함유된 GM-CSF의 방출결과는 효소면역측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 통하여 측정하였고, 이는 표 2 및 도 7과 8에 나타내었다.

비교예 1

폴리락트산-글리콜산 공중합체(락트산:글리콜산 몰비 = 75 : 25, 분자량 90,000 g/mole) 0.35 g을 3.5 mL의 메틸렌클로라이드에 골고루 용해시킨, 10 중량 % 농도의 생분해성 고분자를 함유한 유기용매 혼합용액과 18.2 ㏁-㎝의 순수한 증류수(Milli-Q, Millipore, France)를 70 : 30의 부피비로 혼합한 후, 초음파분쇄기를 이용하여 약 30 W에서 50초 동안 혼합하여 완전유화용액을 제조하였다. 이하 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.

비교예 2 및 3

폴리락트산-글리콜산 공중합체(락트산:글리콜산 몰비 = 75 : 25, 분자량 90,000 g/mole) 0.35 g을 3.5 mL의 메틸렌클로라이드에 골고루 용해시킨, 10 중량 % 농도의 생분해성 고분자를 함유한 유기용매 혼합용액과 18.2 ㏁-㎝의 순수한 증 류수(Milli-Q, Millipore, France)를 90 : 10(비교예2)의 부피비 및 50 : 50(비교예 3)의 부피비로 혼합한 후, 초음파분쇄기를 이용하여 약 30 W에서 50초 동안 혼합하여 완전유화용액을 제조하였다. 이하 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.

비교예 4

폴리락트산-글리콜산 공중합체(락트산:글리콜산 몰비 = 75 : 25, 분자량 90,000 g/mole) 0.35 g을 3.5 mL의 메틸렌클로라이드에 골고루 용해시킨, 10 중량 % 농도의 생분해성 고분자를 함유한 유기용매 혼합용액과 1 중량% 농도의 저점도의 알긴산 수용액을 70 : 30의 부피비로 혼합한 후, 초음파분쇄기를 이용하여 약 30 W에서 50초 동안 혼합하여 완전유화용액을 제조하였다. 이하 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.

비교예 5

폴리락트산-글리콜산 공중합체(락트산:글리콜산 몰비 = 75 : 25, 분자량 90,000 g/mole) 0.35 g을 3.5 mL의 메틸렌클로라이드에 골고루 용해시킨, 10 중량 % 농도의 생분해성 고분자를 함유한 유기용매 혼합용액과 18.2 ㏁-㎝의 순수한 증류수(Milli-Q, Millipore, France)에 생리활성물질인 과립구대식세포집락자극인자(GM-CSF)가 상기 수용액에 대하여 33.3 및 133.3 중량% 농도가 되도록 각각 50 ng(질량단위) 및 200 ng을 첨가한 혼합 수용액을 70 : 30의 부피비로 혼합한 후, 초음파분쇄기를 이용하여 약 30 W에서 50초 동안 혼합하여 완전유화용액을 제조하였다. 이하 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.

비교예 6

대한민국특허등록 제358,080호의 실시예 1.

실험예

1) 기공크기, 기공부피(Incremental pore volume) 및 기공분포

수은 기공측정기[porosimeter, AutoPore II 9220, Micromeritirics]를 이용하여 제조된 담체의 기공크기분포, 비기공면적, 평균기공 직경 및 다공도를 측정하였는 바, 분석 조건은 다음과 같다. 사용된 각 담체의 질량, 측정수은체적, 수은압력 및 최대압력은 각각 0.1 g, 6.7 ~ 7.3 ㎖, 3.4 ㎫ 및 414 ㎫ 이었으며, 수은압력(P)와 기공 반지름(r)의 관계는 다음과 같은 Washburn 식

에 의해서 정의된다. 여기서 V_i는 전체 침투체적이며, ρ는 밀도를 나타낸다. 그 결과는 표 1에 나타내었다.

2) 수분보유능력

히알루론산의 첨가로 인한 수분보유능력 및 친수성의 변화는 지지체의 초기무게를 먼저 측정하고, 10 ㎖의 물에 담체를 넣어 일정 시간후 그 무게를 측정함으로써, 그 무게의 변화를 퍼센트(%)로 나타낸 것이다. 그 결과는 표 1에 나타내었다.

3) 세포독성의 평가

엠티티 (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT) 분석법을 통한 세포독성의 평가를 실시하였는 바, 분석방법은 다음과 같다. 단층으로 배양된 섬유아세포(NIH/3T3 mouse embryo fibroblast, KCLB21658, Korea Cell Line Bank, Korea)를 1×10⁵cells/지지체의 농도로 제조된 담체에 파종하고, 7, 14, 21 및 28일째에 MTT 용액 (50 ㎎/㎖)을 100 ㎕씩 넣고 4 시간동안 37 ℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 보라색 결정이 생성되면 인산완충용액으로 결정이 떨어지지 않게 3번 헹구고 디메틸설폭사이드 용액을 1 ㎖ 넣어 결정이 완전히 녹을 때까지 초음파에 노출시켜 1 시간동안 결정을 용해하였다. 그 후, 96 웰 플레이트에 샘플을 100 ㎖씩 분주하고 ELISA 플레이트 리더(E-max, Molecular Device, USA)를 이용하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 표 1에 나타내었다.

4) 생리활성물질 방출의 평가

담체에 함유된 생리활성물질(GM-CSF)의 방출결과는 효소결합면역측정 법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 통하여 측정하였는 바, 제조된 각 지지체로부터 생리활성물질의 방출거동을 조사하기 위하여 생체 외에서 방출실험을 실시하였다. 각각의 지지체에 5 ㎖의 용출액(인산완충용액)을 넣은 후, 37 ℃의 인큐베이터에서 70 rpm의 속도로 교반시켜주면서 정해진 시간간격마다 전량의 용출액를 회수하고 동일한 양의 용출액을 보충해 주었다. 채취한 시료는 분석시까지 4 ℃에서 보관하였으며 분석은 ELISA 키트를 사용하였다. 이는, 고정화된 GM-CSF 수용체에 GM-CSF를 결합시킨 후 HRP로 발색시켜 450 ㎚의 파장을 조사하여 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 표 2에 나타내었다.

구분	다공도 (%)	평균 기공크기 (㎛)	비기공 면적 (m²/g)	전체기공크기분포 (㎛)	물흡수율 (%) (after 10일)	흡광도 (optical density) (㎚) (after 28일)
실시예 1	96	21.48	26.15	0.003 ~ 408.24	672.80	0.790
실시예 2	94	14.45	34.86	0.001 ~ 311.69	650.11	0.453
실시예 3	96	19.66	24.59	0.007 ~ 436.08	664.70	0.567
실시예 4	95	17.25	28.30	0.003 ~ 406.98	671.12	0.667
실시예 5	97	19.40	29.10	0.003 ~ 399.87	667.85	0.421
비교예 1	91	12.18	34.73	0.003 ~ 410.41	213.80	0.152
비교예 2	94	14.10	27.96	0.002 ~ 320.21	221.67	0.230
비교예 3	96	20.94	31.35	0.008 ~ 440.18	201.27	0.204
비교예 4	93	12.10	26.70	0.003 ~ 420.24	473.12	0.698
비교예 6	96	20.94	31.4	0.001 ~ 411.56	218.84	0.143

누적방출백분율(accumulative release, %)
시간(일)	0.5	1	3	5	7	14	21	28	42
실시예 6 (50ng)	41.971	43.742	51.598	57.918	63.991	68.753	73.635	79.103	82.523
비교예 5 (200ng)	20.965	21.821	24.361	26.091	27.762	29.178	30.661	31.557	32.079

상기 결과에 의하면, 본 발명의 히알루론산을 함유한 생분해성 다공성 하이브리드 담체는 도 3의 전자현미경사진을 통하여 세포의 이주(migration), 성장(growth) 및 증식(proliferation)을 유도할 수 있는 기공과 기공사이가 상호연결되어 있는 열린 다공구조를 가짐을 확인할 수 있었다. 또한, 친수성 및 생체적합성을 향상시키고 수분과 접촉할 부분이 많아서 생분해를 촉진하기 위한 목적으로 히알루론산을 사용하지 않은 종래의 생분해성 담체(비교예 1)는 약 12.18 ㎛의 기공크기를 보이며, 총비기공면적이 34.73 m²/g 이며, 91 %의 다공도(porosity)를 보이는 반면, 히알루론산을 함유한 생분해성 다공성 담체(실시예 1)는 약 21.48 ㎛의 기공크기를 보이며, 총기공면적이 26.15 m²/g 이며, 약 96 %의 다공도를 보임으로 인해 종래의 생분해성 다공성 담체보다 세포가 성장하기에 적합한 내부 환경을 제공하여 삼차원적 담체로서 갖추어야 할 물리적 물성을 갖추고 있는 것을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명에 따른 담체가 인공장기로 작용할 때, 생체막 및 인체의 조직과 유사한 세포배양에 필요한 배양액과 세포들의 배설물의 확산을 용이하게 할 것으로 사료되며 또한 이식된 세포들의 일시적인 지지체가 되어 세포들로부터 세포외기질을 분비할 수 있게 하며 결국에는 체내에서 분해되어 완전한 천연조직 대체물로서의 역할을 대응하게 될 것으로 기대된다.

또한 동일한 조건에서 10일 동안 수행한 젖음성 측정 실험에서 수분 함유율이 73.15 %로부터 213.83 %로 증가한 종래의 히알루론산을 함유하지 않은 생분해성 담체와 비교하여, 본 발명의 히알루론산을 함유한 생분해성 다공성 하이브리드 담체는 수분 함유율이 524.74 %로부터 672.80 %로 증가함으로써, 인공장기로써 세포 및 여타 조직과의 융합이 쉬워지게 하고 수분을 보유하는 능력이 뛰어나 생체적합성의 장점을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

또한 MTT 분석법을 통한 세포독성의 평가를 통하여 평균적으로 0.094의 흡광도를 보이는 종래의 히알루론산을 함유하지 않은 생분해성 담체와 비교하여, 본 발명의 히알루론산을 함유한 생분해성 다공성 하이브리드 담체는 상대적으로 높은 흡광도를 0.378보였으며 이는 비교예에 비하여 약 4배가 높은 수치를 갖음으로써, 인공장기로써 세포 독성이 낮아 세포의 성장과 증식에 도움을 주며, 또한 특정세포에서의 특이적 세포외기질 발현에도 유리할 것으로 기대된다.

마지막으로, 효소면역측정법을 통한 담체에 함유된 GM-CSF의 방출결과는 종래의 히알루론산을 함유하지 않은 생분해성 담체와 비교하여, 본 발명의 히알루론산을 함유한 생분해성 다공성 하이브리드 담체에서는 담지된 싸이토카인의 방출이 빠른 방출 결과를 보임으로써, 인공장기로써 생활성물질을 빠르게 전달하고 지속적으로 방출이 가능한 장점을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 유화동결건조법에 의한 생분해성 다공성 하이브리드 담체의 제조 모식도이다.

도 2는 실시예 1 에 있어서, 본 발명의 생분해성 다공성 담체를 유화동결건조법으로 제조한 인공 척수를 제조한 사진이다.

도 3은 실시예 1에 있어서, 본 발명의 생분해성 다공성 담체의 표면, 내부 및 바닥면의 구조를 시차주사현미경으로 관찰한 도이다.

도 4는 실시예 1(HA-PLGA) 및 비교예 1(PLGA) 에서 제조된 생분해성 다공성 담체의 내부 기공크기분포를 측정한 도이다.

도 5는 실시예 1(HA-PLGA) 및 비교예 1(PLGA) 에서 제조된 생분해성 다공성 담체의 물 흡수성을 나타낸 도이다.

도 6은 실시예 1(HA-PLGA) 및 비교예 1(PLGA) 에서 제조된 생분해성 다공성 담체의 세포적합성을 나타낸 도이다.

도 7은 실시예 6(HA-PLGA) 및 비교예 5(PLGA) 에서 제조된 생분해성 다공성 담체에 포접된 생리활성물질(50 ng GM-CSF)의 방출 결과를 나타낸 도이다.

도 8은 실시예 6(HA-PLGA) 및 비교예 5(PLGA) 에서 제조된 함유한 생분해성 다공성 담체에 포접된 생리활성물질(200 ng GM-CSF)의 방출 결과를 나타낸 도이다.

Claims

조직공학용 생분해성 다공성 하이브리드 담체를 제조하는 방법에 있어서,

생분해성 고분자를 함유한 유기용매 50 ~ 90 부피%에 친수성 및 생체적합성을 부여하는 용도로써 히알루론산 수용액 10 ~ 50 부피%를 첨가하여 제조된 혼합용액을 몰드(mold)에 투입하여 유화동결건조하는 것을 특징으로 하는 생분해성 다공성 하이브리드 담체의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 0.003 ~ 27 중량% 농도의 생분해성 고분자인 것을 특징으로 하는 생분해성 다공성 하이브리드 담체의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 히알루론산 수용액은 0.001 ~ 3 중량% 농도의 히알루론산 수용액인 것을 특징으로 하는 생분해성 다공성 하이브리드 담체의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 혼합용액은 히알루론산 수용액에 대하여 0.0001 ~ 0.5 중량%의 농도의 생리활성물질인 사이토카인류를 추가로 포함하고 있는 것을 특 징으로 하는 생분해성 다공성 하이브리드 담체의 제조방법.
제 4 항에 있어서, 상기 사이토카인류는 과립구대식세포집락자극인자(GM-CSF), 변환성장인자(TGF), 섬유아세포성장인자(FGF), 인슐린유사성장인자(IGF), 상피성장인자(EGF), 혈관내피성장인자(VEGF), 뉴로트로핀(NT)류, 혈소판유래성장인자(PDGF), 줄기세포인자(SCF), 간세포성장인자(HGF), 각질세포성장인자(KGF)등의 성장인자, 뼈형성단백질(BMP)류 인터루킨1~17(IL) 및 인터페론(INF) 중에서 선택된 1종 이상의 것을 특징으로 하는 생분해성 다공성 하이브리드 담체의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 합성 고분자 또는 합성 및 천연고분자인 것을 특징으로 하는 생분해성 다공성 하이브리드 담체의 제조방법.
제 6 항에 있어서, 상기 합성 고분자는 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락트산-글리콜산 공중합체, 폴리하이드록시뷰티릭산, 폴리카프로락톤, 폴리안하이드라이드, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리다이옥사논 및 폴리포스파젠 중에서 선택된 1종 이상의 합성 고분자인 것을 특징으로 하는 생분해성 다공성 하이브리드 담체의 제조방법.
제 6 항에 있어서, 상기 천연 고분자는 알지네이트, 키토산, 키틴, 콜라겐, 라미닌, 헤파린, 피브린, 콘드로이친 설페이트, 아가로오스 및 젤라틴 중에서 선택된 1종 이상의 천연 고분자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생분해성 다공성 하이브리드 담체의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 유기용매는 아세토니트릴, 디클로로메탄, 클로로포름, 테트라하이드로퓨란 및 디옥산 중에서 선택된 1종 이상의 것을 특징으로 하는 생분해성 다공성 하이브리드 담체의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 유화동결건조는 - 90 ~ - 78 ℃의 온도 및 3 ~ 8 Torr의 압력 조건에서 동결건조하는 것을 특징으로 하는 생분해성 다공성 하이브리드 담체의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 유화동결건조는 테프론, 폴리에틸렌 및 초고분자량 폴리에틸렌 중에서 선택된 재질의 몰드를 사용하는 것을 특징으로 하는 생분해성 다공성 담체의 제조방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중에서 선택된 어느 한 항의 제조방법으로 얻어진 생분해성 다공성 담체로, 표면 및 내부에 세포의 이주 및 성장에 도움을 주는 서로 연결된 기공을 갖는 열린다공구조를 이루며, 이입된 세포가 완벽히 부착하여 성장 및 증식하는 기간까지 충분한 물성을 제공하는 것을 특징으로 하는 인공장기.
제 12 항에 있어서, 상기 인공장기는 인공혈관, 인공요도관, 인공소장, 인공기관지, 인공간, 인공신장, 인공골, 인공 말초 및 중추신경, 인공방광, 인공힘줄 및 인공연골인 것을 특징으로 하는 인공장기.