CN109395095A - 体内用生物膜及其制备方法和用途 - Google Patents

体内用生物膜及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种体内用生物膜，包括基质吸附物、生物添加物、支架添加物、交联剂和通透剂。该体内用生物膜适用于包裹人源性或动物源性组织和细胞，利用这种发明的新型生物膜，观察包裹内人源性或动物源性组织和细胞在实验性动物体内对多种因素影响的反应，重点可以对药物筛选、药物疗效评价、药物适应症评估、药物毒性和药物副作用评价、药物配伍研究等进行检测和分析，同时，也可以对包裹内组织和细胞进行检测和分析。

Description

体内用生物膜及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及生物膜技术领域，具体的，本发明涉及与一种体内用生物膜及其制备方法和用途。
背景技术
近年来，由于分子生物学、细胞生物学技术的不断发展，国内外学者致力于寻找简便易行、准确可靠的化疗药物敏感性检测方法。常规的体外组织细胞培养方法，是将组织以组织块的形式在胶原上进行培养，然后加入药物，观察组织块对药物的敏感性。然则该方法并不能接近体内组织和细胞生长环境的组成成分，不能保持组织和细胞的生长内环境或微环境，不能始终保持组织细胞的生物学特性等，结果的可靠性较差，对药效研究和药物研发成功率低。
而在体内组织细胞培养方法中，常见2种模型：(1)人源性肿瘤细胞系移植瘤模型(Standard Cell Line Derived Xenograft Model，CDX)：将标准的人源性肿瘤细胞系接种到免疫缺陷小鼠体内，细胞肿瘤可以在小鼠体内形成肿瘤组织。特点：不能理想的模拟体内对组织细胞的作用；具有较低的肿瘤异质性；较少的分子、细胞、组织的多样性和多态性，仅表现为鼠源间质；并不再持有原始患者肿瘤细胞的分子特性，不能准确反映原始肿瘤的特征；难以预测临床结果。该模型操作简单，成瘤率高且价格低廉，以前广泛用于肿瘤药物体内药效研究和抗癌药物研发。根据《自然》杂志网站报道，NCI-60细胞系人源性肿瘤细胞系移植瘤模型一直是用来进行抗癌药物测试的癌细胞样本群。这种细胞系让科学家们不断的提高了对癌症的理解。可是经过时间的变化，NCI-60细胞系经过上千代的不断培育，NCI-60细胞已经逐渐适应了与原生环境完全不同的塑料培养皿环境，很多细胞的基因组成和行为都已经出现了一些改变。美国国家癌症研究所(NCI)已宣布，全球所有国家地区研究人员使用了长达25年的NCI-60细胞系人源性肿瘤细胞系移植瘤模型已于2016年停止使用。(2)人源性肿瘤原代细胞移植瘤模型(Patient Derived Xenograft Model，PDX)：将人源性肿瘤组织细胞移植到免疫缺陷型不同的种属动物体内，可以在不同种属动物体内形成人源性肿瘤组织。特点：较理想的模拟了体内对组织细胞的作用；具有较高的肿瘤异质性；较多的分子、细胞、组织的多样性和多态性，表现为鼠源和人源间质；持有原始患者肿瘤细胞的分子特性，准确反映原始肿瘤的特征；可以预测临床结果。利用PDX模型进行药物筛选，可以将结果作为治疗适应性的评估，得出更加适宜的用药方案，针对患者有更强的特异性，也可以提高治疗的成功率。同时，也减少了病人使用多种药物对身体造成的伤害。现广泛用于药物体内药效研究和抗癌药物研发。缺点：成瘤成功率并不高，平均为25％左右；原代组织细胞培养周期较长，至少需要2-3月；由于B细胞和NK细胞在不同种属动物的存在，不可避免的存在不同种属动物体内可能对人源性组织细胞排斥；有时不同种属动物体内造成人源性组织细胞会死亡、凋亡、融合、吞噬；方法操作繁杂。
目前，尚未发现应用本发明生物膜包裹人源性或动物源性组织和细胞在不同种属实验动物(包括免疫缺陷小鼠或无免疫缺陷小鼠)体内培养和生长。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够应用于组织细胞培养生长的体内用生物膜。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种体内用生物膜，根据本发明的实施例，该体内用生物膜包括：基质吸附物、生物添加物、支架添加物、交联剂、通透剂。
发明人意外发现，本发明的体内用生物膜具备非常好的通透性、透明性、柔韧性和富含水性；双向性进行水自由进入，小分子物质和气体如氧和二氧化碳可以自由通过，具有重要的生物医药领域的应用价值。
根据本发明的实施例，该体内用生物膜中所含的基质吸附物包括5～10质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白，10～25质量份的明胶和基质胶，5～10质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素，1～5质量份的藻酸盐、1～5质量份的聚乙二醇、1～5质量份的细胞基质。
根据本发明的具体实施例，所述基质吸附物包括5质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白，10质量份的明胶和基质胶，5质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素，1质量份的藻酸盐，1质量份的聚乙二醇，1质量份的细胞基质。
根据本发明的具体实施例，所述基质吸附物包括8质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白，20质量份的明胶和基质胶，8质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素，3质量份的藻酸盐，4质量份的聚乙二醇，2质量份的细胞基质。
根据本发明的具体实施例，所述基质吸附物包括10质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白，25质量份的明胶和基质胶，10质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素，5质量份的藻酸盐，5质量份的聚乙二醇，5质量份的细胞基质。
根据本发明的实施例，所述胶原蛋白与所述蚕丝蛋白的质量比为1：1。
根据本发明的实施例，所述明胶与所述基质胶的质量比为1：1。
根据本发明的实施例，所述壳聚糖、所述透明质酸与所述硫酸软骨素的质量比为1：1：1。
根据本发明的实施例，该体内用生物膜中所含的生物添加物为选自种属细胞提取物。
根据本发明的实施例，优选为选自种属的血管内皮细胞提取物。
根据本发明的实施例，所述种属的血管内皮细胞提取物为选自人、小鼠、大鼠、兔、猪、牛的血管内皮细胞提取物中的至少一种。
根据本发明的具体实施例，所述种属的血管内皮细胞提取物的添加量为占本发明所述体外用生物膜总量的1质量％～30质量％，优选为15质量％。
根据本发明的实施例，该体内用生物膜中的支架添加物为1～10质量份，优选为6质量份。根据本发明的具体实施例，所述支架添加物包括聚碳酸酯和聚己内酯。
根据本发明的具体实施例，所述聚碳酸酯与所述聚己内酯的质量比为1：5～1：20，优选为1：10。由此，可以获得不同硬度的生物膜。
根据本发明的实施例，该体内用生物膜中所含的交联剂为1～10质量份，优选为6质量份。根据本发明的实施例，所述交联剂为物理交联剂。根据本发明的具体实施例，所述物理交联剂为选自硫酸钠、柠檬酸钠、三聚磷酸钠中的至少一种。
根据本发明的实施例，该体内用生物膜中所含的通透剂为1～10质量份，优选为6质量份，根据本发明的实施例，所述通透剂为选自碳酸氢铵和碳酸铵中的至少一种。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备体内用生物膜的方法，根据本发明的实施例，该方法包括：将所述基质吸附物、生物添加物、支架添加物、交联剂和通透剂在水环境下相接触。本发明的制备方法在工艺上比较简单、无需特殊的大型设备、原料容易获得、价格合理、成本低廉，易于实现产业化。
根据本发明的实施例，本发明制备体内用生物膜的方法进一步包括：(1)在反应器中，将所述基质吸附物加入双蒸水中，机械搅拌均匀；(2)加入所述生物添加物，机械搅拌均匀；(3)加入所述支架添加物，机械搅拌均匀；(4)加入所述交联剂，机械搅拌均匀；(5)加入所述通透剂，机械搅拌均匀；(6)冷却，即得。
所述步骤(1)～(6)中，按基质吸附物>生物添加物>支架添加物>交联剂>通透剂的顺序先后加入。
根据本发明的实施例，步骤(1)～(6)的加入过程均是缓慢加入。由此，使所添加的物质充分接触。
根据本发明的实施例，步骤(1)～(6)的搅拌过程均为机械搅拌，搅拌转速100r～150r/min。根据本发明的具体实施例，所述搅拌的时间均为10min～30min。由此，使后添加的物质更好的融入至之前所形成的体系中。
根据本发明的实施例，所述步骤(1)在加入所述基质吸附物之前，先将双蒸水加热至55摄氏度～65摄氏度。由此，便于基质吸附物更好的融入双蒸水体系中。
根据本发明的实施例，所述步骤(6)冷却至16摄氏度～26摄氏度。
根据本发明的具体实施例，本发明的制备方法为：(1)取双蒸水100ml倒入200ml的反应容器中，将反应容器放在机械搅拌器上加热至55摄氏度～65摄氏度；(2)依次缓慢加入5～10质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白(质量比1：1)，10～25质量份的明胶和基质胶(质量比1：1)，5～10质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素(质量比1：1：1)、1～5质量份的藻酸盐、1～5质量份的聚乙二醇、1～5质量份的细胞基质到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速100r～150r/min,搅拌时间10min～30min；(3)缓慢依次加入质量百分比1％～30％种属的血管内皮细胞提取物到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速100r～150r/min,拌时间10min～30min；(4)缓慢加入1～10质量份聚碳酸酯和聚己内酯(质量比为1：5～1：20)到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速100r～150r/min,搅拌时间10min～30min；(5)缓慢依次加入1～10质量份硫酸钠或柠檬酸钠或三聚磷酸钠至少一种到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速100r～150r/min,搅拌时间10min～30min；(6)缓慢加入1～10质量份碳酸氢铵和碳酸铵中的至少一种到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速100r～150r/min,搅拌时间10min～30min；(7)均匀后，将冷却至16摄氏度～26摄氏度。即得体内用生物膜。
发明人对本发明的体内用生物膜进行常规方法检测，得到不同产品，其厚度：0.1mm～2.0mm(应用计量尺检测生物膜的厚度)；含量水：20％～60％(对体内用生物膜进行干燥后进行重量前后对比)；pH值：6.8～7.6(应用pH值检测仪或检测条对体内用生物膜进行pH值检测)。
生物膜有效期检测：生物膜放入保护液中保存，于4摄氏度条件下保存1年后，仍可将保存后的生物膜对组织、原代细胞、细胞系进行培养。结果发现该生物膜的有效期可达1年(生物膜放入保护液中保存，4摄氏度条件下保存1年)，保护液为市面上的RPMI1640和DMEM。
在本发明的第三方面，本发明提出了前面所述体内用生物膜在培养种属组织和细胞中中的用途。所述种属组织和细胞为选自种属细胞系、原代细胞和组织中的至少一种。根据本发明的实施例，所述种属组织和细胞的来源为人、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、羊、猪、牛。
目前，尚未发现应用本发明生物膜包裹人源性或动物源性组织和细胞在不同种属实验动物(包括免疫缺陷小鼠或无免疫缺陷小鼠)体内培养和生长。
根据本发明的实施例，所述种属细胞系为选自人肺癌细胞A549、人肝癌细胞HepG2、人结直肠癌细胞HT-29、人巨噬细胞RAW264.7中的至少一种。根据本发明的实施例，细胞系来源优选为人、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、羊、猪、牛。
根据本发明的实施例，所述种属原代细胞为选自人组织源性血管内皮细胞、小鼠组织源性肺上皮细胞、大鼠组织源性肝细胞和大兔组织源性平滑肌细胞中的至少一种。根据本发明的实施例，原代细胞来源优选为人、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、羊、猪、牛。
根据本发明的实施例，所述种属组织为选自人肺组织、大鼠平滑肌组织、小鼠肝组织和大兔肾组织中的至少一种。根据本发明的实施例，组织来源优选为人、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、羊、猪、牛。
在本发明的第四方面，本发明提出了前面所述体内用生物膜的应用方法。该方法包括：
(1)将体内用生物膜包裹组织块或分离培养的细胞，以形成“微球包裹体”；
根据本发明的实施例，组织和细胞来源，优选为人、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、羊、猪、牛。
(2)将微球包裹体放入实验性动物体内的目的位置处；
根据本发明的实施例，实验动物，优选为小鼠、大鼠、豚鼠、兔、羊、猪、牛。
(3)使被包裹的组织块或细胞在体内经过培养和生长；
(4)取出微球包裹体并打开，取出组织块或细胞；
(5)对组织块和细胞进行目的性检测和分析。整个操作过程是在无菌条件下进行。
根据本发明实施例的体内用生物膜，可以实现下列优点至少之一：
(1)该体内用生物膜具有高通透性、柔软性、富含水性，膜双面的水份、物质、气体可以进行自由交换；生物膜的有效期：4摄氏度条件下可保存1年；
(2)该体内用生物膜的多种组成成分非常接近体内组织和细胞生长内环境的组成成分；
(3)该体内用生物膜能保持包裹的组织和细胞的生长内环境或微环境；
(4)该体内用生物膜既可使用于包裹组织在体内培养和生长，也可使用于包裹分离的原代细胞在体内培养和生长；
(5)该体内用生物膜可以始终保持组织细胞的生物学特性(包括分化程度、形态特征、结构特点以及分子特性)；
(6)该体内用生物膜可以始终保持组织或细胞较高的组织学、细胞学、分子生物学(包括DNA、RNA、蛋白质、脂质)多样性；
(7)该体内用生物膜可以加快细胞的培养和生长，防止细胞死亡或凋亡，也防止细胞的融合或吞噬，提高细胞培养和生长的成功率；
(8)该体内用生物膜包裹的组织细胞样品用量少，节约组织细胞样品量；
(9)该体内用生物膜包裹的组织细胞方法操作简单，易于放入体内和从体内取出的操作过程；
(10)该体内用生物膜既具有非常好的柔软性也具有不易破碎的物理特性，可以包裹各种形状的组织；
(11)该体内用生物膜包裹的组织细胞放入体内的实验周期可以短，5天～7天即可出结果。实验周期也可以长，2月～3月出结果；
(12)该体内用生物膜包裹的组织细胞在体内存在对器官和组织无刺激性、无过敏性、无毒性反应、无异物感；
(13)该体内用生物膜包裹的组织细胞在体内存在，阻止体内具有免疫功能的B细胞、T细胞、N细胞、NK细胞作用，无类移植性排斥反应；
(14)该体内用生物膜具有非常好的通透性，易于药物或小分子物质或大分子物质等自由的通过生物膜而进入包裹的组织细胞中，可应用于药物筛选、药物疗效评价、药物适应症评估、药物毒性评估、药物副作用、药物配伍等的检测和分析；
(15)该体内用生物膜可非常好的保持组织学多样性，可应用于生物标记物、组织类型、细胞生物学、分子生物学(包括DNA、RNA、蛋白质、脂质)的检测和分析。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为根据本发明一个实施例，不同组织进行体内培养的实验结果对比图；
图2为根据本发明一个实施例，不同原代细胞进行体内培养的实验结果对比图；
图3为根据本发明一个实施例，不同细胞系进行体内培养的实验结果比对图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。另外，如果没有明确说明，在下面的实施例中所采用的所有试剂均为市场上可以购得的，或者可以按照文本或已知的方法合成的，对于没有列出的反应条件，也均为本领域技术人员容易获得的。
体内用生物膜的生物材料来源：组织和细胞培养所用的培养皿、培养方瓶、常用实验用耗材购于Corning公司；组织和细胞完全培养液购于Invitrogen公司；组织、原代细胞、细胞系分别购于Invitrogen、ScieCells公司和中国科学院细胞保藏中心。
小鼠来源：C57BL/6小鼠来源于湖北省疾病预防控制中心。
实施例1 20％含水量的体内生物膜制备
(1)取双蒸水100ml倒入200ml的反应容器中，将反应容器放在机械搅拌器上加热至55摄氏度；
(2)依次缓慢加入5质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白(质量比1：1)，10质量份的明胶和基质胶(质量比1：1)，5质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素(质量比1：1：1)、1质量份的藻酸盐、1质量份的聚乙二醇、1质量份的细胞基质到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速150r/min,搅拌时间10min；
(3)依次缓慢加入质量百分比1％的种属的血管内皮细胞提取物到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速150r/min,搅拌时间10min；
(4)缓慢加入1质量份的聚碳酸酯和聚己内酯(质量比为1：5)到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速150r/min,搅拌时间10min；
(5)缓慢依次加入1质量份的硫酸钠到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速150r/min,搅拌时间10min；
(6)缓慢加入1质量份碳酸氢铵到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速150r/min,搅拌时间10min；
(7)均匀后，将冷却至16摄氏度。即得生物膜。
应用计量尺检测生物膜的厚度为0.1mm；对生物膜进行干燥后对比前后重量，其含水量为20％；应用pH值检测仪或检测条对生物膜进行pH值检测，其pH值为6.8。
实施例2 60％含水量的体内生物膜制备
(1)取双蒸水100ml倒入200ml的反应容器中，将反应容器放在机械搅拌器上加热至65摄氏度；
(2)依次缓慢加入10质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白(质量比1：1)，25质量份的明胶和基质胶(质量比1：1)，10质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素(质量比1：1：1)、5质量份的藻酸盐、5质量份的聚乙二醇、5质量份的细胞基质到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速100r/min,搅拌时间30min；
(3)依次缓慢加入质量百分比30％的种属的血管内皮细胞提取物到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速100r/min,搅拌时间30min；
(4)缓慢加入10质量份的聚碳酸酯和聚己内酯(质量比为1：20)到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速100r/min,搅拌时间30min；
(5)缓慢依次加入10质量份的柠檬酸钠到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速100r/min,搅拌时间30min；
(6)缓慢加入10质量份的碳酸铵到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速100r/min,搅拌时间30min；
(7)均匀后，将冷却至26摄氏度。即得生物膜。
应用计量尺检测生物膜的厚度为2.0mm；对生物膜进行干燥后对比前后重量，其含水量为60％；应用pH值检测仪或检测条对生物膜进行pH值检测，其pH值为7.6。
实施例3 40％含水量的体内生物膜制备
(1)取双蒸水100ml倒入200ml的反应容器中，将反应容器放在机械搅拌器上加热至55摄氏度～65摄氏度；
(2)依次缓慢加入8质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白(质量比1：1)，20质量份的明胶和基质胶(质量比1：1)，8质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素(质量比1：1：1)、3质量份的藻酸盐、4质量份的聚乙二醇、2质量份的细胞基质到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速120r/min，搅拌时间20min；
(3)依次缓慢加入质量百分比15％的种属的血管内皮细胞提取物到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速120r/min，搅拌时间20min；
(4)缓慢加入6质量份的聚碳酸酯和聚己内酯(质量比为1：10)到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速120r/min，搅拌时间20min；
(5)缓慢依次加入6质量份的硫酸钠或柠檬酸钠或三聚磷酸钠至少一种到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速120r/min，搅拌时间20min；
(6)缓慢加入6质量份的碳酸氢铵和碳酸铵中的至少一种到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速120r/min，搅拌时间20min；
(7)均匀后，将冷却至20摄氏度。即得生物膜。
应用计量尺检测生物膜的厚度为1.0mm；对生物膜进行干燥后对比前后重量，其含水为40％；应用pH值检测仪或检测条对生物膜进行pH值检测，其pH值为7.0。
实施例4进行体内组织培养
将实施例3所制得的的体内用40％含水量的体内生物膜包裹人源性组织肺组织、平滑肌组织、肝组织、肾组织(1×1×1mm)，放入小鼠腹腔内进行培养。观察第1天和第5天的组织培养和生长状态。肺组织、平滑肌组织、肝组织、肾组织的对比结果如附图1和表1所示。
另一方面，采用常规方法(与采用本发明所述的方法培养的唯一区别点在于：采用常规培养方法的，没有应用本发明所述的体内用生物膜)，将人源性组织肺组织、平滑肌组织、肝组织、肾组织(1×1×1mm)，直接放入小鼠腹腔内进行培养。观察第1天和第5天的组织培养和生长状态，肺组织、平滑肌组织、肝组织、肾组织的对比结果如附图1和表2所示。
表1应用本发明所述体内用生物膜包裹组织在体内培养时间与组织体积大小(mm3)关系
表2常规组织在体内培养(未应用本发明体内用生物膜)时间与组织体积大小(mm3)关系
结果表明：体内用生物膜包裹人肺组织培养第5天，组织体积是常规人肺组织培养第5天组织体积4.0倍。体内用生物膜包裹小鼠肝组织培养第5天，组织体积是常规小鼠肝组织培养第5天组织体积2.67倍。体内用生物膜包裹大鼠平滑肌组织培养第5天，组织体积是常规大鼠平滑肌组织培养第5天组织体积2.25倍。体内用生物膜包裹兔肾组织培养第5天，组织体积是常规兔肾组织培养第5天组织体积3.33倍。
实施体内用40％含水量的体内生物膜进行组织培养，体积增大的顺序为肺组织>肾组织>平滑肌组织>肝组织，体内生物膜包裹组织培养体积第5天与第1天比较，平均增大9.75倍；而常规组织培养体积第5天与第1天比较，平均增大仅3.25倍。
实施例5进行原代细胞体内培养
将实施例3所制得的体内用40％含水量的体内生物膜包裹人源性原代细胞内皮细胞、上皮细胞、肝细胞、平滑肌细胞(1×105细胞数)，放入小鼠腹腔内进行培养。观察第1天和第5天的原代细胞培养和生长状态。内皮细胞、上皮细胞、肝细胞、平滑肌细胞的对比结果如附图2和表3所示。原代细胞培养体积第1天与第5天比较，体积平均增大为3.28倍。
另一方面，采用常规方法(与采用本发明所述的方法培养的唯一区别点在于：采用常规方法的，没有应用本发明所述的体内用生物膜)培养的内皮细胞、上皮细胞、肝细胞、平滑肌细胞的结果如附图2和表4所示。
表3应用本发明所述体内用生物膜包裹原代细胞在体内培养时间与组织体积大小(×103)关系
表4常规原代细胞在体内培养(未应用本发明体内用生物膜)时间与组织体积大小(×103)关系
结果表明：体内用生物膜包裹人内皮细胞培养第5天，组织体积是常规人内皮细胞培养第5天组织体积2.4倍。体内用生物膜包裹人上皮细胞培养第5天，组织体积是常规人上皮细胞培养第5天组织体积2.8倍。体内用生物膜包裹人肝细胞组织培养第5天，组织体积是常规人肝细胞组织培养第5天组织体积2.92倍。体内用生物膜包裹人平滑肌细胞培养第5天，组织体积是常规人平滑肌细胞培养第5天组织体积2.9倍。
实施体内用40％含水量的体内生物膜进行细胞培养，体积增大的顺序为内皮细胞>肝细胞>平滑肌细胞>上皮细胞，体内用生物膜包裹原代细胞培养细胞数第5天与第1天比较，平均增加3.28倍；而常规原代细胞培养细胞数第5天与第1天比较，平均增大仅1.2倍。
实施例6进行细胞系体内培养
将实施例3所制得的体内用40％含水量的体内生物膜包裹人源性细胞系人肺癌细胞(A549)、人肝癌细胞(Hep G2)、人结直肠癌细胞(HT-29)、人巨噬细胞(RAW264.7)(1×105细胞数)，放入小鼠腹腔内进行培养。观察第1天和第5天的细胞系培养和生长状态。人肺癌细胞(A549)、人肝癌细胞(Hep G2)、人结直肠癌细胞(HT-29)、人巨噬细胞(RAW264.7)的对比结果如附图3和表5所示。
另一方面，采用常规方法(与采用本发明所述的方法培养的唯一区别点在于：采用常规方法的，没有应用本发明所述的体内用生物膜)培养的人肺癌细胞(A549)、人肝癌细胞(Hep G2)、人结直肠癌细胞(HT-29)、人巨噬细胞(RAW264.7)的结果如附图3和表6所示。
表5应用本发明所述体内用生物膜包裹细胞系在体内培养时间与组织体积大小(×103)关系
表6常规细胞系在体内培养(未应用本发明体内用生物膜)时间与组织体积大小(×103)关系
结果表明：体内用生物膜包裹A549培养第5天，组织体积是常规A549培养第5天组织体积2.88倍。体内用生物膜包裹HT-29培养第5天，组织体积是常规HT-29培养第5天组织体积3.77倍。体内用生物膜包裹HepG2组织培养第5天，组织体积是常规HepG2组织培养第5天组织体积2.94倍。体内用生物膜包裹RAW264.7培养第5天，组织体积是常规RAW264.7培养第5天组织体积3.0倍。
实施体内用40％含水量的体内生物膜进行细胞培养，体积增大的顺序为人巨噬细胞(RAW264.7)>人结直肠癌(HT-29)>人肝癌细胞(Hep G2)>人肺癌细胞(A549)，体内生物膜包裹细胞系培养细胞数第5天与第1天比较，平均增加5.13倍；而常规细胞系培养细胞数第5天与第1天比较，平均增大仅1.65倍。
同样的，应用本发明实施例1、实施例2所述的体内用生物膜，分别对不同组织、不同原代细胞、不同细胞系进行体内培养，均得到了与本发明实施例4-6同理的结果。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种体内用生物膜，其特征在于，包括：基质吸附物、生物添加物、支架添加物、交联剂、通透剂。
2.根据权利要求1所述的体内用生物膜，其特征在于，所述基质吸附物包括5～10质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白，10～25质量份的明胶和基质胶，5～10质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素，1～5质量份的藻酸盐，1～5质量份的聚乙二醇，1～5质量份的细胞基质；
任选地，所述基质吸附物包括5质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白，10质量份的明胶和基质胶，5质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素，1质量份的藻酸盐，1质量份的聚乙二醇，1质量份的细胞基质；
任选的，所述基质吸附物包括8质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白，20质量份的明胶和基质胶，8质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素，3质量份的藻酸盐，4质量份的聚乙二醇，2质量份的细胞基质；
任选地，所述基质吸附物包括10质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白，25质量份的明胶和基质胶，10质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素，5质量份的藻酸盐，5质量份的聚乙二醇，5质量份的细胞基质；
任选的，所述胶原蛋白与所述蚕丝蛋白的质量比为1：1；
任选的，所述明胶与所述基质胶的质量比为1：1；
任选的，所述壳聚糖、所述透明质酸与所述硫酸软骨素的质量比为1：1：1。
3.根据权利要求1所述的体内用生物膜，其特征在于，所述生物添加物为选自种属细胞提取物，
优选所述种属细胞提取物为选自种属的血管内皮细胞提取物，
任选的，所述种属的血管内皮细胞提取物为选自人、小鼠、大鼠、兔、猪、牛的血管内皮细胞提取物中的至少一种；
任选的，所述种属的血管内皮细胞提取物的添加量为占本发明所述体外用生物膜总量的1质量％～30质量％，优选为15质量％。
4.根据权利要求1所述的体内用生物膜，其特征在于，所述支架添加物为1～10质量份，优选为6质量份；
任选的，所述支架添加物包括聚碳酸酯和聚己内酯；
任选的，所述聚碳酸酯与所述聚己内酯的质量比为1：5～1：20，优选为1：10。
5.根据权利要求1所述的体内用生物膜，其特征在于，所述交联剂为1～10质量份，优选为6质量份；
任选的，所这交联剂为物理交联剂；
任选的，所述物理交联剂为选自硫酸钠、柠檬酸钠、三聚磷酸钠中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的体内用生物膜，其特征在于，所述通透剂为1～10质量份，优选为6质量份；
任选的，所述通透剂为选自碳酸氢铵和碳酸铵中的至少一种。
7.一种制备权利要求1～6任一项所述的体内用生物膜的方法，其特征在于，包括：
将所述基质吸附物、生物添加物、支架添加物、交联剂和通透剂在水环境下相接触；
任选的，所述制备方法进一步包括：
(1)在反应器中，将所述基质吸附物加入双蒸水中，机械搅拌均匀；
(2)加入所述生物添加物，机械搅拌均匀；
(3)加入所述支架添加物，机械搅拌均匀；
(4)加入所述交联剂，机械搅拌均匀；
(5)加入所述通透剂，机械搅拌均匀；
(6)冷却，即得。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)～(6)的加入过程均是缓慢加入；
任选的，所述步骤(1)～(6)的搅拌过程中，搅拌转速均为100r～150r/min；
任选的，所述搅拌的时间均为10min～30min；
任选的，所述步骤(1)在加入所述基质吸附物之前，先将双蒸水加热至55摄氏度～65摄氏度；
任选的，所述步骤(6)冷却至室温，优选为16摄氏度～26摄氏度。
9.权利要求1～6任一项所述的体内用生物膜在培养种属组织和细胞中的用途，
任选的，所述种属组织和细胞为选自种属细胞系、原代细胞和组织中的至少一种；
任选的，所述种属组织和细胞的来源为人、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、羊、猪、牛。
任选的，所述种属细胞系为选自种属人肺癌细胞A549、人肝癌细胞HepG2、人结直肠癌细胞HT-29和人巨噬细胞RAW264.7中的至少一种；
任选的，所述种属原代细胞为选自人组织源性血管内皮细胞、小鼠组织源性肺上皮细胞、大鼠组织源性肝细胞和大兔组织源性平滑肌细胞中的至少一种；
任选的，所述种属组织为选自人肺组织、大鼠平滑肌组织、小鼠肝组织和大兔肾组织中的至少一种。
10.一种应用权利要求1～6任一项所述的体内用生物膜的方法，其特征在于，在无菌条件下，
(1)将体内用生物膜包裹组织块或分离培养的细胞，以形成微球包裹体；
(2)将所述微球包裹体放入实验性动物体内的目的位置处；
(3)使被包裹的组织块或细胞在体内经过培养和生长；
(4)取出微球包裹体并打开，取出组织块或细胞；
(5)对组织块或细胞进行目的性检测和分析；
任选的，所述实验性动物为小鼠、大鼠、豚鼠、兔、羊、猪、牛；
任选的，所述包裹的组织和细胞来源为人、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猪、牛。
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