CN109402059A - 体外用生物膜及其制备方法和用途 - Google Patents

体外用生物膜及其制备方法和用途 Download PDF

Info

Publication number
CN109402059A
CN109402059A CN201710842064.XA CN201710842064A CN109402059A CN 109402059 A CN109402059 A CN 109402059A CN 201710842064 A CN201710842064 A CN 201710842064A CN 109402059 A CN109402059 A CN 109402059A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mass parts
cell
external use
optional
tissue
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710842064.XA
Other languages
English (en)
Inventor
刘东旭
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Primary Primary Biological Medicine Technology Co Ltd
Original Assignee
Wuhan Primary Primary Biological Medicine Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Primary Primary Biological Medicine Technology Co Ltd filed Critical Wuhan Primary Primary Biological Medicine Technology Co Ltd
Priority to CN201710842064.XA priority Critical patent/CN109402059A/zh
Publication of CN109402059A publication Critical patent/CN109402059A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0688—Cells from the lungs or the respiratory tract
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides
    • C12N2533/72—Chitin, chitosan
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides
    • C12N2533/74—Alginate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides
    • C12N2533/80—Hyaluronan

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提出了一种体外用生物膜，包括基质吸附物、生物添加物、支架添加物、交联剂和通透剂。该体外用生物膜可保持培养细胞的生物学体系，稳定培养细胞的生长状态，适于应用在药物筛选、药物疗效评价、药物适应症评估、药物毒性和副作用评价、药物配伍等的检测和分析中；同时也可以对组织和细胞的生物学活性和遗传特征进行检测和分析。

Description

体外用生物膜及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及生物膜技术领域，具体的，本发明涉及与一种体外用生物膜及其制备方法和用途。
背景技术
细胞培养技术是将组织分离成为单个细胞后，在体外优化的人工环境条件下在培养器皿或方瓶上进行培养，使其生长、传代，也可以将细胞进行冻存和复苏，再次进行细胞培养和生长。而组织培养技术是在体外优化的人工环境条件下将组织在培养器皿或方瓶上进行培养，使组织中的细胞生长、传代，也可以将组织进行冻存和复苏。但通常的组织和细胞培养是在培养器皿或方瓶上，使得所培养的组织和细胞易失去原有的生物学特性，遗传学等特征被改变；组织中的细胞和单独分离的细胞群体中非整倍体染色体组成的不稳定性，易造成前一代细胞与下一代细胞互有差异；并且组织培养和细胞培养在细胞培养器皿或方瓶上不易贴壁，造成其不易成活、不易增殖和分化、不易传代。在细胞培养器皿或方瓶上与其相接触的组织面和细胞面在接受培养液的程度，同与培养器皿或方瓶非接触的组织面和细胞面存在差异。
因此，目前体外用生物膜、体外组织培养和细胞培养的方法仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有利于组织、细胞培养和生长的体外用生物膜。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种体外用生物膜，根据本发明的实施例，该生物膜包括：基质吸附物、生物添加物、支架添加物、交联剂、通透剂。
发明人意外发现，本发明的体外用生物膜具备非常好的通透性、透明性、柔韧性和富含水性；双向性进行水自由进入，小分子物质和气体如氧和二氧化碳可以自由通过，具有重要的生物医药领域的应用价值。
根据本发明的实施例，该体外用生物膜中所含的基质吸附物包括5～10质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白，10～25质量份的明胶和基质胶，5～10质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素，1～5质量份的藻酸盐、1～5质量份的聚乙二醇、1～5质量份的细胞基质。
根据本发明的具体实施例，所述基质吸附物包括5质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白，10质量份的明胶和基质胶，5质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素，1质量份的藻酸盐，1质量份的聚乙二醇，1质量份的细胞基质。
根据本发明的具体实施例，所述基质吸附物包括8质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白，20质量份的明胶和基质胶，8质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素，3质量份的藻酸盐，4质量份的聚乙二醇，2质量份的细胞基质。
根据本发明的具体实施例，所述基质吸附物包括10质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白，25质量份的明胶和基质胶，10质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素，5质量份的藻酸盐，5质量份的聚乙二醇，5质量份的细胞基质。
根据本发明的实施例，所述胶原蛋白与所述蚕丝蛋白的质量比为1：1。
根据本发明的实施例，所述明胶与所述基质胶的质量比为1：1。
根据本发明的实施例，所述壳聚糖、所述透明质酸与所述硫酸软骨素的质量比为1：1：1。
根据本发明的实施例，该体外用生物膜中所含的生物添加物为选自种属细胞提取物。
根据本发明的实施例，优选为选自种属的血管内皮细胞提取物。
根据本发明的实施例，所述种属的血管内皮细胞提取物为选自人、小鼠、大鼠、兔、猪、牛的血管内皮细胞提取物中的至少一种。
根据本发明的具体实施例，所述种属的血管内皮细胞提取物的添加量为占本发明所述体外用生物膜总量的1质量％～30质量％，优选为15质量％。
根据本发明的实施例，该体外用生物膜中的支架添加物为1～10质量份，优选为6质量份。根据本发明的具体实施例，所述支架添加物包括聚碳酸酯和聚己内酯。
根据本发明的具体实施例，所述聚碳酸酯与所述聚己内酯的添加量的质量比为1：5～1：20，优选为1：10。由此，可以获得不同硬度的体外用生物膜。
根据本发明的实施例，该体外用生物膜中所含的交联剂为1～10质量份，优选为6质量份。根据本发明的实施例，所述交联剂为物理交联剂。根据本发明的具体实施例，所述物理交联剂为选自硫酸钠、柠檬酸钠、三聚磷酸钠中的至少一种。
根据本发明的实施例，该体外用生物膜中所含的通透剂为1～10质量份，优选为6质量份，根据本发明的实施例，所述通透剂为选自碳酸氢铵和碳酸铵中的至少一种。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备体外用生物膜的方法，根据本发明的实施例，该方法包括：将所述基质吸附物、生物添加物、支架添加物、交联剂和通透剂在水环境下相接触。本发明的制备工艺简便、无需特殊的大型设备、原料容易获得、价格合理、成本低廉，易于实现产业化。
根据本发明的实施例，本发明制备体外用生物膜的方法进一步包括：
(1)在反应器中，将所述基质吸附物加入双蒸水中，机械搅拌均匀；
(2)加入所述生物添加物，机械搅拌均匀；
(3)加入所述支架添加物，机械搅拌均匀；
(4)加入所述交联剂，机械搅拌均匀；
(5)加入所述通透剂，机械搅拌均匀；
(6)冷却，即得。
所述步骤(1)～(6)中，按基质吸附物>生物添加物>支架添加物>交联剂>通透剂的顺序先后加入。
根据本发明的实施例，步骤(1)～(6)的加入过程均是缓慢加入。由此，使所添加的物质充分接触。
根据本发明的实施例，步骤(1)～(6)的搅拌过程中，搅拌转速均为100r～150r/min。
根据本发明的具体实施例，所述搅拌的时间均为10min～30min。由此，使后添加的物质更好的融入至之前所形成的体系中。
根据本发明的实施例，所述步骤(1)在加入所述基质吸附物之前，先将双蒸水加热至55摄氏度～65摄氏度。由此，便于基质吸附物更好的融入双蒸水体系中。
根据本发明的实施例，所述步骤(6)冷却至16摄氏度～26摄氏度。
在本发明的第三方面，本发明提出了前面所述体外用生物膜在体外培养种属组织和细胞中的用途。根据本发明的实施例，所述种属组织和细胞的来源为人、小鼠、大鼠、兔、猪、牛。
根据本发明的实施例，所述种属细胞系为选自人肺癌细胞A549、人肝癌细胞HepG2、人结直肠癌细胞HT-29、人巨噬细胞RAW264.7中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述种属原代细胞为选自人组织源性血管内皮细胞、小鼠组织源性肺上皮细胞、大鼠组织源性肝细胞和大兔组织源性平滑肌细胞中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述种属组织为选自人肺组织、大鼠平滑肌组织、小鼠肝组织和大兔肾组织中的至少一种。
根据本发明的具体实施例，本发明的制备方法为：(1)取双蒸水100ml倒入200ml的反应容器中，将反应容器放在机械搅拌器上加热至55摄氏度～65摄氏度；(2)依次缓慢加入5～10质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白(质量比1：1)，10～25质量份的明胶和基质胶(质量比为1：1，5～10质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素(质量比1：1：1)、1～5质量份的藻酸盐、1～5质量份的聚乙二醇、1～5质量份的细胞基质到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速100r～150r/min,搅拌时间10min～30min；(3)缓慢依次加入质量百分比为1％～30％的种属的血管内皮细胞提取物到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速100r～150r/min,拌时间10min～30min；(4)缓慢加入1～10质量份的聚碳酸酯和聚己内酯(质量比为1：5～1：20)到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速100r～150r/min,搅拌时间10min～30min；(5)缓慢依次加入1～10质量份硫酸钠或柠檬酸钠或三聚磷酸钠中的至少一种到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速100r～150r/min,搅拌时间10min～30min；(6)缓慢加入1～10质量份碳酸氢铵和碳酸铵中的至少一种到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速100r～150r/min,搅拌时间10min～30min；(7)均匀后，将冷却至16摄氏度～26摄氏度。即得体外用生物膜。
发明人对本发明所制备得到的体外用生物膜采用常规方法进行检测，得到不同产品的厚度为0.1mm～2.0mm(应用计量尺检测本发明所制备得到的体外用生物膜的厚度)；含水量为20％～60％(对该体外用生物膜进行干燥后对比前后重量)；pH值为6.8～7.6(应用pH值检测仪或检测条对该体外用生物膜进行pH值检测)。
检测体外用生物膜的有效期：将体外用生物膜放入保护液中保存，于4摄氏度条件下保存1年后，仍可将保存后的体外用生物膜用于组织、原代细胞、细胞系的培养。结果发现该体外用生物膜的有效期可达1年(体外用生物膜放入保护液中保存，4摄氏度条件下保存1年)，保护液为市面上的RPMI 1640和DMEM。
根据本发明实施例的体外用生物膜，可以实现下列优点至少之一：
(1)该体外用生物膜具有高通透性、柔软性、富含水性，膜双面的水份和物质可以进行自由交换；该体外用生物膜的有效期长：4摄氏度条件下可保存1年；
(2)该体外用生物膜具有柔软性，对培养的组织和细胞无任何刺激性，也对培养的细胞的生长无任何阻碍作用；
(3)该体外用生物膜具有通透性，易于药物或小分子物质或大分子物质等自由的通过生物膜而进入培养细胞中；
(4)该体外用生物膜具有富含水性，不易损伤培养的组织和细胞；
(5)该体外用生物膜双面的水份和物质可以进行自由交换，便于培养液经过体外用生物膜而进入培养细胞中，避免在细胞培养器皿或方瓶上与相其接触的组织面和细胞面在接受培养液的程度，同与培养器皿或方瓶非接触的组织面和细胞面构成差异。
(6)该体外用生物膜可以提升组织和细胞粘附功能，促进细胞培养，加快细胞生长，防止细胞死亡或凋亡，也防止细胞的融合或吞噬，提高细胞培养和生长的成功率；
(7)该体外用生物膜可以稳定所培养细胞的增殖和分化过程，稳定细胞群体中非整倍体染色体组成，从而保持前一代培养的细胞的特性与传代后下一代培养细胞的特性一致。
(8)该体外用生物膜可保持培养细胞的生物学体系，稳定培养细胞的生长状态，适于应用在药物筛选、药物疗效评价、药物适应症评估、药物毒性和副作用评价、药物配伍等的检测和分析中；同时也可以对组织和细胞的生物学活性和遗传特征进行检测和分析。
(9)该体外用生物膜可以防止细胞长期多代培养传代后，造成其对与原生环境完全不同的塑料培养皿或培养方瓶环境的适应从而使基因组成和行为发生改变；同时也可以防止细胞长期多代培养传代后而造成细胞分子生物学和分子遗传学的改变。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为根据本发明一个实施例，应用体外用生物膜进行组织培养的细胞生长计数结果；
图2为根据本发明一个实施例，应用体外用生物膜进行原代细胞培养的生长计数结果；
图3为根据本发明一个实施例，应用体外用生物膜进行细胞系培养的生长计数结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。另外，如果没有明确说明，在下面的实施例中所采用的所有试剂均为市场上可以购得的，或者可以按照文本或已知的方法合成的，对于没有列出的反应条件，也均为本领域技术人员容易获得的。
生物材料来源：组织和细胞培养所用的培养皿、培养方瓶、常用实验用耗材购于Corning公司；组织和细胞培养液购于Invitrogen公司；组织、原代细胞、细胞系分别购于Invitrogen公司、ScieCells公司、中国科学院细胞保藏中心。小鼠来源：C57BL/6小鼠来源于湖北省疾病预防控制中心。
实施例1 20％含水量的体外用生物膜的制备
(1)取双蒸水100ml倒入200ml的反应容器中，将反应容器放在机械搅拌器上加热至55摄氏度；
(2)依次缓慢加入5质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白(质量比1：1)，10质量份的明胶和基质胶(质量比1：1)，5质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素(质量比1：1：1)、1质量份的藻酸盐、1质量份的聚乙二醇、1质量份的细胞基质到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速150r/min,搅拌时间10min；
(3)依次缓慢加入质量百分比1％的种属的血管内皮细胞提取物到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速150r/min,搅拌时间10min；
(4)缓慢加入1质量份的聚碳酸酯和聚己内酯(质量比为1：5)到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速150r/min,搅拌时间10min；
(5)缓慢依次加入1质量份的柠檬酸钠到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速150r/min,搅拌时间10min；
(6)缓慢加入1质量份碳酸氢铵到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速150r/min,搅拌时间10min；
(7)均匀后，将冷却至16摄氏度。即得体外用生物膜。
应用计量尺检测体外用生物膜的厚度为0.1mm；对体外用生物膜进行干燥后对比前后重量，其含水量为20％；应用pH值检测仪或检测条对体外用生物膜进行pH值检测，其pH值为6.8。
实施例2 60％含水量的体外用生物膜的制备
(1)取双蒸水100ml倒入200ml的反应容器中，将反应容器放在机械搅拌器上加热至65摄氏度；
(2)依次缓慢加入10质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白(质量比1：1)，25质量份的明胶和基质胶(质量比1：1)，10质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素(质量比1：1：1)、5质量份的藻酸盐、5质量份的聚乙二醇、5质量份的细胞基质到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速100r/min,搅拌时间30min；
(3)依次缓慢加入质量百分比30％的种属的血管内皮细胞提取物到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速100r/min,搅拌时间30min；
(4)缓慢加入10质量份的聚碳酸酯和聚己内酯(质量比为1：20)到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速100r/min,搅拌时间30min；
(5)缓慢依次加入10质量份的硫酸钠到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速100r/min,搅拌时间30min；
(6)缓慢加入10质量份的碳酸铵到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速100r/min,搅拌时间30min；
(7)均匀后，将冷却至26摄氏度。即得体外用生物膜。
应用计量尺检测体外用生物膜的厚度为2.0mm；对体外用生物膜进行干燥后对比前后重量，其含水量为60％；应用pH值检测仪或检测条对体外用生物膜进行pH值检测，其pH值为7.6。
实施例3 40％含水量的体外用生物膜的制备
(1)取双蒸水100ml倒入200ml的反应容器中，将反应容器放在机械搅拌器上加热至60摄氏度；
(2)依次缓慢加入8质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白(质量比1：1)，20质量份的明胶和基质胶(质量比1：1)，8质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素(质量比1：1：1)、3质量份的藻酸盐、4质量份的聚乙二醇、2质量份的细胞基质到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速120r/min，搅拌时间20min；
(3)依次缓慢加入质量百分比15％的种属的血管内皮细胞提取物到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速120r/min，搅拌时间20min；
(4)缓慢加入6质量份的聚碳酸酯和聚己内酯(质量比为1：10)到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速120r/min，搅拌时间20min；
(5)缓慢依次加入6质量份的三聚磷酸钠到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速120r/min，搅拌时间20min；
(6)缓慢加入6质量份的碳酸铵到反应容器中，进行机械搅拌，搅拌转速120r/min，搅拌时间20min；
(7)均匀后，将冷却至20摄氏度。即得体外用生物膜。
应用计量尺检测生物膜的厚度为1.0mm；对体外用生物膜进行干燥后对比前后重量，其含水量为40％；应用pH值检测仪或检测条对体外用生物膜进行pH值检测，其pH值为7.0。
实施例4培养组织块
将实施例3所制得的40％含水量的体外用生物膜放入组织细胞培养皿或方瓶底部，将组织块种植在体外用生物膜上，加入组织培养液(组织或细胞培养液成份为：1、DMEM/F12；2、添加剂：胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、血管生长因子、L-谷氨酰铵；3、10％胎牛血清；4、青霉素、链霉素)进行培养。定期(第1、2、3、4、5天)观察组织块中细胞生长状态。
具体操作时，体外用生物膜大小依据6孔板34.8mm、12孔板22.1mm、24孔板15.6mm、48孔板10.2mm、96孔板4.5mm而定，例如组织块可为1×1×1mm，采用96孔板进行组织块培养，所得结果如附图1和表1所示。
另一方面，采用常规组织培养(注：采用常规组织培养与采用本发明所述的方法培养的唯一区别点在于：采用常规组织培养的没有应用本发明所述的体外用生物膜)，将组织块放入组织细胞培养皿或方瓶底部，加入组织培养液(组织培养液成份为：1、DMEM/F12；2、添加剂：胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、血管生长因子、L-谷氨酰铵；3、10％胎牛血清；4、青霉素、链霉素)进行培养。定期(第1、2、3、4、5天)观察组织块中细胞生长状态，所得结果如表2所示。
表1应用本发明体外用生物膜培养组织时间与细胞生长进行细胞计数的关系
表2常规组织培养(未应用本发明体外用生物膜)时间与细胞生长进行细胞计数的关系
结果表明：
应用体外用生物膜培养人肺组织第5天细胞数是常规人肺组织培养第5天细胞数的3.5倍。
应用体外用生物膜培养小鼠肝组织第5天细胞数是常规小鼠肝组织培养第5天细胞数的2.3倍。
应用体外用生物膜培养大鼠平滑肌组织第5天细胞数是常规大鼠平滑肌组织培养第5天细胞数的2.7倍。
应用体外用生物膜培养兔肾组织第5天细胞数是常规兔肾组织培养第5天细胞数的2.0倍。
应用体外用生物膜进行组织块培养时间第5天，细胞生长计数最高。
实施例5培养原代细胞
将实施例3所制得的40％含水量的体外用生物膜放入组织细胞培养皿或方瓶中。将原代细胞(依据培养板大小)种植在体外用生物膜上，加入细胞培养液(细胞培养液成份为：1、DMEM/F12；2、添加剂：胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、血管生长因子、L-谷氨酰铵；3、10％胎牛血清；4、青霉素、链霉素)进行原代细胞培养。定期(第1、2、3、4、5天)观察原代细胞生长状态。
具体操作时，体外用生物膜大小依据6孔板34.8mm、12孔板22.1mm、24孔板15.6mm、48孔板10.2mm、96孔板4.5mm而定，例如组织块可为1×1×1mm，采用96孔板进行原代细胞培养，其结果如附图2和表3所示。
另一方面，采用常规培养方法(注：与采用本发明所述的方法培养的唯一区别点在于：采用常规培养方法的，没有应用本发明所述的体外用生物膜)，将原代细胞(依据培养板大小)放入组织细胞培养皿或方瓶中，加入细胞培养液(细胞培养液成份为：1、DMEM/F12；2、添加剂：胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、血管生长因子、L-谷氨酰铵；3、10％胎牛血清；4、青霉素、链霉素)进行原代细胞培养。定期(第1、2、3、4、5天)观察原代细胞生长状态，结果如表4所示。
表3应用本发明体外用生物膜培养原代细胞时间与细胞生长计数(×103)的关系
表4常规原代细胞培养(未应用本发明体外用生物膜)时间与细胞生长计数(×103)的关系
结果表明：
应用体外用生物膜培养人血管内皮细胞第4天细胞数是常规人血管内皮细胞培养第4天细胞数的2.25倍。
应用体外用生物膜培养小鼠肺上皮细胞第4天细胞数是常规小鼠肺上皮细胞培养第4天细胞数的2.0倍。
应用体外用生物膜培养大鼠肝细胞第4天细胞数是常规大鼠肝细胞培养第4天细胞数的2.33倍。
应用体外用生物膜培养兔平滑肌细胞第4天细胞数是常规兔平滑肌细胞培养第4天细胞数的1.67倍。
应用本发明体外用生物膜进行原代细胞培养时间第4天，细胞生长计数最高。应用常规生物膜原代细胞培养时间第7天，细胞生长计数方达最高。
实施例6培养细胞系
将实施例3所制得的40％含水量的体外用生物膜放入组织细胞培养皿或方瓶中。将细胞(依据培养板大小)种植在体外用生物膜上，加入细胞培养液(DMEM+10％胎牛血清+青霉素和链霉素)进行细胞培养。定期(第1、2、3、4、5、6、7、8天)观察细胞生长状态。
具体操作时，体外用生物膜大小依据6孔板34.8mm、12孔板22.1mm、24孔板15.6mm、48孔板10.2mm、96孔板4.5mm而定，采用96孔板进行细胞系培养，其结果如附图3和表5所示。
另一方面，采用常规培养方法(注：与采用本发明所述的方法培养的唯一区别点在于：采用常规培养方法的，没有应用本发明所述的体外用生物膜)，将细胞(依据培养板大小)放入组织细胞培养皿或方瓶中，加入细胞培养液(DMEM+10％胎牛血清+青霉素和链霉素)进行细胞培养。定期(第1、2、3、4、5、6、7、8天)观察细胞生长状态，结果如表6所示。
表5应用本发明体外用生物膜培养细胞系时间与细胞生长计数(×103)的关系
表6常规细胞系培养(未应用本发明体外用生物膜)时间与细胞生长计数(×103)的关系
结果表明：
应用体外用生物膜培养A549细胞第4天细胞数是常规A549细胞培养第天4细胞数的2.67倍。
应用体外用生物膜培养HT-29细胞第4天细胞数是常规HT-29细胞培养第4天细胞数的1.83倍。
应用体外用生物膜培养HepG2细胞第4天细胞数是常规HepG2细胞培养第4天细胞数的2.50倍。
应用体外用生物膜培养RAW264.7细胞第4天细胞数是常规RAW.7细胞培养第4天细胞数的2.75倍。
应用本发明体外用生物膜培养细胞系时间第4天，细胞生长计数最高。应用常规生物膜细胞系培养时间第7天，细胞生长计数方达最高。
同样的，应用本发明实施例1、实施例2所述的体外用生物膜，分别进行组织培养、进行原代细胞培养、进行细胞系培养，均得到了与本发明实施例4-6同理的结果。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种体外用生物膜，其特征在于，包括：基质吸附物、生物添加物、支架添加物、交联剂、通透剂。
2.根据权利要求1所述的体外用生物膜，其特征在于，所述基质吸附物包括5～10质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白，10～25质量份的明胶和基质胶，5～10质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素，1～5质量份的藻酸盐，1～5质量份的聚乙二醇，1～5质量份的细胞基质；
任选地，所述基质吸附物包括5质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白，10质量份的明胶和基质胶，5质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素，1质量份的藻酸盐，1质量份的聚乙二醇，1质量份的细胞基质；
任选地，所述基质吸附物包括8质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白，20质量份的明胶和基质胶，8质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素，3质量份的藻酸盐，4质量份的聚乙二醇，2质量份的细胞基质；
任选地，所述基质吸附物包括10质量份的胶原蛋白和蚕丝蛋白，25质量份的明胶和基质胶，10质量份的壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素，5质量份的藻酸盐，5质量份的聚乙二醇，5质量份的细胞基质；
任选的，所述胶原蛋白与所述蚕丝蛋白的质量比为1：1；
任选的，所述明胶与所述基质胶的质量比为1：1；
任选的，所述壳聚糖、所述透明质酸与所述硫酸软骨素的质量比为1：1：1。
3.根据权利要求1所述的体外用生物膜，其特征在于，所述生物添加物为选自种属细胞提取物，
优选所述种属细胞提取物为选自种属的血管内皮细胞提取物，
任选的，所述种属的血管内皮细胞提取物为选自人、小鼠、大鼠、兔、猪、牛的血管内皮细胞提取物中的至少一种；
任选的，所述种属的血管内皮细胞提取物的添加量为占本发明所述体外用生物膜总量的1质量％～30质量％，优选为15质量％。
4.根据权利要求1所述的体外用生物膜，其特征在于，所述支架添加物为1～10质量份，优选为6质量份；
任选的，所述支架添加物包括聚碳酸酯和聚己内酯；
任选的，所述聚碳酸酯与所述聚己内酯的质量比为1：5～1：20，优选为1：10。
5.根据权利要求1所述的体外用生物膜，其特征在于，所述交联剂为1～10质量份，优选为6质量份；
任选的，所这交联剂为物理交联剂；
任选的，所述物理交联剂为选自硫酸钠、柠檬酸钠、三聚磷酸钠中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的体外用生物膜，其特征在于，所述通透剂为1～10质量份，优选为6质量份；
任选的，所述通透剂为选自碳酸氢铵和碳酸铵中的至少一种。
7.一种制备权利要求1～6任一项所述的体外用生物膜的方法，其特征在于，包括：
将所述基质吸附物、生物添加物、支架添加物、交联剂和通透剂在水环境下相接触；
任选的，所述制备方法进一步包括：
(1)在反应器中，将所述基质吸附物加入双蒸水中，机械搅拌均匀；
(2)加入所述生物添加物，机械搅拌均匀；
(3)加入所述支架添加物，机械搅拌均匀；
(4)加入所述交联剂，机械搅拌均匀；
(5)加入所述通透剂，机械搅拌均匀；
(6)冷却，即得。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)～(6)的加入过程均是缓慢加入；
任选的，所述步骤(1)～(6)的搅拌过程中，搅拌转速均为100r～150r/min；
任选的，所述搅拌的时间均为10min～30min；
任选的，所述步骤(1)在加入所述基质吸附物之前，先将双蒸水加热至55摄氏度～65摄氏度；
任选的，所述步骤(6)冷却至16摄氏度～26摄氏度。
9.权利要求1～6任一项所述的体外用生物膜在体外培养种属组织和细胞中的用途；
任选的，所述种属组织和细胞为选自细胞系、原代细胞和组织中的至少一种；
任选的，所述种属组织和细胞的来源为人、小鼠、大鼠、兔、猪、牛；
任选的，所述种属细胞系为选自人肺癌细胞A549、人肝癌细胞HepG2、人结直肠癌细胞HT-29和人巨噬细胞RAW264.7中的至少一种；
任选的，所述种属原代细胞为选自人组织源性血管内皮细胞、小鼠组织源性肺上皮细胞、大鼠组织源性肝细胞和大兔组织源性平滑肌细胞中的至少一种；
任选的，所述种属组织为选自人肺组织、大鼠平滑肌组织、小鼠肝组织和大兔肾组织中的至少一种。
10.一种培养种属组织和细胞培养的试剂盒，其特征在于包含权利要求1～6任一项所述的体外用生物膜。
CN201710842064.XA 2017-09-18 2017-09-18 体外用生物膜及其制备方法和用途 Pending CN109402059A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710842064.XA CN109402059A (zh) 2017-09-18 2017-09-18 体外用生物膜及其制备方法和用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710842064.XA CN109402059A (zh) 2017-09-18 2017-09-18 体外用生物膜及其制备方法和用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109402059A true CN109402059A (zh) 2019-03-01

Family

ID=65462905

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710842064.XA Pending CN109402059A (zh) 2017-09-18 2017-09-18 体外用生物膜及其制备方法和用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109402059A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109395095A (zh) * 2017-09-18 2019-03-01 武汉原生原代生物医药科技有限公司 体内用生物膜及其制备方法和用途

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050058687A1 (en) * 2003-09-12 2005-03-17 Becton, Dickinson And Company Covalently attached collagen VI for cell attachment and proliferation
CN101524556A (zh) * 2009-04-09 2009-09-09 哈尔滨工业大学 多孔组织工程支架及其制备方法
CN101632841A (zh) * 2009-08-21 2010-01-27 暨南大学 含海藻酸盐、糖胺聚糖和胶原的组织工程支架及其制备方法
CN101643703A (zh) * 2009-08-28 2010-02-10 雷震 一种细胞长期培养保存三维系统及相关的细胞长期培养保存方法
CN102580155A (zh) * 2012-03-11 2012-07-18 杨青芳 一种复合三维组织工程支架及其制备方法
CN103495205A (zh) * 2013-09-17 2014-01-08 中国人民解放军第二军医大学 一种可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂及其制备方法
US20160206780A1 (en) * 2014-08-15 2016-07-21 Suzhou Cancercell Biotechnology Co. Ltd Matrix Scaffold for Three-Dimensional Cell Cultivation, Methods of Construction Thereof and Uses Thereof

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050058687A1 (en) * 2003-09-12 2005-03-17 Becton, Dickinson And Company Covalently attached collagen VI for cell attachment and proliferation
CN101524556A (zh) * 2009-04-09 2009-09-09 哈尔滨工业大学 多孔组织工程支架及其制备方法
CN101632841A (zh) * 2009-08-21 2010-01-27 暨南大学 含海藻酸盐、糖胺聚糖和胶原的组织工程支架及其制备方法
CN101643703A (zh) * 2009-08-28 2010-02-10 雷震 一种细胞长期培养保存三维系统及相关的细胞长期培养保存方法
CN102580155A (zh) * 2012-03-11 2012-07-18 杨青芳 一种复合三维组织工程支架及其制备方法
CN103495205A (zh) * 2013-09-17 2014-01-08 中国人民解放军第二军医大学 一种可注射的镶嵌含药微粒的多孔复合微球制剂及其制备方法
US20160206780A1 (en) * 2014-08-15 2016-07-21 Suzhou Cancercell Biotechnology Co. Ltd Matrix Scaffold for Three-Dimensional Cell Cultivation, Methods of Construction Thereof and Uses Thereof

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
吕杰等: "《生物医用材料导论》", 31 October 2016, 同济大学出版社 *
吴少科等: "血管内皮细胞在骨形成及修复中的作用及机制", 《广东医学院学报》 *
王冉旭等: "人牙髓干细胞在不同HA含量的PLGA/HA复合支架材料上的粘附研究", 《口腔医学研究》 *
郑玉峰等: "《生物医用材料学》", 31 August 2005, 哈尔滨工业大学出版社 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109395095A (zh) * 2017-09-18 2019-03-01 武汉原生原代生物医药科技有限公司 体内用生物膜及其制备方法和用途
CN109395095B (zh) * 2017-09-18 2021-09-24 武汉原生原代生物医药科技有限公司 体内用生物膜及其制备方法和用途

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zimoch et al. Polyisocyanopeptide hydrogels: A novel thermo-responsive hydrogel supporting pre-vascularization and the development of organotypic structures
JP7452519B2 (ja) 培地添加物及び培地組成物並びにそれらを用いた細胞又は組織の培養方法
CN104640974B (zh) 培养基组合物以及使用所述组合物培养细胞或组织的方法
CN103814125B (zh) 粘附性细胞的培养方法
Schmidt et al. Tumor cells develop defined cellular phenotypes after 3D-bioprinting in different bioinks
CN102952279A (zh) 用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶及应用
Soubéran et al. Practical review on preclinical human 3D glioblastoma models: advances and challenges for clinical translation
CN107217039A (zh) 肿瘤组织3d培养方法及培养液
Zhu et al. Three-dimensional bioprinting with alginate by freeform reversible embedding of suspended hydrogels with tunable physical properties and cell proliferation
CN109402059A (zh) 体外用生物膜及其制备方法和用途
Mubarok et al. Tuning myogenesis by controlling gelatin hydrogel properties through hydrogen peroxide-mediated cross-linking and degradation
CN107699492A (zh) 一种小球藻的保藏方法
CN101484574A (zh) 供培养的细胞三维生长的底物
CN104193686B (zh) N-没食子酰胺-嘧啶基苯磺酰胺类衍生物及其制备方法和应用
Yang et al. In vitro study of the interactions of galactosylated thermo-responsive hydrogels with cells
Zahn et al. Minispheroids as a tool for ligament tissue engineering: Do the self-assembly techniques and spheroid dimensions influence the cruciate ligamentocyte phenotype?
CN108118079B (zh) 一种基于定性滤纸的三维肝模型的药物肝毒性评价方法
CN109402047A (zh) 促组织粘附和生长生物粘合剂及其制备方法和用途
CN109395095B (zh) 体内用生物膜及其制备方法和用途
CN207130275U (zh) 一种共培养装置
CN106047806B (zh) 一种适用于高密度细胞培养体系的外周血细胞培养基
RU2506309C2 (ru) Способ культивирования миобластов in vitro для получения биомассы миоцитов для пищевых целей
JP2017055727A (ja) 細胞の培養方法
KR20140141182A (ko) 엘라스틴 유사 인공세포외 기질에 형성된 3차원 세포 군집체를 이용한 체외독성시험방법
Priyadarshini et al. Three-dimensional tumor model and their implication in drug screening for tackling chemoresistance

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190301